Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.
Биотехнология
1)1917 Термин предложен венгерским инженером Карлом Эреки в работе, посвященной
выращиванию свиней с использ...
искомой ДНК – расплетается на 2 нити при 94º, 2. комплементарное присоединение к особым участкам каждой
цепи коротких фраг...
Дополнительные методы работы с культурами:
-гаплоиды из пыльцевых зерен, яйцеклеток, затем перевод в диплоидное состояние
...
Реконструкция клеток животных в 1952 Р. Бриггс и Т. Кинг (США) имплантировали,
пересадили ядра соматических клеток (бласто...
Из стволовых клеток впервые выращены полноценные зубы
By iron 11 августа 2009




5
– Версия для печати
– Комментарии (0)


11 августа 2009
Мыши, потерявшие зубы из-за травмы, болезни или неправильного лече...
Моноциты захватывают попавшие в кровь антигены и передают их В-лимфоцитам (презентация).
В-лимфоциты обретают рецепторы на...
Репродуктивное клонирование млекопитающих
Долли родилась в феврале 1997 г в Рослинском институте Эдинбурга. Работы велись ...
Корейская компания уменьшила стоимость клонирования в три раза

Представители корейской биотехнологической компании RNL Bi...
заинтересована в самовосстановлении организма после того, как ему исполняется 45 лет.
По словам Уотсона, именно изменения ...
Вирусы в клетке-хозяине: 1)ДНК (РНК) вируса в цитоплазме или встраивается в геном клетки. При
необходимости происходит обр...
ЦКП „Секвенирование ДНК“ СО РАН. Центр коллективного пользования дорогостоящим оборудованием для секвенирования ДНК был со...
6.   Отбор трансформированных бактерий.



А) Посев клеток на расстоянии др от др на среду с антибиотиком – отбор на налич...
Ученым удалось создать приматов, которые не только светятся зеленым цветом, но и передают эту
особеннность потомкам.

В СШ...
Вильнюс или в Эстонию. Но пока между членами Обществ генетиков и селекционеров
     (а такое общество было в каждой стране...
Латвия – маленькая страна, и сорта, которые приспособлены для выращивания у нас,
     никто специально создавать не будет....
какую-нибудь человеческую клетку, скажем, Шварценеггера и проклонировали бы ее,
     то Шварценеггер все равно бы не получ...
процесс по стадиям.

Ген свечения.

Будем вести эксперимент, как настоящие ученые. Они слышат что открыт новый ген, что же...
Этот этап называется выделением ДНК. Ее можно выделить не только в виде раствора, а переосадить и
получить сухой препарат,...
должно быть много копий гена bl1 и включаем электрический ток. В другую лунку наносим “маркер
веса” – специальный препарат...
биотехнология
биотехнология
биотехнология
биотехнология
биотехнология
биотехнология
биотехнология
биотехнология
биотехнология
биотехнология
биотехнология
биотехнология
биотехнология
биотехнология
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

биотехнология

10,988 views

Published on

  • Be the first to comment

биотехнология

  1. 1. Биотехнология 1)1917 Термин предложен венгерским инженером Карлом Эреки в работе, посвященной выращиванию свиней с использованием сахарной свеклы «это все виды работ, при которых их сырьевых материалов (сахарная свекла) с помощью живых организмов производятся те или иные продукты (свинина)» 2)в современных энциклопедических словарях словарях Б –(от био…, греч. techne – искусство, мастерство, и логия…) совокупность промышленных методов, использующих живые организмы и биологические процессы для производства ценных для народного хозяйства продуктов; - (или) использование живых организмов и биологических процессов в производстве. Указывают новейшие методы:клеточную и генную инженерию. Ученые дают несколько трактовок: 3) в формальном (традиционном) понимании - любое производство, связанное с использованием организмов, раздел селекции или генетики по созданию высокопродуктивных сортов растений, пород животных, штаммов микроорганизмов, применение научных и инженерных принципов к переработке материалов живыми организмами с целью создания товаров и услуг. 4) в широком (современном) понимании –Б- микробиологический синтез, производство продуктов (кормовых белков, витаминов..), образуемых микроорганизмами в результате их жизнедеятельности (получение пенициллина в 1940). Новые штаммы получали с помощью радиационного и др. (случайного) мутагенеза, и последующего отбора. Радиационная селекция зародилась в 20-30-е гг. 5) в узком (новейшем) понимании – (часто с приставкой молекулярная) биотехнология -прикладная наука, использующая методы клеточной и генной инженерии, опирающаяся на достижения смежных биологических, химических и технических дисциплин. (схема 1) Вермикультивирование (лат vermes – червь) процесс переработки органических остатков почвы в гумус, повышающий е плодородие с использованием дождевых червей (1500 видов, в основном, из сем. Luvbricidae. Дарвин на 1 м2 300 особей. С конца 40х начали выращивают на бытовых отходах в США на корм (50-70% белков). Гумус – комплекс органических веществ. Основные объекты Б. бактерии кишечной палочки Escerichia coli, другие мезофильные (коринебактерии используют для получения аминокислот), термофильные (45-90º, дают термостабильную ДНК-полимеразу активную до 95º - встраивают в E. Coli для Полимеразной цепной реакции ПЦР обнаружить и размножить следовое кол-во ДНК. Этапы:1. температурная денатурация 1
  2. 2. искомой ДНК – расплетается на 2 нити при 94º, 2. комплементарное присоединение к особым участкам каждой цепи коротких фрагментов ДНК из 20-30 нтд, т.н. праймеров (затравок), инициирующих дальнейшие реакции, при 50-65º, 3 – копирование матричных цепей ДНК с участием термостабильной ДНК-полимеразы из нуклеотидов в присутствии АТФ при 70-72º ПЦР открыта в 1984 – выявление следов вирусных и бактериальных ДНК, в диагностике онкологических заболеваний, судебной медицине.), психрофильные (для разрушения токсичных веществ в почве при низких температурах 5--30) бактерии, одноклеточные дрожжи Saccharomyces cerevisae, культуры эукариотических клеток. Термины: генномодифицированные клетки, питательные среды: простые, обогащенные, сложные, термостабильныя ДНК-полимераза, праймер, клеточные линии, устойчивые клеточные линии, перевивание (субкультивирование) клеток. Клеточная инженерия – совокупность манипуляций с клетками, с помощью которых получают клетки нового типа путем культивирования, гибридизации, реконструкции. Метод культуры клеток и тканей. В основе способность к регенерации, тотипотентность клеток (лат totus –весь, potencia – сила) Клоны – генетически идентичное потомство от одной клетки. Получение многих растений клонов – клональное микроразмножение = вегетативное размножение вне организма в пробирке (in vitro). Эксплант (лучше меристема, иначе сначала происходит дедифференциация)– Среда с фитогормонами: ауксинами (корни), кининами (зачатки стеблей) микроэлементами - Колонии клеток - периодическое перевивание - Каллус (бесформенная клеточная масса) растение Получение биомассы растительных культур, образующих вторичные метаболиты - вещества обеспечивающие определенным растениям привлечение опылителей, защиту от растительноядных животных. Часто это лекарственные в-ва для человека (много, экологически чисто, сохранение женьшеня и др. 1. Лаг-период, 2 период размножения (дробление) 3. Период растяжения 4 стационарная фаза (много вторичных метаболитов) 5. Стадия деградации . Современный биореактор 1500л искусственной среды с растительной суспензией. 2
  3. 3. Дополнительные методы работы с культурами: -гаплоиды из пыльцевых зерен, яйцеклеток, затем перевод в диплоидное состояние - соматическая гибридизация Слияние протопластов, лишенных клеточных стенок (гибриды картофеля). Новые сорта. Метод реконструкции клеток. Получение клеток из свободных ядер, цитоплазмы и других частей клеток, например, модифицированных хлоропластов. Метод хромосомной инженерии – замещенные линии (некоторые пары хромосом заменены на хромосомы близких видов), дополнительные линии (введена дополнительная пара хромосом, часть хромосомы) только у растений. Клонирование позвоночных животных Клоны - Только Однояйцевые близнецы, Утрачено бесполое размножение тотипотентность только на ранних этапах эмбрионального развития (у лягушки до 8 бластомеров). Свойство сохраняют стволовые клетки – родоначальные клетки обновляющихся тканей. - разделение бластомеров на ранних этапах (конец 19 в. Г.Дриш нем получил 2х клонов морского ежа) - 1970 Стен Вилладсен (Дат. по происх) у млекопитающих из искусственно разделенных изолированных бластомеров зародыши не развивались. Однояйцевые близнецы получены из половинок и четвертинок эмбрионов овец и коров на стадии бластоцисты (пример 1988 на ВДНХ выставлен химерный гибрид 4 пород коров – бычок Ералаш) 3
  4. 4. Реконструкция клеток животных в 1952 Р. Бриггс и Т. Кинг (США) имплантировали, пересадили ядра соматических клеток (бластоцитов, стволовых) в яйцеклетки. Джон Гердон получил из яйцеклетки белой лягушки с энуклеированным УФ ядром и ядер клеток кишечника темного головастика новую клетку. Клетка и ее потомство благополучно благополучно делились. Получилась взрослая темная лягушка. Термины: клон, стволовые клетки, бластоциста, бластоцит, имплантированное ядро, реконструированные зиготы, химерные организмы. Схема опыта с млекопитающими Терапевтическое клонирование 4
  5. 5. Из стволовых клеток впервые выращены полноценные зубы By iron 11 августа 2009 5
  6. 6. – Версия для печати – Комментарии (0) 11 августа 2009 Мыши, потерявшие зубы из-за травмы, болезни или неправильного лечения, теперь могут не беспокоиться. Им не надо будет тратиться на имплантаты и мосты. Юрким животным японские учёные могут теперь вырастить новые полноценные коренные зубы. А что же человек? Чтобы лучше разглядеть новый зуб, учёные "подсветили" его зелёным флуоресцентным белком (GFP). В результате в ультрафиолетовом свете он становится заметным в полости рта (фото Takashi Tsuji/Tokyo University of Science). Пятидневный зародыш зуба был помещён в десну (сверху), через 36 суток он прорезался (в середине) и полностью вырос через 49 дней (внизу) (фото Takashi Tsuji/Tokyo University of Science). Цудзи же добавляет, что, несмотря на полноценность выращенных зубов, он и его коллеги пока не могут "регулировать" ширину головки, общий размер зуба (они получаются чуть меньше настоящих), скорость роста (у человека в отличие от мышей зубы растут в дёснах годами). Технология может быть перенесена на человека только лет через 15, но учёные уже сейчас мечтают у будущем разработки. Ведь теоретически метод можно использовать и для создания зародышей других органов на пересадку (сердца, почек, печени и, может быть, даже лёгких). Антитела и антигены. Выработка антител (иммуноглобулинов) – многоступенчатый процесс, на примере В-лимфоцитов. В-лимфоциты образуются из стволовых клеток красного костного мозга и попадают в кровяное русло. Образовавшиеся клетки клетки не специализированы и могут находиться в таком состоянии долгое время. 6
  7. 7. Моноциты захватывают попавшие в кровь антигены и передают их В-лимфоцитам (презентация). В-лимфоциты обретают рецепторы на данные антигены и становятся иммунокомпетентными. Они отправляются в селезенку и лимфатические узлы и размножаются путем митоза, образуя клоны. После выхода в кровь претерпевают дальнейшие изменения , в результате чего становятся плазмоцитами (плазматическими клетками), которые непосредственно продуцируют антитела. Антитело специфично распознает определенный антиген, а точнее, только определенную детерминированную группу – эпитоп антигена из 6-8 аминокислот. Каждый антиген содержит несколько таких групп. 1-4 – детерминанты антигена, 3 – основная, наиболее токсичная, вызывающая заболевание. На каждую вырабатывается свое антитело. На весь антиген – семейство из 4 типов антител. Схема антигена 1 2 3 4 В выработке группы антител участвует много различных клонов В-лимфоцитов – получаются поликлональные антитела. Их давно используют, иммунизируя животных и получая сыворотку (против дифтерийного и столбнячного токсинов, змеиных ядов, для распознавания антител и антигенов, ростовых факторов и др.). В их составе мало антител, нейтрализующих основную детерминанту, мала эффективность. Как получить моноклональные? Проблема: В-лимфоциты не живут в клеточной культуре. В ней живут клетки опухолей – атипические клетки. Бывают опухоли на основе плазмоцитов- плазмоцитомы. Мышей иммунизировали, облучали или использовали опухолеобразующие вирусы – опухоли возникали, но клоны с нужными антителами не получались. В 1976 Георг Келлер нем. и Цезарь Мильштейн англ использовали метод получения гибридом (гибридов соматических клеток от слияния протопластов. На первых этапах деления образовавшихся двуядерных клеток хромосомы обоих ядер смешивались, а потом образовывались 2 идентичные клетки, способные к дальнейшим делениям). Получили гибридомы из взвеси клеток селезенки иммунизированных мышей и клеток особой мутантной опухоли, которые не могли расти на ГАТ-среде (содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Обработка смеси клеток симпластообразующим вирусом или полиэтиленгликолем вызвала уничтожение части границ между клетками и их беспорядочное слияние. Остались АОК – антителоообразующие клетки селезенки, Пл – клетки плазмоцитомы и разные их гибриды. Как отделить необходимые гибридомы? Выращивать на ГАТ-среде. Остаются только гибридомы (поликлональные? Да). Последний этап – скрининг – метод идентификации единичного объекта с искомыми свойствами (нужных клонов). Клетки гибридом переносили на лунки пластиковых планшет. Лунки другой планшеты покрывали слоем молекл антигена – мишени. При добавлении содержимого лунки, в которой росли клетки донного клона, определяли, связывается ли это антитело с определенной детерминантной группой антигена (тогда при промывании лунок антитела не вымывались). Клоны растят, замораживают, прививают мышам, получая огромное количество антител. Ноб прем 1984. – не запатентовали, клеточную линию предоставляли всем желающим (для ранней диагностики заболеваний, особенно онкологических, доставки к клеткам опухоли радиоактивных в-в и лекарственных препаратов). 7
  8. 8. Репродуктивное клонирование млекопитающих Долли родилась в феврале 1997 г в Рослинском институте Эдинбурга. Работы велись под руководством Яна Вилмута. Использовали яйцеклетки с удаленными ядрами одной породы и Пытались ввести в них ядра 3 типов клеток разных органов от самок разных пород, опыт удался только с клетками вымени беременной самки беломордой породы. Все клетки предварительно культивировались. Проведено 277 слияний клеток только с такими клетками. Образовалось 29 эмбрионов, 28 погибли на поздних сроках в основном из-за аномалий развития печени. Нет отца, 3 матери Была ли дедифференциация клеток? Повторение опытов с другими млекопитающими. Кошка Сиси (справа) — клон Рейнбоу. В ее генотипе есть и ген рыжего пигмента, но ее индивидуальное развитие сложилось так, что этот ген не проявился в окраске. Да и по характеру мать и дочь совсем не похожи. С этим столкнулись, например, Дуэйн Крамер и его коллеги — сотрудники Техасского сельскохозяйственно-политехнического университета, создавшие первую в мире клонированную кошку Сиси. 8
  9. 9. Корейская компания уменьшила стоимость клонирования в три раза Представители корейской биотехнологической компании RNL Bio заявили о разработке новой технологии клонирования, которая позволит в несколько раз снизить стоимость этого процесса. Утверждается также, что новая технология является на порядок более надежной, чем существующие аналоги. Подробности этого заявления приводит Reuters. Клонированные в RNL Bio щенки бигля. Фото ©AFP В процентах Мышь Кошка Овца Корова Человек Пересадка ядра Собственное ядро яйцеклетки заменяют ядром клетки клонируемого организма. Полученную клетку побуждают к делению 76 43 94 63 75 Дробление клеток Делящиеся клетки становятся бластоцистой, предшественником зародыша 49 28 23 34 4 Пересадка зародыша Развивающийся зародыш переносят в матку суррогатной матери и следят за появлением у нее признаков беременности 38 13 41 41 Клоны человека никогда не были доведены дальше стадии бластоцисты — отчасти по этическим соображениям Успешное рождение Если беременность проходит нормально, на свет появляется жизнеспособный клон 2 1 7 19 Эффективность клонирования Доля успешных попыток: от взятия яйцеклетки до рождения потомства 1 0,5 2 1 Первооткрыватель структуры ДНК верит в генетически изменённых людей Джеймс Уотсон: "По-моему, никаких богов просто нет". 25 апреля 1953 года в журнале Nature была опубликована статья учёных Фрэнсиса Крика (Francis Crick) и Джеймса Уотсона (James Watson), в которой разъяснялось, каким образом генетическая информация передаётся от одного поколения к другому. Это произвело революцию в биологии и медицине. Спустя полвека, на юбилейном собрании в Лондоне, Уотсон заявил, что благодаря генетики природу человека удастся понять значительно глубже. По мнению Уотсона, понимание, какое воздействие генетические изменения оказывают на человеческое поведение, приведёт к слиянию биологии и психологии. По мнению Уотсона, в течение ближайших полстолетия люди начнут усовершенствовать себя и своих ещё не родившихся детей в генетическом плане. Другие учёные, в частности эксперт по восстановлению ДНК из национального института медицинских исследований в Париже, Миро Радман (Miro Radman), считает, что человечество избавится от раковых заболеваний благодаря модификации генетической информации в яйцеклетках и сперматозоидах. По мнению Радмана, человечество вообще пребывает в конфликте с собственным геномом: эволюция не 9
  10. 10. заинтересована в самовосстановлении организма после того, как ему исполняется 45 лет. По словам Уотсона, именно изменения в ДНК являются причиной различий между отдельными людьми. Сюда же относятся предрасположенности к болезням, насилию и даже чувство юмора. Гены контролируют количество нейротрансмиттеров и рецепторов в мозге каждого из нас, соответственно, различия на генетическом уровне приводят к различному поведению у каждого человека, и разным реакциям на события в его жизни. Детальное изучение этого механизма поможет понять, чего человеку ждать от себя. Уотсон считает также, что ничего аморального в использовании генетики на людях нет. "Я бы использовал её где угодно, если это поможет улучшить жизнь людей. Я думаю, нам следует попытаться улучшить человеческий разум. Не думаю, что генетика — это оскорбление богов. По-моему, никаких богов просто нет". Генная (генетическая) инженерия – метод биотехнологии, раздел молекулярной генетики: целенаправленное создание новы комбинаций генетического материала путем манипулирования нуклеиновыми кислотами, искусственного переноса генов одного вида организмов в другой с целью создания организмов с новыми свойствами. 1970-е П.Берг в Стерфордском университете США первая рекомбинантная молекула ДНК вируса и бактерии. Перед этим открыты ферменты: рестриктазы, рассекающие молекулы ДНК по строго определенным местам, лигазы – сшивающие фрагменты ДНК в единое целое. 1980 человеческий инсулин получен от бактерии. Природные механизмы передачи наследственной информации между клетками. Трансформация Фактор Ф. Гриффитса (опыт 1928) пневмококк вирулентного гладкого штамма S (убитые бактерии) + невирулентный живой штамм шероховатый R, - в смеси вызывают болезнь. В мышах обнаружен S. Бактерии трансформировались. Что-то передало наследственную информацию. Позже выяснено, что это были плазмиды. Плазмиды – внехромосомный наследственный материал в виде кольцевой ДНК, способный к длительному самостоятельному существованию. Имеются в клетках прокариот и эукариот, размножаются независимо от ядерного материала (имеют сайт репликации). В клетках бактерий от одной до нескольких сотен длиной от 2-3 до нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов (в хромосомной ДНК бактерий 5*109 ). Бывают несовместимые друг с другом, выполняют разные функции: 1)содержат ген устойчивости к антибиотикам 2)гены токсичности 3)несут информацию о переносе в другую клетку…С их помощью происходит половой процесс у бактерий, т.к. в них содержится информация о возможности построения белка – пилина, образующено трубочки пили, по которым часть ДНК (главной и плазмид (трансмиссивные плазмиды)) при конъюгации переходит от одной бактерии к другой (подобный ген может содержаться и с бактериальной хромосоме некоторых бактерий). Вирусы и бактериофаги. 1892 Д.И. Ивановский. ВТМ. 1915 Д’Эррель - -бактериофаги (в чашках Петри с коккобациллами, вызывавшими гибель саранчи) 10
  11. 11. Вирусы в клетке-хозяине: 1)ДНК (РНК) вируса в цитоплазме или встраивается в геном клетки. При необходимости происходит обратная транскрипция, образуются новые вирусные частицы, клетка гибнет. Все вирионы выходят одновременно. 2) вирусные частицы выходят постепенно, клетка живет, наличие вирусов придает новые свойства. 3) генетический материал вируса встраивается в хромосомы, воспроизводится при делении, передается дочерним клеткам. Во встроенной ДНК(называемой провирус) активен только ген белка-репрессора, сохраняющий эту ДНК и охраняющий клетку от других вирусных частиц. При определенных условиях может активироваться, тогда вар 1 или2. Такие фаги называются лизогенными или умеренными (например. Вирус саркомы Рауса – в нем открыли обратную транскриптазу 1970 амер. Г. Темин, Д. Балтимор., .) из открытия Д. Балтимором, Р. Дульбекко и Г. Теминым явления обратной транскрипции у вирусов (Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1975). Ими был описан фермент обратная транскриптаза, который, используя молекулу РНК в качестве матрицы, строит вторую, комплементарную, цепь, но уже ДНК. Такая одноцепочечная комплементарная ДНК получила название кДНК (cDNA). Лабораторными методами эту кДНК можно «умножить» в миллионы раз и сохранить для последующего анализа. На методе обратной транскрипции базируются многие современные методы исследования для анализа клеточной системы транскрипции-трансляции. Рис. 2. Схема обратной транскрипции Однако тут есть один нюанс — чтобы обратная транскрипция началась, нужна короткая стартовая «затравка» (праймер), которая была бы комплементарна 3’-концу РНК (см. рис. 2). До сегодняшнего дня в качестве универсального праймера в основном использовался олигонуклеотид поли(Т), комплементарный поли(А)-хвосту. Первый онкоген Src выделен в 1978, такие гены играют роль в период эмбрионального развития организмов, у взрослых они подавляются. Вирусы, встраиваясь в геном клетки, могут захватывать гены хозяина и передавать новому хозяину, причем пребывание в составе вируса меняет регуляцию онкогена, он становится опасен. Трансдукция – передача наследственного материала от одной клетки (обнаружено на клетках бактерий – от бакте6рии-донора) к клетке (бактерии)-реципиенту с помощью умеренных бактериофагов (1952 Дж. Ледерберг, Н. Циндер амер). РисU-образная трубка. Если фаг переносит любой случайный фрагмент - общая, неспецифическая трансдукция. Определенный – специфическая. Встраивая .в фаги фрагменты ДНК, можно создать генные библиотеки. Полная библиотека содержит полный геном и представлена большим числом фаговых частиц, удобен фаг лямбда λ. Использовались в программе «Геном человека» Имеют значение при секвенировании – определении последовательности нуклеотидов ДНК генов. Термины: обратная транскриптаза (ревертаза), трансдукция, трансдуцирующий фаг, общая трансдукция, специфическая трансдукция, геномная библиотека, секвенирование. 11
  12. 12. ЦКП „Секвенирование ДНК“ СО РАН. Центр коллективного пользования дорогостоящим оборудованием для секвенирования ДНК был создан в 2000 году на базе Института Химической Биологии и Фундаментальной Медицины (ИХБФМ) и Института Цитологии и Генетики (ИЦиГ). ЦКП располагает полным комплексом современных автоматических приборов для анализа и расшифровки структуры генов и других участков ДНК. Борьба бактерий против вирусов Рестриктазы (рестрикционные эндонуклеазы) – защитные белки, которые разрушают проникшие чужеродные молекулы нуклеиновых кислот бактериофагов. Открыты и применены в молекулярной генетике в 1974 Д. Натансон, Г. Смит (США), В. Арбер (Швейцария), ноб прем 1978. Рестриктазы специфичны, действуют на строго определенные последовательности нуклеотидов в ДНКдлиной 4-6 нуклеотидов, названные сайты узнавания. Выделены десятки видов рестриктаз, у каждой свой сайт узнавания, или несколько сайтов. Расположение азотистых оснований в них в 2-цепочечной ДНК представляет собой двойную цепь-перевертыш, которую можно повернуть относительно центра на 180., одинаково читать в направлении 3-5 или 5-3. -Г-А-А-Т-Т-Ц- -Ц-Т-Т-А-А-Г- Разрезы, образующиеся в цепях ДНК симметричны, расположены наискось друг от друга на равных расстояниях от центра сайта узнавания. На каждой цепи ДНК образуются хвосты – одноцепочечные тяжи. Они комплементарны друг другу и могут соединиться, поэтому их называют «липкими». (некоторые рестриктазы образуют тупые концы). Почему они не разрезают собственную ДНК? В клетках работают модифицирующие ферменты метилазы, они метилируют (присоединяют СН3) основания участков ДНК, узнаваемых для рестриктаз. Использование природных инструментов и путей передачи в генной инженерии. Вырезать ген – встроить в клетку хозяина (с помощью лигаз – ферментов, сшивающих нуклеотиды ДНК, соединяя цепь). Система для переноса в клетку хозяина называется вектором (используется также для клонирования нуклеотидных последовательностей). Это плазмиды или умеренные вирусы (д.б. мелкие, содержать 1 сайт рестрикции – туда будет вшиваться нужный ген (его можно синтезировать и встроить, такой участок называется линкером), иметь селективные маркеры для идентификации клеток с рекомбинантными ДНК (напр ген устойчивости к антибиотикам), включать сайт (сигнал начала репликации т.к. нужный ген необходимо будет клонировать. Популярный вектор создали рВR322 – Ф. Боливар, Р. Родригес (р-plasmid), его сайт репликации работает только в кишечной палочке. Методика получения рекомбинантной ДНК по П. Лобану и П. Бергу –тупые концы плазмиды наращивали ТТТТТТТ, (слева 3-5 верхнюю цепь, справа5-3 нижнюю), а цепи встраиваемого гена наращивали АААААААА, годится и сейчас, если плазмида и нужный ген вырезаются разными рестриктазами. Конструирование клеток с измененной наследственностью (методика С.Коена и Г. Бойера1971) 1. Обработка вектора рестриктазой – липкие концы 2. Обработка ДНК с нужным геном той же рестриктазой 3. Смешивание вектора с геном, между их липками концами образуются водородные связи 4. Обработка гибридной молекулы ферментом ДНК-лигазой, выделенной из бактериофага Т4 (образует фосфодиэфирные связи между фосфатными и гидроксильными группами.) 5. Перенос рекомбинантной плазмиды – трансформация (, действуют высокой температурой, обрабатывают клетки хлористым кальцием для усиления проницаемости оболочек клеток) – в итоге примерно 1 из 1000 + воссоединившиеся плазмиды и неплазмидная ДНК, из которой вырезали гены. Размножение молекул на первых этапах возможно с помощью полимеразной цепной реакции в амплификаторах, однако точность копирования в 1000 ниже, поэтому для длительного сохранения и копирования нужны бактерии. 12
  13. 13. 6. Отбор трансформированных бактерий. А) Посев клеток на расстоянии др от др на среду с антибиотиком – отбор на наличие маркированных плазмид. Б) Скрининг – отбор бактерий на нужный ген. Накрыть колонии фильтром из нитроцеллюлозы, часть клеток колоний к нему прилипнет. Отпечаток обработать гидроксидом натрия (лизис бактерий и разделение 2цепочечных ДНК на цепи. Обработать зондом – одноцепочечным фрагментом ДНК или РНК, комплементарным искомому, и содержащим радиоактивные атомы. Зонд вступит во взаимодействие с искомым ДНК. Накрыть фильтр рентгеновской пленкой, проявить ее и по засвеченным участкам установить искомые колонии. Отобранные бактерии могут клонировать рекомбинантные плазмиды и использоваться. А)если там есть сайт инициации транскрипции у прокариот (и другие части оперона), бактерия может синтезировать нужный белок Б)полученное множество копий плазмид может использоваться для встраивания нужного гена в клетки эукариот. Встраивание генов в эукариотический организм Встраивают в клетки клеточной культуры. С помощью обработки поверхности клеток для усиления трансмиссмии или вбрасывания на частичках золота. Причем нужный ген клонируется в определенных видах бактерий, а вноситься в клетки эукариот должен особыми векторами (на основе вирусов, поражающих эукариотические клетки (вирус SV40 вызывает рак у мартышек, для нас неопасен, хорошо встраивается в геном), или плазмид дрожжей). Векторы должны нести всю информацию для контроля экспрессии встраиваемого гена. Придется вырезать ген из нашей плазмиды и вшить в новый вектор . И снова потребуется отбор клеток (эукариот), которые получили нужный ген. Если мы планируем работать с растениями, маркером может быть ген устойчивости к гербициду. Каллусы, несущие ген-маркер удачной пересадки остаются зелеными в среде сгербицидом – из них может вырасти растение с нужным нам геном. Для этого намеревались с помощью техники рекомбинантных ДНК перенести геном таких вирусов в клетки кишечной палочки. Высказывались опасения, что бактерия с раковым геном случайно может попасть в организм человека. Еще до окончания конференции ее участники обратились к президенту Национальной академии наук с предложением организовать комиссию по рекомбинант-ным ДНК, которая бы оценила степень опасности их создания для работающих с ними и для окружающей среды. Комиссия была создана. В нее вошли крупнейшие американские биологи, в том числе один из первооткрывателей двойной спирали ДНК Дж. Уотсон, а также «отцы» генной инженерии П. Берг, Г. Бойер, С. Коен. В середине 1974 г. комиссия опубликовала обращение в виде открытого письма ко всем молекулярным биологам и генетикам мира, в котором призвала их воздержаться от конструирования некоторых видов рекомби-нантных ДНК до тех пор, пока не будет полностью оценена степень риска с ними и не будут разработаны специальные правила безопасности. это умение эволюции Ученые впервые вывели генетически модифицированных мартышек By gali 30 мая 2009 13
  14. 14. Ученым удалось создать приматов, которые не только светятся зеленым цветом, но и передают эту особеннность потомкам. В США приобретает популярность домашняя генная инженерияВ последнее время в США появилось много энтузиастов, которые в домашних условиях занимаются генной инженерией. Генетики-любители используют самодельные лаборатории и пытаются создать новые формы жизни, сообщает Associated Press. К примеру, 31-летняя Мередит Л. Паттерсон (Meredith L. Patterson) у себя в столовой пытается создать генетически модифицированную йогуртовую бактерию, которая будет светиться зеленым светом, если в молоке присутствует меламин - токсичное вещество, использующееся в производстве красок, лаков и пластмассы. Напомним, что в сентябре этого года в Китае погибло четыре младенца, отравившихся молочной смесью, куда был подмешан меламин, а общее число детей, пострадавших от ядовитой продукции, составило около 53 тыс. Список литературы 1. Основы биотехнологии: 10-11 классы: учебное пособие для учащихся общеобразовательных учреждений / Е.А.Никишова. – М.: Вентана-Граф, 2008. 160 с. – (Библиотека элективных курсов) 2. Основы биотехнологии: 10-11 классы: методическое пособие / Е.А.Никишова. – М.: Вентана-Граф, 2008. 160 с. – (Библиотека элективных курсов). 3. Клетки и ткани: учебное пособие / Д.К. Обухов, В.Н. Кириленкова. – М.: Дрофа, 2007. – 287 с. – (Элективные курсы). 4. Клетки и ткани: методическое пособие / Д.К. Обухов, В.Н. Кириленкова. – М.: Дрофа, 2007. – 287 с. – (Элективные курсы). 5. Генетика от А до Z/ Первая часть: http://gleb-kudr.habrahabr.ru/blog/48533/ 6. : Журнал "Биотехнология" публикует экспериментальные статьи и аналитические обзоры по всем аспектам современной биотехнологии: поиск, селекция и конструирование продуцентов биологически активных веществ, совершенствование технологии их производства, использование биотехнологических препаратов и экологические проблемы, которые биотехнология создает или способна решить. "Биотехнология" является единственным журналом, который публикует работы в данной области, выполняемые во всех странах СНГ Биотехнология для "чайников" : Главный латвийский генетик – о биотехнологии в мире и в Латвии На прошлой неделе в Даугавпилсском Университете состоялся IV Балтийский Главный латвийский генетик – о биотехнологии в мире и в Латвии Успехи генной инженерии переводят человечество на новый уровень. Если можно из отдельной клетки вырастить овцу, значит, можно вырастить и человека? На прошлой неделе в Даугавпилсском Университете состоялся IV Балтийский конгресс генетиков и селекционеров. В течение нескольких дней около ста ученых из разных стран мира дискутировали о проблемах современной науки в области медицины, охраны природы, улучшения видов животных, растений и генетики человека. «Нашей Газете» удалось пообщаться с Президентом Латвийского общества генетиков и селекционеров, профессором Латвийского Университета Исааком Рашалем. – Для нас большая честь, что такой масштабный международный конгресс проводится именно в Даугавпилсе. Это не случайно? – Мысль о проведении таких конгрессов возникла еще в конце 80-х годов, когда представители Балтийских стран (причем не только люди науки, но и, к примеру, искусства) почувствовали, что надо объединяться и активней общаться между собой. Ведь латвийские ученые в то время в Москву ездили гораздо чаще, чем в тот же 14
  15. 15. Вильнюс или в Эстонию. Но пока между членами Обществ генетиков и селекционеров (а такое общество было в каждой стране) такая идея обсуждалась и реализовывалась, Советский Союз успел распасться. И первый такой конгресс состоялся 15 лет назад – в 1992 году в Вильнюсе. Тогда же была создана и Федерация генетических обществ Балтийских стран. Однако постепенно эти общества стали распадаться – первое распалось в Эстонии, и эстонские ученые его больше не восстановили. А несколько лет назад распалось и в Литве. Так что среди Балтийских стран такое общество, в котором объединены генетики и селекционеры, осталось только в Латвии. Второй конгресс был организован в Юрмале в 1995 году, а затем в 2002 году в Вильнюсе. Сейчас второй раз проходит у нас. Инициативу его проведения взяло на себя Латвийское общество генетиков и селекционеров в сотрудничестве с Даугавпилсским Университетом. – И что волнует современных балтийских генетиков? – Например, сегодня у нас был доклад о том, какова ситуация с наукой в Эстонии. А коллега из Польши докладывал о том, что такое философия создания новых сортов растений. Почему миру нужны новые сорта и как накормить людей планеты? Это глобальная проблема – как накормить 6 миллиардов населения, учитывая, что по прогнозам в 2050 году эта цифра увеличится до 10 миллиардов. Конечно, при современной урожайности такое количество людей прокормить нельзя. Значит, надо увеличить интенсивность сельскохозяйственного производства – требуется больше пшеницы, бобовых, риса... В 19 веке резкое увеличение производства сельскохозяйственной продукции произошло за счет технологической революции. Тогда же стала развиваться и наука о физиологии растений. Стало понятно, что растения тоже что-то кушают, а значит, нужны минеральные удобрения, – и вот, ученые получили Нобелевские премии за их изобретение и внедрение. Наш век (и век 20-й) делает упор на биологическую науку, которая дает возможность резко увеличить урожайность сортов. Это и генная инженерия со своими проблемами, и новые методы селекции, и многое другое. – Генетически модифицированные продукты – предмет нескончаемых споров. На ваш взгляд, овощи, которые могут неделями лежать и не портиться, вредны для здоровья или нет? – Все говорят о ГМО вне зависимости от того, понимают люди, что это такое на самом деле или не понимают. Скажем так, ГМО, или способ перенесения генов из одного растения или животного в другой, – это всего лишь технология. Нечто похожее происходит и в самой природе, только с меньшей частотой. Технологии не могут быть хорошими или плохими. Все дело в том, в чьих руках и для чего они используются. На самом деле все, что связано с ГМО, гораздо строже контролируется, чем обычные методы селекции. А селекцией человечество занималось еще несколько тысячелетий назад. Поэтому риск, что с ГМО может выйти что-то плохое, гораздо меньше, чем с обычным селекционированием. Например, в одном из докладов речь шла об очень распространенном в некоторых регионах зернобобовом растении («турецкий» горошек), которое может давать высокие урожаи и в условиях сухого климата. Оказывается, у этого растения имеется опасный невротоксин, вызывающий специфический паралич мышц и даже летальный исход у людей, если эти бобы использовать термически необработанными. Обычно его используют в пище только после термической обработки, однако в новых регионах возделывания, где местное население не было знакомо с особенностями этого растения, погибло несколько десятков людей – хотя это никакое не ГМО, а натуральный продукт. То же самое молоко может у многих вызывать аллергию... ГМО проверяют очень строго на все возможные эффекты. Другой вопрос, если не контролировать и бездумно выращивать такие растения, есть риск, что какой-нибудь ген убежит в природу. Насколько это плохо – вопрос дискуссионный. – В Латвии такими опытами занимаются? – В Балтийских странах никто созданием растений методом генетической инженерии не занимается. Но и у нас могут рано или поздно использовать эти сорта в сельском хозяйстве. Мы сейчас в Евросоюзе – по закону, если сорт будет допущен к выращиванию в любой стране ЕС, то автоматически разрешен и у нас. На наше счастье 15
  16. 16. Латвия – маленькая страна, и сорта, которые приспособлены для выращивания у нас, никто специально создавать не будет. Так что опасность, что кто-то что-то завезет и начнет нелегально у нас выращивать, небольшая. Хотя фермеров-экспериментаторов всегда можно найти. В Европе существует множество различных лабораторий, в которых продукты постоянно проверяют. Зато, например, в большинстве штатов США продукцию, предлагаемую потребителю в магазинах, на наличие ГМО никто не проверяет, и подавляющее большинство американцы даже не хотят, чтобы ее проверяли. Ведь если продукцию проверять, она для потребителя становится дороже: навряд ли производитель это будет делать за свой счет. – Людей очень пугает слово «мутация», и все, что с этим связано... – Сейчас большие деньги вкладываются в секвенирование – расшифровку генома человека, растений и животных. Но понимание того, как устроен геном, – лишь первый этап. А как регулируется реализация информации, которая в нем хранится, – в основном пока еще неизвестно. – Генетика – наука будущего. Возможно ли сейчас говорить о том, что благодаря этой науке человечество сможет полностью контролировать свое здоровье, продолжительность жизни и прочее? – Любой биологический процесс, индивидуальное развитие человека или любого другого вида – это, в принципе, есть реализация той генетической информации, которую он получил от оплодотворенной сперматозоидом яйцеклетки. Конечно, взаимодействие с окружающей средой играет не последнюю роль. Но если ты не знаешь, каков генотип и как он реализуется, ты ничего не поймешь, – любой биологический процесс базируется на наследственности. Другой аспект – вопрос о селекции в связи с энергетикой: мы в основном пользуемся невозобновляемыми ресурсами. Европейский Союз уже говорит о том, что через определенное количество лет мы должны производить энергию из возобновляемых ресурсов. Значит, упор будет идти на биомассу и ее переработку. Увеличенный выход биомассы – это вопрос селекции, а селекция – это выведение новых генотипов, новых сортов. А мы не можем выводить новые сорта, не зная генетики. Или медицина – здоровье человека, где без генетики никуда. Есть болезни, которые определены одним геном, есть те, которые несколькими. Но большинство болезней определяются взаимодействием генетических особенностей и среды. Но если ты не знаешь генетических механизмов, ты не можешь выбрать и правильные методы лечения. Каждый человек различается, и комбинация генов у всех разная: поэтому сейчас в научных кругах витает идея, что через какое-то время каждому человеку можно будет подобрать свое лекарство и его синтезировать в зависимости от особенностей индивидуальных генов, ведь что годится для одного, не всегда годится для другого. Поэтому какую сферу не гляди, без знания генетики невозможно. – А можно ли будет клонировать исчезнувшие виды животных? Вернуть к жизни саблезубого тигра, например, или мамонта... – Клонировать, наверное, нет. Во-первых, найденная ископаемая ДНК бывает очень плохого качества. Она фрагментирована, поэтому полностью восстановить геном мамонта, по крайней мере, на данном уровне науки, невозможно. Хотя если начать научно фантазировать... Если бы можно было найти миллиард фрагментированных ископаемых образцов, их проанализировать и сопоставить вместе, то теоретически можно представить, что всю ДНК можно восстановить. Но проблема также и в том, что каждое животное (не только ископаемое) уникально. В отличие от растений, которые размножаются семенами: семечко мы можем хранить в генном банке годами, потом посадить его в нужных условиях, и вырастет нормальное растение. Даже если вы сохраните яйцеклетку или сперму, трудно получить нормальное животное. Все равно кого-то надо будет оплодотворить, и получится совсем другая комбинация генов. Пока же ученые изучают только особенности генов вымерших животных. Но очень важно было бы знать, как геномы (набор генов) взаимодействуют с цитоплазмой. Цитоплазму никак не восстановить. Так что даже если полностью проанализировать ДНК, еще неизвестно что из этого получится – невозможно полностью восстановить определенный вид животного, создать его точную копию или клон. Если бы мы взяли 16
  17. 17. какую-нибудь человеческую клетку, скажем, Шварценеггера и проклонировали бы ее, то Шварценеггер все равно бы не получился. В лучшем случае (опять же теоретизируем, опуская этические вопросы, связанные с разрешением клонирования) получилось бы нечто похожее на новорожденного Шварценеггера (а мы знаем, что он был слабеньким ребенком). – Результаты конгресса станут известны общественности? – Во-первых, большинство докладов будут опубликованы. Тезисно они уже опубликованы в Известиях Латвийской Академии Наук. Но потом с этими материалами можно будет ознакомиться и целиком. Для нас главное, установить контакты с зарубежными коллегами. – А какие-нибудь сенсационные исследования латвийским генетикам принадлежат? – Трудно ожидать, чтобы в Латвии проводились такие глобальные сенсационные исследования, за которых получают Нобелевские премии. Это другое финансирование. Для того, чтобы проводилось исследование уровня Нобелевской премии, нужен такой широкий и глубокий фронт исследований, который не может осуществить коллектив в 2-3 человека. Поэтому ожидать такого уровня исследований, чтобы об этом вдруг весь мир заговорил, у латвийских ученых шансов мало. Да и время ученых-одиночек уже прошло. Вряд ли ты один, сидя за микроскопом, сделаешь уникальное открытие. Наука сейчас стала очень дорогой, – те же микроскопы нужны не простые, а сканирующие и т.д. Здесь важен другой критерий – насколько часто ученый публикуется и насколько его часто цитируют ученые из других стран. И на конгрессе оказалось, что в Эстонии наиболее сильны специалисты по молекулярной генетике человека, – их публикации наиболее часто цитируют другие специалисты. Среди латвийских ученых наиболее известны работы в области молекулярной биологии, биомедицины, медицинской фармакологии, связанных с генетикой. У нас на хорошем уровне проводятся ряд исследований по генетике растений. Может, это и не сенсация, но это работы, которые замечают и на которые ссылаются зарубежные ученые. Еще пример: один из докладов на конгрессе был посвящен созданию базы генетической выборки населения Латвии. Несколько десятков тысяч образцов ДНК будет собрано и надежно храниться. Изучение разнообразия образцов начнется уже в наши дни. И это такой депозит, к которому впоследствии много ученых будут обращаться для новых исследований еще многие годы вперед. Светлана Кубасова, «Наша газета», 18.10.2007 июнь 2006 № 6 "В МИРЕ НАУКИ" Биотехнологии Генная инженерия от A до Z Приветствую уважаемое сообщество! Итак, это мой первый пост на хабре :) Посвящен он будет серьезной теме, в которой, волею судеб, я неплохо разбираюсь. А именно, генной инженерии. Помнится, тут пробегал пост habrahabr.ru/blogs/the_future_is_here/48069/ в котором говорилось о геннотехнологической лаборатории “на коленке”. Оказалось, что тема интересна аудитории, поэтому я решил заняться ее развитием с просветительскими целями. Я буду давать наглядные и понятные обычным людям примеры для описания сложных процессов. Если кто-то посчитает нужным меня поправить – не стесняйтесь. Я буду сознательно упускать многие вещи, но если вам кажется, что без них страдает логика изложения – так же поправляйте. Итак, начнем. Допустим, мы хотим создать трансгенную новогоднюю елку светящуюся синим светом. Допустим, британские ученые как раз недавно открыли ген синего свечения. Вот и посмотрим на этот 17
  18. 18. процесс по стадиям. Ген свечения. Будем вести эксперимент, как настоящие ученые. Они слышат что открыт новый ген, что же им делать дальше, если хочется создать елку? Настоящий ученый обычно лезет в ncbi.nih.gov и по нескольким ключевым словам ищет научные публикации на эту тему. Например “синее свечение ген светится”. Типична ситуация, когда по одной из ссылок он действительно находит статью “британских ученых”, которая оказывается статьей группы китайских авторов, ни один из которых не отзывается на e-mail. С другой стороны, в статье можно выяснить название этого гена. Пусть он будет называться ButiBl1 (названия генов принято давать буквенными обозначениями + индекс, а впереди может идти несколько первых букв названия организма из которого он выделен, их можно отбрасывать). ButiBl1, например, может быть расшифровано как Butiavka marina blue light 1 gene. Но правила здесь не строгие. По названию гена в базе данных нуклеотидов ищут последовательность гена.Вот что примерно видит ученый на экране: Кстати, мы можем воспользоваться инструментом BLAST и введя последовательность ДНК, получить, к каким генам она может относиться. Это тоже очень важный рутинный инструмент для генных инженеров. Итак, мы получили последовательность гена. Очень хорошо, что дальше? Нужно ведь получить сам ген. Для этого вернемся к вопросу о том, что такое ДНК. Про ДНК. ДНК – это длинная молекула (очень длинная), является полимером из четырех вариантов маленьких молекул – азотистых оснований, попросту “букв”. В каждой клетке содержится от одной до нескольких десятков одинаковых молекул ДНК (обычно — две). Я надеюсь, все это помнят, но если нужно освежить память, пожалуйста, в wiki :) Итак, запомните главное: 1. ДНК – это молекула. 2. Так как это молекула, то ее не видно в микроскоп, не подцепить пинцетом и т.д. и т.п. 3. В клетке обычно одна-две такие молекулы. Как же генные инженеры работают с молекулой ДНК если она одна и с ней невозможно провести никаких прямых манипуляций? Дело в том, что во всех процедурах происходит работа не с одной, а с множеством молекул ДНК, с тысячами и миллионами ее копий. Тысячи таких одинаковых молекул плавают в водном растворе и этот раствор называется “препаратом ДНК”. Все манипуляции с молекулами проводятся типичными химическими методами. То есть ученые работают не с одной молекулой, а с огромным их количеством в растворе с применением химических методов. Как же нам получить ген bl1? Есть два способа. Первый – прямой химический синтез. Однако им не получить достаточно длинные молекулы из-за ошибок синтеза. Поясню, почему. ДНК – это полимер. Его можно синтезировать наращивая по кирпичику, причем есть четыре кирпича разных цветов. На каждой стадии наращивания эффективность составляет порядка 99%. То есть из ста молекул одна получается неправильной. Теперь представьте, что нам нужно сделать молекулу длиной в 1000 букв? Тогда применяя банальную арифметику окажется, что доля верных молекул составит 0,99^1000=0,00004 Учитывая, что разделить верные и неверные молекулы почти невозможно, наша затея тут потерпит фиаско, и в реальных задачах синтез более 100-150 букв уже представляется малореалистичным. Остается второй способ. Потрошим бутявку Мы выбиваем из шефа командировку на побережье Мальдивских островов, где только и водится пресловутая бутявка морская (Butiavka marina). Ловим ее, толчем в порошок, заливаем последовательно разными химическими гадостями чтобы из всей массы тканей в растворе остались только молекулы ДНК. Конечный итог этого – препарат ДНК бутявки. Так как выделение производится из относительно большого образца, то там не одна молекула ДНК, а много – от каждой клетки по паре штук. Эта ДНК содержит не только ген bl1, но и все остальные бутявочные гены. 18
  19. 19. Этот этап называется выделением ДНК. Ее можно выделить не только в виде раствора, а переосадить и получить сухой препарат, то есть чистые молекулы ДНК. Амплификация Итак, командировка окончена, поэтому мы метнемся обратно в лабораторию где нас поджидает чудная процедура амплификации. Смотрите, в препарате ДНК бутявки куча всяких разных генов, а не только нужный нам. Мы же можем работать только с однородными препаратами, нам нужно довести содержание молекул ДНК гена bl1 хотя бы процентов до 90. И тут мы применяем поистине чудесный прием, являющийся краеугольным камнем современной биоинженерии, называемым полимеразной цепной реакцией или ПЦР (polymerase chain reaction, PCR). За открытие этого метода присудили нобелевскую премию, хотя до сих пор ходят споры о приоритете, поэтому фамилий не называю, кому интересно – почитайте. Принцип полимеразной цепной реакции довольно сложен, объяснение дам очень грубое и только для того чтобы было хоть какое-то представление, за подробным – добро пожаловать по ссылке выше. Итак, нам нужно размножить (амплифицировать) молекулы ДНК определенного гена. Для этого мы открываем страничку с последовательностью нашего гена и находим его концы. Берем 20-30 букв с конца и столько же с начала и синтезируем короткие молекулы ДНК химическим синтезом (обычно это делают специальные фирмы) То есть мы имеем две новые пробирки. В одной из них плавает много коротких 30-буквенных последовательности ДНК, гомологичных началу гена, а во второй – то же самое, но для конца гена. Эти новые молекулы называются праймерами. Теперь мы запускаем реакцию ПЦР, причем умножаться у нас будет участок между двумя праймерами (между начальным и концевым). Реакция ПЦР – это биохимическая циклическая реакция, требующая смены температуры. В свое время ее делали на водяных банях, теперь же используют специальные приборы – амплификаторы (они же ПЦР-машины). Их строение очень простое, там стоят элементы Пельтье, есть место для пробирок и ко всему этому присобачены электронные мозги и управляющая панель. То есть вернулись мы в лабораторию с ДНК бутявки. Заказали два праймера — к началу и к концу гена. Потом взяли чистую пробирку, капнули туда чуть-чуть ДНК, чуть чуть каждого праймера, полимеразу (фермент, который строит ДНК), нуклеотидов для строительства ДНК, и немного солей для правильной работы фермента, поставили в амплификатор на пару часов. В амплификаторе смесь то нагревалась, то остужалась и на выходе мы получили пробирку в которой плавает очень много копий ДНК нужного нам гена. Однако пробирка прозрачная, как увидеть что там есть какая-то ДНК, да еще нужная? Детекция ДНК. Существует много способов увидеть ДНК, я же опишу классический, называемый гель-электрофорезом. В лаборатории имеется небольшая ванночка с электродами, называямая форезной камерой. В эту ванночку заливается расплав электрофорезного геля, который по сути очень похож на мармелад. Но вместо сахара там находятся добавки солей и флуоресцентный краситель – бромистый этидий. Это вещество интересно тем, что встраивается в молекулу ДНК и в этом случае начинает светиться в ультрафиолете. После того как гель застынет мы наносим в лунку на нем препарат ДНК где предположительно уже 19
  20. 20. должно быть много копий гена bl1 и включаем электрический ток. В другую лунку наносим “маркер веса” – специальный препарат молекул ДНК, состоящий в равных долях из молекул длины 100, 200, 300 и т.д. нуклеотидов. Молекулы ДНК полярны и движутся в электрическом поле, при этом чем они длиннее, тем сильнее цепляются за структуру геля и тем медленнее в нем движутся. Через некоторое время мы выключаем электричество и несем гель под ультрафиолетовую лампу. На той дорожке где мы нанесли маркер веса мы видим кучу полосок. Самая дальняя от места нанесения пробы соответствует самой короткой ДНК, самая ближняя – самой длинной. В соседних лунках ДНК бежит с одинаковой скоростью, поэтому мы сравниваем их расположение на соседних дорожках и можем определить, относительный размер. Итак, мы обнаружили на дорожке где нанесли пробу одну светящуюся полоску и размер ее судя по соседнему маркеру веса является таким, каким мы ожидали. Мы аккуратнентко вырезаем лезвием из геля этот светящийся кусочек – он содержит много ДНК гена bl1 запутавшейся в геле и с помощью специальных манипуляций высвобождаем из него молекулы. Можно себя поздравить, мы выделили ген bl1 из бутявки! Я рассказал только о первой стадии этого сложного и длинного процесса. Продолжать ли дальше? Решать вам :) Генная инженерия от A до Z часть 2 Итак, настало время продолжения статьи о том, как все же сделать светящуюся елку к следующему новому году с применением настоящей генной инженерии, а не той, о которой вы до этого могли прочитать в новостях :) Краткое содержание предыдущей серии: Ученые открыли ген синего свечения. Мы прочитали об этом гене и загорелись сделать светящуюся трансгенную елку. Нашли в специализированных ресурсах его название и последовательность, выбили командировку у шефа и скатались туда, где живет животное – бутявка, в которой содержится этот ген. Путем различных ухищрений с применением специального оборудования мы получили чистые молекулы ДНК гена bl1, кодирующего белок синего свечения. У нас есть ген. Чего же мы ждем, спросят читатели, давайте засунем этот ген в елку и она начнет светиться? Не все так просто, и вот, почему. Любой ген работает только когда с него считывается информация. В нашем случае это мРНК белка bl1. Более того, сама мРНК должна работать, но это отдельная история. Второе – ген должен передаваться при делении клетки ее потомкам. Иначе все пойдет насмарку. Третье – ведь ген это не булавка, его еще засунуть как-то нужно! Если мы просто поместим в клетку ген, то ни информация с него не будет прочитана, ни передаваться он не будет (да, собственно, и с засовыванием его большие проблемы). Поэтому, мы должны навесить на него какую-нибудь служебную информацию, которая бы позволила ему работать и облечь в форму, которая позволит передаваться потомкам. А так же каким-то образом занести его в клетку. Однако еще раньше мы постараемся сохранить имеющийся ген, чтобы в любой момент можно было его получить много и не ездить за бутявкой. Первая трансформация. Самая первая задача, которая стоит на каждом этапе – сохранить результаты предыдущих этапов. Актуальная задачи и в программировании, не правда ли? :) Сейчас мы поместим наш ген в бактерию, так, чтобы в любой момент мы могли ее размножить и достать оттуда необходимое количество. Это будет наш первый трансгенный организм и процесс его создания называется трансформацией. Почему мы просто не можем размножить ген с помощью ПЦР, как мы делали до этого? Дело в том, что 20

×