Inpronta genetikoa

1. Inprontarekin
erlazionaturiko Angelman
sindromearen detekzioa
Iñaki Mujika, Julen Monje, Andoni Rodriguez eta Izaskun Martin

2. Aurkibidea
 Inpronta
 Gaixotasunak-Angelman sindromea
Detekzio teknikak:
MS-MLPA eta MLPA
MIKROSATELITEAK

3. INPRONTA
 Ugaztunetan gene gutxi.
 Kromosoma parental batean adierazi,
homologoan isildu.
 Multzotan (cluster-etan) (1Mbp)
ICR → erregulazioa

4.  ICRek CG metilazioak eratu.
 Gametogenesian → zatiketa zelularrean zabaldu → adierazpen genetiko ≠ eman
 DMR: metilatu daitezkeen DNA zatiak.
 Alelo bietan, bakarrean metilatuta.

5. GAIXOTASUNAK
• Silver-Russell eta Beckwith-Wiedemann (7q eta 11q)
• UPD(q14) eta Diabetes mellitus-aren (6q24) (disomia parentala)
• 10. kromosoman Turner eta Klinefelter Sindromeak
• Pseudohipoparatiroidismoa (20q12.32)
• Locus berberean emandako adierazpen desberdinek 2 gaixotasun mota eragin
ditzakete: Prader Willi eta Angelman sindromea (15q)

6. ASren SINTOMAK
 Atzerapena garapenean
 Hizkera zailtasunak
 Zoriontasuna erakusten duen portaera
 Hipermotrizitatea
 Arreta falta

7. ANGELMAN SINDROMEA
 15q11-13 eskualdea

9. AS-ren
susmoa
MS-MLPA eta MPLA
Delezioa: MLPA
15q11q13
delezioa
I
II
ICR delezioa
(inpronta akatsa)
Deleziorik ez eta AS-
ren metilazio patroia:
MIKROSATELITEEN
AZTERKETA
UNIPARENTALA:
Pat(15)UPD
BIPARENTALA:
inpronta
epeginetikoaren
akatsa
Deleziorik ez
eta metilazio
patroi normala:
UBE3A
SEKUENTZIAZIO
A
UBE3A-n
mutazioa
Normala: MLPA-
UBE3A
UBE3A-ren
exoi delezioa
Normala:
REEBALUAZIOA

10. MS-MLPA
 MLPAren antzekoa
 Teknika semikuantitatiboa. DNA kopurua aztertzeko erabiltzen da.
 DNA katearen metilazioarekiko espezifikoa.
 Metilaziorako sentikorrak diren errestrikzio entzimak erabili (HhaI).

11. DNA-REN ERAUZKETA

12.  DNAren erauzketa.
 DNA harizpia beroari esker
desnaturalizatu (95ºC 1min).
 T zundak itsasteko (60ºC 15h)
 Entzimak gehitu (metilazioari
sentikorrak eta ligasa)
 PCR (zundak anplifikatu)
 Elektroforesi kapilarra
 Elektroferogramaren azterketa

13. MS-MLPA zertarako?
 Gaixoak ez du amaren aleloa metilatua izango.
 Metilazioak intron zein exonetan.

14. Zundak zelan egin
 Hasleak:
 5´-GCTGCTACGTTATGGCATCG-3´ (Forward)
 5´-GCATGCGCATTAGCCACCTG-3´(Reverse)
 Zunden sintesia:
 5´-GCTGCTACGTTATGGCATCG-GGAGGGAGCTGGGACCCCTGCA-3´
 5´-CTGCGGCAAACAAGCACGCCTGCGCGGCCGC-STUFFER-
TAGGTGGCTAATGCGCATGC-3´

15. ZUNDAK HIBRIDATU
MLPA (ligasa)
Delezioak aztertzeko
Kontrola: : zundaren
anplifikazioa beti
ahalbidetuko duen sekuentzia
MS-MLPA (ligasa + HhaI)
Metilazioak aztertzeko
Kontrola: metilatuta egongo
ez den CGCG sekuentzia

16. (MS)-MLPA zertarako?
 Metilazioen galera.
 SNRPN genean (4 CpG isla)
 DNA delekzioak aztertzeko: 1. mailakoa, 2. mailakoa eta AS-SROrena.
 AS-SRO: ICRaren delezio gehienak solapatzen diren sekuentzia.
 SNRPN genetik 35kb-tako distantziara (urgora) dagoen.
 880 bp.

17. (MS)-MLPAan erabili beharreko kontrolak
 Emaitzak lortzeko kontrol bat baino gehiagorekin konparatu.
 Delezioak eta metilazio galerak.
 Kontrol motak:
 Positiboa: persona osasuntsua.
 negatiboa: zuria (DNA jarri beharrean bufferra).
 Barne kontrola: zundaren anplifikazioa beti ahalbidetuko duen sekuentzia, eta
metilatuta egongo ez den CGCG sekuentzia.
 Lagin guztiak ehun mota berdinetik hartu (adin berekoak).

18. Emaitzak
posibleak

19. Osasuntsua
1-NIPA
2-SNRPN
3-UBE3A
4-Barne kontrola
5-CGCG (metilaziorik ez)
6-SRO-AS
1 2 3 4 5 6
Ligasa
Ligasa + HhaI
Sekuentzia hauekiko
osagarriak diren zundak:

20. I motako delezioa
1-NIPA
2-SNRPN
3-UBE3A
4-Barne kontrola
5-CGCG (metilaziorik ez)
6-SRO-AS
1 2 3 4 5 6
Ligasa
Ligasa + HhaI
Sekuentzia hauekiko
osagarriak diren zundak:

21. II motako delezioa
1-NIPA
2-SNRPN
3-UBE3A
4-Barne kontrola
5-CGCG (metilaziorik ez)
6-SRO-AS
1 2 3 4 5 6
Ligasa
Ligasa + HhaI
Sekuentzia hauekiko
osagarriak diren zundak:

22. SRO-AS delezioa
1-NIPA
2-SNRPN
3-UBE3A
4-Barne kontrola
5-CGCG (metilaziorik ez)
6-SRO-AS
1 2 3 4 5 6
Ligasa + HhaI
Ligasa
Sekuentzia hauekiko
osagarriak diren zundak:

23. Metilazio aldaketa
1-NIPA
2-SNRPN
3-UBE3A
4-Barne kontrola
5-CGCG (metilaziorik ez)
6-SRO-AS
1 2 3 4 5 6
MLPA
MS-MLPA
Sekuentzia hauekiko
osagarriak diren zundak:

24. Metilazio aldaketa
1-NIPA
2-SNRPN
3-UBE3A
4-Barne kontrola
5-CGCG (metilaziorik ez)
6-SRO-AS
1 2 3 4 5 6
Ligasa
Ligasa + HhaI
Sekuentzia hauekiko
osagarriak diren zundak:

25. AS-ren
susmoa
MS-MLPA eta MPLA
Delezioa: MLPA
15q11q13
delezioa
I
II
ICR delezioa
(inpronta akatsa)
Deleziorik ez eta AS-
ren metilazio patroia:
MIKROSATELITEEN
AZTERKETA
UNIPARENTALA:
Pat(15)UPD
BIPARENTALA:
inpronta
epeginetikoaren
akatsa
Deleziorik ez
eta metilazio
patroi normala:
UBE3A
SEKUENTZIAZIO
A
UBE3A-n
mutazioa
Normala: MLPA-
UBE3A
UBE3A-ren
exoi delezioa
Normala:
REEBALUAZIOA

26. Disomia uniparentala
• 15. kromosoma bi aleloak aitarengandik (edo partzialki 15q11-13
eskualdean)
• Aitaren kromosoman geneak inaktibatuak
DISOMIA UNIPARENTALA (aita) OSASUNTSUA

27. HETERODISOMIA
 Erreskate trisomikoa
 2 kromosoma desberdin
 I. Meiosiko banaketa eza
ISODISOMIA
• Erreskate monosomikoa
• 2 kromosoma berdin
• II. Meiosiko banaketa eza

28. Mikrosateliteen identifikazioa
(D15S10,GABRB3,D15S128 etaD15S11)
KOKAPENA GENOMAN

29. 5'GCTGTGTGTAAGTGTGTTTTATATCCTGATAGTAAAAATATGGCC
ATGCAACACGTGGGCTACAGGCTAATAAAAACAATATTCACACACCC
AGACATACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGCCC
CAGATTCCTTCCTGGAAAATCCTTCGTTCTCATCAGCCTCTGCT
CTCTCCACTGGCTTGC3'
• HASLEAK
• Forward: 5' GCTGTGTGTAAGTGTGTTTTATATC 3'
• Reverse: 5' GCAAGCCAGTGGAGAG 3‘
• Reverse-aren osagarria.
*Forwarda markatuko dugu fluoreszenteki
Hasle fluoreszenteen diseinua
D15S128

30. UNIPLEX PCRa
• Mikrosatelite bakoitza bere
aldetik anplifikatuko dugu.
• Aitaren, amaren eta
pazientearen laginekin egingo
da hau
• Zuri bat ere egingo da, DNA
ezik beste guztia izango du

31. • Elektroferograma – kualitatiboa: zeinen mikrosatelitea dago pazientean?
Elektroforesi kapilarra – emaitzak interpretatu
OSASUNTSUA

32. ISODISOMIA paternala – ANGELMAN sindromea HETERODISOMIA maternala– PRADER WILLI