Teks tersebut membahas tentang metode hitung bakteri secara kualitatif yaitu metode Most Probable Number (MPN) untuk menghitung jumlah bakteri koliform. Metode ini terdiri dari 3 langkah yaitu uji pendugaan, penguatan, dan lengkap dengan menggunakan medium tertentu dan Tabel Hopkins untuk menentukan indeks MPN.

1. MIKROBIOLOGI DAN TOKSIKOLOGI
HASIL PERIKANAN
TEKNIK HITUNG MIKROBA (KUANTITATIF)
[ METODE MOST PROBABLE NUMBER (MPN) ]
COLIFORM
ELYJOHN KARIMELA, S. Pi., M. Si PS. TEKNOLOGI PENGOLAHAN HASIL LAUT

2. A. TUJUAN
•Memahami prinsip dasar hitung bakteri secara
kualitatif.
•Melatih mahasiswa menghitung bakteri
menggunakan metode MPN.

3. B. PENGERTIAN
• MPN Coliform adalah suatu metode penentuan angka
mikroorganisme dengan metode Angka Paling Mungkin yang
digunakan luas di lingkungan sanitasi untuk menentukan jumlah
koloni Coliform di dalam air, susu dan makanan lainnya.
• Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jumlah bakteri
yang dapat memfermentasi laktosa membentuk gas, misalnya
bakteri Coliform.

4. C. PRINSIP MPN
• Metode MPN menggunakan medium cair di dalam tabung reaksi,
dimana prinsipnya adalah menghitung jumlah tabung yang positif
yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu
tertentu.
• Tabung pada pengujian MPN dinyatakan positif apabila timbul
kekeruhan dan atau terbentuknya gas di dalam tabung Durham.

5. PENGUJIAN
• Pengujian menggunakan metode MPN terdiri atas dua cara, yaitu
menggunakan deretan 3 tabung dan deretan 5 tabung reaksi.

6. PENGUJIAN
•Berbeda dengan metode hitung bakteri secara
kualitatif, pada hitung bakteri kualitatif ini jumlah
koloni atau sel bukanlah tujuan akhir uji ini. Uji ini
lebih diarahkan untuk mendeteksi apakah ada
bakteri tertentu, terutama bakteri koliform yang
telah mengkontaminasi suatu produk perikanan.

7. PRINSIP DASAR METODE INI MELIPUTI 3 (TIGA)
LANGKA:
• 1.Uji Pendugaan (Presumtive
Test)
•Dengan cara menumbuhkan suspensi bakteri dalam
media kaldu laktosa (lactose broth, LB) pada suhu
37C selama semalam kemudian mengamati
pembentukan asam dan gas setelah proses inkubasi.

8. PRINSIP DASAR METODE INI MELIPUTI 3 (TIGA)
LANGKAH :
•Asam dan gas dihasilkan melalui suatu proses
fermentasi laktose sebagai akibat proses fermentasi
oleh bakteri yang ditandai dengan terjadinya
perubahan warna media LB dari merah atau biru (pH
7.1) menjadi kuning (pH asam) dan terperangkapnya
gas (CO2) dalam tabung Durham.
• 1.Uji Pendugaan (Presumtive
Test)

9. PRINSIP DASAR METODE INI MELIPUTI 3 (TIGA)
LANGKAH :
•Dengan menggunakan jarum Ose, semua tabung
yang positif (memproduksi asam dan gas)
dipindahkan pada media selektif EMB (Eosin
Methylene Blue) Agar atau Endo Agar dengan cara
menggoresnya pada permukaan media tersebut.
• 2. Uji Penguatan (Confirmative
Test)

10. PRINSIP DASAR METODE INI MELIPUTI 3 (TIGA)
LANGKAH :
• Selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu 37C selama
semalam dan amati pertumbuhan koloni tipikal dari E. coli
(kelompok coliform yang memfermentasi laktosa pada EMB
Agar nampak berwarna hitam/merah/hijau metalik dan yang
tidak memfermentasi laktosa akan nampak berwarna merah-
mudah, sedangkan kelompok coliform yang memfermentasi
laktosa pada Endo agar nampak berwarna merah-gelap
dengan cahaya keemasan dan yang tidak memfermentasi
laktosa akan nampak tidak berwarna (transparan).
• 2. Uji Penguatan (Confirmative
Test)

12. PRINSIP DASAR METODE INI MELIPUTI 3 (TIGA)
LANGKAH :
•dengan menggunakan jarum Ose, koloni tipikal
seperti yang digambarkan di atas dipindahkan pada
kaldu laktosa dan diamati kembali pembentukan
asam dan gas. Jika positif, secara aseptic ambil satu
mata dan goreskan pada NA, inkubasi pada suhu
37C selama semalam.
•3. Uji lengkap (Completed Test)

13. PRINSIP DASAR METODE INI MELIPUTI 3 (TIGA)
LANGKAH :
•Semua hasil positif (kualitatif) yang diperoleh pada
setiap langkah pengujian tersebut di atas, dicatat,
kemudian dibandingkan dengan nilai Tabel Hopkins
yang berisi nilai indek MPN/100 ml atau MPN/100
gram (kuatitatif).
•3. Uji lengkap (Completed Test)

14. Seri I
(10 ml)
Seri II
(1.0 ml)
Seri III
(0.1 ml)
Batas Bawah Batas
Atas
0 0 1 3 <0.5 9
0 1 0 3 <0.5 13
1 0 0 4 <0.5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470

15. HASIL PENGAMATAN
UJI PENDUGAAN
• Misalnya: seri I ada 3 tabung positif, seri II 2 tabung positf dan seri
III 1 tabung positf, maka hasil ini dapat ditulis: 3-2-1. Dalam Tabel
Hopkins nilai ini memiliki harga 150 MPN/100 ml atau gram
sampel. Indek ini mengindikasikan bahwa dalam setiap 100 gram
sampel ikan mengandung  150 sel coliform, atau bila
dibandingkan dengan peluang statistik (95%) maka jumlah coliform
berkisar antara 30 – 440 sel per 100 gram sampel.

16. HASIL PENGAMATAN
UJI PENDUGAAN
• Catat semua media EMB Agar yang menunjukan adanya
koloni tipikal E. coli.
• Seperti pada Uji Pendugaan, bandingkan hasil yang
diperoleh dengan Tabel Hopkins. Tentukan apakah sampel
yang diamati memenuhi syarat sanitasi dan hygiene atau
sesuai dengan standar SNI atau tidak, serta berikan
rekomendasi saudara.

17. HASIL PENGAMATAN
UJI LENGKAP
•Catat semua tabung positif pada
Kaldu Laktosa.
•Catat hasil uji Gram-pewarnaan.

18. TUGAS
• Mengapa E. coli digunakan sebagai indikator sanitasi dan
hygiene bahan pangan termasuk produk ikani.
• Jelaskan bagaimana proses terbentuknya asam dan gas dalam
fermentasi laktosa oleh kelompok bakteri coliform.
• Mengapa Uji MPN dimasukan pada metode hitung bakteri secara
kualitatif bukan kuatitatif.
• KUMPUL SELAMBAT-LAMBATNYA 13 NOVEMBER 2020
• BENTUK PDF DAN KIRIM BY EMAIL:
karimelaelyjohn@gmail.com

19. MIKROBIOLOGI DAN TOKSIKOLOGI
HASIL PERIKANAN
Isolasi dan Identifikasi Mikroba
ELYJOHN KARIMELA, S. Pi., M. Si PS. TEKNOLOGI PENGOLAHAN HASIL LAUT

20. SUMBER MIKROBA
•Sumber alami : tanah, air, udara,
tanaman/hewan, limbah, dll
•Lembaga koleksi kultur

21. TAHAPAN IDENTIFIKASI MIKROBA
ISOLASI
•Untuk
memperoleh
kultur
murni
SELEKSI
•Untuk
memperoleh
galur dengan
kinerja terbaik
IDENTIFIKASI
•Dengan
menggunakan
metode yang sesuai
•Untuk mengetahui
nama (klasifikasi)
mikroba tersebut

22. ISOLASI
• Isolasi kultur : kegiatan pemisahan suatu kultur mikroba dari campuran biakan mikroba
di alam  sel individu terpisah
• Sebelum mengisolasi, harus diketahui :
- mikroba apa yang akan diisolasi
- habitat
 menentukan sampel apa yang akan diambil dari alam , lokasi dan media apa yang
akan digunakan

23. METODE PENGAMBILAN SAMPEL
Sampel berupa padatan (tanah, serpihan batu, kayu, dll) :
 Diambil dengan menggunakan spatula atau pinset steril
 Penyimpanan menggunakan kantong plastik steril
Sampel berupa cairan atau semi cair (air, lumpur, dll) :
 Diambil menggunakan pipet steril
 Penyimpanan contoh menggunakan botol atau tabung polipropilen steril
Sampel segera dibawa ke laboratorium
(bila jarak jauh, gunakan es batu pada wadah penyimpanan)
Sampel biasanya segera dipakai atau disimpan pada suhu dingin (kulkas)

24. TEKNIK ISOLASI KULTUR MURNI
1. Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-plate)
2. Penuangan (Pour-plate)
3. Kultur yang Diperkaya (Enrichment Culture)
4. Pengenceran Berseri (Serial-dilution)
5. Isolasi Sel Tunggal

25. SAMPEL
Pengenceran
berseri dengan
larutan garam
fisiologis
Penggoresan /
Penyebaran
pada media
agar  koloni
tumbuh
menyebar
Penggoresan
berulang
KULTUR
MURNI
(1 SEL = 1
KOLONI)
1. TEKNIK PENGGORESAN (STREAK-PLATE)
& PENYEBARAN (SPREAD-PLATE)

26. CARA PENGGORESAN KULTUR
1.Goresan Langsung
2.Goresan Kuadran
3.Goresan Radian
Goresan langsung
(untuk mengkultur mikroba)
Goresan radian (untuk
mengkultur mikroba)
Goresan kuadran (isolasi koloni tunggal untuk
mempelajari mikroba)
http://www.studentsguide.in/microbiology/microbiology-tools-techniques/special-methods-of-isolation-of-pure-
culture.html

27. TEKNIK PENYEBARAN (SPREAD-PLATE)
• Teknik ini merupakan prosedur
rutin untuk isolasi bakteri &
menggunakan peralatan yang
sederhana
• Kelemahan : hanya sejumlah
kecil sampel yang dapat
digunakan/disebarkan pada
media
• Dua sel dapat bergabung
membentuk satu koloni http://www.studentsguide.in/microbiology/microbiology-tools-techniques/special-methods-of-
isolation-of-pure-culture.html

28. 2. TEKNIK PENUANGAN (POUR-PLATE)
• Prinsip : pengenceran sampel
dengan media agar cair dalam
tabung reaksi, sehingga
distribusi sampel merata 
dituang ke cawan petri &
dibiarkan mengeras pada suhu
ruang, lalu diinokulasi

29. 3. KULTUR DIPERKAYA (ENRICHMENT
CULTURE)
• Untuk mengisolasi bakteri yang mempunyai sifat
fisiologis yang khusus (jumlah kecil & tumbuh lambat)
• Prinsip : menggunakan komposisi media dan kondisi
inkubasi tertentu, sehingga yang tumbuh hanya bakteri
tertentu

30. 4. TEKNIK PENGENCERAN BERSERI
(SERIAL-DILUTION)
• Digunakan jika mikroba dlm
kultur campuran terdapat
dalam jumlah lebih besar dari
pada mikroba lain.
Contoh : S. lactis dalam
susu asam
• Dengan tingkat pengenceran
tinggi, sampel hanya
mengandung 1 galur mikroba
• Perlu dicek kemurnian kultur

31. 5. TEKNIK ISOLASI SEL TUNGGAL
a. Metode Mikromanipulator
• Menggunakan alat mikromanipulator yang digabung dengan mikroskop
untuk mengambil suatu sel mikroba tunggal dari sampel
• Dengan mikromanipulator, operator dapat mengontrol gerakan mikropipet
(tabung kapiler) di bawah lensa obyek, sehingga dapat diambil sel
tunggal & dipindahkan ke dalam tabung dan selanjutnya dipindahkan ke
media yang sesuai
• Lebih cepat, namun kelemahannya :
- alat mahal
- operator harus terampil

32. Micromanipulator
http://eatingforaquadrillion.blogspot.com/2011/07/how-to-get-single-cell.html

33. b. Metode Kapiler
-Beberapa tetes media yang mengandung mikroba, ditempatkan pada penutup gelas
obyek steril menggunakan pipet kapiler steril.
-Dengan menggunakan mikroskop, cari tetesan yang mengandung hanya 1 mikroba.
Tetesan tersebut dipindahkan dengan pipet kapiler steril ke media segar  mikroba
tunggal yang berada pada tetesan mulai berbiak untuk menghasilkan kultur murni.

34. PEMBUKTIAN KEMURNIAN KULTUR
Setelah diasumsikan berhasil mengisolasi kultur murni  perlu dilakukan
pengujian dengan kriteria sebagai berikut :
1.Mikroba tampak mirip secara mikroskopis dan menunjukkan hasil
pewarnaan yang sama
2.Pada saat ditanam pada agar cawan, semua koloni menunjukkan
kesamaan
3.Hasil penggoresan dll seragam
4.Beberapa koloni isolat mempunyai penampakan/karakteristik identik,
contoh memfermentasi gula yang sama dll

35. SELEKSI
Tujuan : mendapatkan galur dengan kinerja terbaik
 - tidak menghasilkan produk sampingan yang tidak
dikehendaki
- peningkatan kemampuan penggunaan sumber C
dan N yang murah  penurunan biaya produksi
- perubahan morfologi sel menjadi bentuk yang
lebih mudah dipisahkan dari produk
Pendekatan genetika untuk memperbaiki kualitas mikroba :
1. Mutasi
2. Rekombinasi

36. IDENTIFIKASI
Metode untuk identifikasi mikroba adalah dengan menggunakan ciri/karakteristik :
1. Morfologis
Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela, kapsul atau spora
dengan bantuan mikroskop, baik dengan pewarnaan maupun tidak
2. Nutrisional
Penentuan senyawa kimia dan kondisi fisik khusus (suhu, cahaya, gas) yang
diperlukan untuk pertumbuhan mikroba
3. Kultural
Penentuan tampilan pertumbuhan pada berbagai macam media, baik cair maupun
padat (bentuk koloni, permukaan koloni, tepi koloni, warna, dll)

37. KARAKTERISTIK MORFOLOGIS
Aspergillus E. coli
Streptomyces Penicillium

38. BENTUK DAN SUSUNAN SEL
http://content.answers.com/main/content/img/elsevier/dental/f0396-02.jpg
Sel
Bakteri

39. KARAKTERISTIK KULTURAL
Kultur pada Agar Miring

40. 4. Metabolik
Identifikasi & pengukuran perubahan kimiawi yang dilakukan mikroba  contoh kemampuan
mikroba untuk mengubah karbohidrat menjadi asam organik; gula menjadi asam dan gas, dll)
Contoh : E. coli dapat memfermentasi laktosa, sedangkan
Salmonella typhi tidak dapat memfermentasi laktosa
5. Susunan Kimiawi
Penentuan susunan kimiawi berbagai komponen sel (dinding sel, nukleus, membran, dll)
6. Susunan Antigen (Serologi)
Penelaahan sifat antigen – antibodi yang khas
* Antigen : substansi (sel mikroba) yang menstimulasi produksi antibodi saat diinjeksikan ke
hewan
7. Patogenik
Penentuan potensi suatu mikroba untuk menimbulkan penyakit
8. Genetik
Kajian berdasarkan untaian DNA mikroba menggunakan DNA Probe

41. PEMELIHARAAN DAN PENGAWETAN
KULTUR MURNI
Tujuan :
menjaga sampai periode tertentu mikroba tetap dalam kondisi hidup (viable), mencegah terjadinya
perubahan genetik & tidak terkontaminasi
 harus mampu melestarikan karakteristik spesies mikroba selama diawetkan
Cara :
1. Pemindahan Secara Periodik
- Kultur mikroba secara periodik dipindahkan ke media baru/segar, contoh : media agar
miring
- Komposisi media & suhu serta interval waktu pemindahan harus tepat dan disimpan pada suhu
dingin (5 °C)
 murah & mudah, tapi tidak cocok untuk penyimpanan jangka panjang
 bakteri 2-3 minggu, fungi 3-4 minggu

42. PEMELIHARAAN DAN PENGAWETAN
KULTUR MURNI
2. Pelapisan Kultur dgn Minyak Mineral
- Permukaan agar miring atau media cair dilapisi dengan minyak
mineral steril (parafin) +/- 0,5 inci
- Keuntungan : dapat memindahkan sebagian mikroba di bawah permukaan
minyak mineral dg jarum Ose, lalu diinokulasi ke media segar dengan tetap
mempertahankan kultur awal
- Lapisan parafin menjadikan kondisi anaerob dan mencegah pengeringan
medium
mikroba dorman  pengawetan dapat beberapa
tahun

43. PEMELIHARAAN DAN PENGAWETAN
KULTUR MURNI
3. Liofilisasi  Pengeringan Beku (freeze drying)
- Sel mikroba dikering-bekukan & aktivitas metabolisme stop (dorman)  efektif untuk bakteri
(dapat tetap hidup & tidak berubah selama bertahun-tahun
Cara :
* media berisi senyawa pelindung/penstabil : susu, serum, natrium glutamat, dll
* suspensi mikroba (±0,2 ml) ditempatkan dalam ampul (vial) kaca
* Perendalam dalam es kering + alkohol (-780C)  beku
* Ampul dihubungkan dengan kondensor & pompa vakum  kering (sublimasi)
* Ampul ditutup dengan melelehkan ampul kaca tersebut dalam keadaan vakum 
penyimpanan pada suhu 40 C
- Keuntungan : Cocok untuk penyimpanan jangka panjang (tahunan) & kemungkinan perubahan
kecil & Wadah penyimpanan kecil

44. PEMELIHARAAN DAN PENGAWETAN
KULTUR MURNI
4. Penyimpanan pada Suhu Sangat Rendah (Cryopreservation)
- Menggunakan nitrogen cair (sekitar -156 sampai-1960C)
- Sel dibekukan dengan diberi bahan pelindung beku (gliserol atau dimetil sulfoksida)
 mencegah pembentukkan kristal es & meningkatkan ketahanan hidup sel mikroba
- Contoh beku disimpan dalam lemari pendingin nitrogen cair
- Cocok untuk kapang
- Kelebihan :
hampir sama dgn liofilisasi & kultur yg tidak dapat diawetkan dengan liofilisasi,
dapat dengan cara ini

45. PEMELIHARAAN DAN PENGAWETAN
KULTUR MURNI
5. Penyimpanan pada Tanah Steril
- Diterapkan untuk penyimpanan spora bakteri, actinomycetes dan kapang
- Suspensi 5 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 g bubuk tanah
steril (campuran pasir halus dan tanah liat 1:1)
- Dibiarkan pada suhu kamar selama 10 hari sampai
kering  disimpan pada lemari es

46. TERIMA KASIH