1. TUTOR IMUNOLOGI
PENGUKURAN PRESIPITASI DENGAN
LIGHT SCATTERING /NEFELOMETRI
dr. Alberthina/ dr. Siswanto D. SpPK (K)
6 September 2010
1

2. I. Pendahuluan
Immunoassay memiliki peran yang penting dalam bidang diagnostik dan
pengobatan. Terdapat 2 kelompok dari immunoassay :
 Immunoassay berlabel (labeled immunoassay)
 Immunoassay tidak berlabel (nonlabeled immunoassay)
berdasarkan pada reaksi imunopresipitasi
2

3. Pendahuluan…
Terdapat 3 metode uji dari reaksi imunopresipitasi yaitu :
 Metode presipitat kualitatif
(single immunodiffusion,double immunodiffusion,double immunodiffusion
2 dimensi,electroimmunodiffusion reaction,immunoelectrophoresis)
 Metode presipitat semikuantitatif
(Single radial immunodiffusion,Single dimension electroimmunodiffusion)
 Metode presipitat kuantitatif
(nefelometri)
3

4. NEFELOMETRI
 Suatu metode immunoassay tidak berlabel yang
secara langsung mengukur pencaran cahaya (light
scattered) dari partikel-partikel yang berada didalam
larutan
 Banyak digunakan untuk mengukur protein-protein
plasma seperti : Ig, komponen komplemen, dan protein
spesifik lainnya
 Menggunakan alat nefelometer
4

5. II. PRINSIP NEFELOMETRI berdasarkan :
A. Sifat Pencaran Cahaya
 Bila cahaya mengenai partikel, cahaya dapat ditransmisikan
melewati larutan, diserap, dipantulkan, atau dipencarkan oleh
partikel-partikel tersebut
 Nefelometer mengukur langsung cahaya yg disebarkan oleh
partikel dan mendeteksi cahaya yg terpencar (light scattered) pada
sudut-sudut yang jauh dari sumber cahaya yang masuk (incident
light)
 Intensitas yang rendah dari pencaran cahaya kadang-kadang tidak
dapat dilihat dengan mata langsung→ diukur dengan alat detektor
yang sensitif
5

6. Prinsip pencaran cahaya..
 Sifat dari pencaran cahaya ada 2 jenis, tergantung pada
diameter (d) partikel-partikel dan panjang gelombang (λ)
cahaya yang lewat dalam larutan tersebut yaitu:
1.pencaran cahaya Rayleigh
2.pencaran cahaya Rayleigh-Debye
6

7. Prinsip pencaran cahaya…
 Pencaran cahaya Rayleigh  Pencaran cahaya Rayleigh-Debye
 dihasilkan oleh partikel-  dihasilkan oleh molekul yg besar
partikel kecil seperti albumin, atau kompleks antigen-antibodi
IgG dan IgM (d ≤ 0.05 λ), dgn diameter sebanding panjang
 pencaran cahaya bersifat gelombang,
simetris ke arah depan dan  pencaran cahaya bersifat simetris
belakang, ke arah depan dan belakang,
 pencaran cahaya minimum  cahaya yang terpencar memiliki
diamati pada sudut 90° dari intensitas yg lebih besar ke arah
insident light. depan pada sudut deteksi, θ,
mendekati nol.
7

8. Gambar 16-1. Pola distribusi angular untuk pencaran cahaya
Rayleigh dan Rayleigh-Debye.
Sumber. : Sternberg JC. Rate nephelometry. Dalam Rose NR, Friedman H, Fahey JL (eds): Manual Immunology
8
Laboratorium Klinis, 3rd ed. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1986, hal. 34).

9. Prinsip pencaran cahaya…
 Sensitivitas dari nefelometri dapat meningkat pada :
 molekul ukuran besar atau mendekati panjang
gelombang akan menghasilkan pencaran cahaya dari
arah depan (forward light scatter),
 penggunaan laser sebagai sumber cahaya & deteksi dari
sudut depan pada cahaya yang terpencar akan
menghasilkan sinyal yang lebih besar.
 Batas bawah deteksi(lower limit of detection)1-10 mg/ L
9

10. B. Kinetika Endapan Fase Cair
 Interaksi awal : Ag berikatan dgn molekul Ab, pd umumnya ikatan
Ag-Ab merupakan reaksi yang reversible
 Bila jumlah Ab berlebihan & Ag yg telah berikatan dgn Ab optimal
(polyvalent)→ terjadi ikatan selanjutnya pada komplek Ag-Ab yaitu
bentukan lattice
 Sinar tampak (visible light) yang mengenai bentukan lattice →
menghasilkan pencaran cahaya Rayleigh-Debye
 Lattice maksimal dibentuk pada zona ekuivalensi Ag- Ab
10

11. Gambar 16-2, Kurva presipitin kuantitatif
11
Sumber : courtesy Marcel Dekker, Inc.).

12. Prinsip kinetika…
 Bila spesimen diencerkan dgn dapar & ditambahkan pada
kuvet→ terdapat pencaran cahaya latar (background scattering)
yg terjadi pada blanko sampel
 Sumber-sumber dari pencaran latar (background scattering) :
protein & lipoprotein di dalam sampel, partikel atau debu yg ada
dalam reagen, atau cahaya yg menyimpang (stray light)
 Sinyal latar yg kecil biasanya tidak tergantung pada sudut
deteksi & dapat dikurangi dgn menggunakan nephelometric
grade antisera dan pengenceran yg tinggi dari sampel
12

13. Prinsip kinetika…
 Penambahan antiserum kedalam kuvet menyebabkan reaksi
ikatan Ag-Ab & pembentukan kompleks yg pelan dalam waktu
singkat, terlihat pada peningkatan pencaran cahaya yang pelan-
pelan terjadi → diikuti oleh peningkatan yang cepat pada
intensitas pencaran karena percepatan dalam pembentukan
presipitasi
 Laju dari peningkatan pencaran & tingginya plateau yg dicapai
berhubungan langsung dgn konsentrasi Ag dan pengenceran dari
antiserum
13

14. Prinsip kinetika…
 Interaksi Ag-Ab dikontrol dgn affinitas &aviditas antiserum, dapar, pH,
kekuatan ion dalam larutan uji, dan dapat ditingkatkan dgn adanya anion
&polimer-polimer hidrofilik
 Molekul polimer yg sering digunakan polyethylene glycol (PEG) utk
mempercepat laju reaksi, meningkatkan kemiringan (slope) pada kurva
presipitasi dalam zona excess Ab &mendorong zona ekuivalensi pada
konsentrasi Ag yang lebih tinggi sensitivitas dari nefelometri
meningkat, rentang deteksi lebih luas, dan uji lebih cepat
14

15. Gambar 16-3. Jangka waktu dari reaksi presipitasi imun. (A) Variasi dari
intensitas cahaya yang menyebar vs. waktu. (B) Laju dari peningkatan
pencaran vs. waktu.
Sumber : Cari Stenberg JC. Rate nephelometry.
(American Society for Microbiology, 1986, p34) 15

16. III.KOMPONEN NEFELOMETER
 Komponen-komponen utama nefelometer meliputi :
sumber cahaya, sistem collimating, monokromator, kuvet,
& tabung fotomultiplair
Gambar 16-4. Skema komponen-komponen dasar sebuah nefelometer
16
Sumber : Frings CS, Gauldie J. Spectral techniques die J. Spectral techniques

17. Komponen…
 sumber cahaya berasal dari : lampu tungsten-halogen
(400-620 nm), merkuri (357 nm), xenon,laser(632 nm),
& infrared light-emitting diode(LED)high performance
(840nm)
 nefelometer dgn intensitas tinggi,  tunggal,& sumber cahaya laser
dengan fokus yg sempit→ signal yg besar untuk diukur dan tidak perlu
sistem collimating,tetapi cahaya yg terpencar lebih rentan terhadap
fluktuasi ukuran partikel karena ukuran kompleks Ag-Ab akan berubah
bersamaan dgn waktu reaksi
17

18. Komponen…
 fotodetektor yg sensitif ditempatkan pada sudut
depan→dapat meningkatkan sensitivitas
 umumnya nefelometer menggunakan sudut-sudut
depan sebesar 130-900
18

19. IV. METODE
Terdapat 4 metode nefelometri :
1. Nefelometri Endpoint
 pada reaksi imunopresipitasi, waktu untuk mencapai puncak (plateau)
pencaran cahaya berbeda (menit s/d 1 jam) tergantung pada kondisi
reaksinya
 tahapan meliputi:
(1) reagen, spesimen, & antisera dicampur,
(2) sinyal latar diukur,
(3) inkubasi dari campuran dilanjutkan sampai mencapai plateau,
(4) plateau atau sinyal endpoint diukur,
(5) sinyal terakhir diperoleh setelah memperbaiki interferens latar,
(6) konsentrasi Ag ditentukan dengan menggunakan kurva kalibrasi
19

20. Metode…
 karena banyaknya perbedaan antar sampel, harus ada koreksi latar
 interferens latar yg karena blanko sampel akan membatasi sensitivitas
 aviditas & affinitas antisera menentukan waktu inkubasi & ketinggian
plateau yg dicapai untuk setiap uji
2. Nefelometri Kinetik
 tidak membutuhkan waktu inkubasi yg lama untuk reaksi kompleks
imun mencapai puncak reaksi
 umumnya memerlukan antiserum dgn affinitas & aviditasnya lebih
tinggi daripada metode endpoint
 kecepatan reaksi tergantung pada konsentrasi antigen, affinitas & titer
antisera
20

21. Metode…
waktu yang diperlukan untuk mencapai puncak reaksi berbanding
terbalik dengan konsentrasi antigen sampel
lebih sensitif terhadap faktor-faktor : pH,dapar, & polimer anhancer
bila menggunakan lampu konvensional dgn bandwidth yg luas→
menghasilkan laju reaksi yg lebih cepat daripada laju reaksi yang diukur
dgn laser
21

22. Metode…
3. Nefelometri Inhibition Immunoassay (NIIA)
hapten yg dikonjugasikan pada protein pembawa (carrier protein)
dapat bereaksi dengan antisera yang diarahkan berlawanan pada
hapten tersebut untuk membentuk lattice yg ukurannya mudah
dideteksi oleh nefelometer
 hapten ditambahkan pada campuran konjugat hapten dgn jumlah
tetap dan dengan sejumlah hapten Ab tertentu→ hapten akan
berikatan pada Ab & menghambat pembentukan lattice dari konjugat
hapten dengan Ab
 Banyaknya cahaya yg memencar berhubungan terbalik dengan
konsentrasi hapten di dalam sampel
22

23. Metode…
4. Particle-Enhanced
 banyak digunakan dalam tes serologi semi kuantitatif untuk
mendeteksi faktor reumatoid, protein C-reaktif, dan Ab pada agen
infeksi
 partikel inert digunakan sebagai penghalang pembentukan
pencaran cahaya dari imunopresipitat
 lateks polimer (lateks polistiren) dgn d 0.1-0.2 µm dilapisi
(coated) dengan Ag atau Ab
 dapar glisin & surfaktan sering digunakan pd reagen partikel utk
memperbaiki lapisan dgn mengurangi agregasi partikel lateks
23

24. V. KELEBIHAN DARI NEFELOMETRI
 sangat presisi, akurat, mudah dikerjakan, biaya
murah, dan waktu proses cepat
 uji nefelometri dapat menggantikan RID karena
sebagai metode yg lebih disukai
 koefisien korelasi antara nefelometri & RID >0.9
 Rentang CV untuk nefelometri 0.6-10%
24

25. VI. KELEMAHAN NEFELOMETRI
 Metode end point banyaknya pencaran cahaya
karena partikel debu atau partikel-partikel endogen
seperti lipoprotein dapat membatasi sensitivitas uji
→sering diatasi dengan pengukuran kinetik
 Bahan-bahan endogen yg memencarkan cahaya
kurang larut dalam larutan PEG → diatasi dengan
PEG disentrifus sebelum dites dengan antisera
 Untuk spesimen yang keruh harus disaring dulu
sebelum diuji
 Protein, lipoprotein, heparin, Ig, & kompleks imun
endogen yg mempengaruhi laju reaksi sebenarnya
atau pencaran cahaya end point plateau
25

26. Kelemahan…
 Reaksi samping yg tidak spesifik dapat terjadi oleh faktor
reumatoid atau komponen Ciq pada sistem komplemen
 Pembekuan & pencairan sampel dapat menyebabkan denaturasi
protein atau agregasi dari Ig→ menyebabkan nilai dari blanko
sampel tinggi atau pencaran cahaya latar
 setiap analit yang akan diukur, akurasi ditentukan oleh kualitas
antisera & bahan sampel yg digunakan
26

27. VII. Aplikasi
1. Pengukuran Ig serum
menentukan serum IgA, IgG, dan IgM
dengan sensitivitas max 1 mg/L, konsentrasi normal serum
IgD & IgE terlalu rendah untuk dideteksi dgn nefelometri
penentuan laju nefelometri untuk rasio ε/λ dapat
membedakan hipergammaglobulin monoklonal & poliklonal
perbedaan ini mungkin sulit jika menggunakan Elp serum
27

28. Aplikasi…
2.Sintesis Imunoglobulin Cairan Cerebrospinal
 penentuan sintesis IgG CSF untuk pasien multiple
sclerosis &neurologi memiliki sensitivitas diagnostik,
spesifisitas, dan nilai prediktif 96-98%
 penentuan rasio dari IgG/albumin CSF dgn nefelometri
memiliki akurasi & presisi sebanding dengan RID
3.Faktor Reumatoid
 faktor reumatoid ditentukan dengan teknik terbalik dimana
serum RF diukur menggunakan antigen (IgG) sebagai
reagen
 pengukuran RF dgn nefelometri laser& nefelometri rate
memiliki recovery 86%-105%, CV < 5% 28

29. Aplikasi…
4.Kompleks Imun
 mengukur kompleks imun yg bersirkulasi dgn mengukur IgG dalam
kompleks tersebut
5.Komponen-komponen komplemen
 digunakan untuk komponen komplemen C3, C4, C3d, & faktor B
 komponen komplemen dideteksi sebagai antigen & tidak dideteksi
berdasarkan fungsinya
 Antisera harus grade nephelometric atau disaring terlebih dulu untuk
mengeluarkan partikel-partikel besar yang memencar
29

30. Tabel 16-1. Alat-alat Otomatis untuk Analisis Pencaran Cahaya
Centrigugal Fast
Technicon AIP Behring Autolasser LN Beckman Automated ICS Reaction Rate Analyzer Analyzer
Nephelometer (N) (angle) N (90°) N (5° - 12°) N (70°) T T
or turbidometer (T)
Endpoint (E) or kinetic (K) E + blank E + blank K K or E K or E
analysis of reaction
Light source (wavelength, Mercury arc Lazer Tungsten lamp (400-550 Variable: ultraviolet to 700 Variable: ultraviolet to 700
nm) nm) nm nm
(357 nm) (632.8 nm)
Calibration Standard curve Standard curve Single point, Standard curve, reagent Standard curve, reagent
lot lot
reagent lot
Samples/ hour 120 120-240 30-50 20-40 300
Reaction time 10 min 1 hour (non PEG) 30 sec 1-2 min (kinetic) 1-2 min (kinetic)
Sensitivity 5 mg/L - 1mg/L - -
Precision (CV)
Within-run 2%-5% - 2%-5% - -
Between-run 5%-10% - 5%-10% - -
Capital outlay ++ +++ +++ +++ ++++
Original monitoring 0 + +++ + +
capability
Other type of analysis ++ + + +++ ++++
30
Sumber : Deverill I, Reeve WG: J Immunol Methods 38: 191-204, 1980

31. Simpulan
 Nefelometri adalah suatu metode pemeriksaan imunopresipitasi
kuantitatif yang secara langsung mengukur pencaran cahaya (light
scattered) dari partikel-partikel yang berada didalam larutan
 Terdapat 2 prinsip yaitu : prinsip pencaran cahaya & kinetika endapan
fase cair
 Menggunakan alat nefelometer dgn komponen utama : sumber
cahaya, sistem collimating, monokromator, kuvet, dan tabung
fotomultiplair
 Terdapat 4 metode nefelometri (end point, kinetik, NIIA, particle-
enhanced)
 Terdapat kelebihan & kelemahan pada metode nefelometri dalam
pemeriksaan imunopresipitasi
 Dengan menggunakan alat dan reagen yang bersifat stabil, handal,
dan dijual bebas dipasaran menjadikan nefelometri bermanfaat untuk
teknik-teknik standar dari RID & IEP

32. 32

33. Contoh alat :
Beckman ICS (immunochemistry system) Behring
 Sumber cahaya tungsten &  Sumber cahaya diode light-emitting
mengukur pencaran cahaya pada high performance & mengukur
sudut depan 70° pencaran cahaya pd sudut depan
 Menggunakan program fitting kurva antara 130-240
yg sebelumnya telah ditentukan,  Sinyal cahaya dikonversi menjadi
sinyal-sinyal pencaran cahaya diubah sinyal listrik oleh photodiode yg sensitif
menjadi konsentrasi
 Nefelometer yg dikontrol oleh  Intensitas cahaya yg memencar
mikroprosesor, digunakan pada sebanding dgn konsentrasi kompleks
kinetik atau rate yang dapat imun yang diukur
mengatasi masalah interferensi latar 
atau dapat digunakan manual untuk
analisis end point
33

34. Contoh alat :
Beckman Behring
 Dengan reagan yg dibuat  Respon sinyal cahaya dibandingkan
khusus, alat akan beroperasi dgn nilai-nilai dari kurva referensi yg
dengan kalibrasi titik tunggal sebelumnya disimpan dalam
(single point) →dgn memori terminal komputer &
menggunakan kartu data optik dikonversikan dalam unit-unit
yg ada pada setiap kit reagen konsentrasi
utk mengontrol operasional alat  Menggunakan metode waktu tetap
 Rangkaian pengenceran 6x lipat untuk pengukuran protein plasma
dari kalibrator & sampel tes &menghasilkan 2 pengukuran
dilakukan secara otomatis cahaya yg menyebar berurutan
 Alat secara otomatis memeriksa  Kurva kalibrasi dijalankan dgn 4-8
Ag berlebih, bahan spesimen yg konsentrasi standar, stabil sampai 7
sudah dipakai, & memberikan hari &dapat disimpan dalam memori
instruksi untuk tes ulang terminal komputer.

35. Contoh alat
Beckman Behring
 Bila digunakan model kinetik,  kalibrasi model single point
alat tidak akan menunggu dapat dilakukan dgn
respon plateau→memiliki menggunakan parameter-
waktu operasi yang singkat parameter tes yg sebelumnya
 Monitoring kontinyu dari laju telah ditentukan dan sudah
reaksi menyebabkan hanya termasuk dalam kit reagen
sedikit bahan spesimen yg  Tidak memerlukan deteksi
akan diproses setiap jam antigen excess luasnya rentang
 Dapat digunakan utk pengukuran akan meliputi
menentukan atau analisis peningkatan konsentrasi sampai
batch s/d 6 tes per bahan konsentrasi maksimum terlarut
spesimen dalam plasma
 CV yg dihasilkan terus rendah
di semua tingkatan dari Ig
35

36. Precipitation Curve
 Prozone – antibody excess, many antibodies
coat all antigen sites- results in false negative
 Postzone – antigen excess, antibody coats
antigen but cannot get lattice formation,
results in false negative
 Zone of Equivalence – antigen and antibody
present in optimal proportions to bind and
give visible reaction

37. Precipitation Curve

38. Turbidimetry
 Measures turbidity or cloudiness of a solution by measuring the
amount of light PASSING THROUGH the solution.
 Soluble antigen and antibody join and once they join in sufficient
amounts precipitate, results in cloudiness.
 The more cloudy the solution, the less light can pass through.

39. Nephelometry

40. Passive Immunodiffusion
 Reactions in gels
 Migrate towards each other and where they
meet in optimal proportions form a
precipitate.
 Four Methodologies:
Single diffusion, single dimension
Single diffusion, double dimension
Double diffusion, single dimension
Double diffusion, double dimension

41. Ouidin
Single Diffusion, Single Dimension

42. Oudin Precipitation
 Solution of antibody is carefully layered on top of a solution of
antigen, such that there is no mixing between the two.
 With time at the interface where the two layers meet, antigen-
antibody complexes form a visible precipitate. The other two
tubes are negative controls, containing only antibody or only
antigen plus an irrelevant protein in the second layer.

43. Radial Immunodiffusion

44. RADIAL IMMUNODIFFUSION
Precipitin Rings
A B C
a b c
Standards Samples
Standard Curve

45. Electrophoretic Techniques
 Immunodiffusion can be combined with electrical
current to speed things up.

46. Immunoelectrophoresis

47. Immunoelectrophoresis
 Two-dimensional immunoelectrophoresis. Antigens are
separated on the basis of electrophoretic mobility. The
second separation is run at right angles to the first which
drives the antigens into the antiserum-containing gel to
form precipitin peaks; the area under the peak is related to
the concentration of antigen.

48. Immunofixation Electrophoresis
 Immunofixation Electrophoresis (IFE) combines zone
electrophoresis with immunoprecipitation.
 This technique may be used to identify and
characterise serum proteins.
 In IFE, proteins of sample are first separated by
electrophoresis on a support (agarose) according to
their charge and after that the medium is overlaid
with monospesific antiserá reactive with specific
protein - antigen.
 If the antigen is present a characteristic
immunoprecipitin band will be formed.

49. Enhancement of Agglutination
 Additive to neutralize charge
 Viscosity
 Treatment with enzymes
 Agitation and centrifugation
 Temperature
 pH