Brca1

1. BRCA1 ALELO GALEREN
AZTERKETA: QMPSF
Olatz Niembro
Jone Isasti
Ainhoa Perez
Arantza Muguruza

2. BRCA1 GENEA
• Kokapena 17q21.31
• ≈100Kb
• 29 transkritu (24 exoi)

3. BRCA1 GENEA
• BRCA1 proteina kodetu (220KD)
• Fosfoproteina nuklearra da.
• Amino muturreko RING motako domeinu proteikoa
dauka (ZINK Behatzak)E3 ubikitina-proteina
ligasaren aktibitatea.
INTERAKZIOA POLIUBIKITINAZIOA

5. BRCA1 GENEA
• Poliubikitinazioei esker
BRCA1 hainbat gauza
kontrola ditzake. Adb.:
– G2Mitosira
– HRR
– Zentromeroan
mirkotubuluen nukleazioa
(mikrotubuluen de novo
formazioa) gertatzen
laguntzen du.

6. BRCA1 GENA
• Karboxilo muturrean transkripzioaren koaktibazioan
parte hartzen duten domeinuak daude.
• Lotura hauek eman ahal:
• BRCA1 - RNApol II
• BRCA1 - A Helikasa
• DNAren erregulazioa (BRCA1RAD51 erregulatu)

7. BRCA1 GENA
• P53-rekin interakzioa:
P53:
• Minbiziaren beste
markatzailea.
• Mutazio batean aurrean
ziklo zelularra gelditzea
eragingo du.
BRCA1 + P53
P53-ren transkripzioaren
aktibitatea handitu
egingo du.

8. MUTAZIOA

9. BRCA1:MUTAZIO MEKANISMOAK
● Errekonbinazio homologoa
Alu sekuentzien artean.
● DELEZIO eta BIKOIZKETAK
● Alu sekuentziak
transposoigarriak direnez.
● TXERTAKETAK
Gehienak Alu sekuentziek (primateen SINE) eragindakoak.
●Erretrotransposoia
●300bp
●Oso ugariak (% 41.5)

11. MINBIZIAREN HERENTZIA
• BRCA1-en mutazioak bularreko zein obarioko
minbizia sorrarazi.
• Gehienak ez heredatuMutazioak zelula
somatikoetan.
• %5-10 heredatuMutazioak zelula germinaletan
• Mutazioa izanda transmititzeko %50ko
probabilitatea
• Adierazpen errezesiboa dauka, kopia homologoa
galtzean azaleratu (normalean 45 urtetik gora)
• Batez ere emakumeei eragin.

12. MINBIZIAREN HERENTZIA
Arrisku baxuko familiak:
• Ez dago Br minbizi kasurik.
• Egotekotan, kasu isolatua.
Arrisku ertaineko
familiak:
• Br kasuak daude.
• Br minbizien arteko
harremanak ezin dira
frogatu.

13. Arrisku altuko familiak
• Br kasu ugari.
• Herentzia autosomiko gainartzaile.
• Ebidentziak. Minbizi kasu goiztiarrak, gizonezkoak...
MINBIZIAREN HERENTZIA

14. NOIZ ERABILI DIAGNOSTIKO
MOLEKULARRA?
1. Pazientearen familia minbizia garatzeko arrisku
handikoa denean.
2. Diagnostiko molekularra zuzen interpretatu ahal
izango denean.
3. Diagnostikoaren emaitzak pazientearen edo
minbizia heredatzeko arriskuan dauden
ondorengoen maneiu mediko zein kirurgikoan
eragin dezakenean.
American Society of Clinical Oncology

15. MQPSF
• Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent
Fragments.
• Alelo galerak / bikoizketak aztertzeko.
• Heterozigoto edo homozigoto.
• Erlatiboki laburrak diren anplikoi fluoreszenteen
behaketaren eta konparaketaren bidez.
• Mikrotxertaketak eta mikrodelezioak ere behatu daitezke.

16. • BRCA1 berrantolaketak aztertzeko aurrekariak :
• Southern blotting
• DNA gehiegi xahutu
• Batzutan emaitza ambiguoak
• Northern blotting
• Errutinazko prozesu bihurtzeko, zaila
MQPSF

17. • Errutinazko prozeduretarako metodo azkarra eta
merkea.
• Espezifikotasun altuko diagnosi metodoa.
• Behaketa erraza: fluoreszentzia pikoen
konparaketa.
• x1.5 aldiz handiago  Txertaketa heterozigoto
• X0.5 aldiz txikiago  Delezio heterozigotoa.
– Exoiak banaka aztertu.
MQPSF

18. • DNA kantitate ezberdinak behatzeko PCRa ezin
da Plateau efektura heldu  fase
exponentzialean gelditu.
MQPSF

19. DNA ERAUZKETA
• Linfozitoetatik lortuko dugu DNA genomikoa.
• SDSrekin lisatu.
• Gatz-etanol bidezko protokoloa.

20. 675µl erauzketa tanpoi (30mM Tris-HCl, 10mM EDTA, %1 SDS; pH 8, giro T)
Proteinasa K 10 µl, -20ºC
Berotu O/N, 55ºC
225 µl 5M NaCl
5 min
13000rpm
16ºC
Gainjalkin 450µl
2*Vol (900µl) %100 etanol
30 min
13000rpm
16ºC
-80ºC inkubatu
Etanola kendu
1ml etanol %70
Lehortu, 1h, 37ºC
100 µl MiliQ

21. • DNA laginak kuantifikatu  Espektrofotometro
• Purutasun ratioak: 1.8-2.2
100ng/µl lortzeko.

22. HASLEEN DISEINUA
Name Sekuentziaa
Izena Sekuentziaa
Kontzentrazioab
Tamainac
(5’>3’) (5’>3’) (μM) (bp)
1a 1a F AGAATTCTTCCTCTTCCGTC *1a R TCGGAAATCCACTCTCCCAC 0.3 434
11 *11a F TGATTTGAACACCACTGAGA *11a R CCGCCTATCATTACATGTTT 0.48 297
C1NH-exon3 C1 F GAAACTCAGTTTCTTGAACCAC C1 R TTGGGAGCTGGGTAGTTG 0.4 336
2 2 F GGACGTTGTCATTAGTTCTTTGG 2 R ACATGTCTTTTCTTCCCTAGTATG 0.16 375
3 3 F ATTCTCTGCTGTATTCTCAGTTCCT *3 R ACTTACTTGCAAAATATGTGGTCA 0.15 276
6 6 F CACTGCCATCACACGGTTTAT 6 R ATGTGCACCTTACGATTGAT 0.6 484
10 10 F TGGTCAGCTTTCTGTAATCG 10 R AGATTTTGTGGGTTGTAAAGG 0.2 331
17 17 F TTCCAGGACACGTGTAGAACG 17 R TTATGCAGCAGATGCAAGGT 0.5 291
22 22 F TTAAAATCCATACCCCTACTA 22 R GGGGCATCCATAGGGAC 0.3 365
24 24 F GACCCTGGAGTCGATTGAT 24 R GGGACCCTTGCATAGCC 0.45 404
C1NH-exon7 C2 F TTGCCCATATTACATAGCTCG C2 R AATACTCTAGAGAATGCTAACTA 0.6 614
5 5 F CAGCATCCAAAAACAATTAGG 5 R GAATGGTTTTATAGGAACGCTA 0.4 375
1. TAULA. QMPSF-rako hasleak.
d
Multiplex 1
Multiplex 2
Multiplex 3
Exoia

23. C1NH-exon7 C2 F TTGCCCATATTACATAGCTCG C2 R AATACTCTAGAGAATGCTAACTA 0.6 614
5 5 F CAGCATCCAAAAACAATTAGG 5 R GAATGGTTTTATAGGAACGCTA 0.4 375
9 9 F ATTGTACCTGCCACAGTAGAT 9 R GAAAATACCAGCTTCATAGACA 0.24 250
11 *11a F TGATTTGAACACCACTGAGA *11a R CCGCCTATCATTACATGTTT 0.48 297
12 12 F TTCACACAGCTAGGACGT 12 R GAATGTGGGATACATACTAC 0.64 431
13 *13 F GCAGGAAATGGCTGAACTA 13 R GTGCTGAGCAAGGATCATA 0.3 279
15 15 F ACTTCTAGGCTGTCTTGCG 15 R CAAAAGTGTCCATGATAGACTAG 1.2 488
16 16 F TAATTCAACATTCATCGTTGT 16 R AAATTTTCAGAAATTAGTAATCG 0.6 552
19 19 F TGCTCTTTTGTGAATCGCTG 19 R TGGTCTTGAACTCCCGACAT 0.6 394
20 20 F CCTGAATGCCTTAAATATGACG 20 R AACCTGTGTGAAAGTATCTAGC 0.4 346
C1NH-exon7 C2 F TTGCCCATATTACATAGCTCG C2 R AATACTCTAGAGAATGCTAACTA 0.4 614
7 7 F CTAACTGCAAACATAATGTTTTCC *7 R AGCCCATACTTTGGATGATAGA 0.16 157
8 *8 F ACAAAGCAGCGGATACAACC 8 R TAACTCACCATAGGGCTCATAAA 0.16 222
11 *11b F ACAGTCGGGAAACAAGCATAG *11b R TGACCAACCACAGGAAAGC 0.16 318
14 14 F AACCAATTTGTGTATCATAGATTGA *14 R TTACCTTTCCACTCCTGGTTCT 0.16 277
18 18 F TCAACTTCTAATCCTTTGAGTGTTT 18 R GTAAAAATGCAATTCTGAGGTGT 0.16 205
21 *21 F CAACATGCCCACAGGTAAGA 21 R GAGAAGGGGGACAAGGTATAGT 0.16 249
23 *23 F CAATTGTGGTTGTGCAGCC 23 R CACCCCATGGAAACAGTTCA 0.16 285
MLH1-exon14 C3 F ATTTTTTGTTTTGCAGTTCTCC C3 R GTAGTAGCTCTGCTTGTTCACACA 0.16 195
b
Forward eta reverse hasleentzat kontzentrazio ekimolarra da.
c
Tamainaren barnea hexadekameroarena sartuta dago.
d
Multiplex honetan, 1a eta 2 exoiak alternoki erabiltzen dira (Arrazoia jakiteko Materialak eta Metodoak ikusi)
*Hasle exonikoak.
Multiplex 3
Multiplex 4
a
Sekuentzia hexadekameroak gehitu dira 5' muturrean: 5'-ACCGTTAGTAGTCGAC-3' (Forwrd haslea); 5'-TCGGATAGCTAGTCGT-3' (Reverse

24. HASLEEN DISEINUA
• Hasle kimerikoak:
• 5' muturrean sekuentzia gehigarria.
• RNA-DNA hasleak.
• Tm homogeneizatzeko
• Forward primer: 5'-ACCGTTAGTAGTCGAC-3‘
• Reverse primer: 5'-TCGGATAGCTAGTCGT-3‘
• Forward primer 5' muturra + 6-FAM fluorokromoa

25. PCR OSAGIAK
• Hasleak (μM) (Hasleen taulan)
• 100-150ng purifikatuatko DNA sekuentzia
• 0.2 mM dNTP
• 4mM MgCl2
• 1.5 unitate Thermoprime plus Taq DNA
polymerasa
• 7.5% DMSO*
*DMSO sekuentzia GC nukleotidoetan oso ugaria denean erabiltzen da.
Hidrogeno zubien formazioa ekiditzen du.

28. PCR BALDINTZAK

29. GEL ELEKTROFORESIA
• ABI PRISM 377 DNA Sequencer + GeneScan
• %4,25 poliakrilamida gela

30. 10-20 min ostean helduko dira “read region”-era lehen DNA zatiak.

31. EMAITZAK
• C  estandarizatzeko.
• Duplikazio: x1.5
• Delezio: x0.5

33. AMAIERA