Microbiology

1. Chöông 6: Nhöõng vaán ñeà kyõ thuaät vaø phöông phaùp taïo gioáng vi sinh vaät.
........................................................................................................................................
CHÖÔNG 5
NHÖÕNG VAÁN ÑEÀ KYÕ THUAÄT
VAØ PHÖÔNG PHAÙP TAÏO GIOÁNG
VI SINH VAÄT
Trong quaù trình saûn xuaát cuõng nhö trong quaù trình nghieân cöùu, hoïc
taäp, vieäc giöõ gioáng vaø baûo quaûn gioáng cuõng nhö vieäc taïo ra nhöõng
chuûng loaïi gioáng vi sinh vaät môùi laø raát quan troïng.
Moät chuûng loaïi thuaàn khieát, taïo ra nhieàu saûn phaåm höõu ích cho con
ngöôøi, coù aûnh höôûng toát ñeán töï nhieân laø nhöõng chuûng coù giaù trò to
lôùn veà kinh teá cuõng nhö coù taùc ñoäng toát ñoái vôùi moâi tröôøng xung
quanh.
5.1. GIOÁNG VI SINH VAÄT
1 5.1.1. Yeâu caàu chaát löôïng gioáng:
Moät loaïi gioáng phuø hôïp phaûi ñaùp öùng ñöôïc caùc yeâu caàu sau:
- Taïo ra caùc saûn phaåm maø ta mong muoán vôùi saûn löôïng cao, thuaån
khieát trong moät thôøi gian ngaén.
- Coù khaû naêng ñoàng hoùa nguoàn nguyeân lieäu deã tìm, saün coù, reû
tieàn.
- Khaû naêng taùch saûn phaåm ra deã daøng.
...............................................................................................................................................................
89

2. Vi sinh thöïc phaåm
........................................................................................................................................
- Loaïi gioáng thuaàn chuûng, khoâng bò taïp nhieãm, khoâng chöùa caùc thöïc
khuaån theå (bacteriaphage).
- Loaïi gioáng khoeû, deã daøng caáy truyeàn, deã taïo baøo töû, coù khaû
naêng phaùt trieån nhanh.
- Coù khaû naêng töï baûo veä choáng laïi söï taïp nhieãm.
- Deã baûo quaûn, tính naêng oån ñònh trong suoát thôøi gian baûo quaûn
cuõng nhö söû duïng.
- Coù khaû naêng caûi taïo baèng phöông phaùp ñoät bieán, baèng kyõ thuaät
gen ñeå taïo ra caùc gioáng môùi coù tính naêng toát hôn, hieäu suaát cao
hôn.
5.1.2. Nguoàn gioáng vi sinh vaät:
5.1.2.1. Trong töï nhieân:
Trong thieân nhieân coù raát nhieàu chuûng vi sinh vaät khaùc nhau. Coù raát
nhieàu phöông phaùp saûn xuaát thöïc phaåm theo phöông phaùp coå truyeàn
cuõng laáy nguoàn gioáng töø thieân nhieân. Chính vì vaäy, ta coù theå phaân laäp
caùc vi sinh vaät töø ñaát, töø nöôùc, töø caùc daïng phaân höõu cô, ….
Phöông phaùp phaân laäp:
- Laáy maãu ñaát hoaëc nöôùc.
- Pha loaõng baèng nöôùc muoái sinh lyù (0,85% NaCl), hoaëc baèng pepton
0,1% vôùi caùc vi sinh vaät khoâng öa muoái hoaëc khoâng öa nöôùc caát nhö
Pseudomonas.
- Ñoå ñóa treân moâi tröôøng thaïch. Nuoâi vaøi ngaøy.
- Taùch caùc khuaån laïc ra baèng phöông phaùp caáy ria.
- Laøm vaøi laàn nhö vaäy ñeå laáy chuûng thuaàn khieát.
- Vôùi caùc vi sinh vaät khoâng thích hôïp vôùi moâi tröôøng ñaëc ta coù theå
duøng moâi tröôøng loûng.
...............................................................................................................................................................
90

3. Chöông 6: Nhöõng vaán ñeà kyõ thuaät vaø phöông phaùp taïo gioáng vi sinh vaät.
........................................................................................................................................
Sau khi phaân laäp, coù theå laøm giaøu leân baèng caùch söû duïng caùc moâi
tröôøng thích hôïp ñeå nhaân gioáng vi sinh vaät trong caùc ñieàu kieän thích
hôïp.
5.1.2.2. Caùc trung taâm giöõ gioáng vi sinh vaät:
Sau naøy, ngaøy caøng coù nhieàu trung taâm giöõ gioáng vi sinh vaät treân
theá giôùi. Ta coù theå mua caùc chuûng loaïi gioáng thích hôïp töø caùc trung taâm
naøy veà, ñeå phuïc vuï cho muïc ñích cuûa mình.
Döôùi ñaây laø danh saùch cuûa moät soá trung taâm coù uy tín treân theá giôùi:
- ABBOTT: Abbott Laboratories, North Chicago, III.60064, USA.
- ATCC: American Type Cultur Collection, 12301, Parklawn Drive Rockvill Md
20852, USA.
- CANAD – 212: Division Obioscience, National Research Council, Ottawa,
Canada.
- CC: CRISO Division of Plant Industry, Canberra City, A.C.T. Australia.
- FERM: Fermentation Reseach institute, Agency of IndustrialScience and
Technology, Ministry of Industrial Trade and industry, Chiba, Japan.
- HIR: Food and Fermentation Division, Hokkaido Profectural Industrial
Research Institute, Sapporo, Japan.
- IMASP: Museum of Culture, Institute of Microbiology, Academy of Science of
Republic of China Peking, China.
5.1.3. Moät soá moâi tröôøng duøng trong phaân laäp vaø nuoâi caáy
vi sinh vaät:
Coù raát nhieàu loaïi moâi tröôøng khaùc nhau söû duïng trong nuoâi caáy,
phaân laäp vaø ñònh tính vi sinh vaät. Coù nhöõng loaïi chæ söû duïng ñaëc tröng
cho moät nhoùm vi sinh vaät, coù loaïi laïi ñaëc tröng chæ cho moät gioáng vi sinh
vaät, vaø cuõng coù nhöõng loaïi maø haàu heát caùc vi sinh vaät ñeàu coù theå
söû duïng ñöôïc.
...............................................................................................................................................................
91

4. Vi sinh thöïc phaåm
........................................................................................................................................
Sau ñaây chuùng ta seõ cuøng tìm hieåu veà moät soá loaïi moâi tröôøng ñaëc
tröng.
5.1.3.1. Moâi tröôøng nuoâi caáy vaø phaân laäp vi khuaån:
- Moâi tröôøng nöôùc maém – pepton :
Nöôùc maém 35
0
ñaïm : 30 ml
Pepton : 10 g
Nöôùc caát boå sung ñeán : 1000 ml
pH = 7, khöû truøng 1 atm / 30 phuùt.
- Moâi tröôøng thaïch – nöôùc thòt – pepton :
Nöôùc thòt : 1000 ml
Pepton : 10g
Thaïch (agar) : 20 g
pH = 7, khöû truøng 1 atm / 30 phuùt.
- Moâi tröôøng dòch chieát naám men:
Dòch chieát naám men : 1000 ml
NaCl : 5 g
Na2HPO4 : 1 g
Saccharose : 5 g
- Moâi tröôøng cho Lactobacillus:
Nöôùc eùp caø chua : 200ml
Trypton : 10g
Cao naám men 10g
Nöôùc caát boå sung ñeán : 1000 ml
...............................................................................................................................................................
92

5. Chöông 6: Nhöõng vaán ñeà kyõ thuaät vaø phöông phaùp taïo gioáng vi sinh vaät.
........................................................................................................................................
PH = 7,2
5.1.3.2. Moâi tröôøng nuoâi caáy vaø phaân laäp naám men:
- Moâi tröôøng khoai taây – ñöôøng caùm:
Khoai taây : 300 g
Caùm : 100 g
Ñöôøng kính : 50 g
Nöôùc caát boå sung ñeán : 1000 ml
pH = 7, khöû truøng 1 atm / 30 phuùt
- Moâi tröôøng giaù ñaäu - ñöôøng :
giaù ñaäu : 100g
ñöôøng : 50g
Nöôùc caát boå sung ñeán : 1000 ml
- Moâi tröôøng Sabouraud: pH : 5,6 – 6,0
Pepton : 10 g
Maltose hay glucose : 40 g
Thaïch : 20 g
Nöôùc caát boå sung ñeán : 1000 ml
- Moâi tröôøng Hansen :
Glucose, maltose (hoaëc ñöôøng kính) 50 g
Pepton : 10 g
K2HPO4 : 3 g
MgSO4.7H2O : 2 – 5 g
Thaïch : 20 g
Nöôùc caát boå sung ñeán : 1000 ml
...............................................................................................................................................................
93

6. Vi sinh thöïc phaåm
........................................................................................................................................
- Chuù yù: Trong quaù trình nuoâi caáy naám men ta coù theå cho theâm
natripropionat 2,5 g/l ñeå haïn cheá söï phaùt trieån cuûa naám moác.
5.1.3.3. Moâi tröôøng nuoâi caáy vaø phaân laäp naám moác:
- Moâi tröôøng khoai taây:
Khoai taây goït voû, ñöa vaøo oáng nghieäm.
Ñaäy nuùt boâng vaø khöû truøng.
Coù theå thay khoai taây baèng cuû caûi hay caø roát.
- Moâi tröôøng Czapek:
Saccharose : 30 g NaNO3 : 30 g
K2HPO4 :1 g MgSO4 : 0,5 g
FeSO4: 0,01 g Thaïch ( agar ): 20 g
Nöôùc caát boå sung ñeán: 1000 ml
pH = 6, khöû truøng 1 atm / 30 phuùt.
- Moâi tröôøng Martin :
Glucose : 10 g Pepton : 5 g
K2HPO4 : 1 g MgSO4.7H2O: 0,5 g
Thaïch (agar): 20 g Nöôùc caát : 900 ml
Rosebengal (1/30000): 100 ml
Streptomicin (1%): 3,0 ml
- Moâi tröôøng pepton – glucose :
Glucose: 10 g Pepton: 5 g
K2HPO4: 1 g MgSO4.7H2O : 0,5 g
Thaïch (agar): 20 g Nöôùc caát: 900 ml
...............................................................................................................................................................
94

7. Chöông 6: Nhöõng vaán ñeà kyõ thuaät vaø phöông phaùp taïo gioáng vi sinh vaät.
........................................................................................................................................
Rosebengal (1/30000): 100 ml
Streptomicin (1%): 3,0 ml
- Moâi tröôøng pepton – glucose :
Glucose: 10 g Pepton: 5 g
K2HPO4: 1 g MgSO4.7H2O: 0,5 g
Nöôùc caát: 1000 ml Thaïch (agar) : 20 g
pH = 4, sau khi khöû truøng.
- Chuù yù: Trong quaù trình nuoâi caáy naám moác ta coù theå cho theâm moät
soá chaát ñeå haïn cheá söï phaùt trieån cuûa vi khuaån nhö; rose
bengal, streptomycin, penicillin, NaCNS, tetracyclin, oxytetracyclin,
clorotetracyclin, neomycin, polymycin,
5.1.3.4. Moâi tröôøng nuoâi caáy vaø phaân laäp xaï khuaån:
- Moâi tröôøng Gauze 1:
Tinh boä tan: 20 g K2HPO4: 0,5 g MgSO4.7H2O: 0,5 g
KNO3: 1,0 g NaCl: 0,5 g FeSO4: 0,1 g
Nöôùc caát: 1000 ml Thaïch (agar): 20 g
pH = 7,2 – 7,4.
- Moâi tröôøng tinh boät – ñaïm sunfat:
(NH4)2SO4: 1 g K2HPO4: 1 g NaCl: 1 g
MgSO4: 1 g Tinh boät tan: 10 g Nöôùc maùy: 1000 ml
Thaïch (agar): 20 g
pH = 7,2.
- Moâi tröôøng tinh boät – kali nitrat:
KNO3: 1 g K2HPO4: 3 g NaCl: 0,2 g
MgCO3 : 0,3 g Tinh boät tan: 10 g FeSO4: 0,001 g
...............................................................................................................................................................
95

8. Vi sinh thöïc phaåm
........................................................................................................................................
CaCO3 : 0,5 g Nöôùc maùy: 1000 ml Thaïch (agar): 20 g
pH = 6,8 – 7,2.
- Moâi tröôøng cao ngoâ:
Cao ngoâ : 15 g Pepton : 5 g NaCl : 5 g
Glucose : 10 g Nöôùc caát : 1000 ml Thaïch (agar ): 20 g.
5.2. TAÏO GIOÁNG VI SINH VAÄT:
Trong coâng nghieäp thöïc phaåm luoân caàn caùc chuûng gioáng ñaëc tröng
thích hôïp vôùi yeâu caàu saûn xuaát cuûa loaøi ngöôøi. Trong khi ñoù caùc chuûng
gioáng coù saün trong töï nhieân laïi khoâng ñaùp öùng ñöôïc ñieàu ñoù. Chính vì
vaäy coâng vieäc taïo gioáng chính laø tìm ra nhöõng bieán chuûng coù nhöõng tính
naêng nhö:
- Coù naêng suaát cao, taïo ra nhieàu saûn phaåm.
- Thôøi gian leân men nhanh, ít taïp nhieãm.
- Taïo ra caùc saûn phaåm theo yeâu caàu cuûa con ngöôøi.
(ví duï: saûn xuaát khaùng sinh, acid amin,..)
Coâng vieäc taïo gioáng ñoøi hoûi thôøi gian cuõng nhö tính chính xaùc cuûa
caùc test phaân laäp vaø söï thöû nghieäm treân quy moâ coâng nghieäp.
Coâng vieäc taïo gioáng bao goàm caùc vieäc sau:
- Phaân laäp gioáng töø moâi tröôøng xung quanh hoaëc söû duïng gioáng coù
saün coù tính naêng thích hôïp vôùi muïc ñích söû duïng ñeå nghieân cöùu
nhaém thay ñoåi tính chaát cuûa gioáng theo yeâu caàu coâng vieäc.
- Ñoät bieán nhaân taïo vaø choïn löïa gioáng.
- Söû duïng caùc kyõ thuaät lai taïo, caùc kyõ thuaät gen ñeå taïo thaønh
nhöõng caù theå môùi coù tính naêng nhö mong muoán.
...............................................................................................................................................................
96

9. Chöông 6: Nhöõng vaán ñeà kyõ thuaät vaø phöông phaùp taïo gioáng vi sinh vaät.
........................................................................................................................................
- Thöôøng xuyeân löïa choïn laïi caùc chuûng gioáng, ñeå coù theå giöõ ñöôïc
nhöõng caù theå toát nhaát vaø loaïi boû nhöõng ñoät bieán ngaãu nhieân
baát lôïi cho saûn xuaát.
- Baûo quaûn gioáng trong ñieàu kieän thích hôïp ñeå ñaûm baûo tính naêng
cuûa gioáng khoâng bò thay ñoåi döôùi taùc ñoäng cuûa moâi tröôøng.
Moät soá daïng ñoät bieán thöôøng gaëp:
Loaïi ñoät
bieán
Baûn chaát caùc
thay ñoåi
Daáu hieäu phaùt hieän ñoät bieán
Khoâng di
ñoäng
Maát tieân mao,
hoaëc tieân mao
khoâng hoaït ñoäng
Caùc khuaån laïc moïc dính vaøo nhau.
Trong khi ñoù ôû khuaån laïc nguyeân
thuûy caùc khuaån laïc moïc rieâng leû.
Khoâng taïo
nha baøo
Maát hoaëc thay ñoåi
beà maët maøng
nhaày
Khuaån laïc beù, xuø xì thay vì lôùn,
troøn, boùng.
Khuaån laïc
xuø xì
Maát hoaëc thay ñoåi
lôùp beân ngoaøi
lipopolysaccharide
Khuaån laïc nhieàu haït nhoû, khoâng
ñeàu, thay vì lôùn, troøn, saùng.
Dinh
döôõng
Maát moät hoaëc
nhieàu enzym treân
con ñöôøng sinh
toûng hôïp
Khoâng moïc ñöôïc treân moâi tröôøng
toång hôïp toái thieåu khoâng coù boå
sung caùc vitamin, acid amin,..
Leân men
ñöôøng
Maát enzym cuûa
caùc con ñöôøng
phaân giaûi caùc loaïi
ñöôøng
Khoâng taïo ra söï bieán ñoåi maøu treân
caùc moâi tröôøng coù caùc laoïi ñöôøng
ñaëc tröng vôùi caùc chæ thò maøu ñaëc
tröng.
...............................................................................................................................................................
97

10. Vi sinh thöïc phaåm
........................................................................................................................................
Loaïi ñoät
bieán
Baûn chaát caùc
thay ñoåi
Daáu hieäu phaùt hieän ñoät bieán
Khaùng
thuoác
Thay ñoåi khaû
naêng thaåm thaàu,
ngaên caûn söï xaâm
nhaäp vaøo teá baøo
cuûa caùc loaïi
thuoác, hoaëc phaù
huûy caùc thuoác.
Moïc treân moâi tröôøng coù thuoác ôû
noàng ñoä maø bình thöôøng coù theå
gaây öùc cheá phaùt trieån cuûa vi sinh
vaät.
Khaùng
viruùt
Maát ñieåm tieáp
nhaân viruùt
Phaùt trieån treân moâi tröôøng nuoâi
caáy khi coù maët viruùt ôû noàng ñoä
cao.
Nhaïy caûm
vôùi nhieät
ñoä bình
thöôøng
Thay ñoåi moät
protein thieát yeáu
laøm taêng söï nhaïy
caûm vôùi nhieät ñoä
Coù khaû naêng phaùt trieån ôû nhieät
ñoä thaáp. Nhöng ôû nhieät ñoä bình
thöôøng khoâng phaùt trieån.
Maát saéc
toá
Maát caùc enzym coù
khaû naêng tham gia
toång hôïp saéc toá
Khuaån laïc coù maøu khaùc hoaëc maát
maøu
Ngoaøi phöông phaùp laøm ñoät bieán caùc gioáng vi sinh vaät saün coù, ngöôøi
ta coù theå duøng caùc phöông phaùp phaân laäp ñeå tìm nguoàn vi sinh vaät coù
saün trong ñaát, trong nöôùc,.. trong moâi tröôøng xung quanh chuùng ta - laø
nhöõng loaïi vi sinh vaät ñaõ thích nghi vôùi moâi tröôøng töï nhieân. Sau ñoù thay
ñoåi tính naêng cuûa chuùng cho phuø hôïp vôùi coâng nghieäp saûn xuaát.
5.3. CAÙC PHÖÔNG PHAÙP GIÖÕ GIOÁNG VI SINH VAÄT:
Giöõ gioáng vi sinh vaät laø moät coâng vieäc raát caàn thieát ñoái vôùi caû caùc
trung teâm giöõ gioáng vaø vôùi caû caùc phoøng thí nghieäm nhoû thuoäc caùc
tröôøng hoïc cuõng nhö caùc nhaø maùy saûn xuaát. Muïc ñích cuûa vieäc giöõ
...............................................................................................................................................................
98

11. Chöông 6: Nhöõng vaán ñeà kyõ thuaät vaø phöông phaùp taïo gioáng vi sinh vaät.
........................................................................................................................................
gioáng laø thöïc hieän caùc bieän phaùp kyõ thuaät caàn thieát ñeå giöõ cho gioáng
vi sinh vaät khoâng bò thoaùi hoùa, coù tyû leä soáng soùt cao, khoâng bò taïp
nhieãm. Coù raát nhieàu phöông phaùp giöõ gioáng, tuøy theo ñieàu kieän maø
moãi nôi seõ söû duïng caùc phöông phaùp khaùc nhau. Döôùi ñaây laø moät vaøi
phöông phaùp giöõ gioáng vi sinh vaät thöôøng gaëp:
5.3.1. Phöông phaùp caáy truyeàn ñònh kyø treân moâi tröôøng
môùi:
Thöôøng söû duïng thaïch nghieâng ñeå caáy truyeàn ñònh kyø. Ñöôïc aùp duïng
ñeå baûo quaûn taát caû caùc loaïi vi sinh vaät.
- Vôùi naám moác: caáy truyeàn sau 3 – 6 thaùng.
- Vôùi naám men, vi khuaån: caáy truyeàn sau 1 – 2 thaùng.
Thôøi gian giöõa 2 laàn caáy truyeàn coù theå keùo daøi hôn neáu sau khi caáy vi
sinh vaät, ta giöõ chuùng ôû nhieät ñoä thaáp (3 – 5
0
C)
Öu ñeåm: ñôn giaûn, deã laøm.
Nhöôïc ñieåm: toán coâng söùc, moâi tröôøng, thôøi gian. Phaåm chaát deã bò
thay ñoåi. Thoâng thöôøng sau moät vaøi theá heä caáy truyeàn thì phaåm chaát
cuûa gioáng bò thay ñoåi roõ reät.
Phöông phaùp laøm: Thuaàn khieát laïi chuûng vi sinh vaät treân thaïch ñóa. Sau
caáy caùc vi sinh vaät ñieån hình leân thaïch nghieâng. Nuoâi trong tuû aám ñeå vi
sinh vaät phaùt trieån bình thöôøng. Laáy oáng gioáng ra vaø cho vaøo tuû laïnh
baûo quaûn ôû 4
0
C. Ñònh kyø caáy truyeàn laïi. Coù theå cho theâm 1% daàu thöïc
vaät vaøo moâi tröôøng ñeå traùnh hieän töôïng maát nöôùc cuûa moâi tröôøng.
5.3.2. Phöông phaùp giöõ gioáng treân moâi tröôøng thaïch coù lôùp
daàu khoaùng:
Söû duïng daàu khoaùng nhö vaselin, parafin. Daàu khoaùng phaûi trung tính, coù
ñoä nhôùt cao, khoâng chöùa caùc saûn phaåm ñoäc ñoái vôùi vi sinh vaät vaø voâ
truøng.
Caùch baûo quaûn:
- Khöû truøng daàu khoaùng trong autoclave (121
0
C, 2h).
...............................................................................................................................................................
99

12. Vi sinh thöïc phaåm
........................................................................................................................................
- Sau ñoù saáy khoâ trong tuû saáy (170
0
C, 1 – 2h)
- Ñeå nguoäi.
- Ñoå leân maët moâi tröôøng thaïch nghieâng coù vi sinh vaät phaùt trieån toát
moät löôïng daàu caùch meùp treân cuûa oáng nghieäm laø 1cm. Ñaäy nuùt
boâng laïi.
- Treùt parafin ñaëc leân mieäng vaø giöõ ôû ñieàu kieän laïnh hoaëc ñieàu
kieän thöôøng ñeàu ñöôïc.
Öu ñieåm: Ñôn giaûn, hieäu quaû cao. Moâi tröôøng khoâng bò maát nöôùc.
Vôùi phöông thöùc naøy, vi sinh vaät khoâng tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi oxy neân
khoâng theå phaùt trieån. Chính vì vaäy maø löôïng chaát dinh döôõng coù trong
moâi tröôøng khoâng bò giaûm ñi. Vi sinh vaät seõ ñöôïc baûo quaûn laâu hôn so
vôùi phöông phaùp treân.
5.3.3. Phöông phaùp giöõ gioáng treân ñaát, caùt, haït:
5.3.3.1. Treân ñaát, caùt:
Duøng ñeå baûo quaûn caùc loaïi vi sinh vaät taïo baøo töû tieàm sinh hoaëc
baøo töû voâ tính. Thôøi gian baûo quaûn từ 1 ñeán nhieàu naêm.
Caùch baûo quaûn:
- Ñaát hoaëc caùt ñem raây kyõ, laáy loaïi haït coù cuøng kích côõ. Ngaâm
trong HCl hoaëc H2SO4 ñaäm ñaëc 8 – 12h ñeå loaïi boû caùc acid höõu cô.
Vôùi ñaát chua thì caán trung hoøa baèng CaCO3 1 – 2%.
- Röûa kyõ ñeán pH trung tính.
- Saáy khoâ, thanh truøng vaø giöõ ôû ñieàu kieän voâ truøng.
- Ñoå ñaày caùt vaøo oáng nghieäm chöùa vi sinh vaät phaùt trieån treân moâi
tröôøng thaïch (caùc vi sinh vaät naøy ñaõ taïo thaønh nhieàu baøo töû) vaø
laéc thaät ñeàu.
...............................................................................................................................................................
100

13. Chöông 6: Nhöõng vaán ñeà kyõ thuaät vaø phöông phaùp taïo gioáng vi sinh vaät.
........................................................................................................................................
- Roùt toaøn boä caùt laãn vi sinh vaät vaø baøo töû sang oáng nghieäm voâ
truøng khaùc. Ñaäy nuùt boâng cho vaøo tuû saáy giöõ ôû 40
0
C trong 2 – 3
ngaøy.
- Haøn kín mieäng oáng nghieäm laïi baèng paraffin. Ñeå trong phoøng maùt
hoaëc trong tuû laïnh ôû 4
0
C.
Thôøi gian baûo quaûn töø 1 ñeán nhieàu naêm. Tröôùc khi duøng phaûi caáy ria
leân moâi tröôøng agar vaø choïn caùc khuaån laïc ñieån hình..
5.3.3.2. Treân haït:
Duøng ñeå baûo quaûn caùc vi sinh vaät coù daïng hình sôïi sinh baøo töû hoaëc
khoâng. Thôøi gian baûo quaûn coù theå leân tôùi 1 naêm.
Phöông phaùp baûo quaûn:
- Haït nguõ coác ñöôïc röûa saïch baèng nöôùc noùng.
- Cho vaøo caùc oáng nghieäm caùc haït nguõ coác noùi treân.
- Phuû treân caùc haït naøy moät lôùp boâng thaám nöôùc naáu haït nguõ
coác.
- Thanh truøng haït ôû 121
0
C trong 40 phuùt. Thanh truøng 3 laàn, moãi laàn
caùch nhau 24h.
- Caáy gioáng vi sinh vaät treân lôùp boâng cho moïc thaät daày. Haèng ngaøy
laéc nheï.
- Sau 8 – 10 ngaøy kieåm tra laïi ñoä thuaàn khieát vaø khaû naêng soáng cuûa
gioáng. Gaén paraffin.
- Giöõ ôû nhieät ñoä 15 – 20
0
C.
5.3.4. Giöõ gioáng treân giaáy loïc:
Thöôøng söû duïng ñeå baûo quaûn caùc vi sinh vaät coù baøo töû.
Giaáy loïc ñöôïc caét thaønh caùc mieáng nhoû 1-3 cm. Cho vaøo oáng nghieäm.
Ñaäy nuùt boâng, thanh truøng ôû 121
0
C trong 1 giôø. Sau saáy trong tuû saáy ôû
100
0
C trong 3 giôø.
...............................................................................................................................................................
101

14. Vi sinh thöïc phaåm
........................................................................................................................................
Vi sinh vaät ñöôïc nuoâi trong 3 – 5 ngaøy ñeå coù baøo töû. Duøng pipet voâ
truøng cho vaøo moãi mieáng giaáy loïc 1 gioït vi khuaån. Ñaäy nuùt boâng, nuoâi
theâm 2 – 3 ngaøy cho giaáy loïc hoaøn toaøn khoâ. Phuû paraffin ñaëc ñun chaûy
leân nuùt boâng. Ñeå tuû laïnh hoaëc nôi maùt. Thôøi gian baûo quaûn nhieàu
naêm.
5.3.5. Giöõ gioáng treân caùc mieáng gelatin:
Moâi tröôøng geletin thöôøng duøng coù theå laø nöôùc thòt + 10% gelatin + 5%
inosit hoaëc nöôùc thòt + 10% gelatin + 0,25% acid ascorbic. Cho vi sinh vaät vaøo
moâi tröôøng. Nuoâi moät thôøi gian. Nhoû töøng gioït moâi tröôøng coù chöùa vi
sinh vaät leân nhöõng mieáng nhoû giaáy neán ôû trong hoäp petri ñaõ ñöôïc khöû
truøng. Saáy khoâ trong tuû huùt chaân khoâng, duøng P2O5 ñeå haáp thuï nöôùc.
Sau ñoù boû trong oáng nghieäm. Giöõ ôõ nhieät ñoä ±5
0
C. Khi söû duïng caàn
phaûi nuoâi ôû moâi tröôøng loûng thích hôïp. Sau ñoù caáy vaøo agar vaø choïn
khuaån laïc ñieån hình.
5.3.6. Phöôhg phaùp laïnh ñoâng:
Ñaây laø phöông phaùp laøm ñôn giaûn, vi sinh vaät giöõ ñöôïc laâu.
Sau khi ñöôïc nuoâi caáy thích hôïp, ta troän vi sinh vaät vaø caùc chaát baûo veä
(vd: glycerin 10%, hoaëc huyeát thanh ngöïa, hoaëc saccharose 10% + geletin 1% +
pH trung tính; hoaëc dung dòch glucose 10%, hoaëc dung dòch lactose 10%) vaøo
laãn vôùi nhau. Cho vaøo oáng nghieäm, laøm laïnh töø töø.
- Neáu nhieät ñoä tröõ laïnh töø (-) 15
0
C – (-) 20
0
C : 6 thaùng caáy truyeàn moät
laàn.
- Neáu nhieät ñoä tröõ laïnh laø (-) 30
0
C : 9 thaùng caáy truyeàn moät laàn.
- Neáu nhieät ñoä tröõ laïnh laø (-) 40
0
C : 1 naêm caáy truyeàn moät laàn
- Neáu nhieät ñoä tröõ laïnh töø (-) 50
0
C – (-) 60
0
C : 3 naêm caáy truyeàn moät
laàn
...............................................................................................................................................................
102

15. Chöông 6: Nhöõng vaán ñeà kyõ thuaät vaø phöông phaùp taïo gioáng vi sinh vaät.
........................................................................................................................................
- Neáu nhieät ñoä tröõ laïnh töø (-) 70
0
C – (-) 60
0
C : 10 naêm caáy truyeàn moät
laàn
5.3.7. Phöông phaùp ñoâng khoâ:
Phöông phaùp naøy laøm cho teá baøo maát nöôùc theo phöông phaùp thaêng
hoa ôû aùp suaát thaáp. Ñoàng thôøi laøm giaûm hoaëc laøm ngöøng haún quaù
trình phaân chia cuûa vi sinh vaät. Nhôø ñoù chuùng coù khaû naêng chòu ñöôïc
nhieàu taùc ñoäng cuûa ngoaïi caûnh, khoâng bò bieán ñoåi veà caùc ñaëc tính di
truyeàn, thôøi gian löu giöõ laâu. Phöông phaùp naøy ñuôïc duøng nhieàu trong
saûn xuaát. Thôøi gian baûo quaûn coù theå leân tôùi vaøi chuïc naêm.
Sau khi nuoâi caáy, vi sinh vaät ñöôïc troän vôùi chaát baûo veä, roài phaân vaøo
oáng nghieäm, vaø cho vaøo chaäu laïnh ôû nhieät ñoä (–) 70 – (–) 80
0
C (ñöôïc taïo
töø hoãn hôïp tuyeát carbonic + coàn etylic), trong 1 – 5 phuùt. Sau ñoù ñöa vaøo
thieát bò ñoâng khoâ coù aùp suaát laø 10
-4
Hg, vôùi thôøi gian trung bình 8 – 14
giôø tuøy vaøo thieát bò vaø vaøo löôïng gioáng vi sinh vaät ñöôïc ñöa vaøo. Sau
khi laøm khoâ, ñoä aåm coøn vaøo khoaûng 1 – 4%. Kieåm tra laïi haøm löôïng aåm
baèng giaáy taåm CoCl2 3% (neáu khoâ thaät söï, seõ coù maøu xanh, coøn neáu
khoâng seõ chuyeån sang maøu hoàng). Sau ñoù haøn kín oáng nghieäm khoâ.
Baûo quaûn ôû nhieät ñoä phoøng.
5.4. NGUYEÂN LIEÄU DUØNG TRONG SAÛN XUAÁT VI SINH VAÄT
COÂNG NGHIEÄP
Trong coâng nghieäp, nguoàn moâi tröôøng söû duïng ñeå nuoâi caáy vi sinh vaät
phaûi ñaùp öùng caùc yeáu toá sau:
- Ñaûm baûo ñuû löôïng döôõng chaát phuïc vuï cho söï phaùt trieån cuûa vi
sinh vaät.
- Saün coù, giaù thaønh thaáp (thöôøng laø caùc phuï phaåm trong coâng
nghieäp).
- Caùc pheá thaûi sau leân men khoâng gaây oâ nhieãm moâi tröôøng.
...............................................................................................................................................................
103

16. Vi sinh thöïc phaåm
........................................................................................................................................
5.4.1. Nguoàn muoái voâ cô:
Thöôøng söû duïng ñeå ñaûm baûo löôïng N, P, K vaø caùc nguyeân toá vi löôïng
phuïc vuï cho söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät. Caùc muoái voâ cô thöôøng duøng:
ure, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, H3PO4, KH2PO4, K2HPO4, KCl, K2SO4, HCl, H2SO4,
CaCO3, MgSO4, FeSO4, MnSO4, ZnSO4,..
5.4.2. Nguoàn Carbon:
Ngoaïi tröø ñoái vôùi vieäc saûn xuaát caùc chaát ñoøi hoûi ñoä tinh khieát cao
nhö vacxin môùi söû duïng caùc daïng glucose, saccharose tinh khieát. Coøn trong
coâng nghieäp nuoâi caáy vi sinh vaät thöôøng chæ söû duïng daïng carbon thoâ.
Döôùi ñaây laø moät soá nguoàn carbon thoâ thöôøng ñöôïc söû duïng trong coâng
ngheä vi sinh vaät.
5.4.2.1. Ræ ñöôøng:
Trong coâng nghieäp saûn xuaát ñöôøng mía hoaëc ñöôøng cuû caûi, coù moät
löôïng ñöôøng khoâng keát tinh ñöôïc thöôøng goïi laø ræ ñöôøng. Ræ ñöôøng
thöôøng chieám 3 – 3,5% troïng löôïng cuûa mía. Ñaây laø nguoàn carbon reû tieàn,
giaøu chaát dinh döôõng. Tuy nhieân coù laãn moät soá taïp chaát nhö chaát keo,
taïp khuaån gaây baát lôïi cho quaù trình leân men. Chính vì vaäy luoân caàn xöû
lyù tröôùc khi ñöa vaøo söû duïng.
Thaønh phaàn cuûa ræ ñöôøng phuï thuoäc vaøo gioáng mía, vaøo ñieàu kieän
troàng troït, vaøo phöông phaùp saûn xuaát ñöôøng, ñieàu kieän baûo quaûn vaø
ñieàu kieän vaän chuyeån. Thaønh phaàn chính goàm: 15 – 20% nöôùc vaø 80 –
85% chaát khoâ hoøa tan. Trong ñoù treân 50% laø ñöôøng leân men ñöôïc (goàm
30 – 35% saccharose, 15 – 20% laø ñöôøng khöû), coøn khoaûng gaàn 50% caùc
chaát khoâng phaûi laø ñöôøng (goàm 30 – 32% laø chaát höõu cô, 18 – 20% laø
chaát voâ cô).
Taïi Vieät Nam ræ ñöôøng ñang laø nguoàn nguyeân lieäu cho coâng ngheä saûn
xuaát naám men, saûn xuaát natri glutamat, saûn xuaát coàn etylic,..
...............................................................................................................................................................
104

17. Chöông 6: Nhöõng vaán ñeà kyõ thuaät vaø phöông phaùp taïo gioáng vi sinh vaät.
........................................................................................................................................
5.4.2.2. Malt trích ly
Malt laø haït luùa ñaïi maïch naûy maàm (treân 95% soá haït), ñöôïc saáy khoâ,
sau ñoù taùch maàm vaø reã ra. Trong malt chöùa tính boät, maltose, dextrin,..
protein (9 – 10%) vaø moät löôïng enzym amylase.
Trong quaù trình naáu malt, amylase ñöôïc hoaït hoùa. Luùc naøy amylase coù
khaû naêng phaân giaûi löôïng tinh boät coù trong malt thaønh caùc loaïi ñöôøng
khaùc nhau. Tuøy vaøo loaïi amylase maø tyû leä ñöôøng taïo thaønh coù theå coù
tyû leä khaùc nhau giöõa maltose vaø glucose. Ñaây laø nhöõng loaïi ñöôøng maø
naám men coù khaû naêng söû duïng phuïc vuï cho quaù trình trao ñoåi chaát cuûa
teá baøo ñoàng thôøi cuõng taïo ra saûn phaåm phuïc vuï cho con ngöôøi.
Ngöôøi ta thöôøng söû duïng malt trong coâng ngheä saûn xuaát bia.
5.4.2.3. Tinh boät:
Nhieàu nguoàn tinh boät khaùc nhau ñöôïc söû duïng trong coâng ngheä vi sinh
vaät. Trong quaù trình söû duïng tinh boät , tröôùc tieân ngöôøi ta phaûi thuûy phaân
tinh boät thaønh ñöôøng, sau ñoù môùi duøng nguoàn ñöôøng naøy cho caùc vi sinh
vaät khaùc söû duïng. Coù nhieàu phöông phaùp thuûy phaân tinh boät: coù theå
söû duïng acid ñaëc ôû nhieät ñoä cao hoaëc duøng enzym. Phöông thöùc hay
ñöôïc duøng nhaát laø duøng enzym amylase cuûa naám moác (thöôøng söû duïng
amylase cuûa Asp. niger hoaëc Asp. oryzae) ñeå thuûy phaân tinh boät.
Taïi Vieät Nam chuû yeáu laø duøng saén (Manihot esculenta). Cuû saén chöùa
khoaûng 20 – 35% troïng löôïng tinh boät vaø 1 – 2% troïng löôïng protein. Saén coù
giaù thaønh thaáp, nguoàn nguyeän lieäu laïi saün coù. Chính vì vaäy ñöôïc öùng
duïng nhieàu trong saûn xuaát coàn, mì chính,…
Ngoaøi ra coøn coù theå duøng ngoâ, gaïo, artisoâ, caùc loaïi cuû khaùc (vd:
khoai lang,… ),..trong saûn xuaát. Thoâng duïng nhaát laø söû duïng moät phaàn
gaïo trong coâng ngheä saûn xuaát bia ñeå giaûm giaù thaønh nhaäp khaåu malt
ñaïi maïch. Ngoaøi ra coøn coù theå duøng gaïo vaø ngoâ trong saûn xuaát röôïu
(nhieàu nhaát laø taïi Myõ)…
...............................................................................................................................................................
105

18. Vi sinh thöïc phaåm
........................................................................................................................................
5.4.2.4. Caùc loaïi quaû:
Caùc loaïi quaû thöôøng chöùa moät löôïng fructose cao (6 – 12% ) nhö ñaøo,
mô, leâ döùa hoaëc moät löôïng glucose nhö nho. Ñaây laø nguoàn carbon raát toát
cho vi sinh vaät. Tuy nhieân do giaù thaønh cao neân haàu nhö chæ ñöôïc söû
duïng trong coâng ngheä saûn xuaát röôïu.
5.4.2.5. Caùc chaát thaûi trong cheá bieán coâng nghieäp vaø
thöïc phaåm:
Caùc chaát thaûi trong cheá bieán coâng nghieäp vaø thöïc phaåm luoân ñoøi
hoûi phaûi ñöôïc xöû lyù kyõ tröôùc khi ñaåy ra moâi tröôøng. Neáu xöû duïng laøm
nguyeân lieäu leân men thì khoâng nhöõng taïo ra saûn phaåm höõu ích cho cuoäc
soáng maø coøn giuùp cho vieäc giaûm oâ nhieãm moâi tröôøng. Tuy nhieân caùc
chaát thaûi naøy coù moät nhöôïc ñieåm laø naèm raûi raùc taïi nhieàu vuøng saûn
xuaát khaùc nhau vaø coù haøm löôïng C thaáp. Trong soá caùc loaïi chaát thaûi
coù hai loaïi sau thöôøng ñöôïc söû duïng:
5.4.2.5.1. Dòch kieàm sulfit:
Ngaønh coâng nghieäp saûn xuaát giaáy vaø boät giaáy haøng naêm taïo ra
khoaûng 100 x 10
6
taán dòch kieàm sulfit. Chaát dòch naøy hình thaønh töø quaù
trình xöû lyù goã baèng acid bisulfit. Ñaây laø loaïi acid coù khaû naêng hoøa tan
linhin vaø phaân giaûi hemicellulose thaønh caùc thaønh phaàn coù caáu truùc
phaân töû nhoû hôn.
Thaønh phaàn chính cuûa dòch kieàm sulfit laø linhosulfonat vaø caùc ñöôøng
pentose. Trong quaù trình söû duïng caàn phaûi thoâng khí vaø phaûi boå sung
theâm caùc chaát dinh döôõng chöùa nitô vaø photphat.
5.4.2.5.2. Dòch ñöôøng söõa:
Trong coâng nghieäp saûn xuaát caùc saûn phaåm töø söõa, chaát dòch ñöôøng
söõa naøy laø saûn phaåm taïo thaønh trong quaù trình saûn xuaát phomat vaø
casein. Löôïng dòch ñöôøng söõa naøy neáu ñöa thaúng ra ngoaøi coáng raõnh seõ
taïo neân moät söï oâ nhieãm to lôùn. Chính vì vaäy taïi moät soá nöôùc noù cuõng
ñöôïc taän duïng qua quaù trình leân men Tröôùc khi leân men dòch ñöôøng söõa
...............................................................................................................................................................
106

19. Chöông 6: Nhöõng vaán ñeà kyõ thuaät vaø phöông phaùp taïo gioáng vi sinh vaät.
........................................................................................................................................
caàn phaûi pha loaõng ra ñeán noàng ñoä caàn thieát. Sau ñoù boå sung theâm
nitô, photpho vaø caùc vitamin.
5.4.3. Nguoàn Nitô:
Coù theå söû duïng caùc hôïp chaát voâ cô nhö ureâ, NH4
+
, NO3
-
, cuõng nhö
höõu cô: cao ngoâ, boät ñaäu töông, boät haït boâng,… Ngoaøi ra coù theå boå
sung acid amin trong tröôøng hôïp caàn thieát.
5.5. KYÕ THUAÄT LEÂN MEN
Tröôùc heát caùc chuûng vi sinh vaät thu ñöôïc nhôø choïn gioáng caàn ñöôïc
baûo quaûn sao cho traùnh khoûi maát hoaït tính. Sau ñoù moät phaàn ñöôïc caát ñi
baûo quaûn cho laàn söû duïng sau. Moät phaàn ñöôïc nhaân gioáng taêng soá löôïng
trong phoøng thí nghieäm nhaèm phuïc vuï cho saûn xuaát. Ñònh kyø phaûi kieåm
ta hoaït tính cuûa gioáng. Vieäc nuoâi caáy, nhaân gioáng trong phoøng thí nghieäm
naøy nhaèm muïc ñích cho vieäc taïo sinh khoái teá baøo ñeå ñaûm baûo soá löôïng
teá baøo vi sinh vaät cho quaù trình saûn xuaát, chöù khoâng phaûi cho vieäc taïo
thaønh saûn phaåm. Quaù trình nhaân gioáng naøy dieãn theo nhieàu caáp sao cho
theá tích nuoâi taêng lôùn leân töø 5 – 10 laàn. Sau khi taêng sinh khoái teá baøo
ñeán soá löôïng yeâu caàu chuùng seõ ñöôïc ñöa vaøo noài leân men trong saûn
xuaát. Tuøy theo kích thöôùc noài leân men trong saûn xuaát maø ta coù theå söû
duïng moät hoaëc hai noài leân men tröôùc (thuøng caáy).
Quaù trình leân men trong saûn xuaát caàn chuù yù:
- Nguoàn nguyeân lieäu phaûi reû tieàn, saün coù.
- Moâi tröôøng dinh döôõng coù khaû naêng taïo thaønh saûn phaåm coù hieäu
suaát cao.
- Quaù trình leân men phaûi ñaûm baûo veà ñoä voâ truøng.
- Caàn theo doõi lieân tuïc quaù trình leân men ñeå coù söï thu hoaïch saûn
phaåm vaøo thôøi ñieåm toát nhaàt.
...............................................................................................................................................................
107

20. Vi sinh thöïc phaåm
........................................................................................................................................
Tuøy theo quy moâ saûn xuaát maø ta coù theå söû duïng moät hay nhieàu noài
leân men. Noài leân men ñöôïc chöùa moâi tröôøng nuoâi caáy tôùi möùc moät nöûa
hoaëc hai phaàn ba.
Moät quaù trình leân men coå ñieån ñöôïc chia thaønh caùc phaàn sau:
Hình 5 - : Quaù trình leân men coå ñieån
Ñeå ñaûm baûo ñoä tinh khieát cuûa saûn phaåm cuõng nhö hieäu suaát taïo
thaønh vaø tính kinh teá cuûa quy trình ta phaûi toái öu hoùa töøng coâng ñoaïn.
Vieäc taùch vaø coâ laäp saûn phaåm caàn phaûi ñöôïc chuù yù ngay töø coâng
ñoaïn choïn gioáng vi sinh vaät, choïn moâi tröôøng dinh döôõng. Caàn chuù
troïng tôùi caùc yeáu toá kyõ thuaät cuûa töøng böôùc. Ngoaøi ra, vieäc loaïi boû
vaø söû duïng caùc pheá phaåm vaø phuï phaåm cuõng phaûi ñöôïc coi troïng.
Ñieàu naøy coù yù nghóa raát quan troïng ñeán vieäc baûo veä moâi tröôøng.
5.5.1. Nhu caàu oxy :
Trong quaù trình leân men hieáu khí oxy laø loaïi chaát khoâng theå thieáu ñöôïc.
Vi sinh vaät thöôøng söû duïng oxy hoøa tan. Ñoä hoøa tan cuûa oxy trong nöôùc
raát thaáp, khoaûng 4 – 5 ml oxy/ lít trong ñieàu kieän aùp suaát khí quyeån, ôû
30
0
C. Trong khi ñoù, ñoái vôùi quaù trình saûn xuaát, vi sinh vaät laïi ñoøi hoûi moät
löôïng oxy laø 500 – 5000 ml / lít/ giôø. Chính vì vaäy löôïng oxy trong döôõng chaát
chæ ñuû duøng moät vaøi giaäy ñeán moät vaøi phuùt neáu khoâng ñöôïc cung
caáp thöôøng xuyeân.
...............................................................................................................................................................
108

21. Chöông 6: Nhöõng vaán ñeà kyõ thuaät vaø phöông phaùp taïo gioáng vi sinh vaät.
........................................................................................................................................
Ñeå duy trì vieäc cung caáp oxy cho teá baøo vi sinh vaät trong nuoâi caáy chìm,
ngöôøi ta thöôøng döïa vaøo nguyeân lyù cuûa quaù trình chuyeån dòch chaát.
Quaù trình naøy xaûy ra nhôø doøng chaûy vaø söï khuyeách taùn, sao cho oxy
chuyeån dòch töø boùng khoâng khí vaøo moâi tröôøng dinh döôõng vaø töø ñoù
vaøo teá baøo.
Trong thieát bò leân men thöôøng ñöôïc laép ñaët caùc thieát bò suïc khí vaø
caùc heä thoàng khuaáy , nhaèm ñöa khoâng khí vaøo dung dòch sau ñoù phaù vôõ
caùc boùng khí ñeå oxy coù theå hoøa tan vaøo dòch dinh döôõng phuïc vuï cho söï
sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa teá baøo.
5.5.2. Khöû truøng :
Ñeå ñaûm baûo cho quaù trình leân men xaûy ra coù keát quaû phaûi ngaên caûn
söû phaùt trieån cuûa caùc vi sinh vaät coù haïi. Ñoái vôùi nhieàu quaù trình leân
men vôùi muïc ñích taïo saûn phaåm laø caùc hôïp chaát hình thaønh trong quaù
trình trao ñoåi chaát (vd: saûn xuaát khaùng sinh, acid amin, enzym,..) thì caàn phaûi
khöû truøng trieät ñeå caùc thieát bò leân men, moâi tröôøng dinh döôõng, khoâng
khí xung quanh. (quaù trình leân men voâ truøng). Ngöôïc laïi trong quaù trình leân men
taïo sinh khoái (ví duï: saûn xuaát protein ñôn baøo cuûa naám men, taûo, vi
khuaån), thì ngöôøi ta thöôøng tieán haønh leân men khoâng voâ truøng; trong quaù trình
naøy, söï phaùt trieån cuûa caùc vi sinh vaät laï ñaõ bò ngaên caûn bôûi vieäc taïo
ra ñieàu kieän nuoâi caáy thích hôïp sao cho nhöõng chuûng caàn nuoâi caáy phaùt
trieån maïnh meõ nhaát (ví duï: cô chaát hoaëc pH cuûa moâi tröôøng).
Trong tröôøng hôïp phaûi khöû truøng thì ngöôøi ta coù theå söû duïng moät
hoaëc keát hôïp caùc phöông phaùp döôùi ñaây:
- Khöû truøng baèng hôi nöôùc: khöû truøng thieát bò baèng hôi nöôùc , sau
ñoù ñöa hôi nöôùc vaøo trong thieát bò coù chöùa moâi tröôøng dinh döôõng,
sau ñoù ñun ñeán 120
0
C trong 20 – 40 phuùt
.
Cuoái cuøng caàn laøm nguoäi
moâi tröôøng dinh döôõng ñeán nhieät ñoä nuoâi caáy tröôùc khi cho vi sinh
vaät vaøo.
...............................................................................................................................................................
109

22. Vi sinh thöïc phaåm
........................................................................................................................................
- Khöû truøng luaân chuyeån: Ñun noùng lieân tuïc trong thôøi gian ngaén ôû
140
0
C trong vaøi phuùt. Moâi tröôøng dinh döôõng ñöôïc chaûy thaønh doøng
nhôø heä thoàng khuaáy.
- Khöû truøng baèng hoùa chaát: coù theå duøng etylenoxyt hoaëc beta –
propiolacton. Ñoái vôùi nhöõng dung dòch nuoâi caáy keùm beàn nhieät. Tuy
nhieân caàn phaûi caån troïng trong khi söû duïng bôûi chuùng coù khaû
naêng gaây noå vaø di haïi ñeán söùc khoeû con ngöôøi. Ngoaøi ra coù theå
khöû truøng thieát bò baèng cloramin hoaëc caùc chaát dieät khuaån khaùc,
sau ñoù traùng nöôùc voâ truøng roài môùi cho moâi tröôøng dinh döôõng
vaøo, cuoái cuøng caàn phaûi gia nhieät ñeå khöû truøng moâi tröôøng dinh
döôõng.
- Loïc khöû truøng: söû duïng boâng ñaù hoaëc boâng thuûy tinh hoaëc caùc
loaïi sôïi polymer, maøng, … laøm nguyeân lieäu loïc . Muïc ñích laø loïc
khoâng khí ñeå cung caáy oxy cho moâi tröôøng.
5.5.3. Phöông phaùp nuoâi:
5.5.3.1. Nuoâi giaùn ñoaïn:
Nuoâi giaùn ñoaïn – batch culture. Ñaây laø phöông phaùp nuoâi deã daøng veà
maët kyõ thuaät. Thieát bò vaø moâi tröôøng dinh döôõng ñöôïc xöû lyù voâ truøng.
Vi sinh vaät phaùt trieån ñeán moät chöøng möïc naøo ñoù. Söï sinh tröôûng cuûa vi
sinh vaät gaén lieàn vôùi söï thay ñoåi cuûa ñieàu kieän nuoâi, söï giaûm chaát dinh
döôõng vaø söï taêng sinh khoái teá baøo. Thoâng thöôøng vieäc taïo thaønh saûn
phaåm mong muoán lieân quan ñeán moät traïng thaùi sinh lyù nhaát ñònh trong
pha sinh tröôûng. Traïng thaùi naøy chæ coù theå duy trì trong moät thôøi gian nhaát
ñònh.
5.5.3.1.1. Nuoâi caáy chìm:
Söû duïng noài leân men. Tröôùc heát noài leân men ñöôïc röûa saïch, roùt moâi
tröôøng môùi vaøo vaø khöû truøng ñeå ñaûm baûo cho quaù trình leân men
khoâng bò nhieãm. Caùc cô theå vi sinh vaät toàn taïi trong moâi tröôøng. Trong
...............................................................................................................................................................
110

23. Chöông 6: Nhöõng vaán ñeà kyõ thuaät vaø phöông phaùp taïo gioáng vi sinh vaät.
........................................................................................................................................
noài leân men coù thieát bò suïc khí vaø thieát bò khuaáy giuùp cho khoâng khí,
moâi tröôøng dinh döôõng vaø caùc teá baøo vi sinh vaät ñöôïc phaân phoái ñeàu.
Toaøn boä beà maët teá baøo ñöôïc bao quanh bôûi cô chaát ñeán noãi khoâng
coøn toàn taïi taäp ñoaøn teá baøo.
5.5.3.1.2. Nuoâi caáy beà maët:
Trong phöông phaùp naøy, caùc teá baøo vi sinh vaät toàn taïi ôû beà maët moâi
tröôøng, höôùng veà khoâng khí coù chöùa oxy. Caùc chaát dinh döôõng ñöôïc haáp
thuï nhôø caùc khuaån ty dinh döôõng ñoái vôùi nuoâi caáy naám moác.
Nuoâi caáy beà maët raát toán keùm, nhaát laø khi söû duïng treân quy moâ lôùn.
Vieäc nuoâi caáy ñöôïc tieán haønh treân nhöõng khay phaúng xeáp choàng leân
nhau. Sau ñoù ñöôïc uû trong caùc buoàng voâ truøng ñoùng kín. Chính vì vaäy
thieát bò, cuõng nhö maët baèng söû duïng cho phöông phaùp naøy raát toán keùm.
5.5.3.2. Nuoâi caáy lieân tuïc
5.5.3.2.1. Caùc heä thoáng hôû:
Noài leân men ñöôïc thöôøng xuyeân cung caáp dòch dinh döôõng môùi vaø
cuõng töông ñöông nhö vaäy moät phaàn moâi tröôøng ñaõ söû duïng cuõøng nhö
moät phaàn teá baøo vi sinh vaät ñöôïc ruùt ñi ñeå ñaûm baûo söï caân baèng cuûa
quaù trình trao ñoåi chaát cuûa teá baøo vi sinh vaät.
Ngöôøi ta chia laøm hai daïng heä thoáng: heä thoáng ñoàng nhaát vaø heä
thoáng khoâng ñoàng nhaát.
• Heä thoáng ñoàng nhaát:
- Heä thoáng ñoàng nhaát moät giai ñoaïn:
Söû duïng phöông thöùc khuaáy vaø thoâng khí nhaèm troän ñeàu caùc chaát
leân men. Caùc teá baøo trong noài leân men luoân sinh tröôûng theo pha log. Tuy
nhieân khoâng coù söï sinh saûn ñoàng boä. Caùc teá baøo ñang sinh tröôûng
maïnh meõ vaø caùc teá baøo giaø cuøng toàn taïi song song.
Vieäc baét ñaàu quaù trình nuoâi caáy cuõng töông töï nhö nuoâi caáy giaùn
ñoaïn theo phöông thöùc chìm. Sau khi teá baøo sinh tröôûng ñeán maät ñoä mong
muoán thì chuyeån sang phöông thöùc lieân tuïc. Toác ñoä sinh tröôûng ñöôïc ñieàu
...............................................................................................................................................................
111

24. Vi sinh thöïc phaåm
........................................................................................................................................
chænh bôûi toác ñoä doøng vaøo. Coøn maät ñoä teá baøo laïi phuï thuoäc vaøo noàng ñoä cô
chaát trong doøng vaøo. Khi chuyeån töø traïng thaùi naøy sang traïng thaùi khaùc thì
traïng thaùi caân baèng môùi seõ ñaït ñöôïc sau moät thôøi gian. Neáu taêng toác
ñoä doøng vaøo ñeán moät giaù trò nhaát ñònh thì toác ñoä sinh tröôûng coù theå
ñaït tôùi gaàn toác ñoä cöïc ñaïi. Tuy nhieân, neáu vöôït quaù giaù trò naøy thì seõ
ñeán vieäc röûa troâi teá baøo. Giaù trò tieâu chuaån cuûa toác ñoä doøng vaøo phuï
thuoäc vaøo theå tích noài leân men.
Neáu chia toác ñoä doøng vaøo cho theå tích hoaït ñoäng cuûa noài leân men ta
ñöôïc toác ñoä pha loaõng. Toác ñoä pha loaõng vaø toác ñoä sinh tröôûng laø baèng
nhau trong phaïm vi cuûa toác ñoä pha loaõng tieâu chuaån. Giaù trò maø toác ñoä
pha loaõng ñem laïi hieäu suaát cao nhaát naèm ngay tröôùc thôøi ñieåm röûa troâi
teá baøo.
Caùc heä thoáng ñoàng nhaát moät giai ñoaïn ñöôïc öùng duïng nhieàu trong
vieäc saûn xuaát sinh khoái teá baøo.
- Heä thoáng ñoàng nhaát nhieàu giai ñoaïn:
Heä thoáng lieân tuïc ñöôïc ñieàu khieån caùc yeáu toá hoùa hoïc thì ñöôïc goïi
laø chemostat. Neáu caùc chemostat ñöôïc ñaët noái tieáp nhau ta seõ coù heä
thoáng ñoàng nhaát nhieàu giai ñoaïn. Heä thoáng naøy ñöôïc söû duïng khi quaù trình
trao ñoåi chaát dieãn ra ôû caùc toác ñoä sinh tröôûng khaùc nhau
Ví duï: ñaàu tieân taïo sinh khoái teá baøo, sau taïo saûn phaåm. Trong tröôøng
hôïp naøy ôû noài leân men ñaàu tieân toác ñoä sinh tröôûng ñöôïc duy trì ôû toác
ñoä toái öu nhaát. ÔÛ noài leân men thöù hai, vôùi muïc ñích taïo saûn phaåm thì
ñieàu kieän nuoâi khaùc, toác ñoä sinh tröôûng chaäm hôn. Quaù trình leân men taïi
ñaây ñaõ xaûy ra qua nhieàu giai ñoaïn.
• Heä thoáng khoâng ñoàng nhaát:
Trong heä thoáng naøy khoâng coù söû duïng heä thoáng khuaáy troän ñeàu
baèng caùnh khuaáy. Chính vì vaäy, ñeå ñaûm baûo söï troän ñeàu ngöôøi ta coù
...............................................................................................................................................................
112

25. Chöông 6: Nhöõng vaán ñeà kyõ thuaät vaø phöông phaùp taïo gioáng vi sinh vaät.
........................................................................................................................................
theå söû duïng caùc heä thoáng hình oáng hoaëc heä thoáng ñoái löu. Sau ñaây laø
ñaëc ñieåm cuûa töøng heä thoáng.
- Caùc heä thoáng hình oáng:
Taïi ñaây söû duïng noài leân men hình oáng, noài phaûn öùng hình oáng. Trong
thôøi gian chaûy trong heä thoáng caùc cô theå traûi qua nhöõng traïng thaùt sinh
lyù cuûa söï leân men khoâng lieân tuïc. Nhôø vaäy maø coù theå ñaït tôùi pha caân
baèng (pha oån ñònh) maø khoâng bò röûa troâi sôùm nhö ôû heä thoáng khuaáy
troän (heä thoáng ñoàng nhaát).
Heä thoáng khoâng ñoàng nhaát khoâng cho pheùp thoâng khí maïnh, vì vaäy
noù chæ phuø hôïp vôùi quaù trình leân men yeám khí.
Heä thoáng naøy coù nhöôïc ñieåm laø teá baøo bò laéng ñoïng, chính vì vaäy
hieän nay chöa ñöôïc aùp duïng trong saûn xuaát
- Heä thoáng ñoái löu:
Ñöôïc söû duïng cho söï chuyeån hoùa döôùi taùc duïng cuûa vi sinh vaät ñoái
vôùi caùc cô chaát khoâng hoøa tan trong nöôùc (caùc hydrocarbon loûng vaø khí,
caùc steroid).
Taïi heä thoáng naøy, caùc teá baøo trong dòch dinh döôõng coù chöùa nöôùc
ñöôïc ñöa vaøo töø phía treân, coøn cô chaát khoâng ta trong nöôùc thì ñöôïc ñöa
vaøo töø phía döôùi. Hai doøng chaûy naøy ñi ngang qua nhau vaø phaûn öùng vôùi
nhau. Caùc teá baøo vi sinh vaät phaûi ñöôïc nuoâi tröôùc trong moät chemostat,
hoaëc ñöôïc taùch ra sau phaûn öùng vaø ñöôïc ñöa trôû laïi.
5.3.2.1. Caùc heä thoáng kín:
Trong quaù trình hoaït ñoäng taïi heä thoáng kín teá baøo vi sinh vaät ñöôïc löu
giöõ laïi hoaëc ñöôïc ñöa trôû laïi, trong khi ñoù moâi tröôøng chaûy ñi khoâng
ngöøng. Vì caùc teá baøo chæ hoaït ñoäng trong moät thôøi gian nhaát ñònh neân
sau moät thôøi gian naøo ñoù caàn phaûi thay theá hoaëc boå sung chuùng. Noùi
moät caùch khaùc laø ta keùo daøi pha caân baèng cuûa söï nuoâi khoâng lieân tuïc
nhôø vaøo vieäc ñöa cô chaát vaøo moät caùch lieân tuïc.
...............................................................................................................................................................
113

26. Vi sinh thöïc phaåm
........................................................................................................................................
Heä thoáng kín maø trong ñoù teá baøo vi sinh vaät ñöôïc ñöa trôû laïi ñöôïc öùng
duïng trong saûn xuaát daám theo phöông phaùp nhanh. Coøn heä thoáng kín maø
trong ñoù teá baøo vi sinh vaät ñöôïc giöõ laïi sau ñoù ñöôïc taùch ra vaø ñöa trôû
laïi trong saûn xuaát ñöôïc öùng duïng trong saûn xuaát bia, röôïu etylic cuõng nhö
trong vieäc laøm saïch nöôùc thaûi.
5.5.4. Noài leân men:
Noài leân men ñöôïc öùng duïng trong phöông thöùc nuoâi chìm. Theå tích cuûa
noài leân men dao ñoäng töø döôùi 1 lít (trong phoøng thí nghieäm) ñeán 500 000 lít
(trong saûn xuaát coâng nghieäp). Chuùng ñöôïc thieát keá sao ñeå ñaûm baûo
yeâu caàu toái öu cho töøng quaù trình leân men
Veà chi tieát, coù söï khaùc nhau raát nhieàu giöõa caùc kieåu noài leân men. Tuy
nhieân vaãn coù moät soá tính chaát chung:
- Noài leân men thöôøng ñöôïc taïo töø theùp khoâng ræ, ñeå traùnh söï aên
moøn vaø traùnh söï aûnh höôûng cuûa kim loaïi ñeán quaù trình leân men.
- Vôùi quaù trình leân men voâ truøng thì noài leân men keå caû caùc van phaûi
chòu ñöôïc aùp suaát, ñeå coù theå thöïc hieän khöû truøng ôû aùp suaát cao.
- Ñoái vôùi quaù trình leân men hieáu khí phaûi ñaït ñöôïc söï thoâng khí nhôø
vaøo heä thoáng thoâng khí (coù theå duøng song song vôùi heä thoáng
khuaáy).
- Trong quaù trình leân men yeám khí cuõng phaûi ñaûm baûo söï khuaáy troän,
ñeå ngaên caûn söï laéng cuûa teá baøo.
- Nhieät ñoä leân men ñöôïc duy trì nhôø heä thoáng laøm noùng vaø laøm
nguoäi baèng nöôùc chaûy quanh noài, hoaëc ñöa vaøo trong noài ôû daïng
caùc oáng ruoät gaø.
- Keøm theo ñoù laø caùc heä thoàng kieåm tra nhieät ñoä, aùp suaát, pH,…
...............................................................................................................................................................
114

27. Chöông 6: Nhöõng vaán ñeà kyõ thuaät vaø phöông phaùp taïo gioáng vi sinh vaät.
........................................................................................................................................
Hình 5 - : Sô ñoà cuûa moät noài leân men
...............................................................................................................................................................
115