Nghiên cứu tác dụng giảm đau và bảo vệ gan của các cao chiết từ lá cây Trứng cá (Muntingia calabura L.).pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
NGUYỄN VIỆT QUANG
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢM ĐAU VÀ BẢO VỆ
GAN CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY TRỨNG CÁ
(MUNTINGIA CALABURA L.)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CẦN THƠ, 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
NGUYỄN VIỆT QUANG
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢM ĐAU VÀ BẢO VỆ
GAN CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY TRỨNG CÁ
(MUNTINGIA CALABURA L.)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
Chuyên ngành: Dược Lý – Dược Lâm sàng
Mã số: 8720205
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG
CẦN THƠ, 2021

i
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại Trung tâm Sâm và Dược liệu
Thành phố Hồ Chí Minh tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ, hỗ trợ từ gia
đình, quý Thầy Cô, anh chị và bạn bè. Tôi vô cùng biết ơn mọi người đã dành tất cả
tình yêu thương và tình cảm ấy đã góp phần tạo động lực để tôi có thể vượt qua quãng
đường dài học tập đầy những khó khăn thử thách.
Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới cô PGS.TS
Nguyễn Thị Thu Hương đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi
giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, Khoa Dược, Khoa Sau
đại học, cùng các thầy cô trường Đại học Tây Đô đã giảng dạy và trang bị cho tôi
những kiến thức cơ bản, đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá
trình học tập.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể anh chị em phòng thí nghiệm
tại Trung tâm Sâm và Dược Liệu đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho tôi
hoàn thành đề tài này.
Lời cuối cùng, tôi xin kính chúc quý thầy cô trường Đại học Tây Đô thật dồi dào
sức khỏe, niềm tin để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến
thức cho thế hệ mai sau, cùng các Cô, Chú, Anh, Chị tại Trung tâm Sâm và Dược Liệu
luôn vui vẻ, mạnh khỏe và thành công trong công việc và cuộc sống.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Cần Thơ, ngày tháng năm 2021
Người cam đoan
Nguyễn Việt Quang

ii
TÓM TẮT
Cây Trứng cá (cây mật sâm, tên khoa học Muntingia calabura L.,
Muntingiaceae) là loài cây này khá quen thuộc với người dân vùng đồng bằng sông
Cửu Long. Lá Trứng cá được sử dụng trong y học dân gian giúp hỗ trợ điều trị viêm,
giảm đau, ngăn ngừa nhồi máu cơ tim. Nghiên cứu này nhằm đánh giá tác dụng tác
dụng giảm đau và bảo vệ gan của các cao chiết nước và cao chiết cồn 45% từ lá Trứng
cá bằng các thực nghiệm gây đau (gây đau xoắn bụng bằng acid acetic, gây đau bàn
chân chuột bằng formalin) và thực nghiệm gây tổn thương gan mạn bằng paracetamol
trên chuột nhắt trắng đực chủng (Swiss albino). Kết quả định tính, định lượng cho thấy
các cao chiết từ lá Trứng cá có hàm lượng flavonoid toàn phần là 21,87 mg quercetin/g
cao chiết cồn và 18,48 mg quercetin/g cao chiết nước. Các cao chiết được uống ở các
liều lượng tương đương 2,5 g và 5 g nguyên liệu khô/kg trọng lượng cơ thể chuột theo
phác đồ 5 ngày trước khi tiến hành thực nghiệm gây đau và 7 ngày sau khi tiến hành
thực nghiệm tổn thương gan mạn bằng paracetamol. Kết quả cho thấy các cao chiết
nước và cao chiết cồn từ lá Trứng cá đều thể hiện tác dụng giảm đau phụ thuộc vào
liều trên cả 2 thực nghiệm gây đau, trong đó liều uống tương đương 5 g nguyên liệu/kg
trọng lượng chuột cho tác dụng giảm đau tương tự như thuốc đối chiếu diclofenac natri
(liều uống 15 mg/kg). Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan cho thấy khi cho chuột uống
paracetamol với liều 250 mg/kg trong 15 ngày làm tăng aspartate aminotransferas
(AST) và alanine aminotransferas (ALT) trong huyết tương và tăng hàm lượng
malondialdehyd (MDA), đồng thời làm giảm hàm lượng glutathion (GSH) trong gan
chuột. Việc điều trị bằng cao chiết nước và cao chiết cồn từ lá Trứng cá, tương tự như
thuốc đối chiếu silymarin cho tác dụng làm giảm hoạt độ ALT và AST trong huyết
tương, cải thiện tình trạng stress oxy hóa qua việc làm giảm hàm lượng MDA và làm
tăng hàm lượng GSH trong gan đạt ý nghĩa thống kê so với đối chứng không điều trị.
Nghiên cứu này đã cho thấy lá Trứng cá có thể là một ứng viên tiềm năng cho tác dụng
hỗ trợ điều trị đau và bảo vệ gan.
Từ khóa: Muntingia calabura L., tác dụng giảm đau, flavonoid, mô hình chuột bị tổn
thương gan bằng paracetamol, tác dụng bảo vệ gan

iii
ABTRACT
Muntingia calabura L. (Muntingiaceae) is acquainted familiar to the people in
the Mekong delta. The leaves of M. calabura are known to have ethnopharmacological
properties such as anti-inflammatory, analgesic, antigout activities, and prevention of
acute coronary syndrome. The present study aims to investigate the analgesic and
hepatoprotective effects of M. calabura leaf extracts by using the mouse pain models
(acetic acid-induced writhing responses and formalin-induced hind paw pain) and a
subchronic paracetamol-induced hepatotoxicity model in Swiss albino mice. The
flavonoid contents were found as 21.87 mg quercetin equivalent/dry weight in 45%
ethanol extract and 18.48 mg quercetin equivalent/dry weight in aqueous extract. Oral
administration of M. calabura leaf extracts was performed at the doses equivalent to
2.5 g and 5 g raw materials/kg mouse body weight for 5 days before the pain models
and for 7 days after paracetamol intoxication. The results revealed that aqueous extract
and ethanol extract from M. calabura leaves showed analgesic effects which were
dose-dependent in both pain models. At the oral dose equivalent to 5 g of raw
materials/kg, the M. calabura leaf extracts demonstrated analgesic effect similar to the
reference drug diclofenac sodium (15 mg/kg). On the other hand, the results revealed
that paracetamol orally administered at dose of 250 mg/kg for 15 days induced an
increase in hepatic MDA content, plasma levels of AST and ALT, and significantly
decreased hepatic GSH content in mice. Oral administration of either ethanol extract
or aqueous extract of M. calabura, as well as silymarin (a reference drug, 0.1 g/kg)
decreased plasma AST and ALT concentrations in paracetamol-intoxicated mice.
Moreover, M. calabura leaves extracts also improved the oxidative stress status in
mouse liver through effective reduction of hepatic MDA levels and increasing of
hepatic GSH levels. Taking together, M. calabura leaves may be an alternative
candidate for pain treatment and liver protection.
Keywords: Muntingia calabura L., analgesic effect, flavonoids, paracetamol-induced
hepatotoxicity mouse model, hepatoprotective effect

iv
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam kết luận văn này dựa trên kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng
dẫn của Cô PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương. Các số liệu và kết quả có được trong
luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kì luận văn nào
trước đây, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về đề tài của mình.
Cần Thơ, ngày tháng năm 2021
Người cam đoan
Nguyễn Việt Quang

v
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................1
TÓM TẮT ..................................................................................................................... ii
ABTRACT.................................................................................................................... iii
LỜI CAM ĐOAN .........................................................................................................iv
MỤC LỤC ......................................................................................................................v
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. viii
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................ix
DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ.............................................................................x
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.......................................................................................xi
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY TRỨNG CÁ...............................................................3
1.1.1. Thực vật học...................................................................................................3
1.1.2. Thành phần hóa học của cây Trứng cá ..........................................................4
1.1.3. Công dụng......................................................................................................4
1.1.4. Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Trứng cá ............................5
1.2. TỔNG QUAN VỀ ĐAU .....................................................................................5
1.2.1. Phân loại đau..................................................................................................5
1.2.2. Cơ chế gây đau...............................................................................................6
1.2.3. Điều trị đau.....................................................................................................8
1.3. THỰC NGHIỆM GÂY ĐAU TRÊN CHUỘT.................................................8
1.3.1. Phân loại theo các tác nhân đau .....................................................................8
1.3.2. Phân loại theo vị trí tác động ..........................................................................9
1.4. TỔNG QUAN VỀ SINH LÝ VÀ BỆNH LÝ GAN........................................11
1.4.1. Cấu tạo của gan chuột và gan người.............................................................11
1.4.2. Chức năng của gan........................................................................................12
1.4.3. Các bệnh lý về gan, chẩn đoán và điều trị....................................................14
1.5. THỰC NGHIỆM GÂY TỔN THƯƠNG GAN..............................................18
1.5.1. Các tác nhân gây mô hình tổn thương gan phổ biến ....................................20
1.5.2. Thực nghiệm tổn thương gan bằng paracetamol ..........................................21
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................24

vi
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .........................................................................24
2.1.1. Nguyên liệu...................................................................................................24
2.1.2. Động vật thử nghiệm ....................................................................................24
2.1.3. Thiết bị - dụng cụ..........................................................................................24
2.1.4. Hóa chất........................................................................................................25
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................26
2.2.1. Phương pháp chiết các cao từ lá cây Trứng cá.............................................27
2.2.2. Xác định mất khối lượng do làm khô của nguyên liệu và cao chiết.............28
2.2.3. Định tính và định lượng flavonoid ...............................................................29
2.2.4. Khảo sát tính an toàn của cao chiết từ lá cây Trứng cá ................................31
2.2.5. Khảo sát tác dụng giảm đau của các cao chiết từ lá Trứng cá trên chuột nhắt
trắng ........................................................................................................................32
2.2.6. Khảo sát tác dụng bảo vệ gan của các cao chiết từ lá cây Trứng cá trên chuột
nhắt đực trắng gây tổn thương gan mạn bằng paracetamol....................................33
2.2.7. Đánh giá kết quả ...........................................................................................37
2.3. ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Y HỌC ................................................37
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ .............................................................................................38
3.1. CHIẾT XUẤT CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ TRỨNG CÁ VÀ ĐỊNH TÍNH-
ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID................................................................................38
3.1.1. Chiết xuất các cao chiết từ lá Trứng cá ........................................................38
3.1.2. Định tính- định lượng flavonoid ....................................................................38
3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ TRỨNG
CÁ ............................................................................................................................41
3.3. KHẢO SÁT TÁC DỤNG GIẢM ĐAU CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ
TRỨNG CÁ TRÊN CÁC THỰC NGHIỆM GÂY ĐAU......................................42
3.3.1. Kết quả tác dụng giảm đau của lá Trứng cá trong thực nghiệm gây đau bằng
acid acetic 1%.........................................................................................................42
3.3.2. Kết quả tác dụng của lá Trứng cá trong thực nghiệm gây đau bằng formalin
2,5% ........................................................................................................................44
3.4. KHẢO SÁT TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ
TRỨNG CÁ TRÊN THỰC NGHIỆM GÂY TỔN THƯƠNG MẠN BẰNG
PARACETAMOL....................................................................................................46

vii
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN...........................................................................................55
4.1. ĐỊNH TÍNH- ĐỊNH LƯỢNG..........................................................................55
4.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ TRỨNG
CÁ ............................................................................................................................56
4.3. TÁC DỤNG GIẢM ĐAU CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ TRỨNG CÁ
TRÊN CÁC MÔ HÌNH GÂY ĐAU BẰNG ACID ACETIC VÀ FORMALIN .56
4.4. TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ TRỨNG CÁ
TRÊN MÔ HÌNH GÂY TỔN THƯƠNG GAN MẠN BẰNG PARACETAMOL59
4.4.1. Tổn thương gan mạn bằng paracetamol .......................................................59
4.4.2. Tác dụng bảo vệ gan của các cao chiết từ lá Trứng cá.................................61
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................64
5.1. KẾT LUẬN .......................................................................................................64
5.2. KIẾN NGHỊ ......................................................................................................64
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................66
PHỤ LỤC ................................................................................................................... xiii

viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các hợp chất có trong cây Trứng cá ...............................................................4
Bảng 1.2. Tổng hợp các nghiên cứu tác dụng dược lý của cây Trứng cá .......................5
Bảng 1.3. Một số mô hình gây đau thực nghiệm...........................................................10
Bảng 1.4. So sánh gan chuột và gan người ...................................................................12
Bảng 1.5. Chỉ số De Ritis (AST/ALT) trong chẩn đoán các bệnh về gan ....................17
Bảng 1.6. So sánh các mô hình đánh giá tác động bảo vệ gan......................................20
Bảng 1.7. Một số tác nhân gây tổn thương gan phổ biến..............................................21
Bảng 1.8. Một số nghiên cứu trên thực nghiệm gây tổn thương gan bằng paracetamol.23
Bảng 2.1. Định tính hợp chất flavonoid trong lá Trứng cá bằng phản ứng hóa học.....29
Bảng 2.2. Thiết kế thử nghiệm gây đau chuột bằng acid acetic 1% hoặc bằng formalin
2,5%...............................................................................................................................32
Bảng 2.3. Thiết kế thử nghiệm gây tổn thương gan chuột bằng paracetamol...............33
Bảng 3.1. Kết quả hiệu suất cao chiết ...........................................................................38
Bảng 3.2. Kết quả độ ẩm bột lá Trứng cá và các cao chiết ...........................................38
Bảng 3.3. Kết quả định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học....................................39
Bảng 3.4. Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo quercetin trong các cao chiết từ lá
Trứng cá.........................................................................................................................41
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát liều an toàn của các cao chiết lá Trứng cá ........................41
Bảng 3.6. Tổng số lần xoắn bụng thực nghiệm gây đau bằng acid acetic 1% ..............42
Bảng 3.7. Diễn biến số cơn xoắn bụng của chuột ở các lô thử nghiệm được ghi nhận
mỗi 10 phút trong thực nghiệm gây đau bằng acid acetic 1% ......................................43
Bảng 3.8. Tổng số lần liếm chân trong thực nghiệm gây đau bằng formalin 2,5% tại
pha sớm (0 -5 phút), pha muộn (20 – 30 phút)..............................................................44
Bảng 3.9. Hoạt độ AST (Ul/mL) trong huyết tương chuột ...........................................46
Bảng 3.10. Hoạt độ ALT (Ul/mL) trong huyết tương chuột.........................................48
Bảng 3.11. Hàm lượng MDA (nM/g protein) trong gan chuột .....................................50
Bảng 3.12. Hàm lượng GSH (nM/g protein) trong trong gan chuột.............................52

ix
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)...........................................................3
Hình 1.2. Con đường dẫn truyền cơn đau .......................................................................7
Hình 1.3. Thang 3 bậc điều trị giảm đau của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO).................8
Hình 1.4. Cấu tạo gan chuột (A) và gan người (B) ......................................................11
Hình 1.5. Chức năng gan...............................................................................................14
Hình 1.6. Con đường tổn thương gan do stress oxy hóa ..............................................16
Hình 1.7. Thay đổi cấu trúc khi gan bị tổn thương ......................................................16
Hình 1.8. Con đường chuyển hóa acetaminophen . ......................................................22
Hình 2.1. Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino ............................................................24
Hình 2.2. Bình chiết ngấm kiệt......................................................................................27
Hình 2.3. Máy cô quay thu hồi cồn ethanol ..................................................................28
Hình 2.4. Máy sấy hồng ngoại Kern..............................................................................29
Hình 2.5. Phương trình tạo phức (màu hồng) giữa MDA và thuốc thử TBA ...............36
Hình 2.6. Phương trình tạo phức màu giữa GSH và thuốc thử Ellman.........................36
Hình 3.1. Định tính bằng phản ứng hóa học của lá cây Trứng cá.................................39
Hình 3.2. Sắc ký đồ định tính quercetin trong các cao chiết từ lá Trứng cá......................40
Hình 3.3. Đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thu của quercetin ..........40

x
DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Thiết kế các nội dung nghiên cứu ................................................................26
Sơ đồ 2.2. Bố trí thí nghiệm gây tổn thương gan mạn bằng paracetamol.....................34
Biểu đồ 3.1. Tổng số lần xoắn bụng ghi nhận trong thực nghiệm gây đau bằng acid
acetic 1%........................................................................................................................43
Biểu đồ 3.2. Tổng số lần liếm chân của chuột ở các lô thử nghiệm tại pha sớm (từ 0-5
phút) và pha muộn (từ 20-30 phút) trong thực nghiệm gây đau bằng formalin............45
Biểu đồ 3.3. Hoạt độ AST (Ul/mL) trong huyết tương chuột .......................................48
Biểu đồ 3.4. Hoạt độ ALT (Ul/mL) trong huyết tương chuột.......................................50
Biểu đồ 3.5. Hàm lượng MDA (nM/g protein) trong gan chuột ...................................52
Biểu đồ 3.6. Hàm lượng GSH (nM/g protein) trong huyết tương chuột.......................54

xi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Diễn giải chi tiết tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt
ALT Alanine aminotransferase Enzym alanin aminotransferase
ASA Acetylsalicylic acid Acid acetylsalicylic
AST Aspartate transaminase Enzym aspartat aminotransferase
ATP Adenosine triphosphat Adenosin triphosphat
CAT Catalase Enzym catalase
cGMP Cyclic guanosine
monophosphate
Cyclic guanosin monophosphat,
GMP vòng
COX Cyclooxygenase Enzym cyclooxygenase
COX-1 Cyclooxygenase-1 Enzym cyclooxygenase- 1
COX-2 Cyclooxygenase-2 Enzym cyclooxygenase- 2
CRP C- reaction protein Protein phản ứng C
DNA Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic
EAF Ethyl acetate Ethyl acetat
GSH Glutathione Glutathion
iNOS Inducible nitric oxide
synthase
Enzym inducible nitric oxide synthase
NOS cảm ứng
LD0 Lethal dose 0% Liều không làm chết động vật thí nghiệm
LD100 Lethal dose 100% Liều gây chết tuyệt đối (100%) số động
vật thí nghiệm
LD50 Lethal dose 50% Liều làm chết 50% số động vật thí nghiệm
LOS Lipoxygenase Enzym lipoxygenase
MAPK Mitogen-activated protein
kinase
Protein kinase hoạt hóa phân bào
MDA Malondialdehyde Malondialdehyd
NSAIDs Non-steroidal anti-
inflammatory drugs
Thuốc kháng viêm không phải steroid
PGE2 Prostaglandine E2 Prostaglandin E2
PGF2α α-Prostaglandine F2 Prostaglandin F2 alpha
PGI2 Prostaglandine I2 Prostaglandin I2

xii
PO Per os, per oral Dùng đường uống
RNS Reactive nitrogen species Gốc tự do nitơ
ROS Reactive oxygen species Gốc tự do oxy
RSS Reactive sulfur species Gốc tự do lưu huỳnh
SC Subcutaneous injection Tiêm dưới da
SOD Superoxide dismutase Enzym superoxid dismutase
TRPV1 Transient Receptor Potential
Vanilloid 1
Kênh thụ thể TRPV1
WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới
XO Xanthine oxidase Enzym xanthin oxidase

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Paracetamol và các NSAID là những loại thuốc được sử dụng không cần đơn
thuốc của bác sĩ nhiều nhất, để tự điều trị với mục đích giảm đau và hạ sốt ở người lớn
và trẻ em. Những loại thuốc này an toàn và hiệu quả khi được sử dụng đúng cách,
nhưng gây ra nguy cơ nghiệm trọng khi sử dụng không đúng cách. Paracetamol có thể
gây tổn thương gan ngay cả ở liều điều trị nếu sử dụng trong thời gian dài, đặc biệt
trên những bệnh nhân có chức năng gan thay đổi (nghiện rượu mạn tính, suy dinh
dưỡng, phụ nữ mang thai, bệnh nhân dùng các thuốc có khả năng gây tăng men gan)
hoặc người cao tuổi. Nguy cơ tổn thương gan (từ nhiễm độc gan nhẹ đến nặng, dẫn
đến suy gan cấp tính và tử vong) do sử dụng thường xuyên hay do quá liều
paracetamol ngày một tăng với tỷ lệ lên đến 10% các phản ứng có hại do thuốc gây ra
[86], [87]. Một thống kê cho thấy mỗi năm có khoảng 98000 bệnh nhân đến khoa cấp
cứu do ngộ độc paracetamol và khoảng 49000 bệnh nhân phải nhập viện để điều trị. Sử
dụng quá liều chỉ riêng paracetamol trực tiếp dẫn đến khoảng 150 đến 200 ca tử vong
và 15 đến 20 ca ghép gan mỗi năm [68]. Ngoài ra, các NSAID được chỉ định trong điều
trị viêm khớp và giảm đau thường gây các tác dụng phụ khi được sử dụng dài ngày như
viêm loét dạ dày-tá tràng, suy thận,…. Do đó, việc nghiên cứu nguồn tài nguyên cây
thuốc hoặc bài thuốc dân gian trong hỗ trợ điều trị giảm đau và giảm tác dụng phụ của
tân dược đang được quan tâm nhiều.
Cây Trứng cá (Muntingia calabura L.), là một cây thuốc khá quen thuộc với
người dân vùng đồng bằng sông Cửu Long. Trong y học dân gian, lá Trứng cá được sử
dụng như dạng trà nhằm hỗ trợ điều trị một số bệnh như: gout, chứng viêm sưng, hạ
sốt, giảm đau, ngăn ngừa nhồi máu cơ tim [47], nhưng hiện nay có rất ít công trình
nghiên cứu trong nước chứng minh thực nghiệm tác dụng dược lý của lá Trứng cá. Các
nghiên cứu trước đây cho thấy cao chiết methanol từ lá cây Trứng cá cho tác dụng
giảm đau trên các mô hình thực nghiệm gây đau bởi capsaicin, formalin, acid acetic,
serotonin, hay phiến nóng (hot plate) [59] và có tác dụng bảo vệ gan trên thực nghiệm
tổn thương gan mạn gây bởi paracetamol hay carbon tetrachlorid [52], [97]. Nhằm mục
đích chứng minh kinh nghiệm sử dụng trong dân gian và góp phần nâng cao giá trị
tiềm năng của cây Trứng cá, đề tài “Nghiên cứu tác dụng giảm đau và bảo vệ gan của

2
các cao chiết từ lá cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)” được thực hiện với các mục
tiêu cụ thể như sau:
- Chiết xuất các cao chiết (cao chiết cồn 45% và cao chiết nước) từ lá Trứng cá và
định tính-định lượng hợp chất flavonoid.
- Đánh giá tính an toàn của các cao chiết từ lá Trứng cá.
- Khảo sát tác dụng giảm đau và bảo vệ gan của các cao chiết từ lá Trứng cá.

3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.TỔNG QUAN VỀ CÂY TRỨNG CÁ
1.1.1. Thực vật học
Giới: Plantae
Bộ: Malvales
Họ: Muntingiaceae
Chi: Muntingia
Loài: M. calabura
Hình 1.1. Cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)
(https://www.cabi.org/isc/datasheet/35164)
Hình thái
Cây Trứng cá là cây thân thảo, thuộc loại thực vật tiểu mộc thuộc họ
Muntingiaceae. Thân cây gỗ nhỏ cao 7,5 m -12 m tuổi thọ của cây khoảng 30 năm
[53]. Các cành xếp chồng lên nhau và hơi rủ xuống. Lá cây Trứng cá dài 3,5 cm - 5 cm
và rộng 2,5 cm - 3 cm, viền lá có mép khía hình răng cưa. Các hoa nhỏ màu trắng có 5
cánh, quả khi chín có màu đỏ nhạt đường kính khoảng 1 cm - 1,5 cm. Quả ăn được, có
vị ngọt và mọng nước đường kính 15 mm, chứa nhiều hạt nhỏ, màu vàng trông như
Trứng cá. Hoa Trứng cá trắng, xếp thành 5 cánh, đối xứng với nhau. Hoa dài khoảng 1
cm, lá hoa hình xoan. Đài hoa màu xanh dài 1,5 cm. Cánh hoa một màu trắng, 2 môi,

4
môi dưới màu xanh nhạt, tràng hoa hợp thành ống ngắn có nhiều tiểu nhụy ngắn so với
vành hoa. Quả dạng hình tròn màu đỏ khi chín và xanh khi chưa chín, quả bóng, xốp,
mọng nước có vị ngọt thanh, đường kính khoảng 2 cm, hình tròn chứa rất nhiều hạt.
Sinh thái- phân bố
Cây Trứng cá thích hợp phát triển tốt trên đất nghèo dinh dưỡng, có khả năng
chịu được các điều kiện chua mặn, vùng đất phèn và khô hạn. Cây Trứng cá mọc
hoang ở nhiều vùng, gần ao hồ, ở hầu hết các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long (có nhiều
ở các tỉnh như Long An, Hậu Giang, An Giang, Kiên Giang) và có thể thu hoạch
quanh năm.
1.1.2. Thành phần hóa học của cây Trứng cá
Thành phần hóa học chính của cây Trứng cá là flavonoid. Ngoài flavonoid, cây
Trứng cá còn có chứa các acid hữu cơ, methyl gallat, β–sitosterol, stigmasterol. Cao
chiết methanol của lá cây Trứng cá đã được phân tích cho thấy sự hiện diện của
glycosid, flavonoid, phlobatannin, tannin, terpenoid [82]. Ba flavonoid phân lập từ
phân đoạn ethyl acetat của lá Trứng cá được xác định lần lượt là kaempferol, tilirosid,
kaempferol 3-O-(6”-O-galloyl)-β-D-glucopyranosid [47].
Bảng 1.1. Các hợp chất có trong cây Trứng cá [82]
Các hợp chất Lá Vỏ cây Quả
Glycosid + + +
Flavonoid + - +
Phlobatannin + + -
Saponin - - -
Tannin + + +
Terpenoid + + -
(+): có, (-): không có
1.1.3. Công dụng
Cây Trứng cá được chứng minh có khả năng kháng oxy hóa, tăng sức đề kháng,
kháng khuẩn, trị loét dạ dày, làm giảm huyết áp [5]. Ở Việt Nam, lá cây Trứng cá được
dùng theo kinh nghiệm dân gian để giảm các cơn đau đầu, đau tim, điều trị viêm, giảm
sưng, hạ sốt, viêm gan [47]. Lá Trứng cá có thể dùng hãm với nước nóng để uống như
dạng trà với công thức như sau: lá cây Trứng cá (nhánh lá non và lá trưởng thành) ướp
với đọt lá trà ở tỉ lệ 3:1, thêm nước cam thảo trong 12 giờ. Ngoài ra quả Trứng cá còn
có tác dụng điều trị nhiễm trùng, giảm đau, bảo vệ dạ dày.

5
1.1.4. Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Trứng cá
Bảng 1.2. Tổng hợp các nghiên cứu tác dụng dược lý của cây Trứng cá
Tác dụng Kết quả
Tác dụng bảo vệ dạ dày [98] Cao chiết methanol từ lá Trứng cá có tác dụng ngăn ngừa tồn
thương dạ dày và làm tăng lượng chất nhầy trong dạ dày trên
mô hình chuột tổn thương dạ dày do thắt môn vị.
Tác dụng hạ acid uric máu [78] Cao chiết ethanol từ vỏ cây Trứng cá có tác dụng giảm nồng
độ acid uric máu ở chuột bị đái tháo đường gây bởi alloxan.
Tác dụng bảo vệ gan [96, 100] Cao chiết methanol từ lá cây Trứng cá có tác dụng tác dụng
làm giảm hoạt độ AST, ALT trong huyết tương và ngăn ngừa
các tổn thương tế bào gan trên mô hình chuột bị tổn thương
gan bằng paracetamol hay do CCl4.
Tác dụng kháng khuẩn và
kháng nấm [82]
Cao chiết methanol từ lá cây Trứng cá có tác dụng kháng các
vi khuẩn Gram (+), trực khuẩn mủ xanh, chống lại sự phát
triển của nấm Fusarium sp và Penicillium sp.
Tác dụng giảm đau [58, 79] Cao chiết methanol từ lá cây Trứng cá cho tác dụng giảm đau
thông qua ức chế các COX, LOX, bradykinin và protein kinase
C trên mô hình chuột gây đau bằng acid acetic, formalin hoặc
thông qua ức chế thụ thể TRPV1, kích hoạt các cơ chế ngoại vi
và trung tâm, các chất truyền tín hiệu cGMP trên mô hình
chuột gây đau bằng capsaicin.
1.2.TỔNG QUAN VỀ ĐAU
1.2.1. Phân loại đau
Đau là một cảm giác khó chịu và sự chịu đựng về cảm xúc, chủ yếu đi kèm theo tổn
thương tổ chức [54].
- Đau cảm thụ (nociceptive pain): Là đau do tổn thương tổ chức gồm đau thân thể
(somatic pain, do tổn thương mô da, cơ, khớp…) và đau nội tạng (visceral pain).
- Đau thần kinh (neuropathic pain): Là chứng đau do những thương tổn nguyên phát
hoặc những rối loạn chức năng trong hệ thần kinh.
- Đau hỗn hợp (mixed pain): Gồm cả 2 cơ chế đau cảm thụ và đau thần kinh. Ví dụ:
đau thắt lưng với bệnh lý rễ thần kinh, bệnh lý rễ thần kinh cổ, đau do ung thư, hội
chứng ống cổ tay…
- Đau do căn nguyên tâm lý (psychogenic pain).
- Đau cấp tính (acute pain) là đau mới xuất hiện, có cường độ mạnh mẽ, có thể được
coi là một dấu hiệu báo động hữu ích. Thời gian đau dưới 3 tháng.

6
- Đau mạn tính (chronic pain) là chứng đau dai dẳng tái đi tái lại nhiều lần.
- Đau cục bộ (local pain) là cảm nhận vị trí đau trùng với vị trí tổn thương.
- Đau xuất chiếu (referred pain) là cảm nhận vị trí đau ở vị trí khác với vị trí tổn
thương.
- Đau lan tỏa là cảm giác đau gây ra do sự lan tỏa từ một nhánh dây thần kinh này
sang một nhánh thần kinh khác. Ví dụ khi kích thích đau ở một trong ba nhánh của
dây thần kinh V có thể đau lan sang vùng phân bố của hai nhánh kia.
1.2.2. Cơ chế gây đau
- Cơ chế thần kinh (neuropathic pain) [17]
Quá trình cảm thụ đau bắt đầu bằng sự hoạt hóa các thụ thể cảm giác hướng
tâm ở ngoại vi, còn gọi là các thụ thể đau (nociceptor). Đây là những thụ thể cảm giác
đặc hiệu có nhiệm vụ phát hiện các kích thích gây đau và chuyển các kích đó thành tín
hiệu và chuyển đến hệ thần kinh trung ương. Thụ thể đau chính là đầu tận cùng tự do ở
phía ngoại vi của các tế bào thần kinh hướng tâm nguyên phát. Thụ thể đau phân bố
rộng khắp cơ thể và dẫn truyền cảm giác đau bề mặt (như da, niêm mạc) hoặc nội tạng
(như các khớp xương, ruột), được hoạt hóa bởi các kích thích cơ học, hóa học và nhiệt
độ. Khi đạt đến một ngưỡng nhất định, sợi trục khử cực nhờ mở kênh Na+
và tạo ra
điện thế hoạt động được dẫn truyền vào trung tâm. Kích thích gây đau (điện thế hoạt
động) được truyền vào sừng sau tủy sống thông qua cả hai loại sợi thần kinh có và
không có myelin. Các sợi này được phân loại theo mức độ myelin hóa, đường kính và
tốc độ dẫn truyền như sau:
 Sợi trục A-delta được myelin hóa cho phép điện thế hoạt động di chuyển ở
tốc độ rất nhanh hướng đến hệ thần kinh trung ương (5-30 mét/giây). Các
sợi này đảm nhiệm về “Đau đầu tiên” hoặc “Đau nhanh”, là cảm giác có khu
trú tốt, rõ ràng trong một thời gian ngắn nhằm cảnh báo cho cá thể về
thương tổn từ đó hình thành cơ chế phản xạ phản hồi.
 Sợi trục C không được myelin hóa dẫn truyền chậm hơn (0,5 -2 mét/giây),
còn gọi là sợi dẫn truyền đau đa phương thức đáp ứng với các thương tổn cơ
học, nhiệt và hóa học. Sợi C là trung gian dẫn truyền cảm giác “Đau thứ
phát”, thường kéo dài, có khoảng chậm từ vài giây đến vài phút được mô tả
như cảm giác rát bỏng lan tỏa hoặc đau xé (stabbing).

7
 Sợi trục A-beta có lớp myelin dày bao bọc sợi trục tế bào, thúc đẩy sự dẫn
truyền các tín hiệu cảm ứng, áp lực, cảm nhận (25-90 mét/giây), đáp ứng với
ngưỡng đau nhẹ hoặc các kích thích chuyển động và thường không gây đau
ngoại trừ các trường hợp bệnh lý.
Hình 1.2. Con đường dẫn truyền cơn đau
(https://napaanesthesia.com/blog-pre-emptive-pain-management/)
- Cơ chế thể dịch qua các chất trung gian hóa học [88]
Hầu hết các tế bào thần kinh có nhiều hơn một chất dẫn truyền thần kinh, được
giải phóng đồng thời khi có kích thích truyền đến. Những chất quan trọng gồm chất P
(substance P) được phóng thích từ các đầu tận cùng ngoại vi từ sợi C hướng tâm
nguyên phát không myelin hóa có vai trò dẫn truyền cảm giác đau. Chất P gây giãn
mạch và thoát huyết tương, giải phóng histamin từ hạt dưỡng bào, gây hóa ứng động
và tăng sinh bạch cầu, giải phóng các cytokin. Bradykinin là chất gây đau và hoạt hóa
trực tiếp các thụ thể đau ngoại vi. Histamin dự trữ ở các hạt dưỡng bào và được giải
phóng dưới tác động của chất P và các chất trung gian khác. Tác dụng của histamin

8
thông qua thụ thể đặc hiệu, gây giãn tĩnh mạch, phù và sưng nề tổ chức do tăng tính
thấm của tiểu tĩnh mạch sau mao mạch. Serotonin hoặc 5-hydroxytryptamin dự trữ ở
các thể hạt trong tiểu cầu có tác dụng tăng tính thấm vi mạch. Prostaglandin có vai trò
lớn trong hoạt hóa ban đầu các thụ thể đau và làm tăng quá trình viêm và phù nề tại vị
trí tổn thương. Quá trình oxy hóa COX-2 chuyển nhanh acid arachidonic từ màng tế
bào tổn thương thành nhiều loại prostanoid (prostaglandin và thromboxan A2).
Cytokin và interleukin được giải phóng như một phần của đáp ứng viêm ngoại vi có
thể dẫn đến và tăng sản xuất prostaglandin tại não.
1.2.3. Điều trị đau
Hình 1.3. Thang 3 bậc điều trị giảm đau của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO).
1.3. THỰC NGHIỆM GÂY ĐAU TRÊN CHUỘT
1.3.1. Phân loại theo các tác nhân đau
- Đau do hóa chất [33]
Mô hình đau do hóa chất sử dụng các tác nhân hóa học kích thích cảm cảm giác
đau, có thể được tạo ra ở một số vị trí cụ thể như tiêm vào gan bàn chân, tiêm vào
màng bụng, tiêm vào bàng quang, ống tiêu hóa. Một số mô hình gây đau ở chuột đã
được sử dụng phổ biến trong sàng lọc hiệu quả của các loại thuốc chống viêm mới như
mô hình carrageenan, acid acetic, formalin. Trong đề tài nghiên cứu này, thực nghiệm

9
gây đau bằng acid acetic và formalin được áp dụng để khảo sát tác dụng giảm đau của
các cao chiết từ lá Trứng cá.
 Thực nghiệm gây đau bằng dung dịch acid acetic gây các phản ứng đau quặn
bụng (co rút cơ bụng, lưng cong lên, các chi sau duỗi ra) bằng acid acetic
thường được sử dụng để nghiên cứu tác dụng giảm đau của một thuốc. Thông
qua tiêm acid acetic vào phúc mô chuột gây giải phóng các chất trung gian gây
viêm nội sinh trong khoang bụng [33].
 Thực nghiệm gây đau bằng dung dịch formalin được dùng để xác định cơ chế và
hoạt tính giảm đau của một thuốc bằng cách tiêm formalin vào gan bàn chân
chuột và ghi nhận số lần chuột liếm chân ở 2 pha sớm và pha muộn [33].
- Đau do vật lý
 Tác nhân gây đau do nhiệt [33]
Một trong những mô hình đau do nhiệt được phát triển sớm nhất là mô hình
tail-flick được sử dụng trong nghiên cứu đau bằng cách quan sát phản ứng của chuột
với nhiệt độ được ghi nhận qua tiềm thời của hành động vẩy đuôi. Mô hình phiến nóng
(hot plate test) sử dụng kích thích nhiệt chân chuột nhưng không gây tổn thương mô.
Chuột được đặt trong một không gian hình trụ có đầu hở với sàn có khả năng làm nóng
khoảng 50 o
C và xác định tiềm thời của phản ứng như liếm chân và nhảy thoát khỏi
thiết bị.
 Tác nhân gây đau cơ học [33]
Mô hình đau Randall-Selitto được tiến hành nhằm xác định hành vi loạn cảm
(một phản ứng đau đớn với một kích thích không gây đau) và chứng tăng cảm giác
đau. Trong đó mô hình sử dụng một lực cơ học có cường độ tăng dần lên phần giữa
của gan bàn chân trước hoặc chân sau của chuột (vị trí tiếp xúc được cố định qua các
lần thử nghiệm) cho đến khi tạo ra phản ứng rút chân.
1.3.2. Phân loại theo vị trí tác động
- Gây đau ngoại vi [33]
Các mô hình gây đau ngoại biên được tiến hành bằng cách gây tổn thương dây
thần kinh trực tiếp như: Thắt hoặc cắt các dây thần kinh cột sống, thắt hoặc làm tổn
thương dây thần kinh tọa, hoặc thắt dây thần kinh tủy sống L5 hoặc gây viêm dây thần
kinh tọa bằng cách tiêm chất kích thích gây viêm zymosan vào dây thần kinh tọa. Các
bước tiến hành gây tổn thương dây thần kinh trực tiếp có thể được áp dụng cho dây

10
thần kinh xương hàm. Những thay đổi về cơn đau như: kêu, thay đổi hoạt động vận
động, trốn tránh và có phản ứng quá mức đối với các kích thích đau khác. Ngoài ra mô
hình đau ngoại biên cũng có thể được gây ra bằng các biện pháp hóa học tiêm nọc rắn
hổ mang vào dây thần kinh dưới ổ mắt đã được sử dụng để tạo ra mô hình đau dây
thần kinh V gây các cơn đau kéo dài [7].
- Gây đau trung ương [23]
Các mô hình động vật về cơn đau trung ương được tiến hành phụ thuộc vào
cảm giác kích thích sau các chấn thương tủy sống. Mô hình thiếu máu cục bộ sử dụng
các tổn thương do laser vào mạch máu cột sống của chuột, gây rối loạn xúc giác cấp
tính, liên quan đến giảm ức chế tổng hợp acid γ-aminobutyric ở sừng lưng, làm cho
chuột không đáp ứng với tác dụng giảm đau của morphin.
Bảng 1.3. Một số mô hình gây đau thực nghiệm
Đau do viêm
Mô hình đau do viêm được dùng để đánh giá tình trạng phản ứng đau kéo dài
do viêm dẫn đến thay đổi hành vi phản xạ như tăng thân nhiệt xung quanh vị
trí tiêm, tăng trương lực cơ học bên ngoài vị trí tổn thương. Cảm giác đau
tương ứng với sự nhạy cảm của tế bào thần kinh trung ương [33].
Đau viêm khớp
Thực nghiệm mô phỏng các đáp ứng đau do viêm khớp. Các chất kích thích
gây viêm như capsaicin, kaolin, carrageenan, iodoacetate được tiêm vào khớp
gây viêm khớp cục bộ cấp và mạn [60].
Đau do phẫu
thuật
Mô hình đau do phẫu thuật gây ra bởi một vết rạch dọc qua da và cơ ở chân
sau chuột. Thực nghiệm này gây tổn thương trên bề mặt và tại mô [60].
Đau cơ
Mô hình đau cơ thực nghiệm do tiêm chất kích thích (carrageenan, formalin)
vào cơ bắp chân sau của chuột [60].
Đau nội tạng
Dòng điện, chấn thương cơ học, thiếu máu cục bộ và hóa chất (phổ biến là
acid acetic) được sử dụng để kích thích phúc mạc hoặc các cơ quan của vùng
xương chậu nhằm quan sát hành vi đau [60].
Đau do ung thư
Mô hình đau do ung thư tập trung vào cơn đau phát triển sau khi di căn của
khối u xương. Thông qua việc cấy các tế bào ung thư sarcoma vào xương đùi
của chuột [60].

11
1.4. TỔNG QUAN VỀ SINH LÝ VÀ BỆNH LÝ GAN
1.4.1. Cấu tạo của gan chuột và gan người
Hình 1.4. Cấu tạo gan chuột (A) và gan người (B) [75]
- Gan người
Gan là một tạng lớn nhất trong cơ thể, có trọng lượng trung bình 1500 g
(khoảng 2% trọng lượng cơ thể, 1800 g ở nam và 1400 g ở nữ). Tế bào gan có nhiều ty
thể và hệ thống enzym hoàn chỉnh nên có chức năng chuyển hóa mạnh. Tiểu thùy gan
là đơn vị cấu trúc cũng như đơn vị chức năng của gan. Mỗi tiểu thùy gan gồm thùy
phải, trái, đuôi và vuông. Khu vực phân tách thùy vuông và thùy đuôi là cuống gan, nơi
tĩnh mạch cửa và động mạch đi vào gan [75].
- Gan chuột
Gan chuột có trọng lượng khoảng 2 - 3g (3 – 5% trọng lượng cơ thể chuột),
được chia làm bốn thùy, thùy phải có vách ngang dẫn đến phân lớp bởi thùy phải
(trước) và thùy phải (sau) và thùy giữa. Thùy giữa nằm ở vị trí trung tâm nhất và là nơi
tiếp cận gần nhất khoang bụng của chuột.
A B

12
Theo tỷ lệ phần trăm của tổng khối lượng cơ thể, gan chuột nổi bật hơn so với
gan người. Ở chuột, gan kéo dài và hầu hết nằm trong toàn bộ khu vực, trong khi ở
người bị giới hạn ở góc phần tư bụng bên phải. Dây chằng bụng được chia giúp phân
biệt rõ các thùy gan chuột hơn so với gan người. Bốn thùy của gan chuột là thùy phải,
thùy trung vị, thùy trái và thùy caudate. Ở chuột có hai cánh hình chóp đối xứng được
nối với nhau bằng một eo hẹp trung tâm bên dưới, nhô ra của túi mật. Cánh phải của
thùy giữa lớn hơn thùy bên trái và không có túi mật. Thùy trái là lớn nhất và là nơi
thường xuyên lấy mẫu mô học ở chuột. Thùy caudate nhỏ và có hai đoạn hình tai khác
nhau được nhìn rõ nhất trong quá trình phát triển bằng các phản xạ cơ thể của gan và
dạ dày. Đôi khi cánh thùy được phân loại thành trước và sau [25] (Bảng 1.4).
Bảng 1.4. So sánh gan chuột và gan người [25], [56], [66], [75], [84].
Gan chuột Gan người
Trọng lượng 3 - 5% trọng lượng cơ thể 2% trọng lượng cơ thể
Vị trí Kéo dài toàn bộ khu khoang bụng
Bị giới hạn ở góc phần tư bụng bên
phải
Cấu trúc thùy
Không phân biệt rõ, bao gồm thùy
phải, trái, đuôi và vuông
Phân biệt rõ thùy, bao gồm thùy phải,
trái, đuôi và vuông
Dây chằng
Không có dây chằng ổn định thùy,
dây chằng vành và dây chằng tam
giác gắn gan với cơ hoành
Dây chằng hình liềm nằm giữa thùy
phải và trái và dây chằng vành gắn
gan với cơ hoành
Túi mật
Đáy túi mật là phần nhô ra dưới eo
trung tâm của thùy giữa
Túi mật nằm ở mặt dưới thùy phải
gan
AST 40 – 60 U/L 10-50 U/L ở nam và 10 -35 U/L ở nữ
ALT 24 – 40 U/L 10-50 U/L ở nam và 10 -35 U/L ở nữ
Bilirubin toàn phần 0,1 – 0,7 mg/dL 0,3 – 1,9 mg/dL
1.4.2. Chức năng của gan
Gan tiếp nhận máu từ hai nguồn khác nhau từ tim và từ tĩnh mạch cửa. Gan
đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất, cung cấp năng lượng cần thiết
cho cơ thể.
- Gan tiếp nhận các chất dinh dưỡng và các chất ngoại sinh khác được hấp thụ từ hệ
thống tiêu hóa để được thanh lọc và chuyển hóa thành những chất khác nhau [74].

13
Gan duy trì đường huyết ở mức tương đối ổn định, chịu trách nhiệm cho oxi hóa
khử gốc amin và chuyển hóa amin để tạo nguyên liệu cho sự tổng hợp acid amin và
carbohydrat. Thông qua chu trình urê, gan đào thải nitơ ở dạng urê.
- Gan tổng hợp khoảng 80% lượng cholesterol trong cơ thể từ acetyl-CoA và loại bỏ
cholesterol thông qua hệ tuần hoàn. Gan còn tham gia vào quá trình tổng hợp, lưu
trữ và sản sinh triglycerid, gan chuyển đổi các acid amin dư thừa thành acid béo và
sau đó chuyển chúng thành keton tạo năng lượng cho gan. Gan tham gia vào quá
trình tổng hợp các protein quan trọng của cơ thể như các protein huyết tương
(albumin, globulin), các yếu tố đông máu như fibrinogen, prothrombin. Gan là cơ
quan sản xuất mật. Mỗi ngày, tế bào gan tiết ra khoảng 800- 1000ml mật. Sau khi
mật được tạo ra sẽ được chuyển đến dự trữ ở túi mật. Mật có vai trò nhũ tương hóa
và phân hủy lipid.
- Ngoài ra, gan còn dự trữ nhiều chất quan trọng cho cơ thể như vitamin.
- Bên cạnh các chức năng trên, gan còn được xem là hàng rào bảo vệ cơ thể chống
lại sự xâm nhập của các yếu tố độc hại. Tế bào gan có thể giữ lại một số kim loại
nặng như đồng, chì, thủy ngân ... Sau đó các chất này được thải ra ngoài. Bên cạnh
đó, các tế bào gan chuyển hóa các chất độc hoặc dược phẩm thành các chất ít độc
hơn và thải ra ngoài qua đường mật. NH3 được tạo ra trong cơ thể thông qua quá
trình tạo amin hoặc hấp thu từ ruột già sẽ được tế bào gan chuyển hóa thành urê
qua chu trình ornithin và sau đó urê được thải ra ngoài trong nước tiểu [74].

14
Hình 1.5. Chức năng gan
1.4.3. Các bệnh lý về gan, chẩn đoán và điều trị
1.4.3.1. Phân loại bệnh lý gan trên lâm sàng
- Viêm gan do virus: Viêm gan virus gồm viêm gan siêu vi A, B, C, D và E. Viêm
gan E thường gây thành dịch nhưng lành tính, ngược lại viêm gan B, C và D tiến
triển thành tình trạng viêm gan mạn, xơ gan và cuối cùng là ung thư gan với tỷ lệ
cao [12].
- Viêm gan do dược phẩm: Gan là nơi chuyển hóa rất nhiều loại thuốc, phần lớn
các thuốc sau khi chuyển hóa tạo thành những sản phẩm có độc tính cao, tấn công
trực tiếp vào tế bào gan, gây tổn thương tế bào gan như: paracetamol,
erythromycin, isoniazid, halothan…. [11].
- Viêm gan cấp do độc chất: Thường gặp do nhiễm độc các hợp chất hydrocarbua
đa vòng, các phẩm nhuộm… CCl4 là một chất lỏng không màu, dễ bay hơi, được
dùng làm dung môi trong công nghiệp và còn được dùng gây tổn thương gan thực
nghiệm phổ biến do CCl4 được chuyển hóa bởi gan tạo thành các gốc tự do
(phosgen) gây tổn thương tế bào gan [29].

15
- Viêm gan mạn do rượu ethanol: Khi dùng rượu kéo dài sẽ gây viêm, hoại tử tế
bào gan, gan nhiễm mỡ, cuối cùng dẫn đến xơ gan, đặc biệt rõ trên bệnh nhân
nghiện rượu. Rượu được chuyển hoá ở gan và gây tổn thương gan do tăng quá trình
peroxy hoá lipid và làm giảm các chất chống oxy hoá nội sinh [12].
- Viêm gan nhiễm mỡ: xảy ra khi quá nhiều chất béo tích tụ trong tế bào gan (lớn
hơn 5% trọng lượng gan) gây tổn thương, dẫn đến xơ hóa tế bào gan hoặc hình
thành mô sẹo ở gan [3].
- Viêm gan tắc mật: Được đặc trưng bởi sự tích tụ của các acid mật trong gan, bắt
đầu quá trình viêm dẫn đến tổn thương gan. Acid mật ức chế sự bài tiết cytokin tiền
viêm do lipopolysaccharid gây ra từ các đại thực bào RAW 264.7, ức chế sản xuất
immunoglobulin, làm thay đổi phản ứng miễn dịch của tế bào gan, bao gồm cả tế
bào Kupffer và gây ra tổn thương gan [80].
- Xơ gan là tình trạng gan bị tổn thương vĩnh viễn do mô sẹo thay thế mô gan khỏe
mạnh và ảnh hưởng tren chức năng gan. Nguyên nhân bao gồm bệnh gan do rượu,
bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu, viêm gan B và C mạn [81].
- Ung thư gan xảy ra khi các tế bào ác tính phát sinh tại các mô trong gan. Ung thư
bắt đầu ở gan được gọi là ung thư gan nguyên phát và ung thư gan thứ phát (ung
thư gan do di căn) [51].
1.4.3.2. Tổn thương gan do stress oxy hóa
Stress oxy hóa được định nghĩa là sự mất cân bằng giữa các gốc tự do hoạt
động của oxy hay nitơ (ROS hoặc RNS) với các chất chống oxy hóa nội sinh trong tế
bào do sự tăng quá độ ROS hoặc RNS. Stress oxy hóa là một cơ chế bệnh lý kết hợp,
góp phần vào sự khởi đầu và tiến triển của tổn thương gan, viêm gan mạn tính, xơ gan,
gan nhiễm mỡ và ung thư gan. Nhiều tác nhân khác nhau như virus, rượu, thuốc, các
chất gây ô nhiễm môi trường… có thể gây stress oxy hóa trong gan, dẫn đến các bệnh
lý về gan [49] (Hình 1.6).

16
Hình 1.6. Con đường tổn thương gan do stress oxy hóa [76]
Khi tế bào gan bị tổn thương sẽ tạo thành mô “Giống sẹo” và làm suy giảm
chức năng tế bào gan. Khi tế bào gan bị tổn thương mạn tính sẽ dẫn đến sự thâm
nhiễm tế bào lympho viêm vào nhu mô gan, gây apoptosis tế bào gan. Tế bào Kupffer
được hoạt hóa phóng thích chất trung gian tạo sợi và gây tăng sinh tế bào hình sao
được bao quanh một lượng lớn chất nền protein ngoại bào và làm mất vi nhung mao
[72] (Hình 1.7).
Hình 1.7. Thay đổi cấu trúc khi gan bị tổn thương [72]
Tổn thương gan còn xảy ra hiện tượng tái tạo tế bào gan để thay thế cho các tế
bào hoại tử và các tế bào bị apoptosis. Quá trình này liên quan với đáp ứng viêm và sự

17
lắng đọng có giới hạn của chất nền ngoại bào. Nếu tổn thương gan vẫn tiếp diễn và sự
tái tạo gan thất bại thì các tế bào gan đuợc thay thế bằng chất nền ngoại bào, bao gồm
cả các sợi collagen. Các tế bào sao (có vai trò quan trọng trong việc sản sinh sợi
collagen trong xơ gan) được hoạt hóa và chuyển từ trạng thái nghỉ sang trạng thái hoạt
động dẫn đến kích thích các tế bào miễn dịch giải phóng các cytokin viêm, các yếu tố
tăng trưởng và collagen, glycoprotein (fibronectin, proteoglycan, và các chất khác).
Các chất này gây nên sự tích tụ các chất nền ở ngoại bào song song với quá trình phân
hủy hoặc thoái hóa collagen bị suy giảm [28].
1.4.3.3. Một số xét nghiệm dùng để đánh giá tổn thương gan
Các tế bào gan thực hiện chức năng nhờ có hệ thống enzym phong phú. Khi tế
bào gan bị tổn thương, các enzym này sẽ được giải phóng vào máu, làm nồng độ
enzym trong máu tăng cao. Aspartat transaminase (AST) và alanin transaminase
(ALT) thường được sử dụng là marker trong đánh giá mức độ tổn thương gan [61],
[70].
AST có ở ti thể và bào tương tế bào gan, có ở nhiều mô nhưng nhiều nhất ở cơ
tim và gan.
ALT có ở bào tương đặc trưng cho các bệnh lý ở gan vì có nhiều nhất ở gan, rất
ít ở tim và cơ vân.
Bảng 1.5. Chỉ số De Ritis (AST/ALT) trong chẩn đoán các bệnh về gan [32].
De Ritis (AST/ALT)
AST/ALT < 1 viêm gan do virus, gan nhiễm mỡ không do rượu, viêm gan cấp
AST/ALT > 1 xơ gan, bệnh mạn tính ở gan, ung thư gan
AST/ALT > 2 viêm gan do rượu
Khi các tế bào gan bị tổn thương, nồng độ các transaminase trong máu tăng lên
khoảng 6 – 8 lần hoặc hơn so với bình thường. Tuy nhiên trong một số trường hợp,
người bệnh có chỉ số transaminase bình thường nhưng gan vẫn bị tổn thương nặng.

18
1.3.3.4. Tổng quan một số dược liệu có tác dụng bảo vệ gan
- Cây cúc gai đen (Silybum marianum): Silymarin là một nhóm hợp chất chính
được chiết xuất từ cây cúc gai có tác dụng bảo vệ gan thông qua ổn định màng tế
bào, phục hồi màng tế bào gan bị tổn thương và kích thích tái tạo tế bào gan.
Silymarin còn ức chế stress oxy hóa do làm giảm gốc tự do, tăng glutathion (GSH)
ở gan, kích thích sự tổng hợp protein, làm nhanh chóng phục hồi hệ enzym trong tế
bào [27].
- Nhân trần (Adenosma caeruleum): Là vị thuốc thường được dùng để chữa bệnh
vàng da, bệnh về đường mật và bệnh của phụ nữ sau sanh, có tác dụng làm tăng tiết
mật, tăng giải độc gan, thanh nhiệt, trừ thấp, chống viêm, kháng khuẩn, chữa các
chứng hoàng đản nhiễm trùng, chữa cảm mạo do phong nhiệt [21], [91].
- Diệp hạ châu đắng (Phyllantus amarus): Có khả năng ức chế DNA polymerase
của virus gây viêm gan B [14]. Phạm Đức Dương và cộng sự (2001) đánh giá tác
dụng của VG99 trong thành phần có diệp hạ châu đắng, ngũ vị tử… trên bệnh nhân
viêm gan mạn tính sau 2 tháng điều trị cho thấy các triệu chứng lâm sàng viêm gan
giảm và 60% trường hợp có enzym gan trở về bình thường.
- Actiso (Cynara scolymus): Có tác dụng làm tăng bài tiết mật, tăng lượng nước
tiểu, hạ thấp cholesterol và ure trong máu [21]. Trên thị trường hiện nay có rất
nhiều dạng bào chế của actiso dùng để điều tri bệnh như: trà actiso, xiro actiso,
cao/viên actiso.
- Nghệ (Curcuma longa): Các curcuminoid, curcumin có tác dụng kích thích các tế
bào gan bài tiết mật, có tác dụng thông mật, có tác dụng bảo vệ và phục hồi tổn
thương gan cấp trên thực nghiệm [21], [24].
- Chó đẻ thân xanh (Phyllanthus urinaria): Huỳnh Ngọc Thụy và cộng sự (2001)
đã chứng minh tác dụng hạ AST và ALT của cao chiết từ cây chó đẻ thân xanh trên
chuột nhắt trắng bị gây độc gan bằng CCl4 [37].
- Cỏ mật (Eriochloa ramose (Retz.) Hack): Có tác dụng bảo vệ và phục hồi tổn
thương gan rõ rệt trên mô hình gây viêm gan thực nghiệm [46].
1.5. THỰC NGHIỆM GÂY TỔN THƯƠNG GAN
Tác động bảo vệ gan có thể được đánh giá bằng các chỉ số sinh hóa, tỷ lệ sống
hay đặc điểm mô học của gan. Các mô hình như in vitro, ex vivo hay in vivo và mỗi
mô hình có các đánh giá tác động bảo vệ hay điều trị gan [20].

19
- Mô hình in vitro: Những mô hình in vitro được thực hiện trên tế bào gan tươi, các
tế bào gan nuôi cấy sơ cấp và tế bào gan người (HepG2, HUH7, HepaRG) là lựa
chọn tốt nhất để sàng lọc các hợp chất bảo vệ gan tiềm năng và có thể thiết lập cơ
chế tác động ở mức độ tế bào và phân tử [2]. Nhằm đánh giá tác động bảo vệ, các
thông số như nồng độ enzym phóng thích ngoại bào, tăng sinh tế bào, hình dạng tế
bào sẽ được khảo sát [44].
- Mô hình ex vivo: Các lát cắt gan là môi trường ex vivo mô phỏng các đặc điểm đa
tế bào của các cơ quan in vivo với chi phí thấp hơn. Trong mô hình sử dụng các lát
cắt gan, số lượng động vật thử nghiệm giảm và mô hình cũng có thể áp dụng với
các cơ quan người. Tương tác giữa các tế bào và phân bố được giữ nguyên trong
mô hình này nên có thể dùng trong đánh giá thay đổi mô học. Các lát cắt gan có
đặc điểm giữ được chức năng của các enzym chuyển hóa và tiểu quản mật [65].
Các mô hình này cũng đánh giá quá trình chuyển hóa, tổn thương gan, đồng thời có
chức năng như cầu nối giữa hệ thống in vivo và môi trường tế bào [30]. Gan phân
lập được tưới máu là một mô hình kết hợp các đặc điểm in vitro và in vivo. Mô
hình này giữ được cấu trúc 3 chiều của ống mật tại thời điểm xử lý. Nhược điểm
của mô hình ex vivo là không thể đánh giá các thông số chức năng như dòng chảy
mật và dòng chảy động mạch cửa. Việc cung cấp nguồn oxy cho các tế bào gan
nuôi cấy bị hạn chế, khả năng sống của các lát cắt vẫn còn ngắn (8 – 10 ngày) [30].
Trong các phòng thí nghiệm nhỏ, do giới hạn không gian và chi phí, ưu tiên lựa
chọn là gan chuột được tưới máu, tuy nhiên vẫn có sự khác biệt về kích thước,
chức năng và hình dạng của gan chuột so với gan người.
- Mô hình in vivo được thực hiện trên động vật sống, phổ biến là chuột, thỏ, khỉ….
Tổn thương gây ra ở các động vật thử nghiệm do các chất gây độc gan khác nhau
và tác động của tổn thương và/hoặc khả năng bảo vệ của thuốc nghiên cứu được
đánh giá thông qua các thông số chuyển hóa và sinh hóa cũng như các đặc điểm mô
học [30].

20
Bảng 1.6. So sánh các mô hình đánh giá tác động bảo vệ gan [30].
Mô hình Mẫu thử nghiệm Ưu điểm Nhược điểm
In vitro
 Tế bào gan tươi
 Tế bào gan nuôi cấy
sơ cấp
 Các tế bào ung thư
gan (HepG2,
HUH7, HepRG)
 Nhanh và rẻ
 Cần ít mẫu tế bào
 Biến cố có kiểm soát
và độ lập lại cao
 Có thể phân tích được
nhiều mẫu cùng lúc
 Do các tế bào sắp xếp đơn
giản không phức tạp như
trong cơ thể nên cần thận
trọng khi nhận định kết quả
 Các mẫu thử không trải qua
quá trình biến đổi sinh học
nào nên không đúng với
thực tế
Ex vivo
 Lát cắt gan chuột
 Mẫu gan cô lập
 Môi trường tương tự
như in vitro
 Giảm số lượng động
vật thử nghiệm
 Mô hình thử trên gan
người có thể được
xây dựng
 Tỷ lệ oxy hóa nội bào giảm
 Khả năng sống của mẫu tế
bào lấy ra thấp
 Không có sự khác biệt về
kích cỡ và chức năng của
mô người và chuột
In vivo
Trên động vật (phổ biến
nhất là chuột)
 Được áp dụng rộng
rãi
 Có nhiều mối tương
quan với con người
 Tất cả các thông số
sinh hóa và mô học
đều đo được
 Tuân thủ đạo đức trong thử
nghiệm trên động vật
 Sự khác biệt giữa các cá thể
 Chi phí cao
1.5.1. Các tác nhân gây mô hình tổn thương gan phổ biến
Hiện nay trên thế giới, thực nghiệm gây tổn thương gan ở chuột được thực hiện
bởi rất các tác nhân khác nhau: Paracetamol (acetaminophen), CCl4, D-galactosamin,
ethanol, thioacetamid…(Bảng 1.7).

21
Bảng 1.7. Một số tác nhân gây tổn thương gan phổ biến
CCl4
CCl4 được tiêm vào trong màng bụng để gây tổn thương gan cấp hay mạn
theo cơ chế tạo gốc tự do và gây peroxy hóa lipid dẫn đến tổn thương gan
[19].
Ethanol
Gây tích tụ mỡ, viêm và hoại tử gan. Gây stress oxy hóa ở gan do tăng
phiên mã các cytokin tiền viêm và sự hình thành các gốc tự do [8].
D-galactosamin
Gây tổn thương gan tương tự như viêm gan virus ở người do sự tăng sản
xuất các gốc tự do. D-galactosamin gây ra sự cạn kiệt của nucleotid uracil,
dẫn đến ức chế tổng hợp RNA và protein. Cơ chế gây độc làm mất hoạt
động của bơm ion và tăng tính thấm của màng tế bào, dẫn đến giải phóng
enzym và tăng nồng độ Ca2+
nội bào [83].
Acetaminophen
(paracetamol, APAP)
APAP được chuyển hóa theo pha 1 (chủ yếu là CYP2E1) thành N-acetyl-
para-benzoquionone imine (NAPQI), nhanh chóng gắn vào glutathione
(GSH). Trong điều kiện hình thành quá mức NAPQI và sự suy giảm GSH,
chất chuyển hóa NAPQI liên kết hóa trị với protein sẽ gây rối loạn chức
năng ty thể và stress oxy hóa, dẫn đến tổn thương tế bào gan [77].
Thioacetamid
Thioacetamid gây ra tổn thương gan cấp và mạn tính, tác động lên quá
trình tổng hợp protein, DNA, RNA và hoạt động của gamma-glutamyl
transpeptidase (GGT) gây ra nhiều biến chứng có hại cho gan [74]
1.5.2. Thực nghiệm tổn thương gan bằng paracetamol
Paracetamol hay acetaminophen (tên hóa học: para-acetylaminophenol, APAP) là
một thuốc hạ sốt giảm đau phổ biến nhất hiện nay, không hoặc ít có tác dụng chống
viêm. So với các thuốc kháng viêm giảm đau không có gốc steroid, paracetamol có rất
ít tác dụng phụ (không kích ứng tiêu hóa, không ảnh hưởng đến chức năng tiểu cầu,
đông máu) nên được bán không cần kê đơn ở hầu hết các quốc gia [16].
1.5.2.1. Chuyển hóa paracetamol
Các chuyển hóa xảy ra trong các microsome gan. Khoảng 90% paracetamol
được chuyển đồi thành phức hợp glucuronid (APAP-Gluc, 52-57% được chuyển hóa
qua nước tiểu) và phức hợp sulfat (APAP-Sul, 30-44%), và một lượng nhỏ
paracetamol khoảng 2% được bài tiết mà không cần trải qua bất kỳ quá trình chuyển
hóa nào. Tuy nhiên, khoảng 5 - 10% paracetamol bị chuyển hóa qua cytochrome P450
(CYP1A2 và CYP2E1, chủ yếu là CYP2E1) tạo thành chất chuyển hóa NAPQI gây
độc và gây chết tế bào gan. Bình thường NAPQI sẽ nhanh chóng được khử độc thông

22
qua liên hợp với GSH ở gan để tạo thành acid mercapturic và cystein không gây độc.
Tuy nhiên khi NAPQI được sản sinh quá nhiều gây cạn kiệt GSH (giảm 70%), sẽ hình
thành các chất liên hợp protein thông qua liên kết với các nhóm cystein trên protein
của tế bào. NAPQI nhắm đến các protein ty thể và các kênh ion nên dẫn đến mất sản
xuất/cân bằng năng lượng ion và gây chết tế bào. Sự kết hợp của NAPQI với GSH xảy
ra thông qua quá trình tự phát và phản ứng được xúc tác bởi glutathione -S-transferase
(GSTs) [95] (Hình 1.8).
Hình 1.8. Con đường chuyển hóa acetaminophen [95].

23
Bảng 1.8. Một số nghiên cứu trên thực nghiệm gây tổn thương gan bằng paracetamol
Tác giả Đối tượng Liều, thời gian
Mohamad NE và cộng sự
(2015)
Chuột BALB/c
(4-5 tuần tuổi)
Gây tổn thương gan bằng paracetamol
liều 250 mg/kg để khảo sát tác dụng bảo
vệ gan của giấm Dứa (Ananas comosus),
so sánh với thuốc đối chiếu là silybinin
[57].
Vilash V và cộng sự
(2016)
Chuột Wistar Gây tổn thương gan bằng paracetamol
liều 250 mg/kg trong 7 ngày để khảo sát
tác dụng giải độc gan của cao chiết
ethanol từ lá cây Pellionia heyneana, so
sánh với thuốc đối chiếu silymarin [93].
Reham Zakaria Hamza và
cộng sự (2015)
Chuột ICR (35
– 40 g)
liều 200 mg/kg trong 30 ngày để khảo
sát tác dụng của hạt cây Thì là đen
(Nigella sativa), so sánh với silymarin
[34].
Amit Kaushik và cộng sự
(2017)
Chuột Swiss
albino (25 –
30 g)
được tiêm 1 liều duy nhất 500 mg/kg
vào màng bụng, để khảo sát tác dụng của
cao chiết từ dây thần thông (Tinospora
cordifolia) và cây sâm đất (boerhavia
diffusa), so sánh với thuốc đối chiếu Liv-
52 [55].

24
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu là lá cây Trứng cá trưởng thành thu hái từ cây được trồng sau 2
năm và đạt độ cao từ 3 đến 5 mét [80]. Lá cây Trứng cá được thu hái vào mùa khô
(tháng 3) tại tỉnh An Giang, được Bộ môn Tài nguyên Dược liệu-Trung tâm Sâm và
Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh định danh và lưu mẫu. Lá cây Trứng cá sau thu hái
được rửa sạch, phơi khô, đạt độ ẩm dược liệu theo Dược điển Việt nam V và được xay
thành bột có kích thước qua cỡ mắc rây số 250 (0,25 mm).
2.1.2. Động vật thử nghiệm
Các thử nghiệm in vivo được thực hiện trên chuột nhắt trắng đực (Swiss albino),
5 - 6 tuần tuổi, có trọng lượng trung bình 24 ± 2 g. Chuột và thực phẩm nuôi được
cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế - TP. Nha Trang. Các thí nghiệm trên
động vật nghiên cứu được thực hiện theo “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và
lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” của Bộ Y tế (ban hành kèm theo quyết
định số 141/QĐ – K2ĐT ngày 27/10/2015).
Hình 2.1. Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino
2.1.3. Thiết bị - dụng cụ
- Máy sinh hóa bán tự động Screen Master 3000 (Arezzo, Italy)
- Máy đo quang UV-Vis He⋏iosy (Unicam Limitted – Anh)
- Máy đồng thể SCIENTIFICA
- Máy ly tâm lạnh HERMEL Z32 HK
- Máy đo pH

25
- Cân phân tích PIONEER OHAUS
- Lò nung LENTON FURMACES
- Tủ sấy SANYO MOV-112
- Máy khuấy từ gia nhiệt VELP SCIENTIFICA
- Micropipette
- Các dụng cụ thí nghiệm trong phòng Dược lý- Hóa Sinh
- Kit GOT (ASAT) Liquidcolor của Human Diagnostic Ltd.Co (Đức)
- Kit GPT (ALAT) Liquidcolor của Human Diagnostic Ltd.Co (Đức)
- Máy UV-VIS 1800, dải đo 190 nm-900 nm
- Bản mỏng: TLC Silica gel 60 F254 (Gemany- Đức)
- Máy đo độ ẩm KERN MLS 50-3D (Gemany- Đức)
- Bếp điện
- Bể ổn nhiệt
- Dụng cụ giải phẩu: Kéo kẹp gạc...
- Cối chày, đủa thủy tinh
2.1.4. Hóa chất
- Acid acetic (CH3COOH) (Merck)
- Acid formid (Merck)
- Acid thiobarbituric (TBA) (Sigma Co.Ltd, Mỹ)
- Acid tricloacetic (TCA) (Sigma Co. Ltd, Mỹ)
- Các hóa chất chuyên dụng trong phòng Dược lý- Hóa Sinh
- Ethanol dược dụng 96% (Công ty OPC, Việt Nam)
- Formalin 37% (Sigma Co.Ltd, Mỹ)
- Hóa chất sơ bộ thành phần hóa học
- Quercetin (C15H10O7) Sigma Co. Ltd, (Mỹ)
- Silymarin (Sigma Co. Ldt, Mỹ)
- Thuốc thử Ellman (DTNB) (Sigma Co. Ldt, Mỹ)
- Nước cất
- Nước muối sinh lý 0,9%
- Paracetamol (PARA), (công ty cổ phần XNK Y tế DOMESCO, Mỹ)
- Diclofenac natri 75 mg (Novartis Co. Ldt, Thụy Sĩ)

26
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sơ đồ 2.1. Thiết kế các nội dung nghiên cứu

27
2.2.1. Phương pháp chiết các cao từ lá cây Trứng cá
2.2.1.1. Chiết cao cồn ethanol 45% theo phương pháp ngấm kiệt
- Nguyên tắc: cho dung môi chảy rất chậm qua khối dược liệu đựng trong bình ngấm
kiệt theo quy định. Trong suốt quá trình ngấm kiệt không khuấy trộn. Dược liệu luôn
được tiếp xúc với dung môi mới, luôn tạo ra sự chênh lệch nồng độ hoạt chất từ cao
đến thấp nên có thể chiết kiệt hoạt chất [64].
Hình 2.2. Bình chiết ngấm kiệt
- Cách tiến hành: Cân 300 g bột dược liệu lá cây Trứng cá, làm ẩm 30 phút với dung
môi (ethanol 45%) và nhồi dược liệu vào bình ngấm kiệt, thêm dung môi sao cho bề
mặt dung môi luôn nằm trên dược liệu khoảng 5 cm. Tỉ lệ chiết dược liệu khô (g):
ethanol 45% (mL) là 1:15, ngâm lạnh trong 72 giờ và xả vòi bình chiết với tốc độ rút
dịch là 50 – 60 giọt/phút, thu dịch chiết, sau đó cô quay áp suất giảm để thu hồi
ethanol (nhiệt độ cô quay là 50 o
C), tiếp theo cô cách thủy và thu được cao cồn 45% từ
lá cây Trứng cá.

28
Hình 2.3. Máy cô quay thu hồi cồn ethanol
2.2.1.2. Chiết cao nước lá cây Trứng cá theo phương pháp sắc hãm
- Nguyên tắc: Cho lượng dược liệu vừa đủ đã chia nhỏ vào trong nồi đun theo quy
định, đun sôi đều dược liệu với nước sao cho được liệu luôn được tiếp xúc với nước,
tránh để dược liệu bị trào ra ngoài [64].
- Cách tiến hành: Cân 300 g bột dược liệu lá cây Trứng cá cho vào nồi đun, thêm nước
cất sao cho bề mặt nước cất luôn nằm trên dược liệu khoảng 2 cm với tỉ lệ chiết dược
liệu khô (g): nước (mL) là 1:15. Khi mới sắc, để lửa to cho chóng sôi. Khi đã sôi vặn
xuống mức lửa vừa nhỏ để sôi âm ỉ nhằm để chiết kiệt chất. Điều chỉnh ngọn lửa để
dịch chiết sôi nhưng không trào ra. Chắt lấy dịch chiết lần 1. Gạn lấy bã dược liệu và
tiếp tục sắc lần 2. Hỗn hợp dịch chiết được lọc lại bằng giấy lọc và dịch lọc được cô
cách thủy ở nhiệt độ không quá 60 °C cho đến khi thành cao.
2.2.2. Xác định mất khối lượng do làm khô của nguyên liệu và cao chiết
- Nguyên tắc: Sử dụng máy sấy ẩm hồng ngoại Kern, MLS 50-3D. Máy sấy hoạt động
dựa trên nguyên tắc sử dụng lượng nhiệt sinh ra từ đèn halogen để làm khô dược liệu
tới khối lượng không đổi, sau khi dược liệu khô máy sẽ hiển thị kết quả cuối cùng là
phần trăm độ ẩm. Lượng nhiệt sinh ra từ đèn halogen này có thể thổi bay hơi ẩm hoặc
dư lượng nước tồn tại trong dược liệu. Theo phụ lục 9.6 trong Dược điển Việt Nam V

29
quy định độ ẩm mẫu dược liệu không vượt quá 13% và độ ẩm của mẫu cao đặc không
quá 20%, độ ẩm của mẫu cao khô không quá 5%
- Cách thực hiện: Cân 0,1 g cao hoặc 1,0 g dược liệu khô lá Trứng cá, trải đều trên đĩa
nhôm, đậy nắp và chờ máy hoạt động từ 5-7 phút. Màn hình sẽ hiển thị kết quả về
phần trăm độ ẩm. Ghi nhận kết quả.
Hình 2.4. Máy sấy hồng ngoại Kern
2.2.3. Định tính và định lượng flavonoid
2.2.3.1. Định tính flavonoid:
- Dựa vào phản ứng hóa học.
Bảng 2.1. Định tính hợp chất flavonoid trong lá Trứng cá bằng phản ứng hóa học
Phản ứng Cách tiến hành Hiện tượng
Với dung dịch NaOH 20% 1 mL dịch lọc A và B + 3 giọt NaOH 20% Tủa màu vàng
Với dung dịch FeCl3 5% 1 mL dịch lọc A và B + dung dịch FeCl3
5%
Màu xanh đen
Với Cyanidin 1 mL dịch lọc A và B + bột magie kim loại
+ 3 giọt HCl đậm đặc
Màu đỏ đậm
Lấy khoảng 0,5 g cao chiết từ lá Trứng cá cho vào 2 ống nghiệm được đánh dấu
tương ứng A (cao cồn) và B (cao nước), thêm 5 mL ethanol 90% vào mỗi ống sau đó
lắc đều. Cho 1 mL dịch vào 4 ống nghiệm (có 01 ống đối chứng) và tiến hành các phản
ứng như bảng 2.1 [18].

30
- Dựa vào phương pháp sắc ký lớp mỏng [16]
Bản mỏng: TLC Silica gel 60 F254
 Hệ dung môi khai triển: Toluen : ethyl acetat : acid formic (5 : 4 : 0,2 )
 Dung dịch mẫu thử: Lấy khoảng 1 g cao chiết lá Trứng cá hòa với 5 mL
ethanol 96%, khuấy đều.
 Dung dịch chuẩn quercetin: Lấy 3 mg quercetin, hòa tan với 3 mL ethanol
96%.
 Cách tiến hành: Chấm song song riêng biệt trên lên bản mỏng dung dịch
mẫu thử và dung dịch chuẩn quercetin. Sau khi khai triển, để khô bản mỏng
ngoài không khí ở nhiệt độ phòng, sau đó hiện màu bằng dung dịch FeCl3
5%. Soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
 Yêu cầu: Trên sắc ký lớp mỏng phải cỏ vết màu vàng khi soi dưới đèn UV
tại bước sóng 254 nm có phát quang. So sánh về màu sắc và cùng giá trị Rf
với vết quercetin trên sắc ký lớp mỏng.
2.2.3.2. Định lượng hàm lượng flavonoid
Hàm lượng flavonoid tổng được xác định theo nghiên cứu của Chang và cộng sự
có hiệu chỉnh [15].
Hút đồng lượng 1 mL dung dịch quercetin (các nồng độ 10 - 100 µg) và AlCl3 2%,
để phản ứng trong 10 phút. Tiến hành xác định độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ UV-
Vis He⋏iosy (Unicam Limitted - Anh) ở bước sóng 415 nm.
Các mẫu cao chiết được tiến hành tương tự như quercetin, thí nghiệm được lặp lại
3 lần. Hàm lượng flavonoid toàn phần có trong mẫu cao chiết được quy theo quercetin
và được tính bằng công thức [92].
F = c x V/m
Trong đó:
F: Hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao chiết lá Trứng cá (mg/g).
c: giá trị x từ đường chuẩn quercetin y= ax+b (mg/mL)
V: Thể tích dịch chiết (mL)
m: Khối lượng cao chiết có trong thể tích (g)

31
2.2.4. Khảo sát tính an toàn của cao chiết từ lá cây Trứng cá
Chuột được chia thành các lô có trọng lượng tương tự, những chuột ở cùng một
lô sẽ nhận cùng một liều chất khảo sát. Thể tích cho uống tối đa một lần là 20 ml/kg
trọng lượng chuột [22].
Chỉ tiêu đánh giá kết quả:
- Sự đánh giá dựa vào phản ứng toàn ứng hay bất ứng (sống hay chết) nhận thấy ở
mỗi chuột trong nhóm sau 72 giờ. Chuột được tiếp tục theo dõi sau 14 ngày
uống để ghi nhận những triệu chứng bất thường (nếu có)
- Theo dõi các biểu hiện về hành vi của chuột thí nghiệm trong vòng 72 giờ sau
khi dùng thuốc và trong hai tuần tiếp theo. Ghi mốc thời gian cho chuột uống
thuốc, thời gian xuất hiện các triệu chứng khác thường. Ghi nhận số chuột chết
trong từng lô.
- Quan sát đại thể (quan sát phổi, tim, gan, thận, ruột) ngay sau khi chết đối với
chuột bị chết.
Có 3 trường hợp có thể xảy ra:
- Trường hợp 1: Sau khi cho chuột uống mẫu thử ở liều tối đa có thể bơm được
qua kim cho uống, số chuột trong lô thử nghiệm vẫn bảo toàn, xác định liều cao
nhất có thể bơm qua kim mà không làm chết chuột. Liều này được ký hiệu là
Dmax và liều tương đối an toàn Ds dùng trong các thực nghiệm dược lý có thể
bằng 1/5 Dmax hoặc lớn hơn 1/5 Dmax.
- Trường hợp 2: Sau khi cho chuột uống mẫu thử, tỉ lệ tử vong là 100% thì đây là
liều gây chết tuyệt đối – LD100. Tính toán và gây các lô thử nghiệm (khoảng
cách liều theo cấp số nhân) để tiếp tục xác định được liều không làm chết con
vật nào – LD0. Từ đó, suy ra liều LD50 được tính theo công thức Behrens-
Karber. Liều tương đối an toàn DS dùng cho thực nghiệm dược lý có giá trị
bằng 1/10 LD50 hoặc thấp hơn (thường 1/20-1/50 LD50).
- Trường hợp 3: Sau khi cho uống mẫu thử, phân suất tử vong thấp hơn 100%,
không xác định được liều gây chết tuyệt đối. Đối với trường hợp này, không thể
suy ra liều LD50, nhưng có thể xác định được liều tối đa không gây chết chuột,
gọi là liều dưới liều chết – LD0. Liều tương đối an toàn DS dùng cho thực
nghiệm dược lý có giá trị bằng 1/5 LD0 hoặc thấp hơn.

32
2.2.5. Khảo sát tác dụng giảm đau của các cao chiết từ lá Trứng cá trên
chuột nhắt trắng
Bảng 2.2. Thiết kế thử nghiệm gây đau chuột bằng acid acetic 1% hoặc bằng formalin
2,5%.
Lô (n=8) Mẫu thử nghiệm
Đối chứng Nước cất
Cao lá Trứng cá
Cao cồn từ lá Trứng cá liều 0,69 g/kg
Cao cồn từ lá Trứng cá liều 1,37 g/kg
Cao nước từ lá Trứng cá liều 0,56 g/kg
Cao nước từ lá Trứng cá liều 1,12 g/kg
Đối chiếu Diclofenac natri liều 15 mg/kg
2.2.5.1. Thực nghiệm gây đau bằng dung dịch acid acetic 1%
Thiết kế nghiên cứu: Ngẫu nhiên, có đối chứng.
Sau 5 ngày cho chuột uống các cao lá Trứng cá với các liều tương ứng với từng
lô theo bảng 2.2. Vào ngày thứ 5, 60 phút sau khi cho chuột uống, tiến hành gây đau
bằng cách tiêm phúc mạc acid acetic 1% (0,10 mL, i.p). Ghi nhận hành vi đau của
chuột thể hiện qua số lần xoắn bụng tương ứng với 3 giai đoạn: 0 - 10 phút, 10 - 20
phút, 20 - 30 phút trong tổng thời gian 30 phút [117]. Phần trăm giảm số cơn đau khi
dùng cao chiết được tính theo công thức:
( )
Trong đó:
A%: Là tỷ lệ phần trăm số cơn đau của nhóm uống cao chiết từ lá Trứng cá (%)
Dc: Là số cơn đau quặn trung bình của nhóm uống nước cất (lần / 5 phút)
Dt: Là số cơn đau quặn trung bình của nhóm uống cao chiết từ lá Trứng cá hoặc
nhóm uống diclofenac natri (số lần / mỗi 10 phút)
2.2.5.2. Thực nghiệm gây đau bằng dung dịch formalin 2,5%
Thiết kế nghiên cứu: Ngẫu nhiên, có đối chứng.
Sau 5 ngày cho chuột uống các cao lá Trứng cá với các liều tương ứng với từng
lô theo bảng 2.2. Vào ngày thứ 5, 60 phút sau khi chuột uống cao chiết, tiến hành gây
đau bằng cách tiêm 0,02 mL formalin 2,5% vào gan bàn chân phải của chuột. Ghi

33
nhận hành vi đau của chuột thể hiện qua số lần chuột liếm vào bàn chân phải sau mỗi 5
phút và được chia thành 2 giai đoạn quan sát [74]:
 Pha sớm (early-phase): 0 phút đến 5 phút sau khi tiêm formalin.
 Pha muộn (late-phase): 20 phút đến 30 phút sau khi tiêm formalin.
Phần trăm giảm số cơn đau khi dùng cao chiết được tính theo công thức:
( )
Trong đó:
A%: Là tỷ lệ phần trăm số cơn đau của nhóm uống cao chiết từ lá Trứng cá (%)
Dc: Là số lần liếm chân trung bình của nhóm uống nước cất (lần / 5 phút)
Dt: Là số lần liếm chân trung bình của nhóm uống cao chiết từ lá Trứng cá hoặc
nhóm uống diclofenac natri (số lần / mỗi 5 phút)
2.2.6. Khảo sát tác dụng bảo vệ gan của các cao chiết từ lá cây Trứng cá trên
chuột nhắt đực trắng gây tổn thương gan mạn bằng paracetamol
2.2.6.1. Thực nghiệm gây tổn thương gan mạn bằng paracetamol
Bảng 2.3. Thiết kế thử nghiệm gây tổn thương gan chuột bằng paracetamol
Nhóm
Lô chuột
(n = 8)
Mẫu thử nghiệm
Sinh lý (APAP-)
Chứng Sinh lý Nước cất
Thử 1 Cao chiết cồn lá Trứng cá liều 1,37 g/kg
Thử 2 Cao chiết nước lá Trứng cá liều 1,12 g/kg
Đối chiếu Silymarin liều 0,10 g/kg
Bệnh lý
(APAP+)
Chứng Bệnh lý Nước cất
Thử 1 (2 lô) Cao chiết cồn lá Trứng cá liều 0,69 g/kg và 1,37 g/kg
Thử 2 (2 lô)
Cao chiết nước lá Trứng cá liều 0,56 g/kg và 1,12
g/kg
Đối chiếu Silymarin liều 0,10 g/kg
Thiết kế nghiên cứu: Ngẫu nhiên, có đối chứng. Chuột được chia ngẫu nhiên thành 2
nhóm (bảng 2.3):
- Nhóm bình thường (APAP -): không gây độc gan bằng paracetamol.
- Nhóm bệnh lý (APAP +): từ ngày 1 đến ngày 7 cho uống paracetamol liều 250
mg/kg. Sau 1 giờ uống paracetamol liều 250 mg/kg ở ngày thứ 7, tiến hành lấy
máu tĩnh mạch đuôi chuột để định lượng AST, ALT trong huyết tương. Sau đó

34
tiến hành phân lô ngẫu nhiên và điều trị như bảng 2.3. Từ ngày 7 đến ngày 14
của mô hình, các lô thử nghiệm được cho uống nước cất, mẫu thử hoặc
silymarin sau một giờ uống paracetamol liều 250 mg/kg. Sau 1 giờ cho uống
mẫu thử ở ngày 14 của mô hình, tiến hành lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột để
định lượng hoạt độ AST, ALT trong huyết tương theo hướng dẫn của bộ kit
định lượng. Vào ngày thứ 15, mổ tách lấy gan chuột đem đồng thể và định
lượng MDA và GSH trong gan [63].
Sơ đồ 2.2. Bố trí thí nghiệm gây tổn thương gan mạn bằng paracetamol
2.2.6.2. Định lượng aspartat aminotransferase (ASAT) huyết tương theo Kit
GOT (ASAT) Liquidcolor của Human Diagnostic Ltd.Co (Đức)
- Nguyên tắc:Hoạt độ AST được xác định dựa trên phương trình phản ứng [63]:
MDH là malate dehydrogenase, xúc tác phản ứng tạo malat và oxy NADH tạo NAD+
,
đo độ giảm NADH ở bước sóng 340 nm, từ đó tính được hoạt độ của enzym.
- Hóa chất:
Huyết tương (ống EDTA chống đông)
Subtrat (SUB): 2-oxoglutarat, NADH, Sodium azid.
Buffer (BUF): TRIS buffer (pH= 7,9), L-Aspartat, LDH, MDH, Sodium azid.
- Tiến hành:

35
 Thu 0,2 mL máu tĩnh mạch đuôi chuột vào ống EDTA, ly tâm 3000 vòng/phút
trong 10 phút. Hút 50 µl huyết tương.
 Pha SUB và BUF theo tỉ lệ 1:4, thu được hỗn hợp thuốc thử.
 Trộn 250 µl thuốc thử và 25 µl huyết tương, ủ ở 37 o
C trong 1 phút. Đọc kết quả
sau 2 phút trong máy đo sinh hóa bán tự động.
2.2.6.3. Định lượng alanin aminotransferase (ALAT) huyết tương theo Kit
GPT (ALAT) Liquidcolor của Human Diagnostic Ltd.Co (Đức)
- Nguyên tắc:Hoạt độ ALT được xác định dựa trên phương trình phản ứng [63]:
LDH là lactate dehydrogenase, đo độ giảm hấp thu của NADH ở bước sóng 340 nm,
từ đó xác định được hoạt độ của enzym.
- Hóa chất:
Huyết tương (ống EDTA chống đông)
Subtrat (SUB):2- oxoglutarat, NADH, Sodium azid.
Buffer (BUF): Tris buffer (pH= 7,5), L-alanin, LDH, Sodium azid.
- Tiến hành:
 Thu 0,2 mL máu tĩnh mạch đuôi chuột vào ống EDTA, ly tâm 3000 vòng/phút
trong 10 phút. Hút 50 µl huyết tương.
 Pha SUB và BUF theo tỉ lệ 1:4, thu được hỗn hợp thuốc thử.
 Trộn 250 µl thuốc thử và 25 µl huyết tương, ủ ở 37 o
C trong 1 phút. Đọc kết quả
sau 2 phút trong máy đo sinh hóa bán tự động.
2.2.6.4. Phương pháp định lượng malondialdehyd (MDA) và glutathion (GSH)
trong gan chuột
- Định lượng MDA
+ Nguyên tắc: MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid, khi cho MDA phản
ứng với acid thiobarbituric (TBA), thì một phân tử MDA sẽ phản ứng với hai phân tử
TBA tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Tác dụng chống oxy
hóa thể hiện qua việc làm giảm hàm lượng MDA có trong mẫu, qua đó làm giảm hàm
lượng của phức hợp này. Phản ứng xảy ra ở môi trường có pH từ 2-3, nhiệt độ 90 - 100

36
o
C trong 10 - 15 phút. Đo cường độ màu của phức hợp suy ra lượng MDA có trong
mẫu [63].
Phương trình phản ứng:
Hình 2.5. Phương trình tạo phức (màu hồng) giữa MDA và thuốc thử TBA
+ Tiến hành: Tách gan chuột rồi nghiền đồng thể trong dịch đệm KCl 1,15% lạnh (tỉ lệ
1: 10) trong 1 phút ở tốc độ 13.000 vòng/phút. Lấy 2 mL dịch đồng thể gan bổ sung
dung dịch đệm Tris-HCl (pH = 7,4) vừa đủ 3 mL, ủ ở 37 o
C trong 1 giờ. Kết thúc phản
ứng bằng 1 mL acid trichloroacetic (TCA) 10%, ly tâm 10.000 vòng/phút. Lấy 2 mL
dịch trong sau ly tâm cho phản ứng với 1mL TBA 0,8% ở 100 o
C trong 15 phút và đo
màu ở λ =532 nm.
+ Tính toán kết quả: Hàm lượng MDA (nM/g protein) được tính theo phương trình hồi
quy tuyến tính (y = 0,0796x + 0,0035; R2
= 0,9992) của chất chuẩn MDA.
- Định lượng GSH
+ Nguyên tắc: GSH trong dịch chiết sinh học phản ứng với thuốc thử Ellman hay còn
gọi là DTNB (5, 5’-dithiobis – (2-nitrobenzoic acid)) tạo ra sản phẩm là glutathion
disulfid (GSSG), và 2-nitro-5-thiobenzoic acid có màu vàng hấp thụ cực đại ở bước
sóng 412 nm. Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng GSH [63].
Hình 2.6. Phương trình tạo phức màu giữa GSH và thuốc thử Ellman
+ Tiến hành: Qui trình đồng thể gan tương tự như trong định lượng MDA. Sau khi ly
tâm lấy 1 mL dịch trong cho phản ứng với 0,2 mL thuốc thử Ellman là 5,5’–dithiobis–

37
2–nitrobenzoic acid và thêm đệm phosphat – EDTA vừa đủ 3 mL. Để 3 phút ở nhiệt
độ phòng và sau đó tiến hành đo quang ở bước sóng  = 412 nm.
+ Tính toán kết quả: Hàm lượng GSH (nM/g protein) được tính theo phương trình hồi
quy tuyến tính (y = 0,0043x - 0,0033; R2
= 0,9991) của chất chuẩn GSH.
2.2.7. Đánh giá kết quả
Số liệu thực nghiệm thể hiện bằng số trung bình M ± sai số chuẩn của giá trị
trung bình (SEM). Xử lý số liệu bằng phần mềm MS Excel 2016, xử lý thống kê dựa
vào phép kiểm One –Way ANOVA và hậu kiểm bằng Student – Newman – Keuls test
(phần mềm SigmaStat 3.5, Mỹ). Kết quả thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin
cậy trên 95% khi p < 0,05 so với lô chứng và lô thuốc đối chiếu.
2.3. ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Y HỌC
Lịch sử nghiên cứu thuốc mới đã chứng minh tầm quan trọng không thể phủ
nhận của các động vật thí nghiệm, trong đó chuột nhắt trắng đặc biệt được đánh giá
cao vì có sự tương đồng với 80% gen của người. Các điều kiện cần thiết để đảm bảo
đạo đức cho các nghiên cứu trên động vật là phải có các nghiên cứu tiền đề sàng lọc
trước trên các thực nghiệm in silico - in vitro - ex vivo, chọn lọc phương pháp/mô hình
có độ tin cậy khoa học để giảm thiểu số lượng động vật sử dụng, hạn chế gây các tổn
thương đau đớn (cần sử dụng thuốc giảm đau, thuốc gây mê trước khi phẫu thuật) hoặc
tránh gây stress cho động vật trong quá trình nghiên cứu, tạo môi trường nuôi dưỡng
với điều kiện nhiệt độ/độ ẩm và ánh sáng thích hợp, cung cấp đầy đủ thức ăn và nước
uống.
Các nghiên cứu của đề tài tuân thủ theo “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng
thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” của Bộ Y tế (ban hành kèm theo quyết định số
141/QĐ – K2ĐT ngày 27/10/2015) và đảm bảo thực thi theo nguyên tắc 3R
(Reduction – Refinement – Replacement) trong các khâu thiết kế nghiên cứu, các thao
tác kỹ thuật và lấy mẫu sinh học trên động vật nghiên cứu.

38
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ
3.1. CHIẾT XUẤT CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ TRỨNG CÁ VÀ ĐỊNH TÍNH-
ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID
3.1.1. Chiết xuất các cao chiết từ lá Trứng cá
Bảng 3.1. Kết quả hiệu suất cao chiết
Mẫu chiết Hiệu suất chiết (%) Hiệu suất chiết (%) đã trừ ẩm
Cao chiết nước 22,36 32,04
Cao chiết cồn 27,40 11,24
Kết quả được trình bày trong bảng 3.1 cho thấy cao chiết cồn có hiệu suất chiết lớn
hơn cao chiết nước.
Bảng 3.2. Kết quả độ ẩm bột lá Trứng cá và các cao chiết
Mẫu Bột dược liệu Cao nước Cao cồn
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3
Độ ẩm (%) 8,62 10,00 11,52 14,46 14,50 12,88 4,61 4,70 4,79
Trung bình (%) 10,04 13,95 4,70
Kết quả độ ẩm được trình bày trong bảng 3.2 cho thấy bột lá Trứng cá có độ ẩm
là 10,04% đạt yêu cầu về độ ẩm của mẫu dược liệu (không vượt quá 13% độ ẩm mẫu
dược liệu theo phụ lục 9.6 trong Dược điển Việt Nam V). Độ ẩm của cao chiết nước từ
lá Trứng cá là 13,95% đạt yêu cầu về độ ẩm của mẫu cao đặc (không vượt quá 20% độ
ẩm theo phụ lục 9.6 trong Dược điển Việt Nam V) và độ ẩm cao chiết cồn từ lá trứng
là 4,70% đạt yêu cầu về độ ẩm của mẫu cao khô (không vượt quá 5% độ ẩm theo phụ
lục 9.6 trong Dược điển Việt Nam V)
Từ kết quả hiệu suất chiết và độ ẩm của các cao chiết, các liều thử nghiệm tác
dụng dược lý sẽ được lựa chọn tương đương với 2,5 g và 5 g nguyên liệu.
3.1.2. Định tính- định lượng flavonoid
3.1.2.1. Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học
Kết quả định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học được trình bày trong hình 3.1
cho thấy cao cồn và cao nước lá Trứng cá đều chứa flavonoid.

39
Dịch A. Cao nước lá Trứng cá Dịch B. Cao cồn lá Trứng cá
Hình 3.1. Định tính bằng phản ứng hóa học của lá cây Trứng cá
Ký hiệu:
1.Dung dịch đối chứng
2.Dung dịch sau khi phản ứng với dung dịch NaOH 20%
3.Dung dịch sau khi phản ứng với dung dịch FeCl3 5%
4.Dung dịch sau khi phản ứng với bột magie kim loại và 3 giọt HCl đậm đặc
Bảng 3.3. Kết quả định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học
Phản ứng Hiện tượng
Cao cồn lá
Trứng cá
Cao nước lá
Trứng cá
Với dung dịch NaOH 20% Tủa màu vàng + +
Với dung dịch FeCl3 5% Màu xanh đen + +
Với bột magie + 3 giọt HCl đậm đặc) Màu đỏ đậm + +
Ghi chú: (+) Có phản ứng
3.1.2.2. Kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng được trình bày trong hình 3.2 cho thấy
màu sắc và giá trị Rf của vết thu được trên sắc ký đồ của các cao chiết tương ứng với màu
sắc và giá trị Rf = 4,3 của chất chuẩn quercetin. Như vậy, có sự hiện diện của quercetin
trong các cao chiết từ lá Trứng cá.

40
Toluen: ethyl acetat : acid formic (5 : 4 : 0,2 ) (v/v/v)
Quan sát dưới ánh sáng
thường
Quan sát dưới đèn UV
tại bước sóng 254 nm
Phun thuốc thử FeCl3 5%
Quan sát dưới ánh sáng
thường
Hình 3.2. Sắc ký đồ định tính quercetin trong các cao chiết từ lá Trứng cá
Ký hiệu: m1- Quercetin; m2- Cao cồn lá Trứng cá; m3- Cao nước lá Trứng cá
3.1.2.3. Kết quả định lượng flavonoid toàn phần của các cao chiết từ lá Trứng cá
Đo độ hấp thụ của chất chuẩn quercetin bằng máy đo quang phổ UV-Vis
He⋏iosy ở bước sóng 415 nm. Kết quả sau khi đo độ hấp thu của quercetin được trình
bày trong hình 3.3, cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thu của
quercetin theo phương trình y = 0,008x – 0,0447; R² = 0,9927 trong khoảng nồng độ
quercetin từ 10 - 100 µg.
Hình 3.3. Đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thu của quercetin
y = 0,008x - 0,0447
R² = 0,9927
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 20 40 60 80 100
ĐÔ
HẤP
THU
OD

41
Bảng 3.4. Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo quercetin trong các cao chiết từ lá
Trứng cá
Mẫu thử
Hàm lượng flavonoid toàn phần
(mg quercetin/g cao chiết)
Cao cồn lá Trứng cá 21,87 ± 0,49*
Cao nước lá Trứng cá 18,48 ± 0,69
(*)
: p < 0,05
Kết quả bảng 3.4 cho thấy hàm lượng flavonoid có trong cao cồn cao hơn khác biệt
có ý nghĩa thống kê so với cao nước (p = 0,016). Cao cồn lá Trứng cá cho hàm lượng
flavonoid toàn phần là 21,87 mg quercetin/g cao chiết, nhiều hơn cao nước lá Trứng cá
(18,48 mg quercetin/g cao chiết).
3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ TRỨNG CÁ
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát liều an toàn của các cao chiết lá Trứng cá
Mẫu cao Cao cồn
lá Trứng cá
Cao nước
lá Trứng cá
Số động vật thí nghiệm (n) 10 10
Khối lượng cao (g) 5,04 5,03
Tổng thể tích sau khi pha (mL) 4,51 4,80
Liều D max (g / kg) 22,35 20,99
Liều an toàn D s
(g cao / kg trọng lượng chuột)
0,69 0,56
1,37 1,12
Phân suất tử vong 0 0
Kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống của các cao chiết từ lá Trứng cá được
trình bày trong bảng 3.5. Chuột được cho uống các cao từ lá Trứng cá với thể tích là 20
mL / kg thể trọng chuột. Sau khi cho 5 g cao chiết được pha trong nước cất cho tới độ
đậm đặc tối đa có thể bơm qua kim cho chuột uống thì tất cả chuột đều khỏe mạnh, các
hoạt động sinh lý như ăn, uống, hành vi đều bình thường và tỷ lệ chuột hy sinh sau 72
giờ và sau 14 ngày quan sát là 0%. Cao cồn và cao nước lá Trứng cá không có độc tính
cấp đường uống và không xác định được LD50. Liều tối đa qua kim nhưng không làm
chết chuột D max lần lượt là 22,03 g / kg và 20,99 g / kg.
Từ D max xác định liều an toàn Ds cho thử nghiệm được lý tương đương 2,5 g và
5 g được liệu khô như sau:
 Cao cồn lá Trứng cá: Liều 0,69 g / kg và 1,37 g / kg

Nghiên cứu tác dụng giảm đau và bảo vệ gan của các cao chiết từ lá cây Trứng cá (Muntingia calabura L.).pdf

Nghiên cứu tác dụng giảm đau và bảo vệ gan của các cao chiết từ lá cây Trứng cá (Muntingia calabura L.).pdf

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên cứu tác dụng giảm đau và bảo vệ gan của các cao chiết từ lá cây Trứng cá (Muntingia calabura L.).pdf

Similar to Nghiên cứu tác dụng giảm đau và bảo vệ gan của các cao chiết từ lá cây Trứng cá (Muntingia calabura L.).pdf (20)

More from Man_Ebook

More from Man_Ebook (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Nghiên cứu tác dụng giảm đau và bảo vệ gan của các cao chiết từ lá cây Trứng cá (Muntingia calabura L.).pdf