Sergei Sidorenko: Bacterial identification and typing methods

1. Методы типирования
бактерий
Сергей Сидоренко
Детский научно-клинический центр инфекционных болезней
Кафедра медицинской микробиологии СЗГМУ им. И.И. Мечникова,
Главный внештатный специалист Комитета здравоохранения по клинической
микробиологии и антимикробной резистентности
Санкт-Петербург

2. Pediatric Research and Clinical Centre for Infectious
Diseases

5. Терминология
Изолят
• Любая чистая культура бактерий, выделенной из клинического материала или
окружающей среды.
Штамм
• Фенотипически и генетически охарактеризованные производные изолированной
колонии с плотной питательной среды (набор необходимых характеристик не
определен). Изолят или группа изолятов, отличимые от других изолятов того же
рода или вида по фенотипическим или генотипическим характеристикам. Культуры
определенного микроорганизма, выделенные в одно и то же время из различных
локусов организма пациента и не различимые при типировании
Клон
• Совокупность изолятов, выделенных из различных источников и в различное время,
но сходных по фенотипическим и генетическим характеристикам, что позволяет
предполагать общность их происхождения.
Популяция
• Группа бактерий одного и того же вида населяющую определенную экологическую
нишу

6. Типирование микроорганизмов
Цель: Изучение распространения и динамики популяций бактерий в
учреждениях здравоохранения и окружающей среде на уровнях от отдельного
хозяина до глобальной экосистемы
• Выявление родственных (групп, линий, клонов) в пределах
бактериальных популяций
• Выявление путей и закономерностей распространения возбудителя в
окружающей среде и популяции человека
• Выявление клонов микроорганизмов с повышенной вирулентностью,
резистентностью и другими практически важными свойствами
• Обоснование мероприятий по профилактике распространения
инфекционных болезней

7. Характеристика бактериальных популяций
Клональная
• Преобладание одного или множества
клонов бактерий, которые могут быть
либо родственными, либо не
связанными друг с другом.
• В клональных популяциях для
большинства клонов удается выявить
эволюционные связи.
Панмиктическая
• Невозможно выявить общности между
отдельными клонами или изолятами.
• Является результатом интенсивного
горизонтального (латерального)
генетического обмена

8. Структура бактериальных популяций
• Возможные популяционные структуры (Maynard Smith, 1993)
• клональная (S. enterica)
• панмиктическая (N. gonorrhoeae)
• эпидемическая, скрытое видообразование (N. meningitidis)
• Наблюдаемые популяционные структуры
• молодая
• M. tuberculosis (15,000 лет), Y. pestis (2000 лет)
• изменчивая
• панмиктическая + клоны (Neisseria)
• панмиктическая + биогеографическая (H. pylori)

9. Разрешающая способность методов типирования
Критерий Симпсона
• S – число групп, на которое данный метод разделяет всю выборку штаммов,
• nj – число штаммов в j-й группе
• N – общее число штаммов в исследованной выборке.
• При значении D=1 метод позволяет оценить как различные любые два
штамма

10. Требования к уровню разрешающей способности
Необходимый уровень разрешающей способности определяется задачами
• Наблюдение за распространением инфекций на региональном,
национальном или глобальном уровнях.
• Расследование вспышек инфекционных болезней.
• Изучение патогенеза инфекционных болезней, выявление групп (клонов)
бактерий, обладающих повышенной вирулентностью
• Изучение динамики инфекционного процесса у отдельных пациентов
(исключение или подтверждение предположений о рецидиве процесса или
реинфицировании).

11. Требования к методам типирования
• Требуемый уровень разрешающей способности
• Воспроизводимость и стандартность
• Легкость выполнения
• Низкая стоимость
• Возможность обмена информацией (электронные базы данных)

12. Фенотипические методы типирования
• Биотипирование – сравнение биохимических свойств
• Фаготипирование
• Серологическое типирование
• Антибиотикограммы
• Мультилокусный энзим электрофорез - Multilocus enzyme electrophoresis
(MLE E)

13. Молекулярные методы не связанные с
секвенированием
• Гибридизационные методы
• Плазмидное типирование
• Риботипирование
• ПЦР со случайными праймерами (RAPD-PCR) и другие методы на основе ПЦР
• Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов
• Мультилокусный анализ числа тандемных повторов (MLVA)
• Электрофорез макрорестриктов хромосомной ДНК в пульсирующем поле –
PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis)
• Капсульное ПЦР-типирование – S. pneumoniae, N. meningitidis, K. pneumoniae
и др.

14. PFGE
+
--
-
+
+
Преимущества
• Высокая разрешающая способность
Недостатки
• Трудоемкость
• Высококвалифицированный персонал
• Субъективизм в оценке
• Трудность межлабораторных сопоставлений
Сравнение ванкомицин
-резистентных
энтерококков
Идентичные изоляты

15. Методы типирования, основанные на
секвенировании отдельных локусов
• emm-типирование S. pyogenes, анализ гена М белка
• spa – типирование S. aureus, анализ гена белка A
• por-типирование, белки внешней мембраны N. meningitidis
• opa-типирование (анализ гена, кодирующего мембранный белок)

16. Методы типирования, основанные на
секвенировании многих локусов
• Типирование мультилокусным секвенированием (Multi Locus Sequence
Typing - MLST)
• Определение нуклеотидных последовательностей внутренних
фрагментов 7-ми генов «домашнего хозяйства» не подвергающихся
селективному прессингу иммунной системы
• Изоляты считаются идентичными при полном совпадении нуклеотидных
последовательностей
• Уникальное сочетание аллелей рассматривается как Sequence Type (ST)
• Полное межлабораторное совпадение
• Возможность создания электронных баз данных

17. Мультилокусное сиквенс-типирование
(Multilocus Sequence Typing – MLST)
Секвенирование внутренних фрагментов генов «домашнего хозяйства»:
• arcC (Carbamate kinase)
• aroE (Shikimate dehydrogenase)
• glpF (Glycerol kinase)
• gmk (Guanylate kinase)
• pta (Phosphate acetyltransferase)
• tpi (Triosephosphate isomerase)
• yqi (Acetyle coenzyme A acetyltransferase
• Мутации в перечисленных генах накапливаются с относительно
постоянной скоростью, не подвергаясь селективному прессингу, и,
таким образом, отражают скорость эволюции основного генома
бактерий

18. arcC
aroE
tpi
glpF
gmk
yqiLpta
ПЦР
..GCTTG..
..TAGGC..
..ATGCG..
..CGCTG..
..TGATC..
..TAAGG..
..ACTGA..
секвенирование
2
3
1
1
4
4
3
Аллельный профиль
ST (сиквенс-тип)
7 генов домашнего
хозяйства
http://www.mlst.net/
Мультилокусное сиквенс типирование
(multi-locus sequences typing, MLST)

19. Базы данных PubMLST (https://pubmlst.org/)
Achromobacter
Acinetobacter baumannii
Aeromonas spp.
Anaplasma phagocytophilum
Arcobacter spp.
Bacillus cereus
Bacillus licheniformis
Bacillus subtilis
Bordetella spp.
Borrelia spp.
Bartonella bacilliformis
Bartonella henselae
Bartonella washoensis
Brachyspira spp.
Brucella spp.
Burkholderia cepacia Burkholderia
pseudomallei
Campylobacter spp.
Carnobacterium maltaromaticum
Chlamydiales spp.
Citrobacter freundii
Clostridioides difficile
Clostridium botulinum
Clostridium septicum
Corynebacterium diphtheriae
Cronobacter spp.
Cutibacterium acnes
Dichelobacter nodosus
Enterobacter cloacae
Edwardsiella spp.
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Escherichia spp.
Flavobacterium
psychrophilum
Gallibacterium anatis
Haemophilus influenzae
Haemophilus parasuis
Helicobacter cinaedi
Helicobacter pylori
Helicobacter suis
Klebsiella aerogenes
Klebsiella oxytoca
Lactobacillus salivarius
Leptospira spp.
Macrococcus canis
Macrococcus caseolyticus
Mannheimia haemolytica
Melissococcus plutonius
Mycobacteria spp.
Mycobacterium abscessus
Mycoplasma agalactiae
Mycoplasma flocculare
Mycoplasma hominis
Mycoplasma hyopneumoniae
Mycoplasma hyorhinis
Mycoplasma iowae
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma synoviae
Neisseria spp.
Oral Streptococcus spp.
Orientia tsutsugamushi
Ornithobacterium
rhinotracheale
Paenibacillus larvae
Pasteurella multocida
Pediococcus pentosaceus
Photobacterium damselae
Piscirickettsia salmonis
Porphyromonas gingivalis
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas putida
Rhodococcus equi
Riemerella anatipestifer
Sinorhizobium spp.
Salmonella spp.
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus haemolyticus
Staphylococcus hominis
Staphylococcus
pseudintermedius
Stenotrophomonas maltophilia
Streptococcus agalactiae
Streptococcus bovis/equinus
complex
Streptococcus canis
Streptococcus dysgalactiae
Streptococcus gallolyticus
Streptococcus pyogenes
Streptococcus suis
Streptococcus thermophilus
Streptococcus uberis
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus zooepidemicus
Streptomyces spp.
Taylorella spp.
Tenacibaculum spp.
Treponema pallidum subsp.
pallidum
Ureaplasma spp.
Vibrio spp.
Vibrio cholerae
Vibrio
parahaemolyticus
Vibrio tapetis
Vibrio vulnificus
Wolbachia spp.
Xylella fastidiosa
Yersinia pseudotuberculosis
Yersinia spp.
Yersinia ruckeri

20. 15.12.2019 - PubMLST
Изолятов: 709,991
Геномов: 487,878
Аллелей: 20,429,301

21. Эволюция принципов MLST
Bacterial Isolate Genome Sequence Database (BIGSdb)
• Программная платформа, позволяющая анализировать данные
сиквенса большого числа изолятов, по многим локусам
• Интегрирована в PubMLST

22. Разрешающая способность методов
типирования, основанных на анализе
различного количества генов
Jolley et al. JCM. 2012
Анализ 10 изолятов N.
meningitidis полученных при
вспышке в Саутгемптоне в 1997
• A - 7-локусный MLST
• B - 20-локусный MLST
• C - rMLST
• D - WGS

23. Полногеномное секвенирование
Преимущества
• Максимальная разрешающая
способность
Недостатки
• Высокая стоимость
оборудования и расходных
материалов
• Технологическая сложность
• Биоинформационная
сложность

24. Общие принципы строения бактериального генома
• Структурная организация:
oКольцевая молекула ДНК (= хромосома)
oВнехромосомные (мобильные) элементы: плазмиды, транспозоны,
элементы бактериофагов
• Организация по принципу наличия/отсутствия генов:
oЯдерный – геном (Core): совокупность всех консервативных генов,
составляет 40 – 90% от всех генов генома. Видоспецифические
гены, гены генерального метаболизма (house keeping genes)
oДополнительный геном (Accessory): не обязательная часть генома.
Гены приобретенной резистентности, вирулентности, мобильные
генетические элементы
oPan – геном: совокупность всех генов, встречающихся в популяции
конкретного вида

25. Развитие технологий секвенирования
Секвенатор MinION
Oxford Nanopore
Секвенатор PacBio RS II
Pacific Bioscince
Секвенирование по Сэнгеру
• «Прочтение» фрагментов ДНК
длиной до 800 – 900 по
• Необходима предварительная
информация о частичной
последовательности
Секвенатор AbiPrism 3730
Thermofisher
Секвенатор MySeq
Illumina
«Parallel sequencing»
• «Прочтение» множества
коротких фрагментов ДНК
длиной до 300 по
• Необходимо правильно
«собрать»
Next-generation sequencing
• Секвенирование
отдельных молекул
ДНК – до 40 000 по в
реальном времени
• Секвенирование
отдельных молекул
ДНК – до 500 000 по
в реальном времени
• Относительно
высокая частота
ошибок

26. Поколения секвенирования
хромосома E. coli
I. секвенирование по Сэнгеру
0,0012% от всего генома
II. Прочтение 99% генома
III. Прочтение
полноразмерного
генома
Фрагмент прочтения

27. Workflow: shotgun genome sequencing
лизис и выделение гДНК
подготовка ДНК библиотек проведение сиквенсавалидация ДНК библиотек
получение ридов (raw data)

28. Анализ геномов бактерий
Риды (fastq)
Анализ, фильтр и тримминг
первичных данных
(FastQC, Trimmomatic)
Сборка De novo (ParSeq Lab, Spb)
Pipeline: SpaDes+SSPACE+Picard+Bowtie+QC report
Выравнивание на референс
(Bowtie+Samtools+SNPeff)
Аннотация
- SNP calling
- INDEL calling
Draft
genome
(контиги)
Аннотация
Анализ
Сравнение

29. Как собирается геном бактерий ?
Риды
Контиг
Высокое покрытие Низкое покрытие

30. индивидуальный рид
Контиг

31. Полногеномное секвенирование
(whole genome sequencing, WGS)
• «Прочтение» всего генома микроорганизма
• Неполное секвенирование (Draft genome sequencing) или shotgun
genome sequencing
• Полное секвенирование (Complete genome sequencing)
• Метагеномный подход - «прочтение» всех молекул ДНК или РНК в
образце
• «Прочтение» единичных индивидуальных фрагментов ДНК в
составе какого –либо биологического образца

32. Полный (complete) и не полный геномы (draft)
• Полный
• Полностью собранный геном, замкнутый в
кольцо
• Повторы разрешены
• Структурная геномика
• Сравнительная геномика
• ~5% геномов в NCBI GenBank
• Не полный
• Фрагменты хромосомы
• Повторы не разрешены
• Нельзя изучать крупные структурные элементы
генома
• Анализ всех индивидуальных генов
• ~95% геномов в NCBI GenBank
Хромосома
Плазмида
Хромосома
Плазмида

33. WGS для предсказания
чувствительности к антибиотикам:
рекомендации ESCMID/EUCAST
Рекомендованные критерии контроля качества данных при проведении WGS
Критерий Описание
• Количество ридов Чем выше тем лучше (Illumina Miseq - =<500.000 PE)
• Средняя длина ридов Чем выше тем лучше (Illumina Miseq – 180 - 260)
• Покрытие генома Оптимально >= х30
• Размер собранного генома Должен соответствовать референсу (±2%) = контроль контаминации
• Количество контигов Оптимально < 100 для 5-6 Mb
• N50 Оптимально >= 30 Kb

34. Базы данных для поиска генов резистентности, вирулентности
• Center for Genomic Epidemiology (www.genomicepidemiology.org)
• RES finder ( > 2200 генов)
• MLST
• Plasmid finder
• Phylogeny
• The Comprehensive Antibiotic Resistance Database, CARD (card.mcmaster.ca)
• > 2300 генов
• > 1000 SNP
• аминокислотное выравнивание
• The Pathosystems Resource Integration Center, PATRIC (www.patricbrc.org)
• Аннотация геномов
• Поиск генов Res и Vir
• Приложения для сравнения геномов и геномного контента
• The virulence factor database, VFDB (http://www.mgc.ac.cn/VFs)
• 74 бактериальных патогена
• > 1700 генов вирулентности
• PHAge Search Tool Enhanced Release, PHASTER (http://phaster.ca/)
• Поиск профагов
• > 187.000 вирусных последовательностей
• > 9 млн бактериальных последовательностей

35. Структура популяции
Klebsiella pneumoniae
Holt, KE, et al. PNAS, 2015

36. K. pneumoniae продуцирующие карбапенемазы NDM-типа, связь штаммов,
циркулирующих в Санкт-Петербурге с глобальными генетическими линиями
1
1, 2, 4, 5, 6,
9, 10
7, 8, 11
12, 1, 3
4, 13
14, 13, 8

37. Место, выделенных в Санкт-Петербурге, NDM-пол. K. pneumoniae в
глобальной популяции
Kp-I
Kp-IIA
Kp-IIB
Kp-III
ST101
ST147
ST295
ST11
ST340
≈ 1300 геномов

38. ST101
Великобритания
Норвегия
Испания
Пакистан
IncHI1B
IncFIB(Mar)
IncFIB(K)
IncFII(K)
IncFIB(pQil)
blaCTX-M-15
blaOXA-9
blaSHV-1
aac(6')Ib-cr
oqxA
oqxB

39. ST147
Великобритания
IncFIA(HI1); IncHI1B; IncFII(K); IncFIB(pQil)
США, Италия, Нидерланды
IncHI1B; IncFIB(Mar); IncR; IncFIB(pKPHS1)
blaCTX-M-15 blaSHV-11 blaOXA-9 blaTEM-1B aac(6')Ib-cr oqxA oqxB
blaCTX-M-15 blaSHV-11 blaOXA-1 blaOXA-9 blaTEM-1A aac(6')Ib-cr oqxA oqxB
blaCTX-M-15 blaSHV-11 blaOXA-9 blaTEM-1A aac(6')Ib-cr oqxA oqxB
blaCTX-M-15 blaSHV-11 blaOXA-1 blaOXA-9 blaTEM-1B aac(6')Ib-cr oqxA oqxB
blaCTX-M-15; blaSHV-11; blaOXA-9; blaTEM-1A; aac(6')Ib-cr;
oqxA; oqxB; QnrS1

40. IncHI1B IncFIB(Mar) IncR ColRNAI
IncHI1B IncFIB(Mar) IncR
IncHI1B IncR IncFII(K) IncFIB(pQil) ColRNAI
IncFIA(HI1) IncHI1B IncFIB(Mar) IncR IncL/M(pOXA-48)
blaSHV-11 blaOXA-1 blaTEM-1B aac(6')Ib-cr oqxA oqxB QnrS1
blaCTX-M-15 blaSHV-11 blaOXA-1 blaTEM-1B aac(6')Ib-cr oqxA oqxB QnrS1
blaCTX-M-15 blaSHV-11 blaOXA-1 blaOXA-9 blaTEM-1B aac(6')Ib-cr oqxA oqxB
blaSHV-11 blaOXA-1 blaOXA-48 aac(6')Ib-cr oqxA oqxB
IncFIA(HI1) IncFIB(K) IncFII(K) ColRNAI IncA/C2
IncFIA(HI1) IncFIB(K) IncFII(K) IncA/C2
IncHI1B IncFIB(Mar) IncFIB(K) IncFII(K)
IncFIA(HI1) IncHI1B IncFIB(Mar) IncFIB(K) IncR IncFII(K)
blaSHV-11 blaOXA-1 aac(6')Ib-cr oqxA oqxB QnrB1
blaSHV-11 blaOXA-1 blaOXA-9 aac(6')Ib-cr oqxA oqxB
blaCTX-M-15 blaSHV-11 blaOXA-1 aac(6')Ib-cr oqxA oqxB QnrB1
blaCTX-M-15; blaSHV-11; blaOXA-1; blaDHA-1; aac(6')Ib-cr; oqxA; oqxB; QnrB58
Великобритания, Норвегия, Бразилия
ST395
ST11
ST340
Норвегия, США
Норвегия, США, Колумбия

41. Распространение генетических линий по
стационарам
2 3 4
5 7 10
9 11 12
13
8 6
14 ST101
ST147
ST395
ST340
ST11

42. Вспышка инфекций, вызванных КРС продуцирующими K.
pneumoniae
Snitkin ES. et al. 2012, Sci Transl Med
Контакты между пациентами Вероятные пути передачи

43. Ген
карбапенемазы
КРС-2
Китай
Китай
Санкт-Петербург
Санкт-Петербург
Китай
Китай