Ringkasan dokumen ini adalah sebagai berikut: 1. Penelitian ini bertujuan mengembangkan metode isolasi total RNA, mRNA, dan sintesis cDNA dari sengon sehat dan terserang hama boktor. 2. Metode modifikasi memberikan hasil isolasi RNA dan sintesis cDNA dengan konsentrasi tertinggi dibandingkan metode kontrol. 3. Penelitian ini menunjukkan bahwa pengembangan metode isolasi dan sintesis asam nukleat dapat digunakan

1. Pengembangan Metode Isolasi Total RNA,
mRNA dan Sintesis cDNA Sengon (Falcataria
moluccana L. Nielsen) yang Sehat dan Terserang
Hama Boktor (Xystrocera festiva)
oleh:
Ade Ayu Dewayani
E44090072
Pembimbing:
Dr. Ir Ulfah Juniarti, M.Agr
Dr. Ir N. Sri Hartati
Departemen Silvikultur
Fakultas Kehutanan
Institut Pertanian Bogor
2015

2. Pengendalian hama boktor
pada sengon dengan
pendekatan biologi molekuler.
Tidak semua penanda
molekuler berbasis DNA
berkaitan langsung dengan gen
penyandi TI dan AAI.
Diperlukan pendekatan lain
untuk mendapatkan gen-gen
penyandi TI dan AAI.
Latar Belakang

3. Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode
isolasi total RNA, mRNA, serta sintesis cDNA sengon
dari pohon yang sehat maupun yang terserang hama
boktor yang dapat digunakan untuk penelitian
identifikasi gen penyandi ketahanan terhadap hama
boktor.

4. Metode Penelitian
Tempat
Laboratorium Genetika Molekuler dan
Modifikasi Jalur Biosintesis Tanaman –
Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga
Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI),
Cibinong, Kabupaten Bogor.
Waktu
Penelitian dilakukan mulai bulan Maret-
September 2014 dan November 2014-
Januari 2015.

5. Metode Penelitian
Bahan
Bahan yang digunakan adalah
jaringan kambium serta kit
untuk isolasi RNA (Total RNA
Mini Kit dari Geneaid®), isolasi
mRNA (PolyATract mRNA
Isolation System III with Magnetic
Stand dari Promega®), dan
sintesis 1
st
cDNA (cDNA
Substraction Kit dari Clontech®
dan RevertAid RT Transcription
Kit dari Thermo®).

6. Metode Penelitian
Alat
Alat yang digunakan antara
lain microtube, alu, mortar,
mikro pipet Eppendorf Research
Plus, centrifudge Eppendorf
5430R, timbangan analitik,
vorteks, thermal cycler Techne
TC-5000, Wise Clean Waterbath,
perangkat elektroforesis, UV
transilluminator.

7. Metode Penelitian
Prosedur Pelaksanaan
• Pengambilan Sampel Jaringan
Potong
jaringan
dari pohon
Simpan di
dalam es
Sampel
segar siap
diisolasi
• Isolasi RNA total
Penghancuran
jaringan
LISIS
K= 5 menit
M = 30 menit
Pengikatan
RNA
Pencucian
(Wash Buffer)
ELUSI
K = 2min, 50µl
M = 10min, 25µl

8. Metode Penelitian
Prosedur Pelaksanaan
• Isolasi mRNA
Annealing
K = 65ºC
M = suhu ruang
Pengikatan
mRNA pada
Magnetic Particle
Elusi
K = 0min, 250µl
M = 3min, 150µl
• Sintesis cDNA
•Bahan dasar
mRNA
•SSH Kit
Kontrol
•Bahan dasar RNA
total
•Thermo Kit
Modifikasi

9. Hasil dan Pembahasan
• Isolasi RNA Total
Gambar 2. Hasil elektroforesis RNA dengan Metode Modifikasi.
M SK SC BK1 BK2 BC
M 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 M 1 5 4 3 2 10 11 12 13 14 15
Gambar 1. Hasil elektroforesis RNA dengan Metode Kontrol.

10. Hasil dan Pembahasan
(lanjutan...)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
SC 7-BC 5 SC 8 SC 9 SC 10
Grafik Konsentrasi
RNA
Metode Kontrol
SC
BC
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Grafik Konsentrasi
RNA
Metode Modifikasi
SC
BC

11. Hasil dan Pembahasan
• Isolasi mRNA
Gambar 3. Hasil elektroforesis
mRNA dengan Metode Kontrol.
M 14-1 14-2
Gambar 4. Hasil elektroforesis
mRNA dengan Metode
Modifikasi.
M 35-1 35-2 35-A

12. Nama Bahan
Jumlah (µl)
C1 C2 S1 S2 S3 S4 S5 B1 B2 B3 B4 B5
Control/Total RNA 2 4 7 2 10 1 5 7 2 10 1 5
Oligo (dT) primer 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
5X Reaction Buffer 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
riboLock Inhibitor 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
10 mM DNTP Mix 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Revert Aid 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
DEPC Treated
Water
9 7 4 9 1 10 6 4 9 1 10 6
∑ 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20
Hasil dan Pembahasan
Tabel 2. Matriks variasi komposisi pereaksi yang digunakan pada
metode modifikasi sintesis cDNA.

13. Hasil dan Pembahasan
(lanjutan...)
• Sintesis cDNA
M C1 C2 S1 S2 B1 B2 S3 S4 S5 B3 B4 B5
Gambar 5. Hasil elektroforesis cDNA dengan Metode Modifikasi
berdasarkan variasi pereaksi yang digunakan.

14. Hasil dan Pembahasan
(lanjutan...)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Grafik Konsentrasi cDNA
Metode Modifikasi
SC
BC

15. Simpulan dan Saran
Metode terbaik adalah metode
modifikasi
Rata-rata konsentrasi tertinggi
pada RNA modifikasi (65,60
ng/µl) dan cDNA modifikasi
(2296,17ng/µl).
Penanganan sampel harus
lebih terjaga.
Proses isolasi dilakukan
secepat mungkin untuk
menghindari degradasi.
Simpulan
Saran

16. TERIMA KASIH