Qmpsf

1. «BULARREKO MINBIZIAREN
AZTERKETA QMPSF BIDEZ»
Andrea Abaurrea
Eneritz Aizkibel
Aitor Bermejo
Maider Fernandez
Lorena Oyarbide

2. AURKIBIDEA
1) Sarrera
 Zer da bularreko minbizia.
 Zein genek eragiten duen
 BRCA1 eta BRCA2 ren
ezberdintasunak.
 Zergatik QMPSF.
2) Metodoak
3) Emaitzak

3. SARRERA
Zer da bularreko minbizia?
 MINBIZIA: izaera gaiztoa duen eritasuna da (tumorea).
 Kokapena eta izena.
Bularreko
zelula
epitelialak
kontrolik
gabe zatitu
BULARREKO
MINBIZIA
Zelulen
proliferazioa
Bularreko hodiak ixten joan.
KONTROLIK EZ: Anomalia ahula Anomalia larria Metastasia.

4. SARRERA
Zein genek eragiten du?
Minbizi
gehienen
agerpena
EZEZAGUNA
%5-%10
mutazio
genikoek
eraginda
TP53, PTEN,
ATM, BRCAI,
BRC2 …
KASUAN HONETAN BRC1 AZTERTUKO DA
ZERGATIK?
Mutazio genetikoek eragindako bularreko
minbizien %35 BCRA1 eta BCRA2 deituriko
geneetan gertatuko mutazioek azaltzen dute
Bularreko minbizia
BRCA1
eta
BRCA2

5. SARRERA
BRCA1 eta BRCA2:
 DNAren konponketa mekanismoa.
 Gorputzeko atal guztietan.
 Bereziki bular (edo obarioen) minbiziaren garapenean inplikatuta.
Zergatik BRCA1, eta ez BRCA2?
BRCA1 eta
BRCA2
mutatuak
DNAren
konponketan
arazoak
Akatsen
metaketa
Minbizia

6. SARRERA
Kasu honetan BRCA1 aztertuko da:
 Fenotipo karakateristikoa.
 Tumore gradua altua (oso inbasiboa).
 Hartzaile negatiboak.
 17.kromosoman dago, eta 81.189 bp (24 exoi).
BRCA1 BRCA2
17q21 kokatuta eta 1863 aa 13q12-q13 kokatuta eta 3418 aa
Triplete negatiboak (ER, PR, HER2) Estrogeno positiboak
Tratamendu hormonalari ez erantzun Tratamendu hormonalari bai erantzun

7. SARRERA
QMPSF metodoa erabiliko da:
GURE HELBURUA: BRCA1 genearen alelo galerak edo duplikazioak
sortaraten duen bularreko minbizia aztertzeko protokolo bat diseintazea.
QMPSF metodo erabiliko da
DUPLIKAZIOA DELEZIOA
2 GAUZA AZTERTUKO
DIRA:

8. SARRERA
Ez da beti sortuko bularreko minbizia:
 Minbizia pairatzeko bi aleloak mutatuak egon behar dira.
 Lerro germinala (guraso herentzia).
 Bizitzan zehar.
Heredagarritasuna:
 Minbizi zelulen bidez ezin da jakin ea heredagarria den edo ez. Odoleko
zelulak erabiliko dira.
Kasua:
 Jakitea ea 20 urteko neska batek BRCA1 mutatua duen edo ez (jakinik,
amak eta izebak bularreko minbizia dutela).

9. METODOAK
DNAren erauzketa
GRADIENTE ERAUZKETA TANPOIA K PROTEIN KINASA
ZENTRIFUGAZIOA - Tris·Cl, pH=8
- SDS (%1)
- EDTA (10 mM)
- RNAsak
Desproteinizazi
oa
Zelulen
isolamendua
Lisi
zelularra

10. Fenol  Polarra % 95 Etanola % 70 Etanola
Kloroformo  Apolarra
Prezipitazioa Garbiketa
Erauzketa
organikoa
METODOAK

11.  DNA PURUTASUNA?
Espektrofotometroa: R = R =
Abs 260
Abs 230
Abs 260
Abs 280
METODOAK

12. METODOAK
QMPSF teknika
Q  Kuantitatiboa
M  Multiplex izaera
P  PCR
S  Sekuentzia laburrak
F  Fluoreszentzia
BRCA1 24 Exoi
4 multiplex
PCR
Bakoitzean
5-9 exoi
9
Putzu

13. METODOAK
Hasleen diseinua
• Hasle espezifikoak
• Dimerorik ez sortu
• Fluoreszenteki markatuak
• Hasle kimerikoak  16bp sekuentzia gehitu  Tm berdintzeko
 Kontzentrazio antzekoak gehitzeko
FORWARD HASLEA REVERSE HASLEA
5'- ..........
ACCGTTAGTAGTCGAC-3'
5'- ..........
TCGGATAGCTAGTCGT-3'

14. METODOAK
Hasleen diseinua
BRCA1 genean sekuentzia polimorfikoak (SNP)
Hasleak ezin dira osagarriak izan
Bestela agian ez dira hibridatuko

15. METODOAK
BRCA1 genearen SNP-ak

16. METODOAK
SNP pilo bat
Batzuen informaziorik ez (frekuentziarik ez)
Beste esperimentu bateko hasleak
Introietan kokatuta

17. METODOAK
2. exoiaren adibidea:
Introia Exoia Fordward
haslea
Reverse
haslea

18. METODOAK
PCR ezaugarriak
• Osagaiak:
 DNA itua 1 µg
 Hasle parea: 5 - 50 pmol (0.1 µM / 50 µL).
 Polimerasa termoegonkorra (Taq polimerasa): 1.25 U/ 50 µL
 dNTP: Kontzentrazio ekimolekularrean, 0.2 mM/ 50 µL
 Tanpoia:
 10 mM TRIS-Cl
 50 mM KCl
 % 0.01 Gelatina
 % 0.1 Triton x-100
 1.5 - 3 mM MgCl2
 Gehigarriak

19. METODOAK
Kontrolak
Gene
kontrola
Pertsona
kontrola
PCR ezaugarriak

20. METODOAK
EX
OIA
FORWARD
HASLEA
REVERSE
HASLEA
KONTZENT
RAZIOAK
(µM)
ANPL
IKOI
TAM
AINA
1 AGAATTCTTCCT
CTTCCGTC
TCGGAAATCCA
CTCTCCCAC
0.3 434
2 GGACGTTGTCA
TTAGTTCTTTGG
ACATGTCTTTT
CTTCCCTAGTA
TG
0.16 375
4 AAGAAAGAAAG
AAATATTAAATA
TC
CTAGCATCATT
ACCAAATTATA
TAC
0.32 160
11 TGATTTGAACAC
CACTGAGA
RCCGCCTATCA
TTACATGTTT
0.48 297
Kon
trol
a
(C1
NH-
exo
n3)
GAAACTCAGTTT
CTTGAACCAC
TTGGGAGCTG
GGTAGTTG
0.4 336
EXOIA FORWARD
HASLEA
REVERSE
HASLEA
KONTZENT
RAZIOA
(µM)
ANPLIKOI
TAMAINA
3 ATTCTCTG
CTGTATTC
TCAGTTCC
T
ACTTACTT
GCAAAATA
TGTGGTCA
1.5 276
6 CACTGCCA
TCACACGG
TTTAT
ATGTGCAC
CTTACGAT
TGAT
0.6 484
10 TGGTCAGC
TTTCTGTAA
TCG
AGATTTTG
TGGGTTGT
AAAGG
0.2 331
17 TTCCAGGA
CACGTGTA
GAACG
TTATGCAG
CAGATGCA
AGGT
0.5 291
22 TTAAAATC
CATACCCC
TACTA
GGGGCATC
CATAGGGA
C
0.3 365
24 GACCCTGG
AGTCGATT
GAT
GGGACCCT
TGCATAGC
C
0.45 404
KONTROLA
(C1HN-EXOI
7)
TTGCCCAT
ATTACATA
GCTCG
AATACTCT
AGAGAATG
CTAACTA
0.6 614

21. METODOAK
EXOI
A
FORWARD
HASLEA
REVERSE
HASLEA
KONTZE
NTRAZIO
A (µM)
ANPLI
KOI
TAMA
INA
5 CAGCATCCAAA
AACAATTAGG
GAATGGTTTTAT
AGGAACGCTA
0.4 375
9 ATTGTACCTGC
CACAGTAGAT
GAAAATACCAG
CTTCATAGACA
0.24 250
12 TTCACACAGCT
AGGACGT
GAATGTGGGAT
ACATACTAC
0.64 431
13 GCAGGAAATGG
CTGAACTA
GTGCTGAGCAA
GGATCATA
0.3 279
15 ACTTCTAGGCT
GTCTTGCG
CAAAAGTGTCC
ATGATAGACTA
G
1.2 488
16 TAATTCAACATT
CATCGTTGT
AAATTTTCAGAA
ATTAGTAATCG
0.6 552
19 TGCTCTTTTGT
GAATCGCTG
TGGTCTTGAAC
TCCCGACAT
0.6 394
20 CCTGAATGCCT
TAAATATGACG
AACCTGTGTGA
AAGTATCTAGC
0.4 346
KONT
ROLA
(C1N
H-
EXON
7)
TTGCCCATATT
ACATAGCTCG
AATACTCTAGA
GAATGCTAACT
A
0.4 614
EXOI
A
FORWARD
HASLEA
REVERSE
HASLEA
KONTZE
NTRAZIO
A (µM)
ANPL
IKOI
TAMA
INA
7 CTAACTGCAAAC
ATAATGTTTTCC
AGCCCATACTT
TGGATGATAGA
0.16 157
8 ACAAAGCAGCGG
ATACAACC
TAACTCACCAT
AGGGCTCATAA
A
0.16 222
14 AACCAATTTGTG
TATCATAGATTG
A
TTACCTTTCCA
CTCCTGGTTCT
0.16 277
18 TCAACTTCTAATC
CTTTGAGTGTTT
GTAAAAATGCA
ATTCTGAGGTG
T
0.16 205
21 CAACATGCCCAC
AGGTAAGA
GAGAAGGGGG
ACAAGGTATAG
T
0.16 249
23 CAATTGTGGTTG
TGCAGCC
CACCCCATGGA
AACAGTTCA
0.16 285
KONT
ROLA
(MLH
1-
EXON
14)
ATTTTTTGTTTTG
CAGTTCTCC
GTAGTAGCTCT
GCTTGTTCACA
CA
0.16 185

22. EMAITZAK
Duplikazioa 3-8 exoietan
2. multiplex 3. multiplex
4. multiplex
1. multiplex
Gorria: aztertzen ari garen lagina
Urdina: pertsona kontrola

23. EMAITZAK
Delezioak heterozigositatean, 23 eta 24 exoietan izan ezik
2. multiplex1. multiplex
3. multiplex
4. multiplex
1 exoia  2 exoia

24. EMAITZAK
Delezioa 15-16 exoietan
3. multiplex