Aleloen bereizketa

1. ALELOEN BEREIZKETA
Anabel Rico
Ane Olabarrieta
Peio Rodriguez

2. AURKIBIDEA
• Zer da?
- SNPak
- Oinarria
• Oinarrizko printzipioak
• Oinarrizko emaitzak
• Prozedura:
- Hasle eta zunden diseinua
- DNAren erauzketa
- Erreakzio plakak prestatu
- Amplifikazioa
- Neurketak
•Emaitzak
• Analizatzeko beste modu bat

3. ZER DA?
• Q-PCR-aren aplikazioa. ADAPTAZIOA
•AD = “Allelic discrimination”
• Aleloetako polimorfismoak detektatzeko  SNPak
o Genotipoak bereizi
o Mutazioak detektatu
Pertsona desberdinenak
bereizi

4. ZER DA?
• Oinarria: PCR fluoreszentea multiplexa  alelo
espezifikoetarako (2 zunda ≠ ). Itu DNA-ren anplifikazioarekin
batera fluoreszentzia agertu  Bi kolore agertu.
Segun ze alelo (AA, BB edo AB) = seinale ≠
•Kualitatiboa!  sekuentzien kantitatea ezin da neurtu.

5. ZER DA?: SNPak
• Single Nucleotide Polymorphism.
• Gutxienez populazioaren %1
pertsonetan agertzen den base jakin
bateko bariazioa.
• Giza genomaren bariazioen %90-a.
• Geneen alde kodetzailean, alde ez
kodetzailean edo alde intergenikoetan.

6. ZER DA?: OINARRIA
Q-PCRaren antzekoa baina…
• Bi zunda espezifiko (gune = ezagutuko dutenak). SNP-arekin.
• A aleloa ezagutuko duena (basatia)  markadore bat
(VIC)
• B aleloa ezagutuko duena (mutatua)  markadore
desberdina (FAM)

7. ZER DA?: OINARRIA
Q-PCRaren antzekoa baina… Neurketak egitean…
• q-PCRan DNA kantitateak jakin nahi  datuak fase
esponentzialean hartu behar  ziklo bakoitzean!!
•Aleloen bereizketan  kualifikazioa  datuak anplifilazioaren
amaieran.
Q-PCR
AD

8. OINARRIZKO PRINTZIPIOAK
Q-PCR-an oinarritzen da  Polimerasaren exonukleasa
aktibitatean oinarrituta. HIDROLISIAN OINARRITUTA
BAINA KASU HONETAN … Bi zunda desberdin daudenez …
1 zunda (Mutatua) %100 espezifikoa
2.zunda (Basatia) %100 espezifikoa
Oinarria:
Base baten aldaketa = zundaren egonkortasuna = Tm
Segun zein genotipo daukan SNP horretarako 
zunda bat itsatsi edo bestea

9. OINARRIZKO PRINTZIPIOAK
PCRa egiterakoan  Pegatu den zunda hidrolizatuko du 
fluoreszentzia igorri.
Markadorea eta Quencher-a banatu.
Ze fluoreszentzia mota neurtu dugu?  GENOTIPATU
2.Zundak igorritakoa  Bi aleloak basatiak  mutaziorik ez
1.Zundak igorritakoa  Bi aleloak mutatuak

10. OINARRIZKO PRINTZIPIOAK
1.Zundaren eta 2.zundaren koloreak ikusten badira… 
HETEROZIGOTOA!
Bi zundak pegatu
dira  biak
quencher-etik
banatu

11. NTC= no template control
OINARRIZKO EMAITZAK
• Lortutako xurgapenekin … grafiko hau egin
HAINBAT PERTSONEN ANALISIAK KONPARATU
Puntu bakoitza lagin bateri dagokio
2.zunda
1.zunda

12. PROZEDURA: Fluoreszentzian oinarritu
Fluoreszentziaren neurketa 3 puntutan egin daiteke:
• Anplifikazioaren aurretik: Zunden fluoroforoak quencher-arekin
batera egonda igortzen duten fluoreszentzia neurtu.
• Anplifikazioa egiten: Real-Time PCR-an lortzen diren datuak,
nolabaiteko kuantifikazioa egiteko.
• Anplifikazioa amaitu eta gero: Fluoreszentzia finala neurtzen da.
Datu hauek anplifikazio aurreko neurketaren datuekin konparatu.

13. PROZEDURA
DNA erauzi denetik PCRaren amaiera arte
Hasleen eta
zunden diseinua
DNA erauzi eta
purifikatu
Erreakzio plakak
prestatu
Anplifikazioa
egin
Anplifikazio
osteko neurketa
Anplifikazio
aurretiko neurketa

14. PROZEDURA: Hasle eta zunden diseinua
Hasleak Vs zunda espezifikoak
Hasleak Zunda espezifikoak
GC kopurua %30-80 artean egon behar da
3 G kontsekutibo baino gehiago ezin dira egon
Tm 58-60ºC artekoa Tm 65-67ºC artekoa
F era R hasleak ahalik eta gertuen
jarriko dira, beti zunda gainjarri
gabe
5’ muturrean G-rik ez
3’ muturreko azkeneko 5
nukleotidoetatik 1 edo 2 baino ez
dira G-C-k izango
Diseinuan C gehiago G baino

15. PROZEDURA: Hasle eta zunden diseinua
Hasleak (diseinurako softwareak daude)
Reverse eta forward-a SNP-a inguratzen jarri.
Zunda espezifikoak
Sistema bialelikoari jarraituz  SNP-a barnean
5’ muturrean  Bi fluoroforo desberdinez markatuta
3’ muturrean  Quecherra
Tetrametilrodamina.

16. Alelo bakoitzarentzako zunda
espezifikoa fluoroforo
desberdinak eramango ditu.
FAM, TET, VIC,…
Ondoan dagoen quencherra
igorritako fluoreszentzia
murriztuko du.
Quencherrak zunda blokeatu
 hasle bezala ez
funtzionatzeko
PROZEDURA: Hasle eta zunden diseinua

17. PROZEDURA: DNAren erauzketa eta
purifikazioa
Modu asko existitzen dira
Nondik?  Odola, beste edozein ehun, zelula lerroak, landareen
ehunak, …
Normalean pertsonengan egin  ODOLA
1. Zelulak lisatu  proteasak, txoke osmotikoa, …
2. DNA purifikatu behar
KONTUAN HARTU BEHARREKOAK!
• PCR-aren inhibitzailerik ez.
• DNA-ren A260/280 ratioa 1.7 baino handiagoa izan behar.
• DNA 60ºC-tik gora ez berotzea  degradatua ez izateko

18. PROZEDURA: Erreakzio plakak prestatu
Anplifikazioa egin aurretik …
• Hainbat pertsonen analisia egin  baldintza berdinetan
egin behar!
• 96 putzuetako plakan egingo da.
o NTC-ak (No tenplate Controls)  Kontrol (-)
o DNA genomiko ezagunak  Kontrol (+)
o DNA genomiko ezezaguna
• Putzu bakoitzera bota:
o DNA itua (K. (-)an izan ezik)
o MIX-nahastea (denentzako berdina)

19. PROZEDURA: Erreakzio plakak prestatu
• MIX-aren prestaketarako osagaiak
• MIX-erako gehigarria  Bi
zunda bereziak
•DNA frakzioa ez da MIX-era
botako  plaketako putzuetara
botako da.
• Erreakziorako bolumena: 25µl
+ Zunda espezifikoak!!

20. PROZEDURA: Erreakzio plakak prestatu
• Guk erabaki gauzak non sartu.
• Putzu bakoitzean zer dagoen kontrolatu  Ordenagailuan
neurketak egiterakoan. PLAKARAKO DOKUMENTUA.

21. PROZEDURA: Anplifikazio aurretiko
neurketa
• Nahiz eta fluoroforoak quencherrarekin egon  Fluoreszentzia
igorri.
• Putzu bakoitzaren fluoreszentzia neurtu.
• Anplifikazio osteko neurketei hemen lortutako balioak kendu.
Fluoreszentzia totala = Hasierako fluoreszentzia – Amaierako fluoreszentzia
•Hau egitean plaka hotzetan
mantendu. Erreakzioa ez hasteko
•Datu hauek ordenagailuan sartuta
mantendu.

22. PROZEDURA: Software-a prestatu
•Analisia nahi dugun bezala egiteko konfigururatu.
•Termozikladorea programa detektore honi lotuta.
1. Aleloen bereizketa
teknika aukeratu.
2. Fluoroforoak
aukeratu.
3. Neurketak amaieran.

23. DNA itua 94-95ºC-tara
berotu (desnaturalizazioa)
PROZEDURA: Anplifikazioa
Plaka termozikladre-software-an sartuko da …

24. Tenperatura 72ºC-tara igo
(luzapena)  zundak hidrolizatu
PROZEDURA: Anplifikazioa
Tenperatura 50-65ºC-tara jaitsi
(Hasle eta zunden parekaketa)

25. PROZEDURA: Anplifikazio osteko neurketa
• Anplifikazioa amaitzean, erreakzio
plakan agertutako fluoreszentzia
aztertu  Datu gordinak lortu.
• Datuak software-arekin analizatu:
• Zunda espezifiko bakoitzaren
presentzia neurtu
(fluoreszentzia desberdina).
• Zunda bakoitza alelo jakin
batekin erlazionatu.
• Lagin bakoitzean dagoen
genotipoa ondorioztatu.

26. EMAITZEN ANALISIA
Software-ak datuen analisia egingo dizu  honelako emaitzak
eman

27. EMAITZEN ANALISIA

28. EMAITZEN ANALISIA
• Datuen analisia egin ondoren, grafiko bat egin.
• X ardatzean, alelo jakin batekin erlazionaturiko
fluoreszentziaren intentsitatea. Y ardatzean, beste aleloarekin
erlazionatuta dagoena.
• Grafikoan: puntu bakoitzaLagin bat.
• Igorritako fluoreszentziaren arabera Leku ezberdina grafikan.
• Puntuen pilaketa (Cluster-ak)  Genotipoa ondorioztatu.

29. ANALIZATZEKO BESTE MODU BAT
MELTING CURVE  Fluoreszentzia neurtu tenperaturaren menpe
• Disoziazio puntua neurtzean SNP-ak
detektatu. Merkea eta azkarra.
• PCR anplifikazioaren ostean.
• Zunda bat erabiliz  bi markaketa
desberdinekin  Biak pegatuko dira!
• PCR a amaitzean  zundak hibridatzen
utzi eta tenperatura gradualki
• Askatzean fluoroforoak eta quencher-ak
gertuago  F

30. ANALIZATZEKO BESTE MODU BAT
OINARRIA:
• DNA-ren egonkortasunean oinarritu.
• Tm-ak (DNAren egonkortasuna adierazi) menpekotasunak
 GC kopurua eta bi kateen osagarritasuna.
• DNA itua/zunda guztiz osagarriak ez badira T desegonkortu
• DNA itua / zunda guztiz osagarriak T aguantatu.