1. Rachmat Afriyanto
NIM. 26020114140104
Pembimbing Utama :
Dr. Ir. Delianis Pringgenies, MSc
NIP. 19581007 198703 2 001
Pembimbing Anggota :
Prof. Dr. Ir. Agus Sabdono, MSc
NIP. 19580615 198503 1 001
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK BAKTERI SIMBION SPONS
Callyspongia sp. DAN Leiosella sp. TERHADAP BAKTERI PATOGEN
MULTI DRUGS RESISTANT
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
UNIVERSITAS DIPONEGORO
Jum’at, 29 Juni 2018
1
3. Biodiversitas Lingkungan Laut
(Pringgenies dan Renta, 2014)
Akumulasi senyawa
Bioaktif dengan struktur
Unik pada Avertebrata
Laut
3
Eksploitasi Spons berlebihan
Tidak sesuai
dengan prinsip
Konservasi
(Pastra dan
Surbakti, 2012)
4
Bakteri Simbion (Radjasa, 2007)
Bakteri simbion
Memproduksi
Metabolit sekunder
yang identik dengan
inangnya
Pendahuluan
LATAR BELAKANG
2
1
2
Spons Laut (Taylor, 2007)
Callyspongia sp. dan Leiosella sp.
(Mioso et al., 2017)
4. Pemanfaatan
antibiotik yang
tidak sesuai dosis
menyebabkan
bakteri patogen
menjadi resisten
Multi Drug Resistant
Pada Tahun 2010:
79% strain E.coli dan
43% strain S.aureus
telah resisten terhadap
antibiotik umum yang
beredar dipasaran.
(Cita et al., 2017)
Pendahuluan
RUMUSAN PERMASALAHAN
Penyebaran bakteri
Multi Drug Resistant
menjadi isu Global dan
penyumbang utama
morbiditas dan
mortalitas di negara
berkembang seperti di
Indonesia.
(Cita et al., 2017)
2
3
3
1
5. 1
Multi Drug Resistant
Pendahuluan
RUMUSAN PERMASALAHAN
2
3
4
Natural
Product
Pemanfaatan bakteri simbion spons
sebagai sumber antibakteri baru
yang tetap memperhatikan aspek
ramah lingkungan (Pastra dan
Surbakti, 2012).
4
7. Pendahuluan
TUJUAN PENELITIAN
MANFAAT
Database Potensi Pemanfaatan
Bakteri simbion Callyspongia sp. dan
Leiosella sp. dalam pengembangan
bioteknologi kelautan
Potensi Antibakteri Patogen MDR
Ekstrak bakteri simbion Callyspongia sp.
dan Leiosella sp. terhadap patogen MDR
E.coli dan MRSA
Isolasi Bakteri Simbion
Aktivitas Antibakteri Ekstrak
Bakteri Simbion Spons
Identifikasi Molekuler Bakteri
Simbion Spons yang memiliki
Aktivitas Antibakteri
5
8. Pengambilan sampel
Isolasi bakteri simbion spons
Purifikasi bakteri simbion spons
Uji gram bakteri simbion spons
Uji pendahuluan aktivitas antibakteri
Kultur massal bakteri simbion
Ekstraksi bakteri simbion spons
Uji aktivitas antibakteri ekstrak bakteri
simbion spons
Identifikasi molekuler Isolat Bakteri
Analsisis data
Materi dan Metode
METODOLOGI
Tahap I
Tahap 3
Tahap 4
Tahap 2 – 4
Dilaksanakan di
Laboratorium Tropical
Marine Biotechnology
Lab. Kelautan –
Oseanografi dan
Laboratorium Marine
Natural Product
Lab. Terpadu Undip
Tahap 2
(Madigan, 2012)
(Madigan, 2012)
(Sardiani, 2015)
(Sabdono & Radjasa 2008)
(Trianto, 2016)
(Handayani, 2017)
(Pratiwi, 2008)
(Asagabaldan, 2017)
20 – 21 Mei 2017
P. Krakal Besar dan
P. Katang,
Kep. Karimun Jawa
(Susilowati et al., 2015)
(Mohan, 2015);
(Suryadi et al., 2016) 6
9. Hasil dan Pembahasan
HASIL PENELITIAN
No.
Kode
Sampel
Kode
Isolat
Karakteristik Koloni
Warna Ukuran Bentuk Margin Elevasi
1 17KJ13
01 Putih Sedang Irregular Lobate Flat
02 Kuning Kecil Concentric Smooth Umbonate
03 Putih Kekuningan Kecil Round Smooth Umbonate
04 Kuning Kecil Irregular Lobate Umbonate
2 17KJ19
01 Putih Besar Concentric Smooth Flat
02 Putih Sedang Round Smooth Raised
03 Kuning Kecil Round Smooth raised
04 Putih Kecil Round Smooth raised
Tabel 1. Hasil Isolasi dan Identifikasi Bakteri Simbion Spons Callyspongia sp. dan Leiosella sp.
Media
Marine Zobell 2216E Agar
(Radjasa et al., 2009)
7
10. Hasil dan Pembahasan
HASIL PENELITIAN
No.
Kode
Sampel
Kode
Isolat
Karakteristik Koloni
Warna Ukuran Bentuk Margin Elevasi
1 17KJ13
01 Putih Sedang Irregular Lobate Flat
02 Kuning Kecil Concentric Smooth Umbonate
03 Putih Kekuningan Kecil Round Smooth Umbonate
04 Kuning Kecil Irregular Lobate Umbonate
2 17KJ19
01 Putih Besar Concentric Smooth Flat
02 Putih Sedang Round Smooth Raised
03 Kuning Kecil Round Smooth raised
04 Putih Kecil Round Smooth raised
Isolasi Bakteri Simbion:
(Madigan, 2012)
Tabel 1. Hasil Isolasi dan Identifikasi Bakteri Simbion Spons Callyspongia sp. dan Leiosella sp.
8
Isolat
Bakteri
Media
Marine Zobell 2216E Agar
(Radjasa et al., 2009)
7
11. No. Sampel Spons
Isolat Bakteri Simbion
Positif Negatif
1 17KJ13 3 1
2 17KJ19 2 2
Total 5 3
Hasil dan Pembahasan
HASIL PENELITIAN
Tabel 2. Hasil Identifikasi Jenis Gram Bakteri Simbion Spons Callyspongia sp. dan Leiosella sp.
Identifikasi gram
menggunakan Teknik
pengecatan Gram (Gram
staining)
(Pelczar & Chan, 2005);
(Sardiani, 2015)
8
12. No. Sampel Spons
Isolat Bakteri Simbion
Positif Negatif
1 17KJ13 3 1
2 17KJ19 2 2
Total 5 3
Hasil dan Pembahasan
HASIL PENELITIAN
Tabel 2. Hasil Identifikasi Jenis Gram Bakteri Simbion Spons Callyspongia sp. dan Leiosella sp.
17KJ13-01 17KJ13-02
17KJ13-03 17KJ13-04
17KJ19-01 17KJ19-02
17KJ19-03 17KJ19-04
2
1
8
Identifikasi gram
menggunakan Teknik
pengecatan Gram (Gram
staining)
(Sardiani, 2015)
13. (Volk & Wheeler,1993)
No. Kode Isolat
E.coli MRSA
24 Jam
1 17KJ13-01 + +
2 17KJ13-02 - -
3 17KJ13-03 - -
4 17KJ13-04 - -
5 17KJ19-01 - -
6 17KJ19-02 + +
7 17KJ19-03 - -
8 17KJ19-04 - -
Hasil dan Pembahasan
HASIL PENELITIAN
Tabel 3. Hasil Uji Pendahuluan Antibakteri Bakteri Simbion Spons Callyspongia sp. dan Leiosella sp.
Antibakteri Spektrum Luas
17KJ13-01 terhadap E.coli
17KJ13-01 terhadap MRSA
9
(Volk & Wheeler,1993)
14. Hasil dan Pembahasan
HASIL PENELITIAN
No. Kode Isolat Berat Ekstrak (mg)
1 17KJ13-01 49,91
2 17KJ19-02 55,20
Tabel 4. Hasil Berat Ekstrak Isolat Bakteri Simbion Spon yang Memiliki Aktivitas Antibakteri
Keterangan :
• Kulur massal dilakukan
dalam media Nutrient
Broth sebanyak 1 Liter
secara bertahap
• Ekstraksi cair-cair dengan
separatory funnel
(Handayani, 2017)
• Pelarut Etil Asetat degan
perbandingan 1: 1
(Handayani, 2017)
• Ekstrak dipekatkan
dengan Vacuum Rotary
Evaporator (Handayani,
2017)
10
Proses Kultur Massal dan ekstraksi
15. No. Kode Isolat Konsentrasi
Rata-rata Diameter Zona Hambat (mm)
E.coli MRSA
24 Jam 48 Jam 24 Jam 48 Jam
1 17KJ13-01 500 5,1 ± 1,25 3,3 ± 0,55 3,9± 0,55 2,37 ± 0,49
1000 6,5 ± 0,35 3,83 ± 0,84 5,7 ± 0,32 -
2 17KJ19-02 500 6,6 ± 0,80 6,5 ± 0,80 3,5 ± 0,26 2,3 ± 0,42
1000 5,4 ± 0,74 5,37 ±0,74 3,7 ± 0,42 2,27 ± 0,37
Hasil dan Pembahasan
HASIL PENELITIAN
Tabel 5. Rata-rata Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat Bakteri Simbion Spons yang memiliki
Aktivitas Antibakteri
Keterangan :
• Rata-rata diameter zona
hambat dikurangi diameter
paper disc 6 mm
• Data merupakan hasil
rerata dari tiga kali
ulangan ± standar deviasi
• Kontrol positif
menggunakan antibiotik
kloramfenikol 30 µl/disk
• Kontrol negatif
menggunakan DMSO
(Handayani, 2017)
Aktivitas Ekstrak Antibakteri 17KJ13-01 : Sedang
Aktivitas Ekstrak Antibakteri 17KJ19-02 : Rendah
(Ernawati, 2007)
11
16. Hasil dan Pembahasan
HASIL PENELITIAN
Tabel 6. Hasil Penelusuran Sekuen DNA dengan Menggunakan BLAST
Homologi sekuens
16S rDNA yang lebih
besar dari 97% dapat
mewakili kesamaan
pada tingkat spesies.
Persamaan sekuens
antara 93%-97%
hanya dapat mewakili
identitas pada tingkat
genus (Da Silva et
al., 2013).
(Suryadi, 2016)
No. Kode Isolat Hasil Identifikasi Homologi No. Akses
1 17KJ13-01 Bacillus cereus 99% NR_074540.1
2 17KJ19-02 Virgibacillus salarius 95% NR_041270.1
12
17. Hasil dan Pembahasan
HASIL PENELITIAN
Tabel 7. Hasil Penelusuran Sekuen DNA dengan Menggunakan BLAST
No. Kode Isolat Hasil Identifikasi Homologi No. Akses
1 17KJ13-01 Bacillus cereus 99% NR_074540.1
2 17KJ19-02 Virgibacillus salarius 95% NR_041270.1
Bacillus cereus : Bakteri gram positif
yang diketahui memiliki sifat antibakteri
(Naclerio et al., 1993).
Bacillus cereus yang diisolasi dari
spons Polymastia janeirensis diketahui
memiliki potensi untuk digunakan
sebagai agen bioremediasi limbah
merkuri Gandelman (2014)
13
18. Hasil dan Pembahasan
HASIL PENELITIAN
Tabel 7. Hasil Penelusuran Sekuen DNA dengan Menggunakan BLAST
No. Kode Isolat Hasil Identifikasi Homologi No. Akses
1 17KJ13-01 Bacillus cereus 99% NR_074540.1
2 17KJ19-02 Virgibacillus salarius 95% NR_041270.1
Virgibacillus salarius : Bakteri gram
positif. Sulistiani (2010)
menunjukkan Virgibacillus salarius
yang diisolasi dari karang lunak
Sinularia sp. aktivitas antibakteri
terhadap Staphylococcus aureus.
14
19. Penutup
KESIMPULAN
1
2
Didapatkan empat Bakteri spons Callyspongia sp. dengan Tiga bakteri gram positif dan satu bakteri gram negatif.
sedangkan spons Leiosella sp. terdapat empat bakteri simbion dengan dua isolat bakteri gram positif dan dua
isolat gram negatif.
Ekstrak bakteri simbion Callyspongia sp. 17KJ13-01 dan Leiosella sp. kode 17KJ19-02 menunjukan potensi
antibakteri dengan spektrum luas karena mampu melawan patogen Multi Drug Resistant Escherichia coli
(gram negatif) dan Methicilin-Resistant Staphylococcus aureus (gram positif) serta bersifat bakteriostatik
karena hanya menghambat pertumbuhan bakteri patogen namun tidak membunuhnya.
3
Hasil penelusuran BLAST amplifikasi gen 16S rRNA menunjukkan bahwa bakteri simbion dengan kode
isolat 17KJ13-01 memiliki homologi 99% dengan bakteri Bacillus cereus, dan bakteri dengan kode isolat
17KJ19-02 memiliki homologi 95% dengan bakteri Virgibacillus salarius.
15
22. Suplemen 1
PENGAMBILAN SAMPEL
20 – 21 Mei 2017
P. Krakal Besar dan
P. Katang,
Kep. Karimun Jawa
Pengambilan sampel
dengan metode purposive
sampling method
17
24. Suplemen 3
KULTUR MASSAL DAN EKSTRAKSI BAKTERI SIMBION SPONS
• Pembuatan starter 10 ml (2 hari) 100 ml (3 hari) 1000 ml (6 hari)
• Dilakukan inkubasi dengan shaker 120 rpm
• Hasil banyaknya masa polar dan semi ekstrak berbeda-beda, ekstrak tidak bisa
disamakan dengan ekstrak lain (Al-Zereini, 2014).
• Perbedaan jumlah ekstrak dipengaruhi oleh kepadatan koloni bakteri, dengan
kebutuhan dan laju pertumbuhan beda (Pelczar dan Chan, 2013).
19
Upaya untuk memenuhi kebutuhan senyawa bioaktif dengan pemanfaatan mikroorganisme yang bersimbiosis dengan spons (Radjasa et al., 2007).
Pringgenies (2009) melaporkan bahwa terdapat hubungan antara mikroorganisme dengan organisme laut yang juga mensintesa metabolit sekunder seperti organsime inangnya.
Pemanfaatan antibiotic dengan dosis yang tidak sesuai dan dalam waktu yang lama menyebabkan bakteri menjadi resisten
Laporan Cita et al., menunjukkan pada tahun 2010
Potensi laut yang besar, terutama keunikan senyawa bioaktif identik Bakteri simbion spons dapat dimanfaatkan sebagai Natural product untuk menjadi solusi sumber antibiotic baru
Pengambilan sampel dengan metode purposive sampling method
Penelitian eksploratif dengan metode experimental laboratoris
Bacakan tiap langkah dan tahap dengan metode singkat, akhiri dengan lokasi penelitian
Keberhasilan isolasi bakteri simbion menggunakan media marine zobell 2216E ditunjukkan didapatkannya:
Isolasi dilakukan dengan menggunakan metode rujukan Madigan (2012)
Menurut Fitri (2015) bakteri gram positif memiliki struktur dinding sel dengan kandungan peptidoglikan yang tebal sehingga mampu mempertahankan pewarna kristal violet yang diberikan pada uji pengecatan gram
Sedangkan bekteri gram negatif memiliki membran sel ganda dengan kandungan lipid yang tinggi sehingga pada pemberian alkohol 96% akan meluruhkan dinding selnya dan pewarna kristal violet akan ikut meluruh
Sedangkan bekteri gram negatif memiliki dinding sel dengan kandungan lipid yang tinggi sehingga pada pemberian alkohol 96% akan meluruhkan dinding selnya dan pewarna kristal violet akan ikut meluruh
Menurut Jawetz & Adelbergs (2008), terdapat beberapa mekanisme kerja antibakteri, yaitu: (1) Penghambatan melalui toksisitas selektif. (2) Penghambatan sintesis dan fungsi membran sel. (3) Penghambatan sintesis protein (4) Penghambatan sintesis asam nukleat.
Pembuatan starter 10 ml (2 hari) 100 ml (3 hari) 1000 ml (6 hari)
Dilakukan inkubasi dengan shaker 120 rpm
Hasil banyaknya masa polar dan semi ekstrak berbeda-beda, ekstrak tidak bisa disamakan dg ekstrak lain (Al-Zereini, 2014).
Perbedaan jumlah ekstrak dipengaruhi oleh kepadatan koloni bakteri , dgkebutuhan dan laju pertumbuhan beda (Pelczar dan Chan, 2013).
pernyataan Davis (1971); Ernawati (2007) bahwa hasil uji aktivitas antibakteri dikatakan sangat kuat apabila rata-rata diameter zona hambatnya lebih dari 20 mm
aktivitas kuat jika diameter zona hambatnya antara 10-20 mm
aktivitas sedang jika diameter zona hambatnya antara 5-10 mm, dan
aktivitas lemah jika zona hambatnya kurang dari 5 mm.
Beberapa strain bakteri ini telah diketahui sebagai agen dari dua penyakit bawaan makanan yang berbeda, yaitu sindrom emetik, yang terjadi dalam 1 sampai 5 jam setelah konsumsi makanan yang terkontaminasi dan ditandai dengan mual dan muntah, dan
sindrom diare, terjadi 8 sampai 16 jam setelah konsumsi dan ditandai dengan kram perut, diare, dan rektal tenesmus,
sementara strain lain dapat bermanfaat sebagai probiotik untuk hewan dan antibakteri bagi manusia (Naclerio et al., 1993).
