Pirosek

1. PIROSEKUENTZIAZIOA:
Denbora errealean DNAren sintesia monitorizatzean oinarrituriko
sekuentziazio metodoa da.
.“In vitro” egiten da
. DNA sekuentziatzeko à FLUORESZENTZIAN OINARRITU

2. PIROSEKUENTZIAZIOA:
Denbora errealean DNAren sintesia monitorizatzean oinarrituriko
sekuentziazio metodoa da.
.“In vitro” egiten da
. PCRan oinarritzen da
. DNA sekuentziatzeko à FLUORESZENTZIAN OINARRITU
Luziferasaren bidez ATP
kantitatea modu ez zuzenean
neurtu

3. Lau entzima garrantzitsu daude:
! DNA POLIMERASA
! APIRASA
! ATP SULFURILASA
! LUZIFERASA

4. sstDNA LIBURUXKA LORTU
Adaptatzaileen funtzioak bi dira:
! PCRrako hasle moduan jardun à SEKUENTZIA EZAGUNA
! B ADAPTATZAILEA: Biotinaturik (3’) à estreptoabidina bolatxoei lotu
GURI BAKARRIK HASLEAK INTERESATU

5. sstDNA LIBURUXKA LORTU
A A
5’ 3’
A B
5’ 3’
B B
5’ 3’
B A
5’ 3’
Biotina B adaptadorearen 3’-an

6. sstDNA LIBURUXKA LORTU
A
A B
5’ 3’
B
3’
5’
Biotina B adaptadorearen 3’-an

7. sstDNA LIBURUXKA LORTU
A
A B
5’ 3’
B
5’
3’5’
B A
3’
Biotina B adaptadorearen 3’-an

8. 3’
B B
5’ 3’
sstDNA LIBURUXKA LORTU
Biotina B adaptadorearen 3’-an

9. sstDNA LIBURUXKA LORTU
3’
5’
B B
5’ 3’
Biotina B adaptadorearen 3’-an

10. 3’
3’
B B
5’ 3’
sstDNA LIBURUXKA LORTU
Biotina B adaptadorearen 3’-an

11. Kasu honetan lotura BASEEN OSAGARRITASUNAREN arabera
ematen da, bolatxo hauek A sekuentzia adaptatzailearekiko
osagarriak diren oligoak baitituzte.
BOLATXO BAKOITZEAN sstDNA BAKARRA
sstDNA LIBURUXKA LORTU

12. emPCRa
Esfera bakoitza
mikroanbiente batean
isolaturik geratzen da
PCRrako behar diren
mix osagaiekin.
ssTDNA liburuxkari ura
eta olioa gehitzen zaizkio
PCR termozikloen ondoren eta DNA desnaturalizatu ostean
sstDNA bakoitzaren anplikoi
bat klonaturik lortzen dugu
esfera bakoitzean

13. Sulfurilasa + Luciferasa +
Apirasa
“PicoTiterPlate” :
400.000 putzu
Putzu bakoitzean entzimak dituzten esfera asko sartuko dira baina
gure sekuentzia duen esfera bakarra sartuko da.
“PicoTiterPlate” sekuentziadorean jarriko dugu
Sekuentziazioa

14. Sekuentziazioa
A A A A A A
T
1. ZIKLOA: Adeninen gehiketa
APIRASA
Adeninak lotu ez direnez
APIRASAK degradatuko ditu
Fosfodiester loturarik eman ez denez à PPi ez à Luziferasak ez du
seinalerik emango

15. Soberan dauden erreaktiboen garbiketa APIRASA
entzimaren bidez burutuko da.
CCD kamerak luciferasaren
bidez emititutako argia
jasoko du eta software
baten bidez interpretatuko
da.
Sekuentziazioa
1. ZIKLOA:Timinen gehiketa

16. Sekuentziazioa
T T T T T T
1. ZIKLOA:Timinen gehiketa

17. Sekuentziazioa
C C C C C C
T
1. ZIKLOA: Zitosinen gehiketa
APIRASA 1. ZIKLOA: Guaninen gehiketa
G G G G G G

18. Zikloa
errepikatu
(normalean
ATCG ordenan)
Sekuentziazioa

19. SANGER
METODOA
PIROSEKUENTZIAZIOA
Nukleotidoak ddNTP dNTP
PCR
4 PCR, 4 hodi PCR bakarra eta ziklikoa
Emaitzen analisia ELEKTROFORESIA ORDENAGAILUA
Emaitzen analisian,
zertan oinarritu? Anplikoiaren tamaina ATP-aren fluoreszentzia
Abiadura
67.000 base orduro 20 milioi 4,5 orduro

20. SANGER
METODOA
PIROSEKUENTZIAZIOA
Konplexutasuna Sinplea Konplikatuagoa, sekuentzia
bat baino gehiago aldi
berean sekuentziatu
Kostea Merkea Oso garestia
Tamaina Erreakzioko 500bp
sekuentziatu
Erreakzioko ehundaka
milioi sekuentzioatu
Zertarako? Zertarako?
Sekuentzia motzak
zehaztasunez
aztertzeko
Zertarako? Bp askotako
sekuentziak aztertzeko

21. Luciferasak igorritako argia à gehitutako nukleotidoekiko proportzional

22. AGGGGTGGCTTTGGGGTTGCAGTTG
TCCCCACCGAAACCCCAACGTCAAC

23. 1) Bisulfitoa: C metilatua à C
C ez metilatua à U
CpG irlen metilazioaren azterketarako:

24. 1) Bisulfitoa: C metilatua à C
C ez metilatua à U
2) PCR anplifikazioa: U à T
C à C
CpG irlen metilazioaren azterketarako:

25. 1) Bisulfitoa: C metilatua à C
C ez metilatua à U
2) PCR anplifikazioa: U à T
C à C
CpG irlen metilazioaren azterketarako:
Kontrola

26. 1) Bisulfitoa: C metilatua à C
C ez metilatua à U
2) PCR anplifikazioa: U à T
C à C
CpG irlen metilazioaren azterketarako:
Kontrola

27. 9 CpG-en metilazio maila
4 CpG metilatu gabe

28. SNP-EN ANALISIAK
v Hasleetako baten 3’ muturra
polimorfismoa baino base batzuk
lehenago hibridatzeko diseinatzen
da.
v Genotipoen arteko (homozigoto/
heterozigoto) desberdintzapena
v Oso kuantitatiboaàaleloen
maiztasuna populazioan kalkulatu
daiteke.
v >5000 lagin analizatu daitezke 8
ordutan.

29. Resequencing
v PCR produktu baten sekuentziazioa
egiteko metodo askoz ere azkarragoa.
v Nukleotido mutatuen kuantifikazio
zehatza.
v p53 tumore supresorearen mutazioen
identifikazio eta kuantifikazioa 2000.
urtean

30. Tag Sequencing:
v Teorikoki: 9-10 nukleotidok genea identifikatzeko balio beharko lukete.
Benetan, 30 inguru behar dira.
v Pirosekuentziazio bidez egindako ikereketak guztiz bat datiz Sanger
metodoarekin sekuentziatutako fragmentuekin.
v 96 lagin aztertu daitezke ordubetean, eta cDNA zuzenean erabil daiteke
hurrengo analisietarako.

31. Egitura sekundario konplikatuen
azterketa:
v “Hairpin” edo urkila egiturak.
Funtzio erregulatzailea.
v Egiturari dagokionez sekuentzia
“ambiguoak” aurkitu ziren.
v (Ronaghi eta bere taldeak, 1999.
urtean lortu zuen egoki sekuentziatzea.

32. Birus eta mikroorganismoen identifikazioa:
v Klinikan oso garrantzitsua.
v Patogeno berriak agertzen diraà Oso garrantzitsua da
zehaztasun osoz sekuentziatzea.
v Genotipazio egokia ezinbestekoa da terapiak garatzeko.
Pirosekuentziazioak hori azkar eta modu egokian egitea
baimentzen du.

33. Onddoen identifikazioa:
v Onddo patogeno asko daude.
v Infektatutako gaixoei erauzten zaie DNA.
v Amplifikazioan hasle berezi batzuk erabiltzen dira.
(Onddoetan oso kontserbatuta dauden sekuentzia
batzuekiko osagarriak)
v 18-32 nukleotido nahikoa dira hainbat espezie
identifikatzeko (C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C.
parapsilosis,C.Tropicalis eta Aspergillus spp.)