SlideShare a Scribd company logo

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYME ALGINATE LYASE TỪ VI SINH VẬT CÓ TRONG RONG BIỂN VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG NÓ ĐỂ THỦY PHÂN ALGINATE - TẢI FREE ZALO: 093 457 3149

•
•
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0936 885 877
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0936 885 877

TẢI FREE ZALO: 093 457 3149 (NHẬN BÀI NGAY 5 GIÂY). NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYME ALGINATE LYASE TỪ VI SINH VẬT CÓ TRONG RONG BIỂN VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG NÓ ĐỂ THỦY PHÂN ALGINATE

Education
1 of 79
Download to read offline
1 DANH MUÏC CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT .................................................................4 DANH MUÏC CAÙC BAÛNG BIEÅU, HÌNH VAØ ÑOÀ THÒ ......................................5 MÔÛ ÑAÀU............................................................................................................5 1. Tính caáp thieát cuûa ñeà taøi.................................................................................7 2. Muïc ñích, nhieäm vuï vaø noäi dung nghieân cöùu cuûa ñeà taøi................................8 3. Ñieåm môùi vaø yù nghóa khoa hoïc, thöïc tieãn cuûa ñeà taøi.....................................8 Chương 1. TOÅNG QUAN ...................................................................................9 1.1. Toång quan veà rong Naâu [1] .........................................................................9 1.2. Toång quan veà Alginate..............................................................................11 1.2.1. Alginate[1][11].......................................................................................11 1.2.2. Coâng thöùc caáu taïo cuûa axit alginic vaø muoái alginate [1],[11]................12 1.2.2.1. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa Alginic............................................................12 1.2.2.2. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa caùc keo Alginate.............................................14 1.2.3. Tính chaát cuûa moät soá loaïi keo Alginate .................................................15 1.3 Moät soá nghieân cöùu veà alginate lyase .........................................................18 1.4. Nhöõng nghieân cöùu veà Oligo alginate (OA) ...............................................19 1.4.1. Nhöõng nghieân cöùu trong nöôùc ................................................................19 1.4.2. Nhöõng nghieân cöùu ngoaøi nöôùc................................................................21 1.5. Toång quan sô löôïc veà caùc phöông phaùp nghieân cöùu .................................23 1.5.1. Phöông phaùp phaân laäp vi sinh vaät[6],[8] ................................................23 1.5.2. Phöông phaùp baûo quaûn gioáng vi sinh vaät ...............................................23 1.5.3. Phöông phaùp nghieân cöùu hình thaùi vi sinh vaät.[6]..................................24 1.5.4. Phöông phaùp nuoâi caáy vi sinh vaät sinh enzyme vaø thu nhaän cheá phaåm enzyme[3][4][5][7]...........................................................................................25 1.5.4.1. Phöông phaùp nuoâi caáy .........................................................................25 1.5.4.2. Thu hoài cheá phaåm enzyme ..................................................................26 Chöông 2. NOÄI DUNG VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU.........................28 2.1. Noäi dung nghieân cöùu. ................................................................................28
2 2.2. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu[3][6][7][8].................................................29 2.3. Phöông phaùp boá trí thí nghieäm ..................................................................29 2.3.1. Boá trí nghieäm phaân laäp chuûng vi khuaån trong töï nhieân coù khaû naêng sinh toång hôïp algL ...................................................................................................29 2.3.2. Sô ñoà boá trí thí nghieäm löïa choïn chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång hôïp algL cao.....................................................................................................30 2.3.3. Sô ñoà boá trí thí nghieäm kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa chuûng vi sinh vaät ñöôïc löïa choïn ...................................................................................................32 2.3.4. Sô ñoà boá trí thí nghieäm thu dòch enzyme algL töø moâi tröôøng sinh khoái.33 2.3.5. Sơ ñồ bố trí thí nghiệm thử nghiệm phaân caét caùc loại Natri alginate khaùc nhau bằng dung dịch enzyme thu ñược.............................................................34 2.3.6. Sô ñoà boá trí thí nghieäm xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme................................35 2.3.7. Sô ñoà boá trí thí nghieäm phaân aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät vaø khaû naêng phaân caét cuûa algL ...............................36 2.3.8. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL ......................................................................38 Sô ñoà 2.3.8: AÛnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL...38 2.3.9. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL ....................................................................................39 2.3.10. Sô ñoà boá trí thí nghieäm choïn taùc nhaân keát tuûa thích hôïp ñeå thu hoài algL töø dòch enzyme .................................................................................................40 Chöông 3. KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU VAØ THAÛO LUAÄN ...............................41 3.1. Keát quaû nghieân cöùu phaân laäp chuûng vi sinh vaät trong töï nhieân coù khaû naêng sinh toång hôïp enzyme algL ..............................................................................41 3.2. Kết quả thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật coù khả năng sinh algL cao42 3.3. Keát quaû thí nghieäm kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa vi sinh vaät ñaõ choïn.....44 3.4. Keát quaû thí nghieäm phaân caét caùc loaïi natri alginate baèng dung dòch enzyme thu ñöôïc...............................................................................................45
3 3.5 Keát quaû ñònh danh vi sinh vaät.....................................................................47 3.5.2. Keát quaû nhuoäm Gram vaø sinh hoùa ñònh danh baèng heä thoáng IDS14GNR....48 3.5.3. Keát quaû giaûi trình töï gene 16S treân maùy CEQ 8000 vaø tra cöùu treân BLAST SEARCH .............................................................................................49 3.6. Keát quaû thí nghieäm xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme ..........................................51 3.7. Keát quaû thí nghieäm aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät vaø khaû naêng phaân caét cuûa algL do vi sinh vaät sinh ra..............53 3.8. Keát quaû thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc ion kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL ....................................................................................54 3.9. Keát quaû nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL...................................................................................................................56 3.10. Keát quaû thí nghieäm choïn taùc nhaân keát tuûa thích hôïp ñeå taùch chieát algL töø dòch enzyme......................................................................................................58 3.11. Ñeà xuaát quy trình thu hoài cheá phaåm enzyme algL töø vi khuaån Klebsiella sp ......................................................................................................................60 Chöông 4. KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ XUAÁT YÙ KIEÁN .............................................63 4.1. Keát luaän.....................................................................................................63 4.2. Ñeà xuaát yù kieán...........................................................................................64 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO .............................................................................................66 PHUÏ LUÏC 1. CAÙC KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU............................................................70 PHUÏ LUÏC 2. HOÙA CHAÁT VAØ THIEÁT BÒ SÖÛ DUÏNG TRONG LUAÄN VAÊN............75
4 DANH MUÏC CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT E: Enzyme S: Cô chaát Na-alginate dd: dung dòch OA: Oligo Alginate vsv: vi sinh vaät algL: Alginate lyase Na-alg: Natri alginate EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid
5 DANH MUÏC CAÙC BAÛNG BIEÅU, HÌNH VAØ ÑOÀ THÒ STT TEÂN BAÛNG Trang 1 Baûng 1.2.3. Nhieät ñoä phaân huûy cuûa caùc loaïi Alginte khaùc nhau 16 2 Bảng 1.4.1. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä oligo alginate ñeán khaû naêng naûy maàm cuûa haït thoùc gioáng 19 3 Baûng 3.4. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa caùc dung dòch Na- alginate khaùc nhau 44 4 Baûng 3.5.2. Keát quaû thöû nghieäm sinh hoùa ñònh danh 47 5 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt ñộng của alginate lyase 55 TEÂN HÌNH 1 Hình 1.2.2.1a :Coâng thöùc coå ñieån cuûa hai ñôn vò monomeric trong axit Alginic 12 2 Hình 1.2.2.1b: Hình theå daïng gheá cuûa axit Uronic 13 3 Hình 1.2.2.1c: Caáu taïo cuûa axit Alginic 13 4 Hình 1.2.2.1d: Caáu taïo axit alginic theo moâ hình caùc coâng thöùc coå ñieån (coâng thöùc phoái caûnh) 13 5 Hình 1.2.2.2a: Coâng thöùc caáu taïo Na-alginate 14 6 Hình 1.2.2.2b: Coâng thöùc caáu taïo Ca-alginate 15 7 Hình 1.4.2a: Aûnh höôûng cuûa hoãn hôïp Oligomanuronate (Oligo- M) chöa baûo hoaø vaø hoãn hôïp Oligoguluronate (Oligo-G) chöa baûo hoaø leân söï daøi ra cuûa reå caây caø roát vaø caây luùa 20 8 Hình 1.4.2b: AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä hoån hôïp oligo-G ñeán söï daøi ra cuûa reå caây caøroát vaø luùa . Hình 1.4.2c: AÛnh höôûng cuûa möùc ñoä ñoàng truøng hôïp oligo-G ñeán söï daøi ra cuûa reå caây caøroát aø luùa . Ñoä daøi cuûa reå xaùc ñònh sau 8 vaø 15 ngaøy. (noàng ñoä 0,75mg/ml) 21 9 Hình 3.1a: VSV coù khuaån laïc maøu traéng söõa (C1) 40 10 Hình 3.1b: VSV coù khuaån laïc maøu môõ gaø (C2) 40
6 11 Hình 3.3a. Khuaån laïc vi sinh vaät maøu traéng söõa treân moâi tröôøng thaïch I 43 12 Hình 3.3b. Khuaån laïc vi sinh vaät maøu traéng söõa treân moâi tröôøng thaïch chæ coù Na-alginate 1,5% vaø soi döôùi kính hieån vi vaät kính 100x 43 13 Hình 3.5.1. Khuaån laïc vi sinh vaät phaân laäp treân caùc moâi tröôøng khaùc nhau 46 14 Hình 3.5.2. Hình aûnh teá baøo vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc 47 15 Hình 3.5.3. Sô ñoà giaûi trình töï gene 16S cuûa chuûng vi sinh vaät phaân laäp 49 TEÂN ÑOÀ THÒ 1 Ñoà thò 3.2. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% theo thôøi gian phaân caét 41 2 Ñoà thò 3.4. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa caùc dd Na-alginate 1% khaùc nhau theo thôøi gian phaân caét 44 3 Ñoà thò 3.6a. Möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% theo noàng ñoä Enzyme 50 4 Ñoà thò 3.6b. Möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na- alginate 1% theo noàng ñoä Enzyme 51 5 Ñoà thò 3.7. AÛnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån cuûa Klebsiella sp vaø hoaït ñoä enzyme algL 52 6 Ñoà thò 3.8. AÛnh höôûng caùc ion kim loaïi ñeán hoaït löïc cuûa enzyme algL 53 7 Ñoà thò 3.9. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa enzyme algL 55
7 MÔÛ ÑAÀU 1. Tính caáp thieát cuûa ñeà taøi Rong bieån laø nguoàn lôïi bieån cung caáp caùc chaát keo quan troïng nhö Agar, Alginate, Carrageenan duøng trong coâng ngheä thöïc phaåm vaø caùc ngaønh coâng nghieäp khaùc. Treân theá giôùi töø nhöõng naêm 1980 rong bieån ñaõ ñöôïc quan taâm nghieân cöùu. Naêm 1930 coâng ngheä cheá bieán caùc chaát Alginate, Manitol, Agar phaùt trieån maïnh vaø ngaøy caøng öùng duïng nhieàu trong thöïc teá, ñaëc bieät laø ôû caùc nöôùc Nhaät Baûn, Myõ vaø Trung Quoác. Theo Luning (1990) toång saûn löôïng cuûa Alginate laø 35.000 taán.[1] Treân theá giôùi coù nhieàu coâng trình nghieân cöùu öùng duïng cuûa Alginate trong caùc ngaønh coâng nghieäp nhö: Thöïc phaåm, döôïc phaåm, myõ phaåm, coâng ngheä deät, noâng nghieäp, coâng ngheä sinh hoïc, nghieân cöùu khoa hoïc… Keát quaû cuûa caùc coâng trình nghieân cöùu öùng duïng alginate trong noâng nghieäp cho thaáy raèng, maïch alginate sau khi caét maïch coù taùc duïng kích thích söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån ñoái vôùi caây troàng [9][10][12][13][14]. Vôùi öùng duïng naøy, thieát nghó vieäc nghieân cöùu caùc phöông phaùp caét maïch alginate ñeå saûn xuaát cheá phaåm kích thích taêng tröôûng thöïc vaät laø raát caàn thieát nhaèm taêng naêng suaát caây troàng vaø taïo ra caùc saûn phaåm coù giaù trò toát töø ñoù naâng cao giaù trò kinh teá laø moät höôùng quan troïng ñang ñöôïc caùc nhaø khoa hoc Vieät Nam quan taâm. Chính vì leõ ñoù, ñeà taøi “ Nghieân cöùu taùch chieát Enzyme Alginate lyase töø vi sinh vaät coù trong rong bieån vaø böôùc ñaàu öùng duïng noù ñeå thuyû phaân alginate” laø raát caàn thieát, goùp phaàn öùng duïng coâng ngheä sinh hoïc vaøo noâng nghieäp vaø ñôøi soáng saûn xuaát ôû nöôùc ta.
8 2. Muïc ñích, nhieäm vuï vaø noäi dung nghieân cöùu cuûa ñeà taøi Muïc ñích, nhieäm vuï Ñeà taøi nhaèm phaân laäp, tuyeån choïn chuûng vi sinh vaät trong tự nhieân coù khaû naêng sinh toång hôïp alginate lyase cao. Tieán haønh nuoâi caáy chuûng vi sinh vaät ñaõ tuyeån choïn trong moâi tröôøng thích hôïp sau ñoù löïa choïn phöông phaùp thích hôïp ñeå thu nhaän cheá phaåm alginate lyase töø moâi tröôøng nuoâi caáy vaø böôùc ñaàu nghieân cöùu öùng duïng caét maïch alginate. Xaùc ñònh hoaït ñoä cuûa enzyme alginate lyase theo phương phaùp ño ñộ nhớt dung dịch alginate 1% trước vaø sau khi phaân caét. 3. Ñieåm môùi vaø yù nghóa khoa hoïc, thöïc tieãn cuûa ñeà taøi Ñieåm môùi cuûa ñeà taøi Ñaây laø moät trong nhöõng nghieân cöùu ñaàu tieân veà phaân caét alginate baèng phöông phaùp sinh hoïc. Enzyme alginate lyase coù theå öùng duïng ñöôïc vaøo noâng nghieäp ñeå saûn xuaát ra cheá phaåm taêng tröôûng thöïc vaät ít ñoäc haïi cho con ngöôøi vaø goùp phaàn giaûm laøm giaûm oâ nhieãm moâi tröôøng. YÙ nghóa khoa hoïc vaø thöïc tieãn Keát quaû cuûa ñeà taøi goùp phaàn laøm phong phuù theâm nhöõng hieåu bieát veà coâng ngheä sinh hoïc vaø öùng duïng cuûa noù vaøo caùc lónh vöïc cuûa ñôøi soáng xaõ hoäi ñaëc bieät laø trong coâng ngheä saûn xuaát enzyme, noâng nghieäp vaø moät soá ngaønh coâng nghieäp khaùc. Keát quaû cuûa ñeà taøi cuõng môû roäng ñaàu ra cho ngaønh coâng nghieäp alginate cuûa Vieät Nam. Beân caïnh ñoù caùc coâng ty saûn xuaát thuoác taêng tröôûng thöïc vaät cuõng coù theå öùng duïng ñeå saûn xuaát ra moät cheá phaåm taêng tröôûng thöïc vaät ít gaây ñoäc haïi cho con ngöôøi vaø moâi tröôøng.
9 Chöông 1 TOÅNG QUAN 1.1. Toång quan veà rong Naâu [1] Ngaønh rong Naâu laø moät trong nhöõng ngaønh coù giaù trò kinh teá cao. Rong Naâu coù treân 190 chi, hôn 900 loaøi, phaàn lôùn soáng ôû bieån, soá loaøi vaø soá chi tìm thaáy trong nöôùc ngoït khoâng nhieàu laém. Rong coù caáu taïo nhieàu teá baøo daïng maøng giaû, daïng phieán, daïng sôïi ñôn giaûn, moät haøng teá baøo chia nhaùnh, daïng oáng hoaëc phaân nhaùnh phöùc taïp hôn daïng caây coù goác, reã, thaân, laù. Rong sinh tröôûng ôû ñænh, ôû giöõa, ôû goác caùc loùng. Ngoaøi ra, do caùc teá baøo rong daïng phieán chia caét sinh tröôûng khueách taùn goïi laø sinh tröôûng beà maët. Thaønh phaàn hoaù hoïc cuûa rong Naâu + Saéc toá Saéc toá rong Naâu laø dieäp luïc toá (Chlorophyl), dieäp hoaøng toá (Xanthophyl), saéc toá maøu naâu (Fucoxanthin), saéc toá ñoû (Caroten). Tuyø theo tyû leä caùc loaïi saéc toá maø rong coù maøu töø naâu – vaøng naâu – naâu ñaäm – vaøng luïc. Nhìn chung saéc toá cuûa rong Naâu khaù beàn. + Gluxit − Monosachride Monosacharide quan troïng trong rong Naâu laø ñöôøng Manitol ñöôïc Stenhouds phaùt hieän naêm 1884 vaø ñöôïc Kylin (1913) chöùng minh theâm. Manitol coù coâng thöùc toång quaùt laø : HOCH2 – (CHOH)4 – CH2OH Manitol tan ñöôïc trong ancol, deã tan trong nöôùc coù vò ngoït. Haøm löôïng töø 14 ÷ 25% troïng löôïng khoâ tuyø thuoäc vaøo ñieàu kieän soáng. − Polysacharide
10 Alginic: laø moät polysacharide taäp trung giöõa ôû vaùch teá baøo, laø thaønh phaàn chuû yeáu taïo thaønh taàng beân ngoaøi cuûa maøng teá baøo rong Naâu Alginic vaø muoái cuûa noù coù nhieàu coâng duïng trong ngaønh coâng nghieäp, noâng hoïc, y hoïc vaø thöïc phaåm. Haøm löôïng Alginic trong caùc loaïi rong Naâu khoaûng 2 ÷ 4% so vôùi rong töôi vaø 13 ÷ 15% so vôùi rong khoâ. Haøm löôïng phuï thuoäc vaøo loaïi rong, ñieàu kieän ñòa lyù moâi tröôøng maø rong sinh soáng. Theo taøi lieäu toång keát cuûa Miyake (1995) cho thaáy haøm löôïng Alginic trong caùc loaïi rong Naâu ôû caùc vuøng bieån Lieân Xoâ cuõ laø 13 ÷ 40% Theo taøi lieäu phaân tích cuûa caùc chuyeân gia Boä Thuyû saûn cho thaáy haøm löôïng Alginic trong caùc loaïi rong Naâu ôû Haûi Phoøng laø 22 ÷ 40%, trong khi ñoù, rong Naâu ôû vuøng bieån Phuù Yeân vaø Khaùnh Hoaø cao hôn haún. Haøm löôïng Alginic coù trong caùc loaøi rong ôû Mieàn Trung Vieät Nam laø khaù cao, dao ñoäng töø 12,3 ÷ 39,4% so vôùi troïng löôïng khoâ tuyeät ñoái, tuyø thuoäc vaøo loaøi vaø vuøng ñòa lyù. Trong ñoù, loaøi rong S. mcclurei vaø Turbinaria ornata coù haøm löôïng Alginic cao nhaát khoaûng 35,9 ÷ 39,4% rong khoâ tuyeät ñoái. Neáu so saùnh taát caùc vuøng bieån thì rong ôû vuøng bieån Khaùnh Hoaø coù haøm löôïng Alginic cao hôn caû (töø 26,2 ÷ 39,4% rong khoâ tuyeät ñoái). − Axit Fucxinic: coù tính chaát gioáng vôùi axit Alginic. Axit Fucxinic taùc duïng vôùi axit Sunfuric taïo thaønh hôïp chaát coù maøu tuyø thuoäc vaøo noàng ñoä axit Sunfuric. − Fuccoidin: laø loaïi muoái giöõa axit Fuccoidin vôùi caùc kim loaïi hoaù trò khaùc nhau nhö Ca, Cu, Zn. Fuccoidin coù tính chaát gaàn gioáng vôùi axit Alginic, nhöng haøm löôïng thaáp hôn Alginic. − Laminarin: Laminarin laø tinh boät cuûa rong Naâu, thöôøng gaëp ôû daïng boät khoâng maøu, khoâng muøi vaø coù hai loaïi hoaø tan vaø khoâng hoaø tan trong nöôùc.
11 Laminarin coù haøm löôïng töø 10 ÷ 15% troïng löôïng rong khoâ tuyø thuoäc vaøo loaïi rong, vò trí ñòa lyù vaø moâi tröôøng sinh soáng cuûa rong Naâu. − Cellulose: laø thaønh phaàn caáu taïo neân voû caây rong. Haøm löôïng Cellulose trong rong Naâu nhieàu hôn rong Ñoû. + Proâteâin: Proâteâin trong rong Naâu khoâng cao laém nhöng khaù hoaøn haûo. Do vaäy rong Naâu coù theå laøm thöïc phaåm. Proâteâin trong rong Naâu thöôøng ôû daïng lieân keát vôùi Iod taïo Iod höõu cô coù giaù trò cao nhö: MonoIodInzodizin, DiIodInzodizin. Haøm löôïng proâteâin rong Naâu ôû vuøng bieån Nha Trang dao ñoäng 8,05 ÷ 21,11% so vôùi troïng löôïng khoâ. Haøm löôïng axit amin cuõng ñaùng keå vaø coù giaù trò cao trong proâteâin cuûa rong bieån. + Chaát khoaùng Haøm löôïng caùc nguyeân toá khoaùng trong rong Naâu thöôøng lôùn hôn nöôùc bieån. Chaúng haïn: Iod cuûa rong bieån lôùn hôn trong nöôùc bieån töø 80 ÷90 laàn. Haøm löôïng Ba lôùn hôn trong nöôùc bieån laø 1.800 laàn. Haøm löôïng khoaùng ôû vuøng bieån Nha Trang dao ñoäng trong töø 15,51 ÷ 46,30% phuï thuoäc vaøo muøa vuï vaø thôøi kyø sinh tröôûng 1.2. Toång quan veà Alginate 1.2.1. Alginate[1][11] Alginate laø thuaät ngöõ thöôøng duøng cho caùc loaïi muoái cuûa axit alginic, nhöng cuõng coù theå xem laø taát caû caùc daãn xuaát cuûa axit alginic hay chính baûn thaân axit alginic. ÔÛ moät soá nôi thì thuaät ngöõ “algin” ñöôïc duøng thay cho alginate. Alginate toàn taïi trong caùc thaønh teá baøo cuûa rong Naâu döôùi daïng muoái canxi, Magieâ, natri cuûa axit alginic. Alginate ñöôïc hình thaønh nhôø phaûn öùng ñoàng truøng hôïp khoâng phaân nhaùnh cuûa axit α – L – guluronic vaø axit β – D – manuronic. Söï khaùc nhau giöõa caùc block laø veà kích thöôùc vaø söï thay ñoåi caùc
12 ñoaïn manuronic (M) vaø guluronic (G) cuõng nhö söï toàn taïi cuûa caùc block ngaãu nhieân. Caáu truùc cuûa alginate chòu aûnh höôûng cuûa nguoàn rong bieån cuõng nhö ñieàu kieän phaùt trieån cuûa rong. Ngöôøi ta raát quan taâm ñeán tyû leä M/G vì noù quyeát ñònh ñeán tính chaát cuûa gel ñöôïc taïo thaønh. Neáu tyû leä naøy caøng nhoû thì khaû naêng taïo gel cuûa alginate caøng cao vaø ngöôïc laïi. Alginate cuõng coù theå ñöôïc sinh toång hôïp töø moät loaïi vi sinh vaät robacter vinelandii, tuy nhieân saûn phaåm alginate do vi sinh vaät saûn sinh ra coù khaû naêng taïo gel keùm, ít coù tính thöông maïi neân thöôøng chæ ñöôïc ñeà caäp ñeán trong coâng taùc giaûng daïy. 1.2.2. Coâng thöùc caáu taïo cuûa axit alginic vaø muoái alginate [1],[11] 1.2.2.1. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa Alginic Alginic thuoäc polysacharide nhöng coù chöùa nhoùm carboxyl (-COOH ) trong phaân töû neân thöôøng goïi laø axit alginic hay polysacharide coù tính axit yeáu. Theo Niwa (1940) cho raèng ñôn vò caáu truùc cuûa Alginic laø Uronic coù coâng thöùc phaân töû laø (C24H30O23)n, Chapman thì cho raèng Alginic laø daïng truøng hôïp thoaùt nöôùc cuûa D.Mamuronic coù coâng thöùc (C5H9O5COOH)n vaø coâng thöùc hoaù hoïc töông ñöông cuûa Alginic laø (C6H8O6)n. Hai thuyeát töông töï nhau, n = 80 ÷83 do vaäy coù söï truøng hôïp raát lôùn. III.1.2.2. Moät soá tính chaát cuûa caùc alginate. Hình 1.2.2.1a :Coâng thöùc coå ñieån cuûa hai ñôn vò monomeric trong axit Alginic
13 Theo caùc taøi lieäu hoaù sinh gaàn ñaây moâ taû caáu taïo cuûa Alginic goàm caùc axit D.Manuronic lieân keát vôùi L.Lunuronic baèng lieân keát 1 – 4 maïch thaúng khoâng phaân nhaùnh Alginic laø polymer goàm nhieàu axit Manuronic (M) keát hôïp vôùi Guluronic (G) taïo maïch thaúng khoâng phaân nhaùnh vaø coù theå lieân keát theo hình phaúng sau: Treân phaân töû Alginic, caùc phaân töû M vaø G seõ toå hôïp thaønh caùc block theo daïng hình sau ñaây: Hình 1.2.2.1b: Hình theå daïng gheá cuûa axit Uronic Hình 1.2.2.1d: Caáu taïo axit alginic theo moâ hình caùc coâng thöùc coå ñieån (coâng thöùc phoái caûnh) Hình 3: Caáu taïo cuûa Alginic axit Hình 1.2.2.1c: Caáu taïo cuûa axit Alginic
14 1.2.2.2. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa caùc keo Alginate. Natri Alginate. Coâng thöùc phaân töû: (C5H7O4COONa)n. Coâng thöùc caáu taïo: Hình 1.2.2.1e: G block Hình 1.2.2.1f: M block Hình 1.2.2.1g: MG block Hình 1.2.2.2a: Coâng thöùc caáu taïo Na-alginate
15 Canxi Algiante. Coâng thöùc phaân töû: [(C5H7O4COO)2 Ca)]n. Coâng thöùc caáu taïo: Alginate Amonium 1.2.3. Tính chaát cuûa moät soá loaïi keo Alginate Muoái alginate cuûa kim loaïi hoaù trò I ( Natri alginate ) deã hoøa tan trong nöôùc, taïo dung dòch keo nhôùt, coù ñoä dính vaø ñoä nhôùt cao, khi laøm laïnh khoâng ñoâng vaø khi khoâ trong suoát coù tính ñaøn hoài. Muoái Alginate cuûa kim loaïi hoùa trò II ( Alginate Canxi, Alginate Magieâ,…) khoâng hoaø tan trong nöôùc, tuyø theo kim loaïi maø coù maøu khaùc nhau. Khi muoái aåm thì deûo deã bieán hình, khi khoâ raát cöùng, raát khoù thaám nöôùc, nhôø coù tính chaát naøy maø Alginate coù raát nhieàu öùng duïng trong caùc lónh vöïc khaùc nhau. Boät Alginate deã bò giaûm ñoä nhôùt neáu khoâng ñöôïc baûo quaûn ôû nhieät ñoä thaáp. Khaùc vôùi Agar thì khi giaûm nhieät ñoä thì dung dòch Alginate khoâng bò ñoâng laïi, ngay caû khi laøm laïnh vaø tan giaù thì ñoä nhôùt vaø beà ngoaøi cuõng khoâng thay ñoåi. Hình 1.2.2.2b: Coâng thöùc caáu taïo Ca-alginate
16 Propyleneglycol Alginate ( PGA) vôùi 80 – 85% nhoùm -COOH ñöôïc ester hoaù coù taùc duïng nhoû nhaát vôùi ion Canxi, do ñoù hôïp chaát naøy ñöôïc öùng duïng trong coâng nghieäp söõa. PGA giaûm tính hoaø tan khi pH moâi tröôøng 4. pH = 2 thì PGA bò keát tuûa. Caùc loaïi Alginate khaùc nhau thì seõ bò phaân huyû ôû caùc nhieät ñoä khaùc nhau. Theo nghieân cöùu cuûa Kenfikato – Khoa Thuyû saûn Tröôøng Ñaïi hoïc Hokaido, Nhaät Baûn cho thaáy nhieät phaân huûy cuûa caùc Alginate trong baûng sau: Alginate Nhieät ñoä phaân huûy ( o C ) Axit Alginic Na – Alginate(1) Na – Aginate(2 ) Ca – Algiante Al – Alginate Fe – Alginate 186 221,5 231,5 204,5 196 218,5 Baûng 1.2.3. Nhieät ñoä phaân huûy cuûa caùc loaïi Alginate khaùc nhau Ñoä nhôùt vaø troïng löôïng phaân töû. Dung dòch Alginate taïo neân ñoä nhôùt cao khi hoaø tan trong nöôùc. Ñoä nhôùt cuûa noù taêng theo noàng ñoä Alginate hoaø tan vaø giaûm theo chieàu taêng cuûa nhieät ñoä. Troïng löôïng phaân töû trung bình cuûa Alginate ñöôïc ño baèng ñoä nhôùt vaø khaû naêng thaåm thaáu theo phöông trình sau ñaây: η = K.Mγ Trong ñoù: η: ñoä nhôùt M: khoái löôïng phaân töû trung bình K, γ : heä soá thöïc nghieäm.
17 Troïng löôïng phaân töû trung bình cuûa Alginate ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông phaùp ñoä nhôùt (Viscometric method).
18 1.3 Moät soá nghieân cöùu veà alginate lyase R. Scott Doubet vaø Ralph S. Quatrano (1982), thuoäc tröôøng Ñaïi hoïc Oregen State. Nghieân cöùu phaân laäp caùc vi khuaån bieån coù khaû naêng sinh Lyase ñaëc hieäu caét maïch Alginate. Cho thaáy caùc Alginate lyase ñöôïc chieát ruùt töø moâi tröôøng cuûa moät soá vi sinh vaät ñaõ ñöôïc phaân laäp. Caùc lyase naøy ñöôïc sinh ra nhôø moâi tröôøng coù alginate töï nhieân vaø coù hoaït tính vôùi caû block cuûa axit manuronic vaø axit guluronic cuûa chuoãi polymer alginate. Lyase ñaëc hieäu ñoái vôùi axit guluronic ñöôïc taùch chieát töø moâi tröôøng, trong khi ñoù lyase ñaëc hieäu vôùi axit manuronic ñöôïc taùch chieát töø teá baøo vi khuaån.[20] Naêm 1992, Manabu Kitamikado, Chao-Huang Tseng, Kuniko Yamaguchi vaø Takashi Nakamura thuoäc tröôøng Ñaïi hoïc Fukuoka, Nhaät Baûn. Nghieân cöùu hai chuûng vi sinh vaät sinh enzyme alginate lyase. Cho thaáy caùc algiante lyase ngoaïi baøo ñöôïc tinh saïch töø Vibrio harveyi Al-128 vaø V. alginolyticus ATCC 17749. Söï hình thaønh enzyme naøy ñaàu tieân caét ñöùt lieân keát α 1,4 bao goàm caùc ñôn vò L-guluronate vaø sau ñoù laø caét ñöùt caùc lieân keát beta 1,4 bao goàm caùc ñôn vò D-manuronate. Phaân töû löôïng cuûa enzyme naøy ñöôïc xaùc ñònh khoaûng töø 47.000 ñeán 57.000 Da vaø coù ñieåm ñaúng ñieän laàn löôït laø 4,3 vaø 4,6. Enzyme töø chuûng AL-128 haàu nhö hoaït ñoäng ôû moâi tröôøng coù noàng ñoä NaCl töø 0,3 ñeán 1,0 M. Coøn moâi tröôøng hoaït ñoäng toái thích cuûa enzyme töø chuûng ATCC 17749 laø söï coù maët cuûa CaCl2 coù noàng ñoä töø 5 ñeán 10 mM.[17] Naêm 2000, Wataru Hashimoto, Osamu Miyake, Keiko Momma, Shigeyuki Kawai vaø Kousaku Murata thuoäc tröôøng Ñaïi hoïc Kyoto, Nhaät Baûn. Nghieân cöùu xaùc ñònh phaân töû löôïng cuûa alginate lyase cuûa Sphingomonas sp. Chuûng A1 laø moät trong nhöõng enzyme caét maïch Alginate. Keát quaû cho thaáy alginate bò caét maïch taïo thaønh caùc oligoalginate bôûi ba loaïi enzyme ( A1-I {66
19 kDa}, A1-2 {25 kDa}, A1-3 {40 kDa}) ñöôïc sinh ra töø teá baøo chaát. Caùc enzyme naøy vaø gene cuûa chuùng ñöôïc phaân laäp töø caùc vi sinh vaät phaùt trieån ôû vuøng coù maët alginate.[19] Yuan-Hong Wang, Guang-Li Yu, Xin-Min Wang, Zhi-Hua LV, Xia Zhao, Zhi Hong Wu, Wei-Shang Ji (2006). Nghieân cöùu söï tinh saïch vaø ñaëc tính cuûa alginate lyase ñöôïc sinh ra töø Vibrio sp. Cho bieát caùc lyase naøy ñöôïc tinh saïch bôûi söï keát hôïp giöõa chaát laéng amonium sulfate vaø diethylaminoethyl trong coät saéc kyù Shephacel. Keát quaû cho thaát phaân töû löôïng cuûa caùc alginate lyase khoaûng 62,5 kDa, vôùi nhieät ñoä vaø pH hoaït ñoäng toái öu laàn löôït laø 250 C vaø 7,0. Khaû naêng hoaït ñoäng cuûa lyase taêng khi coù maët EDTA vaø Zn2+ , nhöng bò kìm haõm bôûi Ba2+ . Lyase naøy ñaëc hieäu caét ñöùt lieân keát beta-D-1,4 manuronic cuûa chuoãi alginate. Xiao Ting Fu, Sang Moo Kim (2007), Khoa Sinh hoïc vaø Coâng ngheä Bieån Tröôøng Ñaïi hoïc Quoác Gia Kangnung, Haøn Quoác, nghieân cöùu tinh saïch vaø tính chaát cuûa alginate lyase töø vi khuaån bieån Agarivorans albus. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy raèng alginate lyase laø moät chuoãi polypeptit coù khoái löôïng phaân töû 60 Kda vaø coù ñieåm ñaúng ñieän laø 5,5 – 5,7. pH vaø nhieät ñoä toái thích cho hoaït ñoäng cuûa enzyme naøy laàn löôït laø 7,0 vaø 400 C. Hoaït löïc cuûa enzyme bò maát hoaøn toaøn bôûi söï thaåm tích vaø phuïc hoài trôû laïi khi theâm 0,1 M Na+ hoaëc K+ .[21] 1.4. Nhöõng nghieân cöùu veà Oligo alginate (OA) 1.4.1. Nhöõng nghieân cöùu trong nöôùc Năm 2002, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt ñã sản xuất chế phẩm tăng trưởng thực vật TD bằng cách chiếu xạ tia gamma lên phân tử alginate ñể thu nhận OA có khối lượng phân tử thấp hơn.
20 Naêm 2002, Traàn Thaùi Hoøa vaø Nguyeãn Thò AÙi Nhung ôû Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc, Ñaïi hoïc Hueá nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa oligo alginate ñeán khaû naêng naûy maàm cuûa haït thoùc gioáng. Oligoalginate duøng ñeå thí nghieäm ñöôïc taïo ra baèng 3 phöông phaùp : chieáu xaï, phaân caét baèng kieàm vaø axit maïnh. Keát quaû nhö sau:[10] STT Toå hôïp noàng ñoä toái öu Söùc naûy maàm (%) Cheânh leäch % so vôùi maãu ñoái chöùng Taêng % so vôùi ñoái chöùng Ñieåm chaát löôïng caây maàm 1 A1 50ppm 92,4 + 10,5 111,3 9 2 A2 40ppm 91,6 + 9,7 111,8 9 3 A3 30ppm 94,7 + 12,8 115,6 9 4 Ñoái chöùng 81,9 7 Baûng 1.4.1. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä Oligo alginate ñeán khaû naêng naûy maàm cuûa haït thoùc gioáng Naêm 2005 cuõng taïi Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc Hueá, taùc giaû Voõ Thò Mai Höông cuõng ñaõ nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa OA ñeán söï phaùt trieån cuûa moät soá gioáng caây ngaén ngaøy vaø coù keát luaän nhö sau: − Oligoalginate coù khaû naêng kích thích söï sinh tröôûng, taêng söï tích luõy chaát khoâ vaø naêng ñeû nhaùnh cuûa luùa. Taïi noàng ñoä OA 80 ppm haøm löôïng chaát khoâ ñaït cao nhaát (taêng 25,40% so vôùi ñoái chöùng), soá nhaùnh/caây cao nhaát (taêng 21,10%) vaø troïng löôïng haït/chaäu cao nhaát (taêng 32,41). − OA theå hieän roõ reät taùc duïng kích thích leân sinh tröôûng cuûa caây ngoø. Noàng ñoä OA toái thích laø 60 ppm. Taïi noàng ñoä naøy troïng löôïng töôi cuûa ngoø taêng 165,145%, naêng suaát taêng 60,76%. Taát caû caùc loâ coù xöû lyù OA ñeàu coù naêng suaát cao hôn so vôùi ñoái chöùng.
21 − OA laøm taêng soá hoa/caây vaø tyû leä hoa höõu hieäu vaø naêng suaát cuûa laïc ôû taát caûc caùc noàng ñoä nghieân cöùu. Saûn löôïng laïc taêng 1,77 – 7,48 taï/ha vaø ñaït cao nhaát (26,83 taï/ha, taêng 38,66%) ôû noàng ñoä OA toái thích (80 ppm). 1.4.2. Nhöõng nghieân cöùu ngoaøi nöôùc Naêm 2003, caùc nhaø nghieân cöùu ôû Tröôøng Ñaïi hoïc Nagasaki, Nhaät Baûn ñaõ nghieân cöùu khaû naêng kích thích söï phaùt trieån reå caây caø roát vaø luùa cuûa caùc Oligo uronate chöa baûo hoaø töø alginate. Caùc oligo uronate chöa baûo hoaø ñöôïc chuaån bò nhôø moät enzyme alginate lyase tieâu hoaù polymannuronate ( PM ) vaø polyguluronate ( PG ), ñöôïc tinh saïch töø Pseudomonas sp. Söï phaùt trieån cuûa reå ñöôïc xaùc ñònh bôûi söï daøi ra cuûa reå caây caøroát vaø caây luùa ñöôïc uû trong moâi tröôøng coù chöùa 0,8% agar trong boùng toái. PG vaø PM khoâng coù khaû naêng kích thích söï phaùt trieån reå nhöng khi ta troän laãn caùc enzyme tieâu hoaù PG thì noù laïi coù khaû naêng kích thích söï phaùt trieån cuûa reå cuûa hai loaïi caây naøy ôû noàng ñoä toái thieåu laø 0,5mg/ml, khaû naêng kích thích söï phaùt trieån reå laø cöïc ñaïi ôû noàng ñoä 0,75 mg/ml. Hình 1.4.2a: AÛnh höôûng cuûa hoãn hôïp Oligomanuronate (Oligo-M) chöa baûo hoaø vaø hoãn hôïp Oligoguluronate (Oligo-G) chöa baûo hoaø leân söï daøi ra cuûa reå caây caø roát (a) vaø caây luùa (b). Ñoä daø i cuû a reå (cm) Thôøi gian (ngaøy) Ñoä daø i cuû a reå (cm) Thôøi gian (ngaøy) Ñoä daø i cuû a reå (cm)
22 Haït gioáng cuûa hai loaïi caây naøy ñöôïc ñaët trong moâi tröôøng agar ôû 250 C, trong boùng toái. Khi chieàu daøi cuûa reå ñaït töø 1 – 1,5cm sau 5 – 6 ngaøy thì tieán haønh caét reå vaø ñem uû trong moâi tröôøng coù chöùa hoån hôïp oligo-G vaø oligo-M ôû noàng ñoä 0,5mg/ml. Reå ñöôïc uû trong boùng toái vaø xaùc ñònh chieàu daøi sau 4 – 5 ngaøy uû.[13] Hai nhaø nghieân cöùu Iwasaki vaø Matsubara, Vieän Nghieân cöùu Thöïc phaåm thuoäc Quaän Kagawa, Takamatsu, Nhaät Baûn ñaõ nghieân cöùu vieäc tinh cheá caùc oligosacharide alginate với khaû naêng kích thích phaùt trieån reå cuûa caây rau dieáp. Keát quaû cho thaáy, natri alginate ñöôïc thuyû phaân bôûi alginate lyase töø Corynebacterium sp., vaø sau ñoù tinh cheá saûn phaåm nhôø quaù trình sieâu loïc (UF). Khi xöû lyù dung dòch oligo natri alginate baèng phöông phaùp sieâu loïc döôùi aùp suaát 0,15 Mpa, toác ñoä cuûa doøng chaûy khoaûng 0,6m/s, haàu heát caùc alginate khoâng ñöôïc phaân caét ñöôïc loaïi boû hoaøn toaøn. Phaàn alginate ñöôïc giöõ laïi laø moät hoãn hôïp cuûa disacharide tôùi octosacharide vaø coù khaû naêng kích thích söï phaùt trieån chieàu daøi reå caây rau dieáp ( khoaûng 2 laàn so vôùi maãu ñoái chöùng) ôû Ñoä daø i cuû a reå (cm) Noàng ñoä (mg/ml) Hình 1.4.2b: AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä hoãn hôïp oligo-G ñeán söï daøi ra cuûa reå caây caøroát (□) vaø luùa (■). Ñoä daøi cuûa reå xaùc ñònh sau 8 vaø 14 ngaøy. Hình 1.4.2c: AÛnh höôûng cuûa möùc ñoä ñoàng truøng hôïp oligo-G ñeán söï daøi ra cuûa reå caây caøroát (□) vaø luùa (■). Ñoä daøi cuûa reå xaùc ñònh sau 8 vaø 15 ngaøy. (noàng ñoä 0,75mg/ml) Ñoä daø i cuû a reå (cm)
23 noàng ñoä trong khoaûng 200 – 300 µg/ml. Möùc ñoä aûnh höôûng khaùc nhau cuûa caùc oligoalginate ñöôïc xaùc ñònh baèng caùch thöû töøng oligoalginate coù möùc ñoä phaân caét maïch khaùc nhau. Tri-, tetra-, penta- vaø hexasacharide ñeàu coù khaû naêng kích thích söï phaùt trieån reå cuûa caây rau dieáp. [14] 1.5. Toång quan sô löôïc veà caùc phöông phaùp nghieân cöùu 1.5.1. Phöông phaùp phaân laäp vi sinh vaät[6],[8] Phaân laäp vi sinh vaät laø quaù trình taùch rieâng vi sinh vaät ñoù töø maãu vaät hoaëc quaàn theå vi sinh vaät ban ñaàu ñeå thu gioáng ôû daïng thuaàn khieát. Caùc vi sinh sinh vaät thuaàn khieát chæ bao goàm caùc teá baøo ñöôïc sinh ra töø teá baøo ban ñaàu. Haàu heát caùc öùng duïng coâng ngheä sinh hoïc ñeàu lieân quan ñeán vieäc söû duïng gioáng thuaàn. Phaàn lôùn caùc phöông phaùp phaân laäp gioáng thuaàn khieát ñeàu döïa treân kyõ thuaät pha loaõng, thöôøng goàm caùc böôùc sau: chuaån bò maãu, taêng sinh maãu ( neáu soá löôïng vi sinh vaät coù trong maãu ít ), pha loaõng maãu, caáy maãu leân moâi tröôøng thaïch ñaëc hieäu, uû maãu ôû ñieàu kieän thích hôïp, kieåm tra vaø phaùt hieän khuaån laïc ñaë tröng, choïn khuaån laïc ñaëc tröng ñem taïo gioáng thuaàn vaø kieåm tra gioáng thuaàn. 1.5.2. Phöông phaùp baûo quaûn gioáng vi sinh vaät Baûo quaûn gioáng vi sinh vaät hay coøn goïi laø giöõ gioáng vi sinh vaät. Baûo quaûn nhaèm laøm chaäm quaù trình hoâ haáp vaø trao ñoåi chaát cuûa teá baøo vi sinh vaät, ngaên caûn söï sinh saûn cuûa chuùng, ñoàng thôøi khoâng laøm thay ñoåi phaåm chaát ban ñaàu cuûa gioáng, coù nghóa laø gioáng ñöôïc baûo quaûn toát thì seõ coù caùc quaù trình sinh lyù, sinh hoùa gioáng nhö ban ñaàu neáu gaëp ñöôïc ñieàu kieän sinh tröôûng gioáng nhö ban ñaàu. Gioáng ñem ñi baûo quaûn phaûi ôû traïng thaùi thuaàn khieát vaø trong traïng thaùi sinh, lyù toát.
24 Coù nhieàu phöông phaùp baûo quaûn gioáng vi sinh vaät, nhö phöông caáy chuyeàn ñònh kyø leân moâi tröôøng môùi , phöông phaùp giöõ gioáng treân moâi tröôøng thaïch coù phuû lôùp daàu khoaùng, phöông phaùp giöõ gioáng treân caùt hay haït, hay phöông phaùp ñoâng khoâ. 1.5.3. Phöông phaùp nghieân cöùu hình thaùi vi sinh vaät.[6] Vi sinh vaät laø nhöõng cô theå soáng voâ cuøng nhoû beù. Phaàn lôùn caùc vi sinh vaät khoâng theå quan saùt baèng maét thöôøng maø phaûi nhôø ñeán ñoä phoùng ñaïi cuûa kính hieån vi. Chính vì theá, kính hieån vi laø moät duïng cuï voâ cuøng quan troïng, khoâng theå thieáu trong vieäc nghieân cöùu ñaëc tính hình thaùi cuûa vi sinh vaät cuõng nhö hình daùng, kích thöôùc, khaû naêng di ñoäng, söï hình thaønh baøo töû, sinh saûn…. Caùc tieâu baûn taïm thôøi ñöôïc söû duïng ñeå quan saùt hình thaùi vi sinh vaät Ñoái vôùi tieâu baûn taïm thôøi coù nhuoäm maøu, thuoác nhuoäm vi sinh vaät phaûi khoâng ñoäc hoaëc ít ñoäc ñoái vôùi vi sinh vaät caàn quan saùt vaø phaûi pha loaõng ñeán noàng ñoä nhaát ñònh ñeå ñaûm baûo vi sinh vaät vaãn coøn soáng vaø di ñoäng. Teá baøo soáng vaø teá baøo cheát coù theå phaân bieät khi nhuoäm maøu vôùi xanh methylene. Methylene coù maøu xanh khi khoâng coù söï hieän dieän cuûa hydro vaø khoâng coù maøu khi coù maët cuûa hydro. Khi caùc teá baøo ôû traïng thaùi nghæ ( traïng thaùi ôû pha oån ñònh treân ñöôøng cong sinh tröôûng ), maëc duø coøn soáng nhöng khoâng coù khaû naêng khöû maøu xanh cuûa methylene thaønh khoâng maøu. Do ñoù, neân quan saùt teá baøo ôû giai ñoaïn ñaàu cuûa pha taêng tröôûng. Cuõng coù theå nghieân cöùu hình thaùi vi sinh vaät baèng phöông phaùp nhuoäm cuûa Christian Gram. Nhuoäm Gram khoâng nhöõng giuùp phaân bieät vi khuaån nhôø caùc ñaëc ñieåm cuûa hình thaùi vaø söï saép xeáp cuûa teá baøo maø coøn cung caáp thoâng tin veà lôùp voû teá baøo. Khi nhuoäm theo phöông phaùp naøy teá baøo vi khuaån Gram döông coù lôùp voû teá baøo taïo bôûi peptidolycan seõ coù maøu tím coøn vi khuaån Gram
25 aâm coù lôùp voû teá baøo moûng hôn ( do coù ít peptidolycan ) vaø ñöôïc bao boïc bôûi lôùp maøng moûng seõ coù maøu hoàng. 1.5.4. Phöông phaùp nuoâi caáy vi sinh vaät sinh enzyme vaø thu nhaän cheá phaåm enzyme[3][4][5][7] 1.5.4.1. Phöông phaùp nuoâi caáy Ñeå thu ñöôïc enzyme coù hai phöông phaùp nuoâi caáy vi sinh vaät khaùc nhau veà nguyeân taéc. Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët hay phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu hay coøn goïi laø nuoâi caáy chìm, trong nuoâi caáy chìm coù phöông phaùp nuoâi caáy chìm hai böôùc. 1. Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët Trong phöông phaùp nuoâi beà maët vi sinh vaät phaùt trieån treân beà maët cuûa moâi tröôøng dinh döôõng ñaëc tröng ôû theå raén ñaõ ñöôïc laøm aåm vaø voâ truøng. Trong moâi tröôøng dinh döôõng ngöôøi ta thöôøng cho theâm caùc chaát caûm öùng caàn thieát cho söï toång hôïp enzyme naøo ñoù hoaëc moät soá chaát dinh döôõng boå sung nguoàn nitô,photpho nhö nöôùc chieát ngoâ, khoai taây, dòch chieát naám men… Ñeå ñaûm baûo ñoä xoáp cuûa moâi tröôøng caàn coù caùc chaát taïo ñoä xoáp nhö traáu tyû leä töø 10 – 20%. Tröôùc khi gieo caáy vi sinh vaät moâi tröôøng caàn phaûi ñöôïc voâ truøng ñeå ñaûm baûo khoâng bò laây nhieåm vi sinh vaät laï trong khi nuoâi. Ñeå nuoâi caáy be maët ngöôøi ta thöôøng duøng maønh maønh hoaëc khung ñuïc loã ñeå trong phoøng kín. Phöông phaùp nuoâi beà maët thöôøng thích hôïp ñeå nuoâi caáy caùc teá baøo naám moác vì khaû naêng phaùt trieån maïnh neân ít bò taïp nhieãm. 2. Phöông phaùp nuoâi caáy chìm Phöông phaùp nuoâi caáy chìm vi sinh vaät phaùt trieån trong moâi tröôøng loûng coù suïc khí vaø khuaáy ñaûo lieân tuïc. Nguoàn cung caáp cacbon phuï thuoäc vaøo töøng loaïi vi sinh vaät sinh enzyme. Trong thöïc teá saûn xuaát ngöôøi ta coøn duøng caû moät soá saûn phaåm thuûy phaân cuûa tinh boät ñeå taïo nguoàn cacbon deã daøng ñöôïc ñoàng
26 hoùa. Coøn nguoàn nitô ngöôøi ta hay duøng nguoàn nitô höõu cô nhö cao ngoâ, dòch chieát naám men, khoâ laïc… Ngoaøi ra trong thaønh phaàn moâi tröôøng cuõng caàn boå sung theâm caùc chaát khoaùng. Moâi tröôøng nuoâi caáy caàn ñöôïc ñònh möùc phoái cheá coù tröø hao löôïng hôi nöôùc baùm vaøo thaønh bình vaø thanh truøng tröôùc khi caáy gioáng. Thöôøng thanh truøng moâi tröôøng baèng caùch suïc hôi nöôùc tröïc tieáp ôû nhieät ñoä 1210 C trong voøng 60 – 90 phuùt ñoái vôùi caùc moâi tröôøng chöùa caùc nguyeân lieäu boät, ñaïm thoâ vaø 20 – 30 phuùt ñoái vôùi caùc moâi tröôøng coù chöùa ñöôøng. Trong quaù trình nuoâi caáy phaûi suïc khí voâ truøng vaø khuaáy ñaûo lieân tuïc. Thôøi gian keùo daøi töø 1 – 4 ngaøy tuøy thuoäc vaøo töøng loaïi vi sinh vaät. Trong nuoâi caáy chìm vieäc khoáng cheá pH , ñieàu kieän yeám khí vaø voâ truøng laø nhöõng ñieàu kieän ñaëc bieät quan troïng vaø ñöôïc chuù yù nhieàu hôn nuoâi caáy beà maët. 3. Phöông phaùp nuoâi chìm hai böôùc Theo phöông phaùp naøy caùc teá baøo vi sinh ñöôïc nuoâi trong thieát bò ñeå phaùt trieån toái ña, sau ñoù ñöôïc chuyeån tôùi thieát bò leân men sinh toång hôïp enzyme, trong ñoù thaønh phaàn moâi tröôøng khaùc vôùi ñieàu kieän phaùt trieån cuûa vi sinh vaät. Phöông phaùp naøy coù öu ñieåm laø khoâng coù chaát kích thích, saûn löôïng enzyme cao vaø chæ caàn moät löôïng nhoû chaát dinh döôõng. Phöông phaùp naøy coù nhieàu thuaän lôïi trong vieäc kieåm tra vaø taïo ñieàu kieän toát cho caùc pha rieâng bieät ñoù laø pha sinh tröôûng vaø pha cheá taïo enzyme, vì vaäy hieäu quaû cao. 1.5.4.2. Thu hoài cheá phaåm enzyme Caùc cheá phaåm enzyme ñöôïc öùng duïng trong thöïc teá vôùi nhieàu daïng khaùc nhau. Trong moät soá tröôøng hôïp, canh tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät coù chöùa enzyme ñöôïc söû duïng tröïc tieáp khoâng caàn taùch taïp chaát neáu caùc taïp chaát ñoù khoâng gaây taùc haïi ñaùng keå ñeán saûn phaåm vaø kyõ thuaät saûn xuaát sau naøy ( ví duï: saûn xuaát röôïu, da)
27 Cuõng coù nhieàu tröôøng hôïp ngöôøi ta caàn ñeán cheá phaåm enzyme tinh khieát vôùi möùc ñoä khaùc nhau tuøy theo yeâu caàu söû duïng ( ví duï: coâng nghieäp deät, coâng nghieäp ñöôøng töø tinh boät, y hoïc, nghieân cöùu khoa hoïc …). Enzyme raát deã bò giaûm hoaït tính döôùi taùc duïng cuûa caùc taùc nhaân beân ngoaøi do ñoù khi tinh cheá enzyme caàn traùnh söï bieán tính proâteâin, gaây aûnh höôûng xaáu ñeán hoaït tính cuûa enzyme, caàn tieán haønh quaù trình thu hoài nhanh ôû nhieät ñoä thaáp. Noùi chung khoâng coù moät quy trình chung ñeå chieát xuaát vaø tinh cheá enzyme. Tuøy theo töøng tröôøng hôïp maø ngöôøi ta aùp duïng caùc phöông phaùp chieát xuaát vaø tinh cheá khaùc nhau.
28 Chöông 2 NOÄI DUNG VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 2.1. Noäi dung nghieân cöùu. Nhöõng noäi dung nghieân chính trong ñeà taøi ñöôïc trình baøy treân sô ñoà sau: Sô ñoà 2.1: Nhöõng noäi dung nghieân cöùu chính. Phaân laäp, tuyeån choïn chuûng vi khuaån sinh toång hôïp alginate lyase trong töï nhieân. Nuoâi caáy chuûng vi sinh vaät ôû 37o C, trong 2 ngaøy Sinh khoái vaø taùch chieát alginate lyase töø moâi tröôøng nuoâi caáy vi khuaån. Böôùc ñaàu phaân caét caùc alginate khaùc nhau baèng alginate lyase Xaùc ñònh hoaït ñoä alginate lyase Thu thaäp soá lieäu vaø ñöa ra keát luaän Nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa moät soá yeáu toá ñeán khaû naêng phaân caét alginate cuûa alginate lyase Nghieân cöùu taùch chieát alginate lyase töø dòch sinh khoái baèng dung moâi thích hôïp Ñònh danh vi sinh vaät sinh
29 2.2. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu[3][6][7][8] 2.2.1. Phaân laäp vi sinh vaät baèng kyõ thuaät pha loaõng 2.2.2. Kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa vi sinh vaät baèng phöông phaùp caáy ria vaø soi kính hieån vi 2.2.3. Giöõ gioáng vi sinh vaät baèng phöông phaùp caáy truyeàn ñònh kyø leân moâi tröôøng. 2.2.4. Xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme baèng phöông phaùp ño ñoä nhôùt 2.2.5. Xaùc ñònh nhieät ñoä vaø pH baèng nhieät keá vaø pH keá 2.2.6. Xaùc ñònh soá löôïng teá baøo baèng phöông phaùp caáy gaït 2.2.7. Thu hoài cheá phaåm enzyme baèng phöông phaùp keát tuûa 2.2.8. Ñònh danh vi sinh vaät baèng phöông phaùp giaûi trình töï gene 16S 2.2.9. Xöû lyù soá lieäu baèng phaàn meàm Microsoft Office Excel 2.3. Phöông phaùp boá trí thí nghieäm 2.3.1. Boá trí nghieäm phaân laäp chuûng vi khuaån trong töï nhieân coù khaû naêng sinh toång hôïp algL Alginate 1% Ñoå xuoáng ñaát Laáy maãu ñaát hoøa vaøo nöôùc tieät truøng Caáy vaøo moâi tröôøng agar chöùa 1,5% algiante natri Nuoâi caáy ôû 37o C trong 02 ngaøy
30 Sô ñoà 2.3.1: Boá trí thí nghieäm phaân laäp chuûng vi khuaån coù khaû naêng sinh toång hôïp algL Rong Naâu ñöôïc uû trong ñaát một thời gian cho ñeán khi bò muõn ra. Khi thấy rong ñã bị phân hủy, chuaån bò 100 ml dung dòch alginate 1%, ñoå xuoáng khoaûng 30cm2 ñaát ñaõ uû rong Naâu, ñònh kyø 2 ngaøy moät laàn, tieán haønh lieân tuïc trong 02 thaùng. Sau ñoù laáy khoaûng 1 g ñaát ôû ñoä saâu töø 3 -5 cm cho vaøo 5ml nöôùc tieät truøng, troän ñeàu treân maùy troän maãu, ñeå oån ñònh roài laáy 10 µl huyeàn phuø noåi treân beà maët caáy trang vaøo 10 ml moâi tröôøng thaïch agar coù chöùa 1,5 % alginate natri nhö nguoàn cacbon cô baûn, uû ôû 37o C trong 02 ngaøy. 2.3.2. Sô ñoà boá trí thí nghieäm löïa choïn chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång hôïp algL cao Khuaån laïc vi sinh vaät sau khi phaân laäp Thu hoài dòch enzyme Nuoâi caáy vaø sinh khoái vi sinh vaät Phaân caét dung dòch alginate 1% Löïa choïn chuûng vi sinh thích hôïp - Nhieät ñoä: 370 C - pH = 7,0 – 7,5 - tyû leä E/S = 4/10
31 Sô ñoà 2.3.2: Boá trí thí nghieäm löïa choïn chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång hôïp algL cao Moâi tröôøng vaø ñieàu kieän nuoâi caáy − Thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy (moâi tröôøng I) Na-alginate : 0,5% Pepton : 0,1% Dòch chieát naám men: 0,5% CaCl2 : 0,5% pH : 7,0 -7,5 − Thaønh phaàn moâi tröôøng sinh khoái (moâi tröôøng II) Na-alginate : 0,5% Pepton : 0,5% Dòch chieát naám men : 0,1% NaCl : 0,5% KH2PO4 : 0,1% MgSO4 : 0,1% pH : 7,0 -7,5 Sau khi phaân laäp treân moâi tröôøng agar coù chöùa 1,5% alginate ôû 370 C trong 2 ngaøy, khuaån laïc cuûa caùc vi sinh vaät khaùc nhau coù khaû naêng phaân caét natri alginate seõ phaùt trieån treân beà maët cuûa thaïch. Duøng que caáy voâ khuaån laáy moät ít caùc khuaån laïc naøy hoøa vaøo 10ml nöôùc caát voâ truøng, roài pha loaõng ñeán 105 laàn, sau ñoù laáy 10µl caáy trang leân moâi tröôøng thaïch I, nuoâi caáy 2 ngaøy ôû 370 C trong tuû aám. Ñeán khi treân moâi tröôøng thaïch chæ coù nhöõng khuaån laïc ñaõ choïn phaùt trieån(coù theå coi laø thuaàn khieát) thì sinh khoái caùc chuûng vi sinh vaät naøy trong bình tam giaùc coù chöùa 10 ml moâi tröôøng loûng II (ñaõ löïa choïn) ôû nhieät ñoä
32 phoøng trong 2 ngaøy treân maùy laéc vôùi toác ñoä 250v/p, tieáp tuïc laáy 3ml dòch sinh khoái töø 10ml treân ñoå vaøo bình tam giaùc 500ml chöùa 100ml moâi tröôøng loûng II roài sinh khoái trong ñieàu kieän töông töï. Töø 100ml dòch sinh khoái treân laáy tieáp 90ml ñoå vaøo bình tam giaùc 1000ml chöùa 500ml moâi tröôøng loûng II vaø sinh khoái ôû nhieät ñoä phoøng, 370 C, treân maùy laéc 250v/p. Löu yù: − Que caáy voøng sau khi laáy khuaån laïc vi sinh vaät treân moâi tröôøng thaïch phaûi ñöôïc khöû truøng treân ngoïn ñeàn coàn tröôùc khi laáy tieáp moät khuaån laïc vi sinh vaät khaùc. − Ñoái vôùi caùc khuaån laïc vi sinh vaät khaùc nhau, tieán haønh nuoâi caáy vaø sinh khoái trong caùc hoäp loàng vaø bình tam giaùc khaùc nhau. Laøm laïnh dòch sinh khoái thu ñöôïc xuoáng 30 C, roài ly taâm vôùi toác ñoä 10.000v/p ôû nhieät ñoä 100 C trong 30’. Thuyû phaân dung dòch natri alginate baèng caùc dòch enzyme thu ñöôïc sau ly taâm ôû ñieàu kieän nhaát ñònh ñeå löïa choïn chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång enzyme cao. 2.3.3. Sô ñoà boá trí thí nghieäm kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa chuûng vi sinh vaät ñöôïc löïa choïn Chuûng vi sinh vaät ñaõ löïa choïn Pha loaõng baèng nöôùc voâ truøng Caáy leân moâi tröôøng thaïch I Kieåm tra khuaån laïc hoaëc soi döôùi kính hieån vi Pha loaõng baèng nöôùc voâ truøng
33 Sô ñoà 2.3.3: Boá trí thí nghieäm kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa chuûng vi sinh vaät ñaõ löïa choïn Duøng que caáy voøng laáy moät ít khuaån laïc cuûa vi sinh vaät ñaõ löïa choïn hoøa trong 1ml nöôùc caát tieät truøng, tieáp tuïc pha loaõng baèng caùch dùng pipet laáy 0,1 ml töø oáng nghieäm ban ñaàu ñoå sang oáng nghieäm coù chöùa 0,9ml nöôùc caát tieät truøng, tieáp tuïc pha loaõng baèng caùch laáy 0,1ml töø oáng nghieâm thöù 2 ñoå sang oáng nghieäm thöù 3 coù chöùa 0,9 ml nöôùc caát tieät truøng, tieán haønh töông töï cho ñeán oáng nghieäm thöù 5, ta thu ñöôïc dung dòch vi sinh vaät ñöôïc pha loaõng 105 laàn. Laáy 0,1 ml dung dòch vi sinh vaät töø oáng nghieäm thöù 5 caáy trang leân moâi tröôøng thaïch I trong hoäp loàng petri ñaõ chuaån bò tröôùc. Ñeå dung dòch vi sinh vaät ngaám vaøo moâi tröôøng trong vaøi phuùt. Laät ngöôïc hoäp loàng petri ñaõ caáy vi sinh vaät, nuoâi trong tuû aám ôû 370 C, trong thôøi gian 2 ngaøy. Sau 2 ngaøy nuoâi caáy kieåm tra caùc khuaån laïc moïc treân moâi tröôøng thaïch, neáu caùc khuaån laïc moïc rieâng leû coù hình daïng, maøu saéc gioáng nhau thì coù theå keát luaän chuûng vi sinh vaät laø thuaàn khieát, hoaëc coù theå kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa vi sinh vaät baèng caùch soi döôùi kính hieån vi hoaëc caáy trang. 2.3.4. Sô ñoà boá trí thí nghieäm thu dòch enzyme algL töø moâi tröôøng sinh khoái 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 1ml 0,9ml 0,9ml 0,9ml 0,9ml Sinh khoái Ly taâm 10000v/p, 30’ Dòch enzyme Vi sinh vaät thuaàn khieát
34 T heo taøi lieäu tham khaûo thì quaù trình thu dòch enzyme phaûi tieán haønh ôû nhieät ñoä laïnh 50 C. Tuy nhieân, do ñieàu kieän thí nghieäm neân dòch sinh khoái ñöôïc laøm laïnh xuoáng 30 C roài ly taâm ôû nhieät ñoä 100 C vôùi toác ñoä 10000 v/p trong 30 phuùt. 2.3.5. Sơ ñồ bố trí thí nghiệm thử nghiệm phaân caét caùc loại Natri alginate khaùc nhau bằng dung dịch enzyme thu ñược Alginate Thaùi Lan (A1) Alginate Tröôøng ÑH Nha Trang(A3) Alginate Trung Quoác(A2) Saûn phaåm sau phaân caét Phaân caét Nhieät ñoä: 370 C pH = 7,0 ÷ 7,5 Thôøi gian: 20’, 40’, 60’ 10 / 4 = S E Ño ñoä nhôùt Sô ñoà 2.3.4: Boá trí thí nghieäm thu dòch enzyme töø dòch sinh khoái
35 Sô ñoà 2.3.5: Thí nghieäm phaân caét caùc loaïi natri alginate khaùc nhau baèng dung dòch enzyme thu ñöôïc Caùc maãu natri alginate khaùc nhau ñöôïc maõ hoùa laø caùc maãu A1, A2, A3 vaø pha thaønh 100 ml dung dòch 1%, ñöïng trong bình tam giaùc 250 ml, theâm vaøo moãi bình 40 ml dung dòch enzyme vöøa thu ñöôïc, ñieàu chænh pH = 7,0 – 7,5 roài tieán haønh phaân caét ôû nhieät ñoä 370 C trong thôøi gian 20’, 40’, 60’. Ño ñoä nhôùt saûn phaåm thu ñöôïc ở 200 C. 2.3.6. Sô ñoà boá trí thí nghieäm xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme Sô ñoà 2.3.6: Boá trí thí nghieäm xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme Xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme baèng phöông phaùp ñoä nhôùt Nguyeân taéc: theo taøi lieäu nghieân cöùu cuûa caùc taùc giaû A. Nakagawa, T. Ozaki, K. Chubachi, T. Hosoyama thuoäc chuyeân ngaønh Sinh hoïc – Tröôøng Ñaïi hoïc Teikyo vaø Khoa sinh hoïc öùng duïng – Tröôøng Ñaïi hoïc Utsunomiya. Ñeå xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme algL coù 2 phöông phaùp, phöông phaùp ñoä nhôùt vaø 100ml dung dòch natri alginate 1% Phaân caét - Dung dòch enzyme 5 ÷ 40 ml - pH = 7,0 ÷ 7.5 - t0 = 37 0 C - thôøi gian: 20’ Saûn phaåm sau phaân caét Ño ñoä nhôùt Keát luaän
36 phöông phaùp so maøu vôùi axit uronic. Vôùi phöông phaùp ñoä nhôùt thì moät ñôn vò hoaït ñoä cuûa enzyme algL ñöôïc ñònh nghóa laø löôïng enzyme laøm giaûm 50% ñoä nhôùt cuûa dung dòch natri alginate 1% trong 20 phuùt. Phaân caét natri alginate vôùi 5 ÷ 40 ml ( böôùc nhaûy 5ml) dung dòch enzyme trong 20’, sau ñoù tieán haønh ñoä nhôùt vaø xaùc ñònh moät ñôn vị hoạt ñộ töông öùng vôùi bao nhieâu ml dung dòch enzyme. Tieán haønh: Chuaån bò 9 bình tam giaùc 250 ml coù chöùa 100 ml dung dòch natri alginate 1%, trong ñoù moät bình ñoái chöùng vaø 8 bình coøn laïi laàn löôït ñöôïc boå sung töø 5 ÷ 40 ml (böôùc nhaûy 5 ml) dung dòch enzyme, phaân caét ôû nhieät ñoä 370 C, treân maùy laéc toác ñoä 250 v/p trong 20 phuùt. Ño ñoä nhôùt cuûa dung dịch baèng nhôùt keá roto ở 200 C. 2.3.7. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät vaø khaû naêng phaân caét cuûa algL Khuaån laïc vi sinh vaät Sinh khoái 1 Sinh khoái 2 12h 24h 36h 48h 60h 72h Ly taâm Phaân caét alginate - pH = 7,0 – 7,5 - To = 370 C - 10 2 = S E thời gian = 20’
37 Sô ñoà 2.3.7. Boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán khaû naêng thuyû phaân alginate Duøng que caáy voøng voâ truøng laáy moät ít khuaån laïc vi sinh vaät treân moâi tröôøng thaïnh I roài sinh khoái laàn 1 trong bình tam giaùc 500ml coù chöùa 100 ml moâi tröôøng II trong 12h ôû nhieät ñoä phoøng treân maùy laéc toác ñoä 250 v/p. Chuaån bò 6 bình tam giaùc 500ml coù chöùa 100ml moâi tröôøng II coù ñaùnh soá thöù töï töø 1 ñeán 6 ñeå sinh khoái laàn 2 baèng caùch: laàn löôït laáy 10ml dung dòch sinh khoái laàn 1 ñaõ qua 12h sinh khoái cho vaøo laàn löôït 6 bình tam giaùc noùi treân, ñaët 6 bình tam giaùc leân maùy laéc toác ñoä 250 v/p, ôû nhieät ñoä phoøng vaø sinh khoái ôû caùc thôøi gian khaùc nhau. Bình tam giaùc 1 sinh khoái trong 12h, bình tam giaùc 2 sinh khoái trong 24h, laàn löôït cho caùc bình tam giaùc 3,4,5,6 sinh khoái vôùi thôøi gian laàn löôït laø 36h, 48h, 60h, 72h. Sau khi ñaït thôøi gian sinh khoái, tieán haønh ly taâm dòch sinh khoái vôùi toác ñoä 10.000 v/p ôû nhieät ñoä 100 C trong thôøi gian 30 phuùt. Dòch enzyme thu ñöôïc sau khi ly taâm ñöôïc duøng ñeå phaân caét dung dòch alginate 1%, töø ñoù xaùc ñònh ñöôïc söï aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy vi sinh vaät ñeán khaû naêng phaân caét alginate cuûa enzyme alginte lyase. Söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät ñöôïc xaùc ñònh baèng caùch ñeám teá baøo baèng phöông phaùp caáy gaït
38 2.3.8. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL Sô ñoà 2.3.8: AÛnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL Chuaån bò 12 bình tam giaùc 250 ml chöùa 100 dung dòch alginate 1%, trong ñoù moät bình ñoái chöùng chæ phaân caét vôùi 40ml dung dòch enzyme, 1 bình phaân caét vôùi 40ml dòch enzyme ñaõ ñöôïc xöû lyù vôùi 1mM EDTA, 5 bình tam giaùc phaân caét vôùi dòch enzyme ñaõ ñöôïc boå sung 2mM caùc muoái kim loaïi, 5 bình coøn laïi phaân caét baèêng enzyme ñaõ xöû lyù 1mM EDTA vaø 2mM caùc muoái kim loaïi. Caùc muoái kim loaïi ñöôïc söû duïng laø: CaCl2, MnCl2, MgCl2, CuCl2, FeCl2. Phaân caét trong thôøi gian 20 phuùt, sau ñoù ño ñoä nhôùt vaø xaùc ñònh ñöôïc aûnh höôûng cuûa caùc ion kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL. Dung dòch natri alginate 1% Phaân caét pH = 7,0 ÷ 7,5 to = 370 C Caùc muoái kim loaïi 10 4 = S E thời gian = 20’ Saûn phaåm sau phaân caét Ño ñoä nhôùt Keát luaän
39 2.3.9. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL Sô ñoà 2.3.9. Nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL Söï aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL ñöôïc thí nghieäm töø 10 ÷ 60o C, vôùi böôùc nhaûy laø 10. Dung dòch natri alginate 1% Phaân caét pH = 7,0 ÷ 7,5 to = 10 ÷ 60 0 C 10 4 = S E thời gian = 20’ Saûn phaåm sau phaân caét Ño ñoä nhôùt Keát luaän
40 2.3.10. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu choïn taùc nhaân keát tuûa thích hôïp ñeå thu hoài algL töø dòch enzyme Sô ñoà 2.3.10. Boá trí thí nghieäm ngieân cöùu choïn taùc nhaân keát tuûa thích hôïp ñeå taùch chieát AlgL Tieán haønh thí nghieäm thu hoài cheá phaåm enzyme thoâ töø dòch sinh khoái baèng muoái trung tính (NH4)2SO4 (theâm tröïc tieáp vaøo dòch enzyme cho tôùi khi baõo hoøa, thöôøng laø ñaït 70%, luoân giöõ dòch enzyme ôû nhieät ñoä 40 C). Coàn 600 vaø acetol ñöôïc theâm vaøo dòch enzyme vôùi tyû leä 1:1, giöõ ôû nhieät ñoä 40 C trong 12h. Sau ñoù ly taâm ñeå thu hoài cheá phaåm enzyme thoâ. Laøm laïnh (4 0 C) Keát tuûa 12h ôû 4 0 C Ly taâm 1000 v/p Dòch enzyme Enzyme thoâ - (NH4)2SO4 baõo hoøa - Dung moâi: Coàn 600 , acetol -pH = 7,0 – 7,5 - T0 = 4 0 C - Tyû leä = 1:1 Phaân caét Na-alg 1% Choïn dung moâi thích hôïp - E/S = 0,5g/100ml - T0 = 370 C - pH = 7,0 – 7,5 - thời gian = 20’
41 CHÖÔNG 3 KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU VAØ THAÛO LUAÄN 3.1. Keát quaû nghieân cöùu phaân laäp chuûng vi sinh vaät trong töï nhieân coù khaû naêng sinh toång hôïp enzyme algL Nhaän xeùt: Sau 2 ngaøy nuoâi caáy ôû nhieät ñoä 370 C, treân cuøng moät moâi tröôøng thaïch chæ coù natri alginate1,5% laø nguoàn cacbon cô baûn thaáy coù 2 loaïi khuaån laïc phaùt trieån, moät coù maøu traéng söõa vaø moät coù maøu môõ gaø. Tieáp tuïc phaân laäp 2 loaïi vi sinh vaät naøy ôû noàng ñoä pha loaõng 10-5 treân moâi tröôøng thaïch, khuaån laïc cuûa 2 loaïi naøy phaùt trieån nhö hình 3.1a vaø 3.1b. Döïa vaøo hình 3.1a vaø 3.1b thaáy raèng treân moâi tröôøng thaïch, khuaån laïc cuûa 2 chuûng vi sinh vaät naøy ñeàu coù hình troøn, phaùt trieån rieâng leû tuy nhieân khuaån laïc maøu traéng söõa coù ñöôøng kính (1÷2mm) lôùn hôn so vôùi khuaån laïc maøu môõ gaø (1mm), khuaån laïc maøu traéng söõa cuõng phaùt trieån vôùi maät ñoä daøy hôn so vôùi khuaån laïc maøu môõ gaø. Töø keát quaû nghieân cöùu coù theå keát luaän raèng caû hai chuûng vi sinh vaät naøy ñeàu coù khaû naêng sinh toång hôïp enzyme alginate lyase. Tuy nhieân, khoâng Hinh 3.1a: VSV coù khuaån laïc maøu traéng söõa (C1) Hinh 3.1b: VSV coù khuaån laïc maøu môõ gaø (C2)
42 theå keát luaän raèng chuûng naøo coù khaû naêng sinh toång hôïp enzyme alginate coù hoaït löïc cao hôn. 3.2. Kết quả thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật coù khả năng sinh algL cao C1: Alginate lyase thu ñöôïc töø vi sinh vaät coù khuaån laïc maøu traéng söõa C2: Alginate lyase thu ñöôïc töø vi sinh vaät coù khuaån laïc maøu môõ gaø Kết quả số liệu thể hiện mức ñộ hao tổn ñộ nhớt của dung dịch Na-alginate 1% ñược trình bày ở bảng 3.2 thuộc phụ lục 1. Nhaän xeùt Khi phaân caét dung dòch Na-alginate 1% baèng dòch enzyme alginate lyase thu ñöôïc töø hai chuûng vi sinh vaät ñaõ phaân laäp trong cuøng moät ñieàu kieän thì enzyme thu ñöôïc töø hai chuûng naøy ñeàu laøm cho ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate giaûm ñi ñaùng keå, trong 20 phuùt ñaàu phaân caét ñoä nhôùt cuûa Na-alginate1% giaûm maïnh hôn 50%, khi thôøi gian phaân caét keùo daøi thì ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate tieáp tuïc giaûm nhöng giaûm khoâng maïnh nhö ban ñaàu. Thôøi gian (phuùt) Ñoà thò 3.2. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% theo thôøi gian phaân caét Ñoä nhôù t hao toå n (%) 0.0 0.0 79.9 75.4 65.7 71.3 67.9 57.5 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 0 20 40 60 C1 C2 Thôøi gian (phuùt)
43 Keát quaû thí nghieäm cuõng cho thaáy raèng dòch enzyme C1 coù hoaït löïc maïnh hôn so vôùi dòch enzyme C2, baèng chöùng laø trong cuøng moät ñieàu kieän phaân caét nhöng dòch enzyme C1 laøm giaûm ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% maïnh hôn so vôùi C2. Ñieàu naøy cuõng deã hieåu bôûi vì coù theå nhieàu vi sinh vaät cuøng sinh toång hôïp moät enzyme, song khoâng phaûi chuùng ñeàu coù khaû naêng sinh toång hôïp enzyme coù hoaït löïc nhö nhau, ngay caû treân caû nhöõng chuûng cuøng gioáng, cuøng loaøi. Hôn nöõa, ñaëc ñieåm vaø tính chaát sinh lyù, sinh hoùa cuûa töøng chuûng vi sinh vaät coù yù nghóa quyeát ñònh quaù trình sinh toång hôïp enzyme cuõng nhö hoaït löïc cuûa enzyme. [3][4][5] Keát luaän: Töø hai chuûng vi sinh vaät ñaõ phaân laäp ñöôïc, choïn chuûng vi sinh vaät coù khuaån laïc maøu traéng söõa ñeå tieáp tuïc nuoâi caáy vaø thu nhaän enzyme alginate lyase.
44 3.3. Keát quaû thí nghieäm kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa vi sinh vaät ñaõ choïn Nhaän xeùt: Treân moâi tröôøng thaïch I, khuaån laïc cuûa vi khuaån maøu traéng söõa phaùt trieån rieâng bieät vaø coù hình daïng gioáng nhau, coøn khi soi döôùi vaät kính daàu 100x ta thaáy teá baøo vi sinh vaät naøy coù hình que, daøi töø 2÷4 µm, roäng töø 0,5÷1 µm, bắt màu hồng nên ñây là vi sinh vật gram âm. Ta cuõng thaáy ñöôïc raèng khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng thaïch I vôùi ñaày ñuû caùc chaát dinh döôõng thì khuaån laïc Hình 3.3a. Khuaån laïc vi sinh vaät maøu traéng söõa treân moâi tröôøng thaïch I Hình 3.3b. Khuaån laïc vi sinh vaät maøu traéng söõa treân moâi tröôøng thaïch chæ coù Na-alginate 1,5% vaø soi döôùi kính hieån vi vaät kính 100x
45 cuûa vi sinh vaät naøy phaùt trieån maïnh hôn, maät ñoä daøy hôn vaø kích thöôùc cuûa caùc khuaån laïc ñoàng ñeàu hôn so vôùi moâi tröôøng thaïch chæ coù Na-alginate 1%. Keát luaän: Döïa vaøo caùc taøi lieäu nghieân cöùu veà vi sinh vaät [2][6][8] coù theå keát luaän chuûng vi sinh vaät ñaõ thuaàn khieát. 3.4. Keát quaû thí nghieäm phaân caét caùc loaïi natri alginate baèng dung dòch enzyme thu ñöôïc 1 2 3 0 ,0 ,0 ,0 20 5,7 4,0 2,8 40 5,3 2,1 1,0 60 8,2 8,5 6,9 Na-alginate Thôøi gian (phuùt) Ñoà thò 3.4. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa caùc dd Na-alginate 1% khaùc nhau theo thôøi gian phaân caét Thôøi gian (phuùt) Ñoä nhôù t hao toå n (%) Baûng 3.4. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa caùc dung dòch Na-alginate khaùc nhau 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 0 20 40 60 A1 A2 A3
46 A1: Dung dòch Na-alginate do Thaùi Lan saûn xuaát A2: Dung dòch Na-alginate do Trung Quoác saûn xuaát A3: Dung dòch Na-alginate do Tröôøng ÑH Nha Trang saûn xuaát Keát quaû soá lieäu theå hieän möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa caùc dd Na- alginate khaùc nhau ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.4 vaø phuï luïc 1. Nhaän xeùt: Töø keát quaû thí nghieäm, cho thaáy raèng khi phaân caét baèng enzyme algL thì caùc loaïi Na-alginate khaùc nhau bò phaân caét ôû caùc möùc ñoä khaùc nhau, ta cuõng nhaän thaáy raèng trong khoaûng thôøi gian ñaàu thì khi phaân caét ôû cuøng moät ñieàu kieän, loaïi Na-alginate coù ñoä nhôùt cao hôn thì möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuõng lôùn hôn . Cuï theå laø, dung dòch A1 coù ñoä nhôùt ban ñaàu laø 34,6 mPa.s, cao hôn so vôùi A2 (17,2) vaø A3 (26,8) thì trong 20 phuùt ñaàu phaân caét ñoä nhôùt cuûa A1 bò hao toån tôùi 67,6% trong khi ñoù A2 hao toån 52,3% coøn A3 laø 62,6%, thôøi gian phaân caét keùo daøi thì söï hao toån cuûa ba loaïi Na-alginate naøy laø gaàn nhö nhau. Thaûo luaän Enzyme algL tham gia caét ñöùt lieân keát 1-4 glucozit giöõa α – L – guluronate vaø axit β – D – manuronate cuûa ñaïi phaân töû alginate, maø soá löôïng lieân keát 1-4 glucozit phuï thuoäc vaøo troïng löôïng phaân töû cuûa alginate, hay noùi caùch khaùc phuï thuoäc vaøo ñoä nhôùt cuûa dung dòch alginate. n
47 Trong thôøi gian ñaàu, do A1 coù ñoä nhôùt lôùn neân soá löôïng lieân keát 1-4 glucozit bò phaân caét bôùi algL laø nhieàu hôn so vôùi A2 vaø A3 neân ñoä nhôùt cuûa A1 bò hao toån nhieàu hôn. Khi keùo daøi thôøi gian phaân caét thì caùc oligo alginate naøy tieáp tuïc bò caét ngaén maïch, ñoä nhôùt cuûa caùc dung dòch Na-alginate tieáp tuïc bò hao toån. Thôøi gian phaân caét keùo dài thì caùc oligo alginate trong caùc dung dòch Na-alginate naøy coù troïng löôïng gaàn töông ñöông nhau, nhöng do A1 coù noàng ñoä caùc oligo alginate lôùn hôn so vôùi A2 vaø A3 neân duø möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa A1 laø lôùn hôn nhöng ñoä nhôùt cuûa dung dòch A1 vaãn cao hôn so vôùi A2, A3. 3.5 Keát quaû ñònh danh vi sinh vaät Maãu vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc göûi ñònh danh taïi Coâng ty TNHH Nam Khoa – Thaønh phoá Hoà Chí Minh. Keát quaû ñònh danh nhö sau: 3.5.1. Keát quaû phaân laäp chuûng vi sinh vaät treân caùc moâi tröôøng phaân laäp khaùc nhau Thaïch maùu UriSelect 4 Agar Mac Conkey Agar Hektoen enteric agar Hình 3.5.1. Khuaån laïc vi sinh vaät phaân laäp treân caùc moâi tröôøng khaùc nhau
48 Nhaän xeùt: Khi nuoâi caáy chuûng vi sinh vaät ñaõ phaân laäp ñöôïc treân caùc moâi tröôøng khaùc nhau, quan saùt thaáy raèng khuaån laïc phaùt trieån treân caùc moâi tröôøng khaùc nhau ñeàu coù hình daïng troøn ñoàng nhaát, maøu saéc gioáng nhau vaø ñaëc tröng cho moãi moâi tröôøng. Keát luaän: Chuûng vi sinh vaät ñaõ thuaàn khieát. 3.5.2. Keát quaû nhuoäm Gram vaø sinh hoùa ñònh danh baèng heä thoáng IDS14GNR Hình 3.5.2. Hình aûnh teá baøo vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc Quan saùt keát quaû nhuoäm gram cuûa coâng ty Nam Khoa ta thaáy truøng vôùi keát quaû nghieân cöùu ban ñaàu. Chuûng vi sinh vaät phaân laäp coù daïng hình que vaø coù gram aâm. Thöû nghieäm Keát quaû Thöû nghieäm Keát quaû Oxidase - Indol - Urease + Di ñoäng - H2S - NO3 →NO2 + LCD + Citrate +
49 Glucose + VP + PAD - ONPG + Esculin + Malonate + 3.5.3. Keát quaû giaûi trình töï gene 16S treân maùy CEQ 8000 vaø tra cöùu treân BLAST SEARCH Baûng 3.5.2. Keát quaû thöû nghieäm sinh hoùa ñònh danh
50 Hình 3.5.3. Sô ñoà giaûi trình töï gene 16S cuûa chuûng vi sinh vaät phaân laäp Keát luaän: Chuûng vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc laø chuûng Klebsiella sp Klebsiella sp laø vi khuaån gram aâm, khoâng di ñoäng, teá baøo coù hình que, coù khaû naêng thuûy phaân lieân keát glucozit trong esculin taïo esuletin vaø glucose, coù theå söû duïng Malonat laøm nguoàn dinh döôõng cacbon, coù khaû naêng sinh toång hôïp Urease, chuyeån hoùa nitrate thaønh nitrite, leân men glucose, lactose. Chuûng
51 0.0 0.0 24.6 44.8 57.5 63.8 67.5 72.8 71.6 69.4 2.2 5.2 9.0 13.8 18.7 21.6 24.6 27.2 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Na-alg +dịch E Na-alg +nước cất Klebsiella sp khoâng coù khaû naêng sinh indol, khoâng sinh enzyme oxydase, khoâng khöû H2s. 3.6. Keát quaû thí nghieäm xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme Nhö phaàn boá trí thí nghieäm ñaõ trình baøy, trong phöông phaùp ñoä nhôùt thì moät ñôn vò hoaït ñoä enzyme lyase laø löôïng enzyme caàn thieát ñeå laøm ñoä nhôùt cuûa natri alginate 1% giaûm 50% trong 20 phuùt. Töùc laø döïa vaøo löôïng cô chaát bò maát ñi trong thôøi gian nhaát ñònh öùng vôùi noàng ñoä enzyme xaùc ñònh.[3][22] Keát quaû soá lieäu theå hieän söï hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% theo noàng ñoä enzyme ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.6 – phuï luïc 1. Nhaän xeùt: Töø keát quaû thu ñöôïc ta cuõng coù theå thaáy ñöôïc aûnh höôûng cuûa noàng ñoä Enzyme ñeán möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate. Ta thaáy raèng ban ñaàu khi noàng ñoä enzyme algL taêng thì ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate S E (/ 100ml S) Ñoä nhôù t hao toå n (%) Ñoà thò 3.6a. Möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% theo noàng ñoä Enzyme
52 0.0 57.5 56.0 53.7 50.7 47.0 44.8 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 0 10 11 12 13 14 15 Na-alg+dịch E 1% hao huït ñaùng keå, tuy nhieân khi 100 25 = S E trôû leân thì möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% giaûm daàn. Moät ñieàu deã nhaän thaáy nöõa treân ñoà thò 3.7 laø ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na- alginate 1% bò hao huït 44,8% vaø 57,5% khi phaân caét laàn löôït vôùi 10 vaø 15 ml enzyme algL. Vaäy ñeå xaùc ñònh ñôn vò hoaït ñoä cuûa enzyme algL ta phaûi tieán haønh phaân caét Na-alginate 1% vôùi löôïng algL töø 10 ÷15 ml. Ñoà thò 3.6b cho thaáy raêng ñoä nhôùt cuûa Na-alginate 1% bò hao huït ñi 50% khi phaân caét vôùi 12ml dòch enzyme algL. Ñieàu naøy coù nghóa raèng moät ñôn vò hoaït ñoä cuûa Enzyme algL töông öùng vôùi 12 ml dòch enzyme, hay noùi caùch khaùc trong 20 phuùt 12ml dòch enzyme laøm giaûm 50% ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1%. S E (/ 100ml S) Ñoä nhôù t hao toå n (%) Ñoà thò 3.6b. Möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% theo noàng ñoä Enzyme
53 3.7. Keát quaû thí nghieäm aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät vaø khaû naêng phaân caét cuûa algL do vi sinh vaät sinh ra Nhaän xeùt vaø thaûo luaän: Trong 12h nuoâi caáy ñaàu, vi khuaån baét ñaàu thích nghi vôùi moâi tröôøng vaø tieát enzyme ra moâi tröôøng ñeå söû duïng nguoàn dinh döôõng saún coù trong moâi tröôøng. Trong thôøi gian naøy soá löôïng teá baøo chöa taêng maïnh vì chuû yeáu chuùng söû duïng chaát dinh döôõng ñeå phaùt trieån veà kích thöôùc chöù chöa sinh saûn. Löôïng enzyme algL trong 12h ñaàu ñöôïc tieát ra moâi tröôøng cuõng coù hoaït löïc khaù maïnh, trong 20 phuùt phaân caét noù laøm ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na- alginate 1% hao huït 61,9%. Khi thôøi gian nuoâi caáy laø 24h, luùc naøy söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät ñang ôû giai ñoaïn phaùt trieån maïnh, soá teá baøo cuûa chuùng taêng nhanh töø 14.10-5 teá baøo/1ml taêng leân 52.105 teá baøo/1ml. Löôïng enzyme algL cuõng ñöôïc tieát ra nhieàu hôn, khaû naêng phaân caét alginate cuõng taêng leân, tieáp tuïc nuoâi caáy ñeán Soá teá baø o /ml (.10 5 ) Ñoä nhôù t hao toå n (%) 0 14 52 40 24 12 27 0.0 59.7 47.4 47.4 49.3 63.8 61.9 0 10 20 30 40 50 60 0 12 24 36 48 60 72 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 Sinh trưởng Độ nhớt Ñoà thò 3.7. Aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån cuûa Klebsiella sp vaø hoaït ñoä enzyme algL
54 36h, thôøi gian naøy dinh döôõng trong moâi tröôøng nuoâi caáy ñaõ daàn caïn kieät neân teá baøo vi sinh vaät baét ñaàu cheát, khaû naêng phaân caét cuûa enzyem algL baét ñaàu giaûm, tuy nhieân möùc ñoä giaûm laø khoâng nhieàu. Tieáp tuïc keùo daøi thôøi gian nuoâi caáy, luùc naøy chaát dinh döôõng ñaõ caïn kieät, caùc saûn phaåm cuûa quaù trình baøi tieát ñaõ tích tuï nhieàu neân laøm teá baøo vi sinh vaät cheát ñi, hoaëc chuyeån sang daïng baøo töû, caùc saûn phaåm baøi tieát cuõng laøm cho pH cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy taêng leân ñaây chính laø nguyeân nhaân laøm bieán tính vaø giaûm hoaït löïc cuûa enzyme algL, neân khi thu hoài dòch enzyme algL thì khaû naêng phaân caét cuûa noù ñaõ giaûm ñi nhieàu.[2][5] Theo ñoà thò 3.7, thaáy raèng khaû naêng phaân caét cuûa algL toát nhaát trong khoaûng 24h – 36h, enzyme algL ñöôïc tieát ra trong thôøi gian naøy cuõng coù hoaït löïc toát. Töø keát quaû thu ñöôïc ta choïn thôøi gian nuoâi caáy caáy chuûng Klebsiella sp ôû 370 C trong thôøi gian 24h. 3.8. Keát quaû thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc ion kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL 72.8 16.4 81.0 75.4 54.9 66.4 31.3 39.6 45.9 67.9 76.9 83.6 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 DC EDTA CaCl2 MnCl2 MgCl2 CuCl2 FeCl2 EnZyme + Ion kim loại EnZyme + EDTA + Ion kim loại Ñoä nhôù t hao toå n (%) Ñoà thò 3.8. AÛnh höôûng caùc ion kim loaïi ñeán hoaït löïc cuûa enzyme algL
55 Nhaän xeùt: Töø keát quaû nghieân cöùu cho thaáy EDTA coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán khaû naêng hoaït ñoäng cuûa enzyme algL, khi xöû lyù dòch enzyme algL vôùi 1mM EDTA thì möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% chæ laø 16,4%. Tuy nhieân, khi tieáp tuïc theâm 2mM muoái CaCl2 thì hoaït löïc cuûa enzyme algL laïi ñöôïc phuïc hoài trôû laïi, thaäm trí maïnh hôn so vôùi ban ñaàu, baèng chöùng laø khi xöû lyù tieáp vôùi CaCl2 thì möùc ñoä hao toån ñeán 83,6%, taêng 13% so vôùi maãu ñoái chöùng. Vôùi caùc muoái kim loaïi nghieân cöùu, chæ coù Ca2+ laøm taêng hoaït löïc cuûa algL coøn haàu heát caùc ion kim loaïi coøn laïi ñeàu ít nhieàu laøm giaûm khaû naêng hoaït ñoäng cuûa enzyme algL, trong ñoù Mn2+ aûnh höôûng ít nhaát ñeán hoaït ñoäng cuûa algL. Khi xöû lyù keát hôïp giöõa EDTA vaø caùc muoái kim loaïi, nhaän thaáy raèng söï kìm haûm cuûa caùc muoái ñoái vôùi enzyme algL giaûm daàn. EDTA laø moät amino axit coù khaû naêng coâ laäp caùc ion kim loaïi hoùa trò II, III, vì vaäy khi xöû lyù dòch enzyme algL vôùi EDTA coù theå EDTA keát hôïp vôùi moät ion kim loaïi hoùa trò II trong trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme algL neân laøm cho enzyme giaûm khaû naêng hoaït ñoäng, khi theâm ion CaCl2 vaøo dòch enzyme thì Ca2+ keát hôïp vôùi EDTA vaø giaûi phoùng cho ion kim loaïi trong trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme algL, ñoàng thôøi Ca2+ coøn coù taùc duïng hoaït hoùa hoaït ñoäng cuûa enzyme algL, laøm taêng möùc ñoä lieân keát giöõa enzyme algL vaø Na-alginate neân laøm cho ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate bò hoån maïnh hôn so vôùi ban ñaàu.
56 Cô cheá söï kìm haõm hoaït ñoäng algL cuûa caùc ion kim loaïi nhö Mg2+ , Cu2+ , Fe2+ trong ñeà taøi naøy chöa coù ñieàu kieän nghieân cöùu cuï theå, nhöng coù theå giaû thuyeát raèng caùc ion kim loaïi naøy laøm thay ñoåi caáu truùc trung taâm hoaït ñoäng cuûa algL theo chieàu höôùng khoâng coù lôïi, neân laøm giaûm khaû naêng lieân keát giöõa algL vaø natri alginate. Khi coù maët EDTA, EDTA seõ moät phaàn taïo phöùc vôùi caùc ion kim loaïi hoùa trò II naøy vaø giaûi phoøng cho trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme algL, giuùp cho enzyme hoaït ñoäng trôû laïi. Coù theå loaïi boû tröôøng hôïp caùc ion kìm haõm naøy laø caùc chaát kìm haõm caïnh tranh vì caáu truùc cuûa caùc muoái naøy khoâng gioáng vôùi natri alginate, hôn nöõa noàng ñoä cuûa caùc muoái naøy nhoû hôn nhieàu so vôùi noàng ñoä natri algiante. Keát luaän : Ñeå taêng khaû naêng hoaït ñoäng cuûa algL, neân xöû lyù algL baèng 1mM EDTA vaø tieáp sau ñoù boå sung theâm 2mM CaCl2 hoaëc MnCl2. Caàn loaïi boû söï coù maët cuûa caùc muoái MgCl2, CuCl2, FeCl2 trong moâi tröôøng hoaït ñoäng cuûa algL vì chuùng laøm giaûm ñaùng keå khaû naêng hoaït ñoäng cuûa algL. 3.9. Keát quaû nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL Ñoà thò 3.9. Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa enzyme algL Độ nhớt 0 32.1 53.7 67.9 75 69 52.2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 ĐC 10 20 30 40 50 60 Nhiệt ñộ Độ nhớt hao tổn (%) Độ nhớt
57 Nhaän xeùt Khi phaân caét ôû nhieät ñoä thaáp 10o C thì möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa Na- alginate thaáp (32,1%), tuy nhieân khi nhieät ñoä theâm 100 C thì möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa Na-alginate baét ñaàu taêng maïnh vaø khi phaân caét ôû nhieät ñoä 400 C, trong 20’ ñoä nhôùt cuûa Na-alginate bò hao toån 75%. Döïa vaøo ñoà thò 3.9 ta thaáy raèng enzyme algL hoaït ñoäng toát trong khoaûng nhieät ñoä töø 35 ÷ 450 C, trong khoaûng nhieät ñoä lôùn hôn 500 C, hoaït ñoäng cuûa enzyme algL bò giaûm maïnh, neáu tieáp tuïc taêng nhieät ñoä thì enzyme algL seõ bò ñình chæ hoaït ñoäng. Thaûo luaän Nhö ñaõ bieát, theo quy luaät cuûa phaûn öùng do enzyme xuùc taùc, thoâng thöôøng vaän toác cuûa phaûn öùng caøng taêng khi nhieät ñoä taêng, tuy nhieân do enzyme coù baûn chaát protein neân khi taêng nhieät ñoä ñeán moät giôùi haïn naøo ñoù thì vaän toác phaûn öùng seõ bò giaûm do enzyme bò bieán tính. Trong khoaûng nhieät ñoä maø enzyme chöa bò bieán tính thì heä soá nhieät ñoä cuûa ña soá enzyme khoaûng 1,4 – 2. Coù nghóa laø khi taêng nhieät ñoä leân 100 C thì toác ñoä phaûn öùng taêng leân töø 1,4 – 2 laàn. Khi baét ñaàu coù söï bieán tính protein thì xaõy ra hai heän töôïng: moät maët toác ñoä phaûn öùng vaãn taêng theo söï taêng nhieät ñoä, maët khaùc vaän toác bieán tính enzyme xaûy ra nhanh hôn. Keát quaû laø toác ñoä phaûn öùng giaûm daàn vaø bò ñình chæ hoaøn toaøn.[3][7] Trong khoaûng nhieät ñoä töø 10 – 20 0 C, hoaït ñoäng cuûa algL yeáu, nhöng luùc naøy protein chöa bò bieán tính neân khi taêng nhieät ñoä leân trong khoaûng töø 30 – 40 0 C thì hoaït ñoäng cuûa algL ñöôïc phuïc hoài trôû laïi, ñaây cuõng chính laø lí do laøm cho ñoä nhôùt cuûa dung dòch natri alginate hao toån maïnh so vôùi maãu ban
58 ñaàu. Nhöng khi nhieät ñoä phaân caét tieáp tuïc taêng leân 50 – 60 0 C thì söï bieán tính enzyme baét ñaàu xaûy ra neân laøm giaûm khaû naêng phaân caét Na-alginate, baèng chöùng laø khi phaân caét ôû nhieät ñoä naøy möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa Na-alginate 1% chæ laø khoaûng 50%. Keát luaän: Maëc duø khi phaân caét ôû 400 C thì hoaït ñoäng cuûa enzyme algL laø maïnh nhaát, nhöng cuõng cao hôn khoâng ñaùng keå khi phaân caét ôû nhieät ñoä 370 C. Do ñoù, ta neân choïn phaân caét ôû nhieät ñoä 370 C vì coù theå tieát kieäm ñöôïc veà maët kinh teá. 3.10. Keát quaû thí nghieäm choïn taùc nhaân keát tuûa thích hôïp ñeå taùch chieát algL töø dòch enzyme Taùc nhaân keát tuûa ÑC (NH4)2SO4 Axetol Coàn 600 Ñoä nhôùt (mPa.s) 26,8 2,3 4,6 5,4 Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt (%) 0 91,4 82,8 79,9 Löôïng E thu ñöôïc (g/500ml) 0 1,04 1,12 1,36 Nhaän xeùt Khi keát tuûa enzyme algL baèng coàn 600 C thì löôïng enzyme keát tuûa thu ñöôïc lôùn hôn so vôùi Axetol vaø muoái Amoni sunphat, tuy nhieân hoaït ñoä cuûa cheá phaåm enzyme algL thoâ thu ñöôïc khi keát tuûa baèng muoái (NH4)2SO4 laïi maïnh nhaát, baèng chöùng laø khi phaân caét 100ml dung dòch Na-alginate 1% baèng 0,5g cheá phaåm enzyme thoâ trong 20’ thì ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% bò giaûm ñeán 91,4%. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích nhö sau: Coù theå caùc dung moâi naøy gaây voâ hoaït algL neân laøm giaûm khaû naêng hoaït ñoäng cuûa algL hôn nöõa chuùng coøn keát tuûa nhöõng Pr taïp khoâng phaûi laø algL neân khoái löôïng Pr thu ñöôïc lôùn hôn so Bảng 3.10. Ảnh höôûng cuûa taùc nhaân keát tuûa ñeán khoái löôïng protein thu hoài vaø hoaït ñoäng cuûa algL
59 vôùi keát tuûa baèng muoái. Trong khi ñoù muoái trung tính ôû noàng ñoä baûo hoøa thì coù theå keát tuûa ñöôïc toái ña löôïng algL trong dòch enzyme vaø muoái trung tính ít gaây giaûm hoaït löïc cuûa algL hôn so vôùi dung moâi neân duø löôïng Enzyme thu ñöôïc thaáp nhöng cheá phaåm naøy phaàn lôùn laø algL. Keát luaän: Duøng muoái trung tính Amoni sunphat ôû noàng ñoä baûo hoøa ñeå taùch chieát enzyme algL ra khoûi dòch sinh khoái. Quaù trình keát tuûa tieán haønh ôû nhieät ñoä laïnh 40 C trong 12h.
60 3.11. Ñeà xuaát quy trình thu hoài cheá phaåm enzyme algL töø vi khuaån Klebsiella sp Sô ñoà 3.11. Quy trình thu hoài cheá phaåm enzyme algL thoâ töø dòch sinh khoái vi khuaån Klebsiella sp Sinh khoái Gioáng vi sinh vaät Laøm laïnh Ly taâm 1 Dòch enzyme Keát tuûa baèng (NH4)2SO4 Ly taâm 2 Cheá phaåm enzyme thoâ Saáy khoâ Nghieàn mòn Baûo quaûn Xaùc ñònh hoaït ñoä Xaùc ñònh hoaït ñoä
61 Giaûi thích quy trình 1. Sinh khoái Tröôùc khi sinh khoái, chuûng Klebsiella sp ñöôïc nuoâi caáy treân moâi tröôøng thaïch I, nuoâi ôû 370 C trong 2 ngaøy. Khuaån laïc cuûa Klebsiella sp seõ phaùt trieån treân moâi tröôøng thaïch I, duøng que caáy voâ khuaån laáy moät ít khuaån laïc vi sinh vaät treân moâi tröôøng thaïch I, hoøa ñeàu vaøo 10ml moâi tröôøng dinh döôõng (II) chöùa trong bình tam giaùc 100ml, sinh khoái 2 ngaøy ôû nhieät ñoä 370 C treân maùy laéc 250v/p, tieáp tuïc laáy 3ml töø 10ml dòch sinh khoái naøy ñoå vaøo 100 ml moâi tröôøng dinh döôõng ñöïng trong bình tam giaùc 250 ml roài sinh khoái ôû ñieàu kieän töôïng töï, tieáp tuïc laáy 9ml töø 100 ml dòch sinh khoái ñoå vaøo 500ml moâi tröôøng dinh döôõng chöùa trong bình tam giaùc 1000ml vaø sinh khoái ôû ñieàu kieän töông töï. 2. Ly taâm 1 Dòch sinh khoái ñöôïc laøm laïnh vaø ly taâm ôû 40 C, thôøi gian 30’ vôùi toác ñoä 10.000 v/p 3. Keát tuûa baèng (NH4)2SO4 Dòch enzyme ñöôïc laøm laïnh xuoáng 4o C, theâm tröïc tieáp muoái (NH4)SO4 daïng boät vaøo dòch enzyme cho ñeán khi baõo hoøa, trong quaù trình keát tuûa phaûi luoân duy trì nhieät ñoä cuûa dòch enzyme ôû 40 C. Sau ñoù, dòch enzyme ñöôïc giöõ ôû nhieät ñoä 40 C trong 12h tröôùc khi ly taâm ñeå taùch cheá phaåm enzyme algL thoâ. 4. Ly taâm 2 Ly taâm ôû toác ñoä 12.000 v/p, nhieät ñoä 4o C, thôøi gian 30 phuùt ñeå taùch keát tuûa 5. Xaùc ñònh hoaït ñoä
62 Khi thu ñöôïc cheá phaåm algL thoâ, tieán haønh xaùc ñònh hoaït ñoä cuûa algL theo phöông phaùp ñoä nhôùt. 6. Saáy khoâ Sau khi xaùc ñònh ñöôïc hoaït ñoä enzyme, cheá phaåm enzyem algL ñöôïc saáy khoâ sau ñoù nghieàn mòn, roài baûo quaûn. Caàn löu yù raèng, algL bò giaûm hoat löïc ôû 500 C trôû leân, neân khi saáy cheá phaåm algL caàn saáy ôû nhieät ñoä thaáp, coù theå saáy laïnh ôû nhieät ñoä 30 – 350 C. Sau khi saáy khoâ, algL caàn ñöôïc xaùc ñònh laïi hoaït ñoä ñeå xaùc ñònh aûnh höôûng cuûa cheá ñoä saáy ñeán hoaït ñoä cuûa algL, cheá phaåm enzyme algL khoâ ñöôïc nghieàn mòn roài baûo quaûn.
63 CHÖÔNG 4 KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ XUAÁT YÙ KIEÁN 4.1. Keát luaän Töø nhöõng keát quaû nghieân cöùu ta coù theå keát luaän moät soá vaán ñeà sau: 1. Ñaõ phaân laäp ñöôïc chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång hôïp enzyme algL treân moâi tröôøng thaïch coù chöùa 0,5% Na-alginate; 0,5% NaCl; 0,1% pepton vaø 0,5% dòch chieát naám men. 2. Ñaõ thu ñöôïc cheá phaåm enzyme algL thoâ töø moâi tröôøng sinh khoái vi sinh vaät. Moâi tröôøng sinh khoái vi sinh vaät nhö sau: - Thaønh phaàn moâi tröôøng sinh khoái (moâi tröôøng II) Na-alginate : 0,5% Pepton : 0,5% Dòch chieát naám men : 0,1% NaCl : 0,5% KH2PO4 : 0,1% MgSO4 : 0,1% pH : 7,0 -7,5 3. Ñaõ xaùc ñònh ñöôïc 1 ñôn vò hoaït ñoä enzyme algL theo phöông phaùp ñoä nhôùt laø 12ml/20’ (coù nghóa laø vôùi 12ml dung dòch enzyme algL laøm cho ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% giaûm xuoáng 50% trong 20 phuùt). 4. Ñaõ xaùc ñònh ñöôïc thôøi gian sinh khoái thích hôïp cho chuûng vi sinh vaät sinh toång hôïp algL laø 24h. Khi sinh khoái trong voøng 24h thì söï phaùt trieån cuûa
64 vi sinh vaät naøy maïnh, ñoàng thôøi algL do chuùng sinh toång hôïp cuõng coù hoaït löïc cao. 5. Ñaõ ñònh danh ñöôïc chuûng vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc laø Klebsiella sp. Ñaây laø tröïc khuaån gram aâm, khoâng di ñoäng, coù khaû naêng leân men, glucoza vaø lactoza, teá baøo coù hình que, khuaån laïc coù hình troøn maøu traéng söõa treân moâi tröôøng phaân laäp I. 6. Ñaõ nghieân cöùu ñöôïc söï aûnh höôûng cuûa ion kim loaïi ñeán hoaït ñoäng cuûa AlgL. 7. Khoaûng nhieät ñoä toái thích cho hoaït ñoäng cuûa algL laø töø 30 – 40 0 C, coøn ôû nhieät ñoä töø 10 – 30 0 C hoaït ñoäng cuûa algL bò kìm haõm tuy nhieân khi naâng nhieät thì hoaït ñoäng cuûa algL ñöôïc phuïc hoài trôû laïi, khi nhieät ñoä taêng leân treân 500 C algL bò bieán tính giaûm khaû naêng hoaït ñoäng, ñoàng thôøi khoâng coù khaû naêng phuïc hoài hoaït ñoäng khi haï xuoáng nhieät ñoä toái thích. 8. Ñeå thu hoài cheá phaåm enzyme algL thoâ, neân söû duïng taùc nhaân keát tuûa laø muoái trung tính (NH4)2SO4 baõo hoøa, thôøi gian keát tuûa 12h ôû nhieät ñoä 4 0 C. 4.2. Ñeà xuaát yù kieán Töø nhöõng vaán ñeà ñaõ nghieân cöùu ñöôïc trong ñeà taøi, xin ñöôïc ñeà xuaát caùc yù kieán sau: 1. Ñeà taøi chöa nghieân cöùu söï aûnh höôûng cuûa tyû leä caùc thaønh phaàn chaát dinh döôõng trong moâi tröôøng nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån vaø hoaït ñoä cuûa enzyme algL do vi sinh vaät sinh toång hôïp neân, vì vaäy caàn môû roäng nghieân cöùu theâm söï aûnh höôûng cuûa caùc chaát dinh döôõng vaø coù theå löïa choïn ñöôïc moâi tröôøng nuoâi caáy, sinh khoái toái öu cho söï phaùt trieån vaø hoaït ñoä algL cuûa vi sinh vaät ñaõ phaân laäp. 2. Nghieân cöùu phöông phaùp tinh saïch enzyme algL nhö phöông phaùp haáp phuï khoâng ñaëc hieäu hay phöông phaùp trao ñoåi ion, ñeå taêng hoaït löïc cuûa
65 algL vaø xaùc ñònh hoaït ñoä cuûa algL theo phöông phaùp so maøu cuõng nhö laø xaùc ñònh ñöôïc khoái löôïng phaân töû cuûa algL. 3. Nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc chaát gaây bieán tính protein cuõng nhö pH ñeán hoaït ñoä cuûa enzyme algL. 4. Nghieân cöùu phaân caét Na-alginate baèng kieàm, axit maïnh vaø so saùnh keát quaû vôùi phöông phaùp phaân caét baèng enzyme. 5. Nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc oligo alginate coù khoái löôïng phaân töû khaùc nhau ñeán khaû naêng naåy maàm cuûa haït gioáng vaø khaû naêng phaùt trieån cuûa thöïc vaät. Beân caïnh ñoù môû roäng nghieân cöùu öùng duïng cuûa caùc oligo alginate trong lónh cöïc thöïc phaåm, sinh hoïc vaø döôïc hoïc.
66 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Taøi lieäu trong nöôùc 1. Traàn Thò Luyeán, Ñoã Minh Phuïng, Ngoâ Ñaêng Nghóa, Nguyeãn Anh Tuaán (2000), “Cheá bieán rong bieån”. Nhaø xuaát baûn Noâng Nghieäp. 2. Nguyeãn Thò Xuyeán (1996), “ Ñaïi cöông vi sinh vaät”. Nhaø xuaát baûn Noâng Nghieäp Thaønh phoá Hoà Chí Minh. 3. Nguyeãn Troïng Caån, Nguyeãn Thò Hieàn, Ñoã Thò Giang, Traàn Thò Luyeán (1998), “Coâng ngheä Enzyme”. Nhaø xuaát baûn Noâng Nghieäp. 4. Leâ Ngoïc Tuù, Leâ Vaên Trö vaø caùc taùc giaû. “Enzyme töø vi sinh vaät”. Nhaø xuaát baûn Khoa hoïc – Kyõ thuaät, Haø Noäi. 5. Löông Ñöùc Phaåm, Hoà Söôûng (1978), “ Vi sinh vaät toång hôïp”. Nhaø xuaát baûn Kyõ thuaät. 6. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Phan Thò Huyeàn, Nguyeãn Aùnh Tuyeát (2006) “ Thí nghieäm vi sinh vaät hoïc “ . Nhaø xuaát baûn Ñaïi hoïc Quoác gia TP. Hoà Chí Minh. 7. Leâ Ngoïc Tuù vaø coäng söï (2002), “ Hoùa Sinh Coâng nghieäp”. Nhaø xuaát baûn Khoa hoïc - Kyõ thuaät Haø Noäi . 8. Traàn Linh Thöôùc (2003), “ Phöông phaùp phaân tích vi sinh vaät”. Nhaø Xuaát baûn Giaùo duïc. 9. Nguyen Quoc Hien, Naotsugu Nagasawa, Le Xuan Tham, Fumio Yoshii, Vo Huy Ñang, Hiroshi Mitomo, Keizo Makuuchi vaø Tamikazu Kume. “Growth – promotion of plant with depolymerized alginates by irradiation”. Nuclear Research Institute, DaLat, Viet Nam. 10. Nguyeãn Thaùi Hoøa, Nguyeãn Thò Aùi Nhung (2002),” Nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa aligoalginate ñeán khaû naêng naûy maàm cuûa haït thoùc gioáng”. Taïp chí Khoa hoïc, Ñaïi hoïc Hueá.
67 Taøi lieäu nöôùc ngoaøi 11. Gacesa P. (1988) Alginates. Carbohydr Polym 8:161–182. 12. Biological effect of radiation-degraded alginate on flower plant in tisue culture. Graduate School of Agricutural Life Sciences, University of Tokyo. 13. Root – Growth promoting Acivity of Unsaturated oligomer Uronate from Alginate on Carrot and Rice plant. Graduate School Biodemical Sciences, Nagasaki University, Japan. 14. Iwasaki, Matsubara. “Purification of alginate oligosacharides with root growth-promoting activity toward lettuce”. 15. Preparation and structure elucidation of alginate oligosaccharides degraded by alginate lyase from Vibro sp. 510. Institute of Marine Drug and Food, Ocean University of China, China. 16. A structural basis for depolymerization of alginate by polysaccharide lyase family-7. Devision of Agronomy and Horticultural Science, Graduate School of Agriculture, Kyoto University, Japan. 17. Manabu Kitamikado, Chao-Huang Tseng, Kuniko Yamaguchi vaø Takasi Nakamura. Two Types of Bacterial Alginate Lyases. Depament of fisheries, Faculty Agriculture, Kyushu University, Japan. 18. Thiang Yian Wong, Lori A. Preston and Neal L Schiller. ALGINATE LYASE: Review of Major Sources and Enzyme Characteristics, Structure- Function Analysis, Biological Roles and Applications. Division of Biomedical Sciences, University of California. 19. Wataru Hashimoto, Osamu Miyake, Keiko Momma, Shigeyuki Kawai and Kousaku Murata. Molecular Indentification of Olicoalginate Lyase
68 of Sphingomonas sp. Strain A1 as one of the Enzymes Required for Complete Depolimerization of Alginate.Research Institure for Food Sience, Kyoto University, Japan. 20. Scott CD. (1982) Immobilized cells: a review of recent literature. Enzyme Microb Technol 9:66–73. 21. A novel alginate lyase from a marine bacterium Agarivorans Albus Ykw-34: purification and characterization 22. Nakagawa A, Ozaki T, Chubachi K, Hosoyama T, Okubo T, Iyobe S, Suzuki T. (1998) An effective method for isolating alginate lyase-producing Bacillus sp. ATB-1015 strain and purification and characterization of the lyase. J Appl Microbiol 84:328–335. 23. Sutherland IW. (1995) Polysaccharide lyases. FEMS Microbiol Rev 16:323–347. 24. Scott CD. (1987) Immobilized cells: a review of recent literature. Enzyme Microb Technol 9:66–73. 25. Yonemoto Y, Tanaka H, Yamashita T, Kitabatake N, Ishida Y, Kimura A, Murata K. (1993) Promotion of germination and shoot elongation of some plants by alginate oligomers prepared with bacterial alginate lyase. J Ferment Bioeng 75:68–70. 26. Iwamoto Y, Xu X, Tamura T, Oda T, Muramatsu T. (2003) Enzymatically depolymerized alginate oligomers that cause cytotoxic cytokine production in human mononuclear cells. Biosci Biotechnol Biochem 67:258– 263. 27. Uchida M. (1995) Enzyme activities of marine bacteria involved in Laminaria thallus decomposition and the resulting sugar-release. Mar Biol
69 123:639–644. 28. Uchida M, Nakata K, Maeda M. (1997) Introduction of detrital food webs into an aquaculture system by supplying single cell algal detritus produced from Laminaria japonica as a hatchery diet for Artemia nauplii. Aquaculture 154:125–137. 29. Elyakova LA, Favorov VV. (1974) Isolation and certain properties of alginate lyase VI from the mollusk Littorina sp. Biochem Biophys Acta 358:341 30. Iwamoto Y, Araki R, Iriyama K, Oda T, Fukuda H, Hayashida S, Muramatsu T. (2001) Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain No. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci Biotechnol Biochem 65:133–142. 31. Hu X, Jiang X, Hwang HM. (2006) Purification and characterization of an alginate lyase from marine bacterium Vibrio sp. mutant strain 510-64. Curr Microbiol 53:135–140.
70 PHUÏ LUÏC 1. CAÙC KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU BảnghiệuchuẩntheoñộnhớtcủadungdịchSucrose 0 20 40 60 80 100 120 140 160 2 2.5 3.2 4.4 6.2 9.5 15.5 28.3 58.9 Độ nhớt mPa.s 400 600
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYME ALGINATE LYASE TỪ VI SINH VẬT CÓ TRONG RONG BIỂN VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG NÓ ĐỂ THỦY PHÂN ALGINATE - TẢI FREE ZALO: 093 457 3149
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYME ALGINATE LYASE TỪ VI SINH VẬT CÓ TRONG RONG BIỂN VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG NÓ ĐỂ THỦY PHÂN ALGINATE - TẢI FREE ZALO: 093 457 3149
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYME ALGINATE LYASE TỪ VI SINH VẬT CÓ TRONG RONG BIỂN VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG NÓ ĐỂ THỦY PHÂN ALGINATE - TẢI FREE ZALO: 093 457 3149
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYME ALGINATE LYASE TỪ VI SINH VẬT CÓ TRONG RONG BIỂN VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG NÓ ĐỂ THỦY PHÂN ALGINATE - TẢI FREE ZALO: 093 457 3149
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYME ALGINATE LYASE TỪ VI SINH VẬT CÓ TRONG RONG BIỂN VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG NÓ ĐỂ THỦY PHÂN ALGINATE - TẢI FREE ZALO: 093 457 3149
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYME ALGINATE LYASE TỪ VI SINH VẬT CÓ TRONG RONG BIỂN VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG NÓ ĐỂ THỦY PHÂN ALGINATE - TẢI FREE ZALO: 093 457 3149
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYME ALGINATE LYASE TỪ VI SINH VẬT CÓ TRONG RONG BIỂN VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG NÓ ĐỂ THỦY PHÂN ALGINATE - TẢI FREE ZALO: 093 457 3149
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYME ALGINATE LYASE TỪ VI SINH VẬT CÓ TRONG RONG BIỂN VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG NÓ ĐỂ THỦY PHÂN ALGINATE - TẢI FREE ZALO: 093 457 3149
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYME ALGINATE LYASE TỪ VI SINH VẬT CÓ TRONG RONG BIỂN VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG NÓ ĐỂ THỦY PHÂN ALGINATE - TẢI FREE ZALO: 093 457 3149

Recommended

Đề tài: Quy trình sản xuất điện năng trong nhà máy nhiệt điện, 9đ
Đề tài: Quy trình sản xuất điện năng trong nhà máy nhiệt điện, 9đĐề tài: Quy trình sản xuất điện năng trong nhà máy nhiệt điện, 9đ
Đề tài: Quy trình sản xuất điện năng trong nhà máy nhiệt điện, 9đDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
EBOOK - Kỹ thuật lên men công nghiệp - 2016 (Hoàng Văn Quốc Chương).pdf
EBOOK - Kỹ thuật lên men công nghiệp - 2016 (Hoàng Văn Quốc Chương).pdfEBOOK - Kỹ thuật lên men công nghiệp - 2016 (Hoàng Văn Quốc Chương).pdf
EBOOK - Kỹ thuật lên men công nghiệp - 2016 (Hoàng Văn Quốc Chương).pdfKhuyen ND
 
Đề tài: Xử lý Fe3+ trong nước bằng vật liệu hấp phụ từ bã cafe, HAY
Đề tài: Xử lý Fe3+ trong nước bằng vật liệu hấp phụ từ bã cafe, HAYĐề tài: Xử lý Fe3+ trong nước bằng vật liệu hấp phụ từ bã cafe, HAY
Đề tài: Xử lý Fe3+ trong nước bằng vật liệu hấp phụ từ bã cafe, HAYDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...
Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...
Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...jackjohn45
 
Nghiên cứu tình hình nhiễm ấu trùng sán lá song chủ trên cá chép và cá trắm c...
Nghiên cứu tình hình nhiễm ấu trùng sán lá song chủ trên cá chép và cá trắm c...Nghiên cứu tình hình nhiễm ấu trùng sán lá song chủ trên cá chép và cá trắm c...
Nghiên cứu tình hình nhiễm ấu trùng sán lá song chủ trên cá chép và cá trắm c...nataliej4
 
địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...
địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...
địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Chẩn đoán bệnh
Chẩn đoán bệnhChẩn đoán bệnh
Chẩn đoán bệnhHuong Vo
 
Phương pháp chemometric để xác định các chất có phổ hấp thụ phân tử
Phương pháp chemometric để xác định các chất có phổ hấp thụ phân tửPhương pháp chemometric để xác định các chất có phổ hấp thụ phân tử
Phương pháp chemometric để xác định các chất có phổ hấp thụ phân tửDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 

Recommended

Đề tài: Quy trình sản xuất điện năng trong nhà máy nhiệt điện, 9đ
Đề tài: Quy trình sản xuất điện năng trong nhà máy nhiệt điện, 9đĐề tài: Quy trình sản xuất điện năng trong nhà máy nhiệt điện, 9đ
Đề tài: Quy trình sản xuất điện năng trong nhà máy nhiệt điện, 9đDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
EBOOK - Kỹ thuật lên men công nghiệp - 2016 (Hoàng Văn Quốc Chương).pdf
EBOOK - Kỹ thuật lên men công nghiệp - 2016 (Hoàng Văn Quốc Chương).pdfEBOOK - Kỹ thuật lên men công nghiệp - 2016 (Hoàng Văn Quốc Chương).pdf
EBOOK - Kỹ thuật lên men công nghiệp - 2016 (Hoàng Văn Quốc Chương).pdfKhuyen ND
 
Đề tài: Xử lý Fe3+ trong nước bằng vật liệu hấp phụ từ bã cafe, HAY
Đề tài: Xử lý Fe3+ trong nước bằng vật liệu hấp phụ từ bã cafe, HAYĐề tài: Xử lý Fe3+ trong nước bằng vật liệu hấp phụ từ bã cafe, HAY
Đề tài: Xử lý Fe3+ trong nước bằng vật liệu hấp phụ từ bã cafe, HAYDịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...
Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...
Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vật liệu nano bạc, đồng, sắt để xử lý vi khuẩn ...jackjohn45
 
Nghiên cứu tình hình nhiễm ấu trùng sán lá song chủ trên cá chép và cá trắm c...
Nghiên cứu tình hình nhiễm ấu trùng sán lá song chủ trên cá chép và cá trắm c...Nghiên cứu tình hình nhiễm ấu trùng sán lá song chủ trên cá chép và cá trắm c...
Nghiên cứu tình hình nhiễm ấu trùng sán lá song chủ trên cá chép và cá trắm c...nataliej4
 
địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...
địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...
địNh danh vùng gene 16 d dna chủng vi khuẩn lam có khả năng gây độc tố ở hồ d...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Chẩn đoán bệnh
Chẩn đoán bệnhChẩn đoán bệnh
Chẩn đoán bệnhHuong Vo
 
Phương pháp chemometric để xác định các chất có phổ hấp thụ phân tử
Phương pháp chemometric để xác định các chất có phổ hấp thụ phân tửPhương pháp chemometric để xác định các chất có phổ hấp thụ phân tử
Phương pháp chemometric để xác định các chất có phổ hấp thụ phân tửDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
ĐTM Trung tâm hội nghị
ĐTM Trung tâm hội nghị ĐTM Trung tâm hội nghị
ĐTM Trung tâm hội nghị PhuongHa644758
 
Sự hài lòng về công việc của nhân viên Bệnh viện tỉnh Sóc Trăng
Sự hài lòng về công việc của nhân viên Bệnh viện tỉnh Sóc TrăngSự hài lòng về công việc của nhân viên Bệnh viện tỉnh Sóc Trăng
Sự hài lòng về công việc của nhân viên Bệnh viện tỉnh Sóc TrăngDịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Đề cương chi tiết hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viết thuê đồ án công ngh...
Đề cương chi tiết hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viết thuê đồ án công ngh...Đề cương chi tiết hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viết thuê đồ án công ngh...
Đề cương chi tiết hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viết thuê đồ án công ngh...Nhận Viết Đề Tài Điểm Cao ZALO 0917193864 - LUANVANTRUST.COM
 
Luận văn: Phát triển nguồn nhân lực tại Công ty Đầu tư C.E.O, 9đ - Gửi miễn p...
Luận văn: Phát triển nguồn nhân lực tại Công ty Đầu tư C.E.O, 9đ - Gửi miễn p...Luận văn: Phát triển nguồn nhân lực tại Công ty Đầu tư C.E.O, 9đ - Gửi miễn p...
Luận văn: Phát triển nguồn nhân lực tại Công ty Đầu tư C.E.O, 9đ - Gửi miễn p...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Luận văn: Tạo động lực lao động tại bảo hiểm xã hội ở Thanh Hóa - Gửi miễn ph...
Luận văn: Tạo động lực lao động tại bảo hiểm xã hội ở Thanh Hóa - Gửi miễn ph...Luận văn: Tạo động lực lao động tại bảo hiểm xã hội ở Thanh Hóa - Gửi miễn ph...
Luận văn: Tạo động lực lao động tại bảo hiểm xã hội ở Thanh Hóa - Gửi miễn ph...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Nghiên cứu công nghệ sản xuất sản phẩm thịt muối chua.pdf
Nghiên cứu công nghệ sản xuất sản phẩm thịt muối chua.pdfNghiên cứu công nghệ sản xuất sản phẩm thịt muối chua.pdf
Nghiên cứu công nghệ sản xuất sản phẩm thịt muối chua.pdfMan_Ebook
 
Đề tài phòng hội chứng tiêu chảy của lợn thịt, HAY, ĐIỂM 8
Đề tài phòng hội chứng tiêu chảy của lợn thịt, HAY, ĐIỂM 8Đề tài phòng hội chứng tiêu chảy của lợn thịt, HAY, ĐIỂM 8
Đề tài phòng hội chứng tiêu chảy của lợn thịt, HAY, ĐIỂM 8Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
mau va mui vi thuc pham
mau va mui vi thuc phammau va mui vi thuc pham
mau va mui vi thuc phamFood chemistry-09.1800.1595
 
Quản lý sự phối hợp giữa nhà trường và gia đình trong giáo dục trẻ
Quản lý sự phối hợp giữa nhà trường và gia đình trong giáo dục trẻQuản lý sự phối hợp giữa nhà trường và gia đình trong giáo dục trẻ
Quản lý sự phối hợp giữa nhà trường và gia đình trong giáo dục trẻDịch vụ viết thuê Luận Văn - ZALO 0932091562
 
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM_10434312092019
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM_10434312092019BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM_10434312092019
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM_10434312092019TiLiu5
 
Luận văn: Xác định đồng thời paracetamol và cafein trong dược phẩm
Luận văn: Xác định đồng thời paracetamol và cafein trong dược phẩmLuận văn: Xác định đồng thời paracetamol và cafein trong dược phẩm
Luận văn: Xác định đồng thời paracetamol và cafein trong dược phẩmDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0936 885 877
 
Ảnh hưởng của văn hóa doanh nghiệp đến cam kết gắn bó làm việc của người lao ...
Ảnh hưởng của văn hóa doanh nghiệp đến cam kết gắn bó làm việc của người lao ...Ảnh hưởng của văn hóa doanh nghiệp đến cam kết gắn bó làm việc của người lao ...
Ảnh hưởng của văn hóa doanh nghiệp đến cam kết gắn bó làm việc của người lao ...Dịch vụ Làm Luận Văn 0936885877
 
Đề tài ảnh hưởng của việc tập ăn sớm cho lợn con, ĐIỂM 8
Đề tài ảnh hưởng của việc tập ăn sớm cho lợn con, ĐIỂM 8Đề tài ảnh hưởng của việc tập ăn sớm cho lợn con, ĐIỂM 8
Đề tài ảnh hưởng của việc tập ăn sớm cho lợn con, ĐIỂM 8Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Luận văn: Nghiên cứu tổng hợp, đặc trưng vật liệu chitosan-apatit và thăm dò ...
Luận văn: Nghiên cứu tổng hợp, đặc trưng vật liệu chitosan-apatit và thăm dò ...Luận văn: Nghiên cứu tổng hợp, đặc trưng vật liệu chitosan-apatit và thăm dò ...
Luận văn: Nghiên cứu tổng hợp, đặc trưng vật liệu chitosan-apatit và thăm dò ...Dịch vụ viết thuê Luận Văn - ZALO 0932091562
 
Đề tài: Tìm hiểu về nhà máy Nhiệt Điện Vĩnh Tân 4, HAY, 9đ
Đề tài: Tìm hiểu về nhà máy Nhiệt Điện Vĩnh Tân 4, HAY, 9đĐề tài: Tìm hiểu về nhà máy Nhiệt Điện Vĩnh Tân 4, HAY, 9đ
Đề tài: Tìm hiểu về nhà máy Nhiệt Điện Vĩnh Tân 4, HAY, 9đDịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
khóa luận tốt nghiệp nghieân cứu đề xuất quy trình sản xuất sữa chua xoài.doc
khóa luận tốt nghiệp nghieân cứu đề xuất quy trình sản xuất sữa chua xoài.dockhóa luận tốt nghiệp nghieân cứu đề xuất quy trình sản xuất sữa chua xoài.doc
khóa luận tốt nghiệp nghieân cứu đề xuất quy trình sản xuất sữa chua xoài.docDV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149
 
Công nghệ sấy lạnh để sấy một số loại rau quả
Công nghệ sấy lạnh để sấy một số loại rau quảCông nghệ sấy lạnh để sấy một số loại rau quả
Công nghệ sấy lạnh để sấy một số loại rau quảebookbkmt
 
đáNh giá công tác quản lý và xử lý chất thải lỏng trong chăn nuôi lợn tại trạ...
đáNh giá công tác quản lý và xử lý chất thải lỏng trong chăn nuôi lợn tại trạ...đáNh giá công tác quản lý và xử lý chất thải lỏng trong chăn nuôi lợn tại trạ...
đáNh giá công tác quản lý và xử lý chất thải lỏng trong chăn nuôi lợn tại trạ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu quy trình sản xuất tương ớt.doc
Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu quy trình sản xuất tương ớt.docLuận văn tốt nghiệp nghiên cứu quy trình sản xuất tương ớt.doc
Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu quy trình sản xuất tương ớt.docDV Viết Luận văn luanvanmaster.com ZALO 0973287149
 
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM - TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM - TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM - TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM - TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN nataliej4
 
36.ke.nhan hoa1
36.ke.nhan hoa136.ke.nhan hoa1
36.ke.nhan hoa1bachbt171092
 
36 Kế nhân hòa (1)
36 Kế nhân hòa (1)36 Kế nhân hòa (1)
36 Kế nhân hòa (1)Nguyen Van Nghiem
 

More Related Content

What's hot

ĐTM Trung tâm hội nghị
ĐTM Trung tâm hội nghị ĐTM Trung tâm hội nghị
ĐTM Trung tâm hội nghị PhuongHa644758
 
Luận văn: Phát triển nguồn nhân lực tại Công ty Đầu tư C.E.O, 9đ - Gửi miễn p...
Luận văn: Phát triển nguồn nhân lực tại Công ty Đầu tư C.E.O, 9đ - Gửi miễn p...Luận văn: Phát triển nguồn nhân lực tại Công ty Đầu tư C.E.O, 9đ - Gửi miễn p...
Luận văn: Phát triển nguồn nhân lực tại Công ty Đầu tư C.E.O, 9đ - Gửi miễn p...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Luận văn: Tạo động lực lao động tại bảo hiểm xã hội ở Thanh Hóa - Gửi miễn ph...
Luận văn: Tạo động lực lao động tại bảo hiểm xã hội ở Thanh Hóa - Gửi miễn ph...Luận văn: Tạo động lực lao động tại bảo hiểm xã hội ở Thanh Hóa - Gửi miễn ph...
Luận văn: Tạo động lực lao động tại bảo hiểm xã hội ở Thanh Hóa - Gửi miễn ph...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0909232620
 
Nghiên cứu công nghệ sản xuất sản phẩm thịt muối chua.pdf
Nghiên cứu công nghệ sản xuất sản phẩm thịt muối chua.pdfNghiên cứu công nghệ sản xuất sản phẩm thịt muối chua.pdf
Nghiên cứu công nghệ sản xuất sản phẩm thịt muối chua.pdfMan_Ebook
 
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM_10434312092019
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM_10434312092019BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM_10434312092019
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM_10434312092019TiLiu5
 
Ảnh hưởng của văn hóa doanh nghiệp đến cam kết gắn bó làm việc của người lao ...
Ảnh hưởng của văn hóa doanh nghiệp đến cam kết gắn bó làm việc của người lao ...Ảnh hưởng của văn hóa doanh nghiệp đến cam kết gắn bó làm việc của người lao ...
Ảnh hưởng của văn hóa doanh nghiệp đến cam kết gắn bó làm việc của người lao ...Dịch vụ Làm Luận Văn 0936885877
 
Công nghệ sấy lạnh để sấy một số loại rau quả
Công nghệ sấy lạnh để sấy một số loại rau quảCông nghệ sấy lạnh để sấy một số loại rau quả
Công nghệ sấy lạnh để sấy một số loại rau quảebookbkmt
 
đáNh giá công tác quản lý và xử lý chất thải lỏng trong chăn nuôi lợn tại trạ...
đáNh giá công tác quản lý và xử lý chất thải lỏng trong chăn nuôi lợn tại trạ...đáNh giá công tác quản lý và xử lý chất thải lỏng trong chăn nuôi lợn tại trạ...
đáNh giá công tác quản lý và xử lý chất thải lỏng trong chăn nuôi lợn tại trạ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
 
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM - TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM - TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM - TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM - TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN nataliej4
 

What's hot (20)

ĐTM Trung tâm hội nghị
ĐTM Trung tâm hội nghị ĐTM Trung tâm hội nghị
ĐTM Trung tâm hội nghị
 
Sự hài lòng về công việc của nhân viên Bệnh viện tỉnh Sóc Trăng
Sự hài lòng về công việc của nhân viên Bệnh viện tỉnh Sóc TrăngSự hài lòng về công việc của nhân viên Bệnh viện tỉnh Sóc Trăng
Sự hài lòng về công việc của nhân viên Bệnh viện tỉnh Sóc Trăng
 
Đề cương chi tiết hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viết thuê đồ án công ngh...
Đề cương chi tiết hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viết thuê đồ án công ngh...Đề cương chi tiết hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viết thuê đồ án công ngh...
Đề cương chi tiết hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viết thuê đồ án công ngh...
 
Luận văn: Phát triển nguồn nhân lực tại Công ty Đầu tư C.E.O, 9đ - Gửi miễn p...
Luận văn: Phát triển nguồn nhân lực tại Công ty Đầu tư C.E.O, 9đ - Gửi miễn p...Luận văn: Phát triển nguồn nhân lực tại Công ty Đầu tư C.E.O, 9đ - Gửi miễn p...
Luận văn: Phát triển nguồn nhân lực tại Công ty Đầu tư C.E.O, 9đ - Gửi miễn p...
 
Luận văn: Tạo động lực lao động tại bảo hiểm xã hội ở Thanh Hóa - Gửi miễn ph...
Luận văn: Tạo động lực lao động tại bảo hiểm xã hội ở Thanh Hóa - Gửi miễn ph...Luận văn: Tạo động lực lao động tại bảo hiểm xã hội ở Thanh Hóa - Gửi miễn ph...
Luận văn: Tạo động lực lao động tại bảo hiểm xã hội ở Thanh Hóa - Gửi miễn ph...
 
Nghiên cứu công nghệ sản xuất sản phẩm thịt muối chua.pdf
Nghiên cứu công nghệ sản xuất sản phẩm thịt muối chua.pdfNghiên cứu công nghệ sản xuất sản phẩm thịt muối chua.pdf
Nghiên cứu công nghệ sản xuất sản phẩm thịt muối chua.pdf
 
Đề tài phòng hội chứng tiêu chảy của lợn thịt, HAY, ĐIỂM 8
Đề tài phòng hội chứng tiêu chảy của lợn thịt, HAY, ĐIỂM 8Đề tài phòng hội chứng tiêu chảy của lợn thịt, HAY, ĐIỂM 8
Đề tài phòng hội chứng tiêu chảy của lợn thịt, HAY, ĐIỂM 8
 
mau va mui vi thuc pham
mau va mui vi thuc phammau va mui vi thuc pham
mau va mui vi thuc pham
 
Quản lý sự phối hợp giữa nhà trường và gia đình trong giáo dục trẻ
Quản lý sự phối hợp giữa nhà trường và gia đình trong giáo dục trẻQuản lý sự phối hợp giữa nhà trường và gia đình trong giáo dục trẻ
Quản lý sự phối hợp giữa nhà trường và gia đình trong giáo dục trẻ
 
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM_10434312092019
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM_10434312092019BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM_10434312092019
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM_10434312092019
 
Luận văn: Xác định đồng thời paracetamol và cafein trong dược phẩm
Luận văn: Xác định đồng thời paracetamol và cafein trong dược phẩmLuận văn: Xác định đồng thời paracetamol và cafein trong dược phẩm
Luận văn: Xác định đồng thời paracetamol và cafein trong dược phẩm
 
Ảnh hưởng của văn hóa doanh nghiệp đến cam kết gắn bó làm việc của người lao ...
Ảnh hưởng của văn hóa doanh nghiệp đến cam kết gắn bó làm việc của người lao ...Ảnh hưởng của văn hóa doanh nghiệp đến cam kết gắn bó làm việc của người lao ...
Ảnh hưởng của văn hóa doanh nghiệp đến cam kết gắn bó làm việc của người lao ...
 
Đề tài ảnh hưởng của việc tập ăn sớm cho lợn con, ĐIỂM 8
Đề tài ảnh hưởng của việc tập ăn sớm cho lợn con, ĐIỂM 8Đề tài ảnh hưởng của việc tập ăn sớm cho lợn con, ĐIỂM 8
Đề tài ảnh hưởng của việc tập ăn sớm cho lợn con, ĐIỂM 8
 
Luận văn: Nghiên cứu tổng hợp, đặc trưng vật liệu chitosan-apatit và thăm dò ...
Luận văn: Nghiên cứu tổng hợp, đặc trưng vật liệu chitosan-apatit và thăm dò ...Luận văn: Nghiên cứu tổng hợp, đặc trưng vật liệu chitosan-apatit và thăm dò ...
Luận văn: Nghiên cứu tổng hợp, đặc trưng vật liệu chitosan-apatit và thăm dò ...
 
Đề tài: Tìm hiểu về nhà máy Nhiệt Điện Vĩnh Tân 4, HAY, 9đ
Đề tài: Tìm hiểu về nhà máy Nhiệt Điện Vĩnh Tân 4, HAY, 9đĐề tài: Tìm hiểu về nhà máy Nhiệt Điện Vĩnh Tân 4, HAY, 9đ
Đề tài: Tìm hiểu về nhà máy Nhiệt Điện Vĩnh Tân 4, HAY, 9đ
 
khóa luận tốt nghiệp nghieân cứu đề xuất quy trình sản xuất sữa chua xoài.doc
khóa luận tốt nghiệp nghieân cứu đề xuất quy trình sản xuất sữa chua xoài.dockhóa luận tốt nghiệp nghieân cứu đề xuất quy trình sản xuất sữa chua xoài.doc
khóa luận tốt nghiệp nghieân cứu đề xuất quy trình sản xuất sữa chua xoài.doc
 
Công nghệ sấy lạnh để sấy một số loại rau quả
Công nghệ sấy lạnh để sấy một số loại rau quảCông nghệ sấy lạnh để sấy một số loại rau quả
Công nghệ sấy lạnh để sấy một số loại rau quả
 
đáNh giá công tác quản lý và xử lý chất thải lỏng trong chăn nuôi lợn tại trạ...
đáNh giá công tác quản lý và xử lý chất thải lỏng trong chăn nuôi lợn tại trạ...đáNh giá công tác quản lý và xử lý chất thải lỏng trong chăn nuôi lợn tại trạ...
đáNh giá công tác quản lý và xử lý chất thải lỏng trong chăn nuôi lợn tại trạ...
 
Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu quy trình sản xuất tương ớt.doc
Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu quy trình sản xuất tương ớt.docLuận văn tốt nghiệp nghiên cứu quy trình sản xuất tương ớt.doc
Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu quy trình sản xuất tương ớt.doc
 
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM - TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM - TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM - TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
BÀI GIẢNG VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM - TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN
 

Similar to NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYME ALGINATE LYASE TỪ VI SINH VẬT CÓ TRONG RONG BIỂN VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG NÓ ĐỂ THỦY PHÂN ALGINATE - TẢI FREE ZALO: 093 457 3149

36 Ke Nhan Hoa(Q1) 791
36 Ke Nhan Hoa(Q1) 79136 Ke Nhan Hoa(Q1) 791
36 Ke Nhan Hoa(Q1) 791bstuananh
 
36 kế của người xưa full
36 kế của người xưa full36 kế của người xưa full
36 kế của người xưa fullThọ Vũ Ngọc
 
Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...
Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...
Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...https://www.facebook.com/garmentspace
 
Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...
Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...
Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...NOT
 
Giải pháp mở rộng XK rau quả vào thị trường Hoa Kỳ 2
Giải pháp mở rộng XK rau quả vào thị trường Hoa Kỳ 2Giải pháp mở rộng XK rau quả vào thị trường Hoa Kỳ 2
Giải pháp mở rộng XK rau quả vào thị trường Hoa Kỳ 2Digiword Ha Noi
 
Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống la...
Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống la...Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống la...
Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống la...Man_Ebook
 
Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng ghép tế bào gốc mô mỡ tự thân điều trị chấn thươn...
Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng ghép tế bào gốc mô mỡ tự thân điều trị chấn thươn...Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng ghép tế bào gốc mô mỡ tự thân điều trị chấn thươn...
Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng ghép tế bào gốc mô mỡ tự thân điều trị chấn thươn...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0936 885 877
 
Giáo trình cấu trúc dữ liệu và giải thuật[bookbooming.com]
Giáo trình cấu trúc dữ liệu và giải thuật[bookbooming.com]Giáo trình cấu trúc dữ liệu và giải thuật[bookbooming.com]
Giáo trình cấu trúc dữ liệu và giải thuật[bookbooming.com]bookbooming1
 
Giao trinh cau truc du lieu va giai thuat
Giao trinh cau truc du lieu va giai thuatGiao trinh cau truc du lieu va giai thuat
Giao trinh cau truc du lieu va giai thuatDang Hong
 
Giao trinh cau truc du lieu va giai thuat
Giao trinh cau truc du lieu va giai thuatGiao trinh cau truc du lieu va giai thuat
Giao trinh cau truc du lieu va giai thuatPham Minh Hai
 
giaotrinhlenmenthucpham.pdf
giaotrinhlenmenthucpham.pdfgiaotrinhlenmenthucpham.pdf
giaotrinhlenmenthucpham.pdfKhuyen ND
 

Similar to NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYME ALGINATE LYASE TỪ VI SINH VẬT CÓ TRONG RONG BIỂN VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG NÓ ĐỂ THỦY PHÂN ALGINATE - TẢI FREE ZALO: 093 457 3149 (20)

36.ke.nhan hoa1
36.ke.nhan hoa136.ke.nhan hoa1
36.ke.nhan hoa1
 
36 Kế nhân hòa (1)
36 Kế nhân hòa (1)36 Kế nhân hòa (1)
36 Kế nhân hòa (1)
 
36.Ke.Nhan.Hoa
36.Ke.Nhan.Hoa36.Ke.Nhan.Hoa
36.Ke.Nhan.Hoa
 
36 Ke Nhan Hoa(Q1) 791
36 Ke Nhan Hoa(Q1) 79136 Ke Nhan Hoa(Q1) 791
36 Ke Nhan Hoa(Q1) 791
 
36 kế của người xưa full
36 kế của người xưa full36 kế của người xưa full
36 kế của người xưa full
 
36.ke.nhan.hoa
36.ke.nhan.hoa36.ke.nhan.hoa
36.ke.nhan.hoa
 
36 Kế Nhân Hoà
36 Kế Nhân Hoà 36 Kế Nhân Hoà
36 Kế Nhân Hoà
 
Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...
Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...
Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...
 
Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...
Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...
Hoàn thiện công tác kế toán tập hợp chi phí sản xuất và tính giá thành sản ph...
 
Giải pháp mở rộng XK rau quả vào thị trường Hoa Kỳ 2
Giải pháp mở rộng XK rau quả vào thị trường Hoa Kỳ 2Giải pháp mở rộng XK rau quả vào thị trường Hoa Kỳ 2
Giải pháp mở rộng XK rau quả vào thị trường Hoa Kỳ 2
 
36 ke nhan hoa (phan 1)
36 ke nhan hoa (phan 1)36 ke nhan hoa (phan 1)
36 ke nhan hoa (phan 1)
 
Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống la...
Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống la...Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống la...
Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống la...
 
Luận án: Ghép TBG mô mỡ tự thân điều trị chấn thương cột sống
Luận án: Ghép TBG mô mỡ tự thân điều trị chấn thương cột sốngLuận án: Ghép TBG mô mỡ tự thân điều trị chấn thương cột sống
Luận án: Ghép TBG mô mỡ tự thân điều trị chấn thương cột sống
 
Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng ghép tế bào gốc mô mỡ tự thân điều trị chấn thươn...
Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng ghép tế bào gốc mô mỡ tự thân điều trị chấn thươn...Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng ghép tế bào gốc mô mỡ tự thân điều trị chấn thươn...
Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng ghép tế bào gốc mô mỡ tự thân điều trị chấn thươn...
 
Vsv chuong4
Vsv chuong4Vsv chuong4
Vsv chuong4
 
Giáo trình cấu trúc dữ liệu và giải thuật[bookbooming.com]
Giáo trình cấu trúc dữ liệu và giải thuật[bookbooming.com]Giáo trình cấu trúc dữ liệu và giải thuật[bookbooming.com]
Giáo trình cấu trúc dữ liệu và giải thuật[bookbooming.com]
 
Giao trinh cau truc du lieu va giai thuat
Giao trinh cau truc du lieu va giai thuatGiao trinh cau truc du lieu va giai thuat
Giao trinh cau truc du lieu va giai thuat
 
Giao trinh cau truc du lieu va giai thuat
Giao trinh cau truc du lieu va giai thuatGiao trinh cau truc du lieu va giai thuat
Giao trinh cau truc du lieu va giai thuat
 
giaotrinhlenmenthucpham.pdf
giaotrinhlenmenthucpham.pdfgiaotrinhlenmenthucpham.pdf
giaotrinhlenmenthucpham.pdf
 
food-microbiology
food-microbiologyfood-microbiology
food-microbiology
 

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0936 885 877

Hoàn Thiện Tổ Chức Kế Toán Quản Trị Tại Công Ty Tnhh Thương Mại Đầu Tư Và Phá...
Hoàn Thiện Tổ Chức Kế Toán Quản Trị Tại Công Ty Tnhh Thương Mại Đầu Tư Và Phá...Hoàn Thiện Tổ Chức Kế Toán Quản Trị Tại Công Ty Tnhh Thương Mại Đầu Tư Và Phá...
Hoàn Thiện Tổ Chức Kế Toán Quản Trị Tại Công Ty Tnhh Thương Mại Đầu Tư Và Phá...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0936 885 877
 
Tiểu Luận Nâng Cao Hiệu Quả Công Tác Quản Lý Các Điểm Di Tích Lịch Sử Văn H...
Tiểu Luận Nâng Cao Hiệu Quả Công Tác Quản Lý Các Điểm Di Tích Lịch Sử Văn H...Tiểu Luận Nâng Cao Hiệu Quả Công Tác Quản Lý Các Điểm Di Tích Lịch Sử Văn H...
Tiểu Luận Nâng Cao Hiệu Quả Công Tác Quản Lý Các Điểm Di Tích Lịch Sử Văn H...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0936 885 877
 
Một Số Kiến Nghị Để Nâng Cao Hiệu Quảng Đối Với Dịch Vụ Quảng Cáo Và Tổ Chức ...
Một Số Kiến Nghị Để Nâng Cao Hiệu Quảng Đối Với Dịch Vụ Quảng Cáo Và Tổ Chức ...Một Số Kiến Nghị Để Nâng Cao Hiệu Quảng Đối Với Dịch Vụ Quảng Cáo Và Tổ Chức ...
Một Số Kiến Nghị Để Nâng Cao Hiệu Quảng Đối Với Dịch Vụ Quảng Cáo Và Tổ Chức ...Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0936 885 877
 

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO: 0936 885 877 (20)

Hoàn Thiện Công Tác Kế Toán Tại Bệnh Viện Chỉnh Hình Và Phục Hồi...
Hoàn Thiện Công Tác Kế Toán Tại Bệnh Viện Chỉnh Hình Và Phục Hồi...Hoàn Thiện Công Tác Kế Toán Tại Bệnh Viện Chỉnh Hình Và Phục Hồi...
Hoàn Thiện Công Tác Kế Toán Tại Bệnh Viện Chỉnh Hình Và Phục Hồi...
 
Hoàn Thiện Công Tác Kế Toán Tại Các Đơn Vị Sự Nghiệp Thuộc Sở Xây...
Hoàn Thiện Công Tác Kế Toán Tại Các Đơn Vị Sự Nghiệp Thuộc Sở Xây...Hoàn Thiện Công Tác Kế Toán Tại Các Đơn Vị Sự Nghiệp Thuộc Sở Xây...
Hoàn Thiện Công Tác Kế Toán Tại Các Đơn Vị Sự Nghiệp Thuộc Sở Xây...
 
Hoàn Thiện Công Tác Hạch Toán Kế Toán Tại Các Đơn Vị Dự Toán Cấp...
Hoàn Thiện Công Tác Hạch Toán Kế Toán Tại Các Đơn Vị Dự Toán Cấp...Hoàn Thiện Công Tác Hạch Toán Kế Toán Tại Các Đơn Vị Dự Toán Cấp...
Hoàn Thiện Công Tác Hạch Toán Kế Toán Tại Các Đơn Vị Dự Toán Cấp...
 
Hoàn Thiện Tổ Chức Công Tác Kế Toán Tại Sở Giáo Dục Và Đào Tạo ...
Hoàn Thiện Tổ Chức Công Tác Kế Toán Tại Sở Giáo Dục Và Đào Tạo ...Hoàn Thiện Tổ Chức Công Tác Kế Toán Tại Sở Giáo Dục Và Đào Tạo ...
Hoàn Thiện Tổ Chức Công Tác Kế Toán Tại Sở Giáo Dục Và Đào Tạo ...
 
Hoàn Thiện Tổ Chức Kế Toán Quản Trị Tại Công Ty Tnhh Thương Mại Đầu Tư Và Phá...
Hoàn Thiện Tổ Chức Kế Toán Quản Trị Tại Công Ty Tnhh Thương Mại Đầu Tư Và Phá...Hoàn Thiện Tổ Chức Kế Toán Quản Trị Tại Công Ty Tnhh Thương Mại Đầu Tư Và Phá...
Hoàn Thiện Tổ Chức Kế Toán Quản Trị Tại Công Ty Tnhh Thương Mại Đầu Tư Và Phá...
 
Hoàn Thiện Tổ Chức Công Tác Kế Toán Tại Các Đơn Vị Thuộc Trung Tâm Y Tế
Hoàn Thiện Tổ Chức Công Tác Kế Toán Tại Các Đơn Vị Thuộc Trung Tâm Y TếHoàn Thiện Tổ Chức Công Tác Kế Toán Tại Các Đơn Vị Thuộc Trung Tâm Y Tế
Hoàn Thiện Tổ Chức Công Tác Kế Toán Tại Các Đơn Vị Thuộc Trung Tâm Y Tế
 
Tiểu Luận Thực Trạng Đời Sống Văn Hóa Của Công Nhân Khu Công Nghiệp - Hay T...
Tiểu Luận Thực Trạng Đời Sống Văn Hóa Của Công Nhân Khu Công Nghiệp - Hay T...Tiểu Luận Thực Trạng Đời Sống Văn Hóa Của Công Nhân Khu Công Nghiệp - Hay T...
Tiểu Luận Thực Trạng Đời Sống Văn Hóa Của Công Nhân Khu Công Nghiệp - Hay T...
 
Tiểu Luận Quản Lý Hoạt Động Nhà Văn Hóa - Đỉnh Của Chóp!
Tiểu Luận Quản Lý Hoạt Động Nhà Văn Hóa - Đỉnh Của Chóp!Tiểu Luận Quản Lý Hoạt Động Nhà Văn Hóa - Đỉnh Của Chóp!
Tiểu Luận Quản Lý Hoạt Động Nhà Văn Hóa - Đỉnh Của Chóp!
 
Tiểu Luận Quản Lý Nhà Nước Về Văn Hóa - Hay Bá Cháy!
Tiểu Luận Quản Lý Nhà Nước Về Văn Hóa - Hay Bá Cháy!Tiểu Luận Quản Lý Nhà Nước Về Văn Hóa - Hay Bá Cháy!
Tiểu Luận Quản Lý Nhà Nước Về Văn Hóa - Hay Bá Cháy!
 
Tiểu Luận Quản Lý Nhà Nước Về Thiết Chế Văn Hóa - Hay Quên Lối Ra!.
Tiểu Luận Quản Lý Nhà Nước Về Thiết Chế Văn Hóa - Hay Quên Lối Ra!.Tiểu Luận Quản Lý Nhà Nước Về Thiết Chế Văn Hóa - Hay Quên Lối Ra!.
Tiểu Luận Quản Lý Nhà Nước Về Thiết Chế Văn Hóa - Hay Quên Lối Ra!.
 
Tiểu Luận Quản Lý Di Tích Kiến Trúc Nghệ Thuật Chùa Tứ Kỳ - Hay Bá Đạo!
Tiểu Luận Quản Lý Di Tích Kiến Trúc Nghệ Thuật Chùa Tứ Kỳ - Hay Bá Đạo!Tiểu Luận Quản Lý Di Tích Kiến Trúc Nghệ Thuật Chùa Tứ Kỳ - Hay Bá Đạo!
Tiểu Luận Quản Lý Di Tích Kiến Trúc Nghệ Thuật Chùa Tứ Kỳ - Hay Bá Đạo!
 
Tiểu Luận Quản Lý Các Dịch Vụ Văn Hóa Tại Khu Du Lịch - Hay Xĩu Ngang!
Tiểu Luận Quản Lý Các Dịch Vụ Văn Hóa Tại Khu Du Lịch - Hay Xĩu Ngang!Tiểu Luận Quản Lý Các Dịch Vụ Văn Hóa Tại Khu Du Lịch - Hay Xĩu Ngang!
Tiểu Luận Quản Lý Các Dịch Vụ Văn Hóa Tại Khu Du Lịch - Hay Xĩu Ngang!
 
Tiểu Luận Nâng Cao Hiệu Quả Công Tác Quản Lý Các Điểm Di Tích Lịch Sử Văn H...
Tiểu Luận Nâng Cao Hiệu Quả Công Tác Quản Lý Các Điểm Di Tích Lịch Sử Văn H...Tiểu Luận Nâng Cao Hiệu Quả Công Tác Quản Lý Các Điểm Di Tích Lịch Sử Văn H...
Tiểu Luận Nâng Cao Hiệu Quả Công Tác Quản Lý Các Điểm Di Tích Lịch Sử Văn H...
 
Tiểu Luận Công Tác Quản Lý Lễ Hội Tịch - Xuất Sắc Nhất!
Tiểu Luận Công Tác Quản Lý Lễ Hội Tịch - Xuất Sắc Nhất!Tiểu Luận Công Tác Quản Lý Lễ Hội Tịch - Xuất Sắc Nhất!
Tiểu Luận Công Tác Quản Lý Lễ Hội Tịch - Xuất Sắc Nhất!
 
Tiểu Luận Công Tác Quản Lý Di Tích Và Phát Triển Du Lịch - Hay Nhứ...
Tiểu Luận Công Tác Quản Lý Di Tích Và Phát Triển Du Lịch - Hay Nhứ...Tiểu Luận Công Tác Quản Lý Di Tích Và Phát Triển Du Lịch - Hay Nhứ...
Tiểu Luận Công Tác Quản Lý Di Tích Và Phát Triển Du Lịch - Hay Nhứ...
 
Tiểu Luận Bảo Vệ Và Phát Huy Di Sản Văn Hóa Dân Tộc - Hay Chảy Ke!
Tiểu Luận Bảo Vệ Và Phát Huy Di Sản Văn Hóa Dân Tộc - Hay Chảy Ke!Tiểu Luận Bảo Vệ Và Phát Huy Di Sản Văn Hóa Dân Tộc - Hay Chảy Ke!
Tiểu Luận Bảo Vệ Và Phát Huy Di Sản Văn Hóa Dân Tộc - Hay Chảy Ke!
 
Quy Trình Tổ Chức Sự Kiện Của Công Ty Cổ Phần Truyền Thông Và Sự Kiện Taf
Quy Trình Tổ Chức Sự Kiện Của Công Ty Cổ Phần Truyền Thông Và Sự Kiện TafQuy Trình Tổ Chức Sự Kiện Của Công Ty Cổ Phần Truyền Thông Và Sự Kiện Taf
Quy Trình Tổ Chức Sự Kiện Của Công Ty Cổ Phần Truyền Thông Và Sự Kiện Taf
 
Thực Trạng Hoạt Động Tổ Chức Sự Kiện Của Công Ty Quảng Cáo
Thực Trạng Hoạt Động Tổ Chức Sự Kiện Của Công Ty Quảng CáoThực Trạng Hoạt Động Tổ Chức Sự Kiện Của Công Ty Quảng Cáo
Thực Trạng Hoạt Động Tổ Chức Sự Kiện Của Công Ty Quảng Cáo
 
Một Số Kiến Nghị Để Nâng Cao Hiệu Quảng Đối Với Dịch Vụ Quảng Cáo Và Tổ Chức ...
Một Số Kiến Nghị Để Nâng Cao Hiệu Quảng Đối Với Dịch Vụ Quảng Cáo Và Tổ Chức ...Một Số Kiến Nghị Để Nâng Cao Hiệu Quảng Đối Với Dịch Vụ Quảng Cáo Và Tổ Chức ...
Một Số Kiến Nghị Để Nâng Cao Hiệu Quảng Đối Với Dịch Vụ Quảng Cáo Và Tổ Chức ...
 
Hoàn Thiện Quy Trình Dịch Vụ Tổ Chức Sự Kiện Của Công Ty Đầu Tư
Hoàn Thiện Quy Trình Dịch Vụ Tổ Chức Sự Kiện Của Công Ty Đầu TưHoàn Thiện Quy Trình Dịch Vụ Tổ Chức Sự Kiện Của Công Ty Đầu Tư
Hoàn Thiện Quy Trình Dịch Vụ Tổ Chức Sự Kiện Của Công Ty Đầu Tư
 

Recently uploaded

BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...Nguyen Thanh Tu Collection
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docx
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docxTrích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docx
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docxnhungdt08102004
 
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh lí
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh líKiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh lí
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh líDr K-OGN
 
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...ThunTrn734461
 
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...Nguyen Thanh Tu Collection
 
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdf
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdfSơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdf
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdftohoanggiabao81
 
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdfChuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdfhoangtuansinh1
 
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptx
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptxChàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptx
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptxendkay31
 
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...Nguyen Thanh Tu Collection
 
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhvanhathvc
 
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...Nguyen Thanh Tu Collection
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...Nguyen Thanh Tu Collection
 
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdf
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdfNQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdf
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdfNguyễn Đăng Quang
 
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...hoangtuansinh1
 
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoabài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa2353020138
 

Recently uploaded (19)

BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
BỘ ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...
BỘ ĐỀ KIỂM TRA CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO CẤU TRÚC ĐỀ MIN...
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
Sáng kiến Dạy học theo định hướng STEM một số chủ đề phần “vật sống”, Khoa họ...
 
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
Sáng kiến “Sử dụng ứng dụng Quizizz nhằm nâng cao chất lượng ôn thi tốt nghiệ...
 
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docx
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docxTrích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docx
Trích dẫn trắc nghiệm tư tưởng HCM5.docx
 
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh lí
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh líKiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh lí
Kiểm tra chạy trạm lí thuyết giữa kì giải phẫu sinh lí
 
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
QUẢN LÝ HOẠT ĐỘNG GIÁO DỤC KỸ NĂNG SỐNG CHO HỌC SINH CÁC TRƯỜNG TRUNG HỌC CƠ ...
 
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...
SÁNG KIẾN “THIẾT KẾ VÀ SỬ DỤNG INFOGRAPHIC TRONG DẠY HỌC ĐỊA LÍ 11 (BỘ SÁCH K...
 
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdf
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdfSơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdf
Sơ đồ tư duy môn sinh học bậc THPT.pdf
 
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdfChuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
Chuong trinh dao tao Su pham Khoa hoc tu nhien, ma nganh - 7140247.pdf
 
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptx
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptxChàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptx
Chàm - Bệnh án (da liễu - bvdlct ctump) .pptx
 
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
TỔNG HỢP ĐỀ THI CHÍNH THỨC KỲ THI TUYỂN SINH VÀO LỚP 10 THPT MÔN NGỮ VĂN NĂM ...
 
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
ôn tập lịch sử hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh
 
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...
10 ĐỀ KIỂM TRA + 6 ĐỀ ÔN TẬP CUỐI KÌ 2 VẬT LÝ 11 - KẾT NỐI TRI THỨC - THEO C...
 
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
30 ĐỀ PHÁT TRIỂN THEO CẤU TRÚC ĐỀ MINH HỌA BGD NGÀY 22-3-2024 KỲ THI TỐT NGHI...
 
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdf
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdfNQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdf
NQA Lợi ích Từ ISO và ESG Tăng Trưởng và Bền Vững ver01.pdf
 
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
Thong bao 337-DHPY (24.4.2024) thi sat hach Ngoai ngu dap ung Chuan dau ra do...
 
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoabài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa
bài 5.1.docx Sinh học di truyền đại cương năm nhất của học sinh y đa khoa
 

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYME ALGINATE LYASE TỪ VI SINH VẬT CÓ TRONG RONG BIỂN VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG NÓ ĐỂ THỦY PHÂN ALGINATE - TẢI FREE ZALO: 093 457 3149

  • 1. 1 DANH MUÏC CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT .................................................................4 DANH MUÏC CAÙC BAÛNG BIEÅU, HÌNH VAØ ÑOÀ THÒ ......................................5 MÔÛ ÑAÀU............................................................................................................5 1. Tính caáp thieát cuûa ñeà taøi.................................................................................7 2. Muïc ñích, nhieäm vuï vaø noäi dung nghieân cöùu cuûa ñeà taøi................................8 3. Ñieåm môùi vaø yù nghóa khoa hoïc, thöïc tieãn cuûa ñeà taøi.....................................8 Chương 1. TOÅNG QUAN ...................................................................................9 1.1. Toång quan veà rong Naâu [1] .........................................................................9 1.2. Toång quan veà Alginate..............................................................................11 1.2.1. Alginate[1][11].......................................................................................11 1.2.2. Coâng thöùc caáu taïo cuûa axit alginic vaø muoái alginate [1],[11]................12 1.2.2.1. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa Alginic............................................................12 1.2.2.2. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa caùc keo Alginate.............................................14 1.2.3. Tính chaát cuûa moät soá loaïi keo Alginate .................................................15 1.3 Moät soá nghieân cöùu veà alginate lyase .........................................................18 1.4. Nhöõng nghieân cöùu veà Oligo alginate (OA) ...............................................19 1.4.1. Nhöõng nghieân cöùu trong nöôùc ................................................................19 1.4.2. Nhöõng nghieân cöùu ngoaøi nöôùc................................................................21 1.5. Toång quan sô löôïc veà caùc phöông phaùp nghieân cöùu .................................23 1.5.1. Phöông phaùp phaân laäp vi sinh vaät[6],[8] ................................................23 1.5.2. Phöông phaùp baûo quaûn gioáng vi sinh vaät ...............................................23 1.5.3. Phöông phaùp nghieân cöùu hình thaùi vi sinh vaät.[6]..................................24 1.5.4. Phöông phaùp nuoâi caáy vi sinh vaät sinh enzyme vaø thu nhaän cheá phaåm enzyme[3][4][5][7]...........................................................................................25 1.5.4.1. Phöông phaùp nuoâi caáy .........................................................................25 1.5.4.2. Thu hoài cheá phaåm enzyme ..................................................................26 Chöông 2. NOÄI DUNG VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU.........................28 2.1. Noäi dung nghieân cöùu. ................................................................................28
  • 2. 2 2.2. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu[3][6][7][8].................................................29 2.3. Phöông phaùp boá trí thí nghieäm ..................................................................29 2.3.1. Boá trí nghieäm phaân laäp chuûng vi khuaån trong töï nhieân coù khaû naêng sinh toång hôïp algL ...................................................................................................29 2.3.2. Sô ñoà boá trí thí nghieäm löïa choïn chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång hôïp algL cao.....................................................................................................30 2.3.3. Sô ñoà boá trí thí nghieäm kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa chuûng vi sinh vaät ñöôïc löïa choïn ...................................................................................................32 2.3.4. Sô ñoà boá trí thí nghieäm thu dòch enzyme algL töø moâi tröôøng sinh khoái.33 2.3.5. Sơ ñồ bố trí thí nghiệm thử nghiệm phaân caét caùc loại Natri alginate khaùc nhau bằng dung dịch enzyme thu ñược.............................................................34 2.3.6. Sô ñoà boá trí thí nghieäm xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme................................35 2.3.7. Sô ñoà boá trí thí nghieäm phaân aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät vaø khaû naêng phaân caét cuûa algL ...............................36 2.3.8. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL ......................................................................38 Sô ñoà 2.3.8: AÛnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL...38 2.3.9. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL ....................................................................................39 2.3.10. Sô ñoà boá trí thí nghieäm choïn taùc nhaân keát tuûa thích hôïp ñeå thu hoài algL töø dòch enzyme .................................................................................................40 Chöông 3. KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU VAØ THAÛO LUAÄN ...............................41 3.1. Keát quaû nghieân cöùu phaân laäp chuûng vi sinh vaät trong töï nhieân coù khaû naêng sinh toång hôïp enzyme algL ..............................................................................41 3.2. Kết quả thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật coù khả năng sinh algL cao42 3.3. Keát quaû thí nghieäm kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa vi sinh vaät ñaõ choïn.....44 3.4. Keát quaû thí nghieäm phaân caét caùc loaïi natri alginate baèng dung dòch enzyme thu ñöôïc...............................................................................................45
  • 3. 3 3.5 Keát quaû ñònh danh vi sinh vaät.....................................................................47 3.5.2. Keát quaû nhuoäm Gram vaø sinh hoùa ñònh danh baèng heä thoáng IDS14GNR....48 3.5.3. Keát quaû giaûi trình töï gene 16S treân maùy CEQ 8000 vaø tra cöùu treân BLAST SEARCH .............................................................................................49 3.6. Keát quaû thí nghieäm xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme ..........................................51 3.7. Keát quaû thí nghieäm aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät vaø khaû naêng phaân caét cuûa algL do vi sinh vaät sinh ra..............53 3.8. Keát quaû thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc ion kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL ....................................................................................54 3.9. Keát quaû nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL...................................................................................................................56 3.10. Keát quaû thí nghieäm choïn taùc nhaân keát tuûa thích hôïp ñeå taùch chieát algL töø dòch enzyme......................................................................................................58 3.11. Ñeà xuaát quy trình thu hoài cheá phaåm enzyme algL töø vi khuaån Klebsiella sp ......................................................................................................................60 Chöông 4. KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ XUAÁT YÙ KIEÁN .............................................63 4.1. Keát luaän.....................................................................................................63 4.2. Ñeà xuaát yù kieán...........................................................................................64 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO .............................................................................................66 PHUÏ LUÏC 1. CAÙC KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU............................................................70 PHUÏ LUÏC 2. HOÙA CHAÁT VAØ THIEÁT BÒ SÖÛ DUÏNG TRONG LUAÄN VAÊN............75
  • 4. 4 DANH MUÏC CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT E: Enzyme S: Cô chaát Na-alginate dd: dung dòch OA: Oligo Alginate vsv: vi sinh vaät algL: Alginate lyase Na-alg: Natri alginate EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid
  • 5. 5 DANH MUÏC CAÙC BAÛNG BIEÅU, HÌNH VAØ ÑOÀ THÒ STT TEÂN BAÛNG Trang 1 Baûng 1.2.3. Nhieät ñoä phaân huûy cuûa caùc loaïi Alginte khaùc nhau 16 2 Bảng 1.4.1. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä oligo alginate ñeán khaû naêng naûy maàm cuûa haït thoùc gioáng 19 3 Baûng 3.4. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa caùc dung dòch Na- alginate khaùc nhau 44 4 Baûng 3.5.2. Keát quaû thöû nghieäm sinh hoùa ñònh danh 47 5 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt ñộng của alginate lyase 55 TEÂN HÌNH 1 Hình 1.2.2.1a :Coâng thöùc coå ñieån cuûa hai ñôn vò monomeric trong axit Alginic 12 2 Hình 1.2.2.1b: Hình theå daïng gheá cuûa axit Uronic 13 3 Hình 1.2.2.1c: Caáu taïo cuûa axit Alginic 13 4 Hình 1.2.2.1d: Caáu taïo axit alginic theo moâ hình caùc coâng thöùc coå ñieån (coâng thöùc phoái caûnh) 13 5 Hình 1.2.2.2a: Coâng thöùc caáu taïo Na-alginate 14 6 Hình 1.2.2.2b: Coâng thöùc caáu taïo Ca-alginate 15 7 Hình 1.4.2a: Aûnh höôûng cuûa hoãn hôïp Oligomanuronate (Oligo- M) chöa baûo hoaø vaø hoãn hôïp Oligoguluronate (Oligo-G) chöa baûo hoaø leân söï daøi ra cuûa reå caây caø roát vaø caây luùa 20 8 Hình 1.4.2b: AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä hoån hôïp oligo-G ñeán söï daøi ra cuûa reå caây caøroát vaø luùa . Hình 1.4.2c: AÛnh höôûng cuûa möùc ñoä ñoàng truøng hôïp oligo-G ñeán söï daøi ra cuûa reå caây caøroát aø luùa . Ñoä daøi cuûa reå xaùc ñònh sau 8 vaø 15 ngaøy. (noàng ñoä 0,75mg/ml) 21 9 Hình 3.1a: VSV coù khuaån laïc maøu traéng söõa (C1) 40 10 Hình 3.1b: VSV coù khuaån laïc maøu môõ gaø (C2) 40
  • 6. 6 11 Hình 3.3a. Khuaån laïc vi sinh vaät maøu traéng söõa treân moâi tröôøng thaïch I 43 12 Hình 3.3b. Khuaån laïc vi sinh vaät maøu traéng söõa treân moâi tröôøng thaïch chæ coù Na-alginate 1,5% vaø soi döôùi kính hieån vi vaät kính 100x 43 13 Hình 3.5.1. Khuaån laïc vi sinh vaät phaân laäp treân caùc moâi tröôøng khaùc nhau 46 14 Hình 3.5.2. Hình aûnh teá baøo vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc 47 15 Hình 3.5.3. Sô ñoà giaûi trình töï gene 16S cuûa chuûng vi sinh vaät phaân laäp 49 TEÂN ÑOÀ THÒ 1 Ñoà thò 3.2. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% theo thôøi gian phaân caét 41 2 Ñoà thò 3.4. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa caùc dd Na-alginate 1% khaùc nhau theo thôøi gian phaân caét 44 3 Ñoà thò 3.6a. Möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% theo noàng ñoä Enzyme 50 4 Ñoà thò 3.6b. Möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na- alginate 1% theo noàng ñoä Enzyme 51 5 Ñoà thò 3.7. AÛnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån cuûa Klebsiella sp vaø hoaït ñoä enzyme algL 52 6 Ñoà thò 3.8. AÛnh höôûng caùc ion kim loaïi ñeán hoaït löïc cuûa enzyme algL 53 7 Ñoà thò 3.9. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa enzyme algL 55
  • 7. 7 MÔÛ ÑAÀU 1. Tính caáp thieát cuûa ñeà taøi Rong bieån laø nguoàn lôïi bieån cung caáp caùc chaát keo quan troïng nhö Agar, Alginate, Carrageenan duøng trong coâng ngheä thöïc phaåm vaø caùc ngaønh coâng nghieäp khaùc. Treân theá giôùi töø nhöõng naêm 1980 rong bieån ñaõ ñöôïc quan taâm nghieân cöùu. Naêm 1930 coâng ngheä cheá bieán caùc chaát Alginate, Manitol, Agar phaùt trieån maïnh vaø ngaøy caøng öùng duïng nhieàu trong thöïc teá, ñaëc bieät laø ôû caùc nöôùc Nhaät Baûn, Myõ vaø Trung Quoác. Theo Luning (1990) toång saûn löôïng cuûa Alginate laø 35.000 taán.[1] Treân theá giôùi coù nhieàu coâng trình nghieân cöùu öùng duïng cuûa Alginate trong caùc ngaønh coâng nghieäp nhö: Thöïc phaåm, döôïc phaåm, myõ phaåm, coâng ngheä deät, noâng nghieäp, coâng ngheä sinh hoïc, nghieân cöùu khoa hoïc… Keát quaû cuûa caùc coâng trình nghieân cöùu öùng duïng alginate trong noâng nghieäp cho thaáy raèng, maïch alginate sau khi caét maïch coù taùc duïng kích thích söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån ñoái vôùi caây troàng [9][10][12][13][14]. Vôùi öùng duïng naøy, thieát nghó vieäc nghieân cöùu caùc phöông phaùp caét maïch alginate ñeå saûn xuaát cheá phaåm kích thích taêng tröôûng thöïc vaät laø raát caàn thieát nhaèm taêng naêng suaát caây troàng vaø taïo ra caùc saûn phaåm coù giaù trò toát töø ñoù naâng cao giaù trò kinh teá laø moät höôùng quan troïng ñang ñöôïc caùc nhaø khoa hoc Vieät Nam quan taâm. Chính vì leõ ñoù, ñeà taøi “ Nghieân cöùu taùch chieát Enzyme Alginate lyase töø vi sinh vaät coù trong rong bieån vaø böôùc ñaàu öùng duïng noù ñeå thuyû phaân alginate” laø raát caàn thieát, goùp phaàn öùng duïng coâng ngheä sinh hoïc vaøo noâng nghieäp vaø ñôøi soáng saûn xuaát ôû nöôùc ta.
  • 8. 8 2. Muïc ñích, nhieäm vuï vaø noäi dung nghieân cöùu cuûa ñeà taøi Muïc ñích, nhieäm vuï Ñeà taøi nhaèm phaân laäp, tuyeån choïn chuûng vi sinh vaät trong tự nhieân coù khaû naêng sinh toång hôïp alginate lyase cao. Tieán haønh nuoâi caáy chuûng vi sinh vaät ñaõ tuyeån choïn trong moâi tröôøng thích hôïp sau ñoù löïa choïn phöông phaùp thích hôïp ñeå thu nhaän cheá phaåm alginate lyase töø moâi tröôøng nuoâi caáy vaø böôùc ñaàu nghieân cöùu öùng duïng caét maïch alginate. Xaùc ñònh hoaït ñoä cuûa enzyme alginate lyase theo phương phaùp ño ñộ nhớt dung dịch alginate 1% trước vaø sau khi phaân caét. 3. Ñieåm môùi vaø yù nghóa khoa hoïc, thöïc tieãn cuûa ñeà taøi Ñieåm môùi cuûa ñeà taøi Ñaây laø moät trong nhöõng nghieân cöùu ñaàu tieân veà phaân caét alginate baèng phöông phaùp sinh hoïc. Enzyme alginate lyase coù theå öùng duïng ñöôïc vaøo noâng nghieäp ñeå saûn xuaát ra cheá phaåm taêng tröôûng thöïc vaät ít ñoäc haïi cho con ngöôøi vaø goùp phaàn giaûm laøm giaûm oâ nhieãm moâi tröôøng. YÙ nghóa khoa hoïc vaø thöïc tieãn Keát quaû cuûa ñeà taøi goùp phaàn laøm phong phuù theâm nhöõng hieåu bieát veà coâng ngheä sinh hoïc vaø öùng duïng cuûa noù vaøo caùc lónh vöïc cuûa ñôøi soáng xaõ hoäi ñaëc bieät laø trong coâng ngheä saûn xuaát enzyme, noâng nghieäp vaø moät soá ngaønh coâng nghieäp khaùc. Keát quaû cuûa ñeà taøi cuõng môû roäng ñaàu ra cho ngaønh coâng nghieäp alginate cuûa Vieät Nam. Beân caïnh ñoù caùc coâng ty saûn xuaát thuoác taêng tröôûng thöïc vaät cuõng coù theå öùng duïng ñeå saûn xuaát ra moät cheá phaåm taêng tröôûng thöïc vaät ít gaây ñoäc haïi cho con ngöôøi vaø moâi tröôøng.
  • 9. 9 Chöông 1 TOÅNG QUAN 1.1. Toång quan veà rong Naâu [1] Ngaønh rong Naâu laø moät trong nhöõng ngaønh coù giaù trò kinh teá cao. Rong Naâu coù treân 190 chi, hôn 900 loaøi, phaàn lôùn soáng ôû bieån, soá loaøi vaø soá chi tìm thaáy trong nöôùc ngoït khoâng nhieàu laém. Rong coù caáu taïo nhieàu teá baøo daïng maøng giaû, daïng phieán, daïng sôïi ñôn giaûn, moät haøng teá baøo chia nhaùnh, daïng oáng hoaëc phaân nhaùnh phöùc taïp hôn daïng caây coù goác, reã, thaân, laù. Rong sinh tröôûng ôû ñænh, ôû giöõa, ôû goác caùc loùng. Ngoaøi ra, do caùc teá baøo rong daïng phieán chia caét sinh tröôûng khueách taùn goïi laø sinh tröôûng beà maët. Thaønh phaàn hoaù hoïc cuûa rong Naâu + Saéc toá Saéc toá rong Naâu laø dieäp luïc toá (Chlorophyl), dieäp hoaøng toá (Xanthophyl), saéc toá maøu naâu (Fucoxanthin), saéc toá ñoû (Caroten). Tuyø theo tyû leä caùc loaïi saéc toá maø rong coù maøu töø naâu – vaøng naâu – naâu ñaäm – vaøng luïc. Nhìn chung saéc toá cuûa rong Naâu khaù beàn. + Gluxit − Monosachride Monosacharide quan troïng trong rong Naâu laø ñöôøng Manitol ñöôïc Stenhouds phaùt hieän naêm 1884 vaø ñöôïc Kylin (1913) chöùng minh theâm. Manitol coù coâng thöùc toång quaùt laø : HOCH2 – (CHOH)4 – CH2OH Manitol tan ñöôïc trong ancol, deã tan trong nöôùc coù vò ngoït. Haøm löôïng töø 14 ÷ 25% troïng löôïng khoâ tuyø thuoäc vaøo ñieàu kieän soáng. − Polysacharide
  • 10. 10 Alginic: laø moät polysacharide taäp trung giöõa ôû vaùch teá baøo, laø thaønh phaàn chuû yeáu taïo thaønh taàng beân ngoaøi cuûa maøng teá baøo rong Naâu Alginic vaø muoái cuûa noù coù nhieàu coâng duïng trong ngaønh coâng nghieäp, noâng hoïc, y hoïc vaø thöïc phaåm. Haøm löôïng Alginic trong caùc loaïi rong Naâu khoaûng 2 ÷ 4% so vôùi rong töôi vaø 13 ÷ 15% so vôùi rong khoâ. Haøm löôïng phuï thuoäc vaøo loaïi rong, ñieàu kieän ñòa lyù moâi tröôøng maø rong sinh soáng. Theo taøi lieäu toång keát cuûa Miyake (1995) cho thaáy haøm löôïng Alginic trong caùc loaïi rong Naâu ôû caùc vuøng bieån Lieân Xoâ cuõ laø 13 ÷ 40% Theo taøi lieäu phaân tích cuûa caùc chuyeân gia Boä Thuyû saûn cho thaáy haøm löôïng Alginic trong caùc loaïi rong Naâu ôû Haûi Phoøng laø 22 ÷ 40%, trong khi ñoù, rong Naâu ôû vuøng bieån Phuù Yeân vaø Khaùnh Hoaø cao hôn haún. Haøm löôïng Alginic coù trong caùc loaøi rong ôû Mieàn Trung Vieät Nam laø khaù cao, dao ñoäng töø 12,3 ÷ 39,4% so vôùi troïng löôïng khoâ tuyeät ñoái, tuyø thuoäc vaøo loaøi vaø vuøng ñòa lyù. Trong ñoù, loaøi rong S. mcclurei vaø Turbinaria ornata coù haøm löôïng Alginic cao nhaát khoaûng 35,9 ÷ 39,4% rong khoâ tuyeät ñoái. Neáu so saùnh taát caùc vuøng bieån thì rong ôû vuøng bieån Khaùnh Hoaø coù haøm löôïng Alginic cao hôn caû (töø 26,2 ÷ 39,4% rong khoâ tuyeät ñoái). − Axit Fucxinic: coù tính chaát gioáng vôùi axit Alginic. Axit Fucxinic taùc duïng vôùi axit Sunfuric taïo thaønh hôïp chaát coù maøu tuyø thuoäc vaøo noàng ñoä axit Sunfuric. − Fuccoidin: laø loaïi muoái giöõa axit Fuccoidin vôùi caùc kim loaïi hoaù trò khaùc nhau nhö Ca, Cu, Zn. Fuccoidin coù tính chaát gaàn gioáng vôùi axit Alginic, nhöng haøm löôïng thaáp hôn Alginic. − Laminarin: Laminarin laø tinh boät cuûa rong Naâu, thöôøng gaëp ôû daïng boät khoâng maøu, khoâng muøi vaø coù hai loaïi hoaø tan vaø khoâng hoaø tan trong nöôùc.
  • 11. 11 Laminarin coù haøm löôïng töø 10 ÷ 15% troïng löôïng rong khoâ tuyø thuoäc vaøo loaïi rong, vò trí ñòa lyù vaø moâi tröôøng sinh soáng cuûa rong Naâu. − Cellulose: laø thaønh phaàn caáu taïo neân voû caây rong. Haøm löôïng Cellulose trong rong Naâu nhieàu hôn rong Ñoû. + Proâteâin: Proâteâin trong rong Naâu khoâng cao laém nhöng khaù hoaøn haûo. Do vaäy rong Naâu coù theå laøm thöïc phaåm. Proâteâin trong rong Naâu thöôøng ôû daïng lieân keát vôùi Iod taïo Iod höõu cô coù giaù trò cao nhö: MonoIodInzodizin, DiIodInzodizin. Haøm löôïng proâteâin rong Naâu ôû vuøng bieån Nha Trang dao ñoäng 8,05 ÷ 21,11% so vôùi troïng löôïng khoâ. Haøm löôïng axit amin cuõng ñaùng keå vaø coù giaù trò cao trong proâteâin cuûa rong bieån. + Chaát khoaùng Haøm löôïng caùc nguyeân toá khoaùng trong rong Naâu thöôøng lôùn hôn nöôùc bieån. Chaúng haïn: Iod cuûa rong bieån lôùn hôn trong nöôùc bieån töø 80 ÷90 laàn. Haøm löôïng Ba lôùn hôn trong nöôùc bieån laø 1.800 laàn. Haøm löôïng khoaùng ôû vuøng bieån Nha Trang dao ñoäng trong töø 15,51 ÷ 46,30% phuï thuoäc vaøo muøa vuï vaø thôøi kyø sinh tröôûng 1.2. Toång quan veà Alginate 1.2.1. Alginate[1][11] Alginate laø thuaät ngöõ thöôøng duøng cho caùc loaïi muoái cuûa axit alginic, nhöng cuõng coù theå xem laø taát caû caùc daãn xuaát cuûa axit alginic hay chính baûn thaân axit alginic. ÔÛ moät soá nôi thì thuaät ngöõ “algin” ñöôïc duøng thay cho alginate. Alginate toàn taïi trong caùc thaønh teá baøo cuûa rong Naâu döôùi daïng muoái canxi, Magieâ, natri cuûa axit alginic. Alginate ñöôïc hình thaønh nhôø phaûn öùng ñoàng truøng hôïp khoâng phaân nhaùnh cuûa axit α – L – guluronic vaø axit β – D – manuronic. Söï khaùc nhau giöõa caùc block laø veà kích thöôùc vaø söï thay ñoåi caùc
  • 12. 12 ñoaïn manuronic (M) vaø guluronic (G) cuõng nhö söï toàn taïi cuûa caùc block ngaãu nhieân. Caáu truùc cuûa alginate chòu aûnh höôûng cuûa nguoàn rong bieån cuõng nhö ñieàu kieän phaùt trieån cuûa rong. Ngöôøi ta raát quan taâm ñeán tyû leä M/G vì noù quyeát ñònh ñeán tính chaát cuûa gel ñöôïc taïo thaønh. Neáu tyû leä naøy caøng nhoû thì khaû naêng taïo gel cuûa alginate caøng cao vaø ngöôïc laïi. Alginate cuõng coù theå ñöôïc sinh toång hôïp töø moät loaïi vi sinh vaät robacter vinelandii, tuy nhieân saûn phaåm alginate do vi sinh vaät saûn sinh ra coù khaû naêng taïo gel keùm, ít coù tính thöông maïi neân thöôøng chæ ñöôïc ñeà caäp ñeán trong coâng taùc giaûng daïy. 1.2.2. Coâng thöùc caáu taïo cuûa axit alginic vaø muoái alginate [1],[11] 1.2.2.1. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa Alginic Alginic thuoäc polysacharide nhöng coù chöùa nhoùm carboxyl (-COOH ) trong phaân töû neân thöôøng goïi laø axit alginic hay polysacharide coù tính axit yeáu. Theo Niwa (1940) cho raèng ñôn vò caáu truùc cuûa Alginic laø Uronic coù coâng thöùc phaân töû laø (C24H30O23)n, Chapman thì cho raèng Alginic laø daïng truøng hôïp thoaùt nöôùc cuûa D.Mamuronic coù coâng thöùc (C5H9O5COOH)n vaø coâng thöùc hoaù hoïc töông ñöông cuûa Alginic laø (C6H8O6)n. Hai thuyeát töông töï nhau, n = 80 ÷83 do vaäy coù söï truøng hôïp raát lôùn. III.1.2.2. Moät soá tính chaát cuûa caùc alginate. Hình 1.2.2.1a :Coâng thöùc coå ñieån cuûa hai ñôn vò monomeric trong axit Alginic
  • 13. 13 Theo caùc taøi lieäu hoaù sinh gaàn ñaây moâ taû caáu taïo cuûa Alginic goàm caùc axit D.Manuronic lieân keát vôùi L.Lunuronic baèng lieân keát 1 – 4 maïch thaúng khoâng phaân nhaùnh Alginic laø polymer goàm nhieàu axit Manuronic (M) keát hôïp vôùi Guluronic (G) taïo maïch thaúng khoâng phaân nhaùnh vaø coù theå lieân keát theo hình phaúng sau: Treân phaân töû Alginic, caùc phaân töû M vaø G seõ toå hôïp thaønh caùc block theo daïng hình sau ñaây: Hình 1.2.2.1b: Hình theå daïng gheá cuûa axit Uronic Hình 1.2.2.1d: Caáu taïo axit alginic theo moâ hình caùc coâng thöùc coå ñieån (coâng thöùc phoái caûnh) Hình 3: Caáu taïo cuûa Alginic axit Hình 1.2.2.1c: Caáu taïo cuûa axit Alginic
  • 14. 14 1.2.2.2. Ñaëc ñieåm, caáu taïo cuûa caùc keo Alginate. Natri Alginate. Coâng thöùc phaân töû: (C5H7O4COONa)n. Coâng thöùc caáu taïo: Hình 1.2.2.1e: G block Hình 1.2.2.1f: M block Hình 1.2.2.1g: MG block Hình 1.2.2.2a: Coâng thöùc caáu taïo Na-alginate
  • 15. 15 Canxi Algiante. Coâng thöùc phaân töû: [(C5H7O4COO)2 Ca)]n. Coâng thöùc caáu taïo: Alginate Amonium 1.2.3. Tính chaát cuûa moät soá loaïi keo Alginate Muoái alginate cuûa kim loaïi hoaù trò I ( Natri alginate ) deã hoøa tan trong nöôùc, taïo dung dòch keo nhôùt, coù ñoä dính vaø ñoä nhôùt cao, khi laøm laïnh khoâng ñoâng vaø khi khoâ trong suoát coù tính ñaøn hoài. Muoái Alginate cuûa kim loaïi hoùa trò II ( Alginate Canxi, Alginate Magieâ,…) khoâng hoaø tan trong nöôùc, tuyø theo kim loaïi maø coù maøu khaùc nhau. Khi muoái aåm thì deûo deã bieán hình, khi khoâ raát cöùng, raát khoù thaám nöôùc, nhôø coù tính chaát naøy maø Alginate coù raát nhieàu öùng duïng trong caùc lónh vöïc khaùc nhau. Boät Alginate deã bò giaûm ñoä nhôùt neáu khoâng ñöôïc baûo quaûn ôû nhieät ñoä thaáp. Khaùc vôùi Agar thì khi giaûm nhieät ñoä thì dung dòch Alginate khoâng bò ñoâng laïi, ngay caû khi laøm laïnh vaø tan giaù thì ñoä nhôùt vaø beà ngoaøi cuõng khoâng thay ñoåi. Hình 1.2.2.2b: Coâng thöùc caáu taïo Ca-alginate
  • 16. 16 Propyleneglycol Alginate ( PGA) vôùi 80 – 85% nhoùm -COOH ñöôïc ester hoaù coù taùc duïng nhoû nhaát vôùi ion Canxi, do ñoù hôïp chaát naøy ñöôïc öùng duïng trong coâng nghieäp söõa. PGA giaûm tính hoaø tan khi pH moâi tröôøng 4. pH = 2 thì PGA bò keát tuûa. Caùc loaïi Alginate khaùc nhau thì seõ bò phaân huyû ôû caùc nhieät ñoä khaùc nhau. Theo nghieân cöùu cuûa Kenfikato – Khoa Thuyû saûn Tröôøng Ñaïi hoïc Hokaido, Nhaät Baûn cho thaáy nhieät phaân huûy cuûa caùc Alginate trong baûng sau: Alginate Nhieät ñoä phaân huûy ( o C ) Axit Alginic Na – Alginate(1) Na – Aginate(2 ) Ca – Algiante Al – Alginate Fe – Alginate 186 221,5 231,5 204,5 196 218,5 Baûng 1.2.3. Nhieät ñoä phaân huûy cuûa caùc loaïi Alginate khaùc nhau Ñoä nhôùt vaø troïng löôïng phaân töû. Dung dòch Alginate taïo neân ñoä nhôùt cao khi hoaø tan trong nöôùc. Ñoä nhôùt cuûa noù taêng theo noàng ñoä Alginate hoaø tan vaø giaûm theo chieàu taêng cuûa nhieät ñoä. Troïng löôïng phaân töû trung bình cuûa Alginate ñöôïc ño baèng ñoä nhôùt vaø khaû naêng thaåm thaáu theo phöông trình sau ñaây: η = K.Mγ Trong ñoù: η: ñoä nhôùt M: khoái löôïng phaân töû trung bình K, γ : heä soá thöïc nghieäm.
  • 17. 17 Troïng löôïng phaân töû trung bình cuûa Alginate ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông phaùp ñoä nhôùt (Viscometric method).
  • 18. 18 1.3 Moät soá nghieân cöùu veà alginate lyase R. Scott Doubet vaø Ralph S. Quatrano (1982), thuoäc tröôøng Ñaïi hoïc Oregen State. Nghieân cöùu phaân laäp caùc vi khuaån bieån coù khaû naêng sinh Lyase ñaëc hieäu caét maïch Alginate. Cho thaáy caùc Alginate lyase ñöôïc chieát ruùt töø moâi tröôøng cuûa moät soá vi sinh vaät ñaõ ñöôïc phaân laäp. Caùc lyase naøy ñöôïc sinh ra nhôø moâi tröôøng coù alginate töï nhieân vaø coù hoaït tính vôùi caû block cuûa axit manuronic vaø axit guluronic cuûa chuoãi polymer alginate. Lyase ñaëc hieäu ñoái vôùi axit guluronic ñöôïc taùch chieát töø moâi tröôøng, trong khi ñoù lyase ñaëc hieäu vôùi axit manuronic ñöôïc taùch chieát töø teá baøo vi khuaån.[20] Naêm 1992, Manabu Kitamikado, Chao-Huang Tseng, Kuniko Yamaguchi vaø Takashi Nakamura thuoäc tröôøng Ñaïi hoïc Fukuoka, Nhaät Baûn. Nghieân cöùu hai chuûng vi sinh vaät sinh enzyme alginate lyase. Cho thaáy caùc algiante lyase ngoaïi baøo ñöôïc tinh saïch töø Vibrio harveyi Al-128 vaø V. alginolyticus ATCC 17749. Söï hình thaønh enzyme naøy ñaàu tieân caét ñöùt lieân keát α 1,4 bao goàm caùc ñôn vò L-guluronate vaø sau ñoù laø caét ñöùt caùc lieân keát beta 1,4 bao goàm caùc ñôn vò D-manuronate. Phaân töû löôïng cuûa enzyme naøy ñöôïc xaùc ñònh khoaûng töø 47.000 ñeán 57.000 Da vaø coù ñieåm ñaúng ñieän laàn löôït laø 4,3 vaø 4,6. Enzyme töø chuûng AL-128 haàu nhö hoaït ñoäng ôû moâi tröôøng coù noàng ñoä NaCl töø 0,3 ñeán 1,0 M. Coøn moâi tröôøng hoaït ñoäng toái thích cuûa enzyme töø chuûng ATCC 17749 laø söï coù maët cuûa CaCl2 coù noàng ñoä töø 5 ñeán 10 mM.[17] Naêm 2000, Wataru Hashimoto, Osamu Miyake, Keiko Momma, Shigeyuki Kawai vaø Kousaku Murata thuoäc tröôøng Ñaïi hoïc Kyoto, Nhaät Baûn. Nghieân cöùu xaùc ñònh phaân töû löôïng cuûa alginate lyase cuûa Sphingomonas sp. Chuûng A1 laø moät trong nhöõng enzyme caét maïch Alginate. Keát quaû cho thaáy alginate bò caét maïch taïo thaønh caùc oligoalginate bôûi ba loaïi enzyme ( A1-I {66
  • 19. 19 kDa}, A1-2 {25 kDa}, A1-3 {40 kDa}) ñöôïc sinh ra töø teá baøo chaát. Caùc enzyme naøy vaø gene cuûa chuùng ñöôïc phaân laäp töø caùc vi sinh vaät phaùt trieån ôû vuøng coù maët alginate.[19] Yuan-Hong Wang, Guang-Li Yu, Xin-Min Wang, Zhi-Hua LV, Xia Zhao, Zhi Hong Wu, Wei-Shang Ji (2006). Nghieân cöùu söï tinh saïch vaø ñaëc tính cuûa alginate lyase ñöôïc sinh ra töø Vibrio sp. Cho bieát caùc lyase naøy ñöôïc tinh saïch bôûi söï keát hôïp giöõa chaát laéng amonium sulfate vaø diethylaminoethyl trong coät saéc kyù Shephacel. Keát quaû cho thaát phaân töû löôïng cuûa caùc alginate lyase khoaûng 62,5 kDa, vôùi nhieät ñoä vaø pH hoaït ñoäng toái öu laàn löôït laø 250 C vaø 7,0. Khaû naêng hoaït ñoäng cuûa lyase taêng khi coù maët EDTA vaø Zn2+ , nhöng bò kìm haõm bôûi Ba2+ . Lyase naøy ñaëc hieäu caét ñöùt lieân keát beta-D-1,4 manuronic cuûa chuoãi alginate. Xiao Ting Fu, Sang Moo Kim (2007), Khoa Sinh hoïc vaø Coâng ngheä Bieån Tröôøng Ñaïi hoïc Quoác Gia Kangnung, Haøn Quoác, nghieân cöùu tinh saïch vaø tính chaát cuûa alginate lyase töø vi khuaån bieån Agarivorans albus. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy raèng alginate lyase laø moät chuoãi polypeptit coù khoái löôïng phaân töû 60 Kda vaø coù ñieåm ñaúng ñieän laø 5,5 – 5,7. pH vaø nhieät ñoä toái thích cho hoaït ñoäng cuûa enzyme naøy laàn löôït laø 7,0 vaø 400 C. Hoaït löïc cuûa enzyme bò maát hoaøn toaøn bôûi söï thaåm tích vaø phuïc hoài trôû laïi khi theâm 0,1 M Na+ hoaëc K+ .[21] 1.4. Nhöõng nghieân cöùu veà Oligo alginate (OA) 1.4.1. Nhöõng nghieân cöùu trong nöôùc Năm 2002, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt ñã sản xuất chế phẩm tăng trưởng thực vật TD bằng cách chiếu xạ tia gamma lên phân tử alginate ñể thu nhận OA có khối lượng phân tử thấp hơn.
  • 20. 20 Naêm 2002, Traàn Thaùi Hoøa vaø Nguyeãn Thò AÙi Nhung ôû Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc, Ñaïi hoïc Hueá nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa oligo alginate ñeán khaû naêng naûy maàm cuûa haït thoùc gioáng. Oligoalginate duøng ñeå thí nghieäm ñöôïc taïo ra baèng 3 phöông phaùp : chieáu xaï, phaân caét baèng kieàm vaø axit maïnh. Keát quaû nhö sau:[10] STT Toå hôïp noàng ñoä toái öu Söùc naûy maàm (%) Cheânh leäch % so vôùi maãu ñoái chöùng Taêng % so vôùi ñoái chöùng Ñieåm chaát löôïng caây maàm 1 A1 50ppm 92,4 + 10,5 111,3 9 2 A2 40ppm 91,6 + 9,7 111,8 9 3 A3 30ppm 94,7 + 12,8 115,6 9 4 Ñoái chöùng 81,9 7 Baûng 1.4.1. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä Oligo alginate ñeán khaû naêng naûy maàm cuûa haït thoùc gioáng Naêm 2005 cuõng taïi Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc Hueá, taùc giaû Voõ Thò Mai Höông cuõng ñaõ nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa OA ñeán söï phaùt trieån cuûa moät soá gioáng caây ngaén ngaøy vaø coù keát luaän nhö sau: − Oligoalginate coù khaû naêng kích thích söï sinh tröôûng, taêng söï tích luõy chaát khoâ vaø naêng ñeû nhaùnh cuûa luùa. Taïi noàng ñoä OA 80 ppm haøm löôïng chaát khoâ ñaït cao nhaát (taêng 25,40% so vôùi ñoái chöùng), soá nhaùnh/caây cao nhaát (taêng 21,10%) vaø troïng löôïng haït/chaäu cao nhaát (taêng 32,41). − OA theå hieän roõ reät taùc duïng kích thích leân sinh tröôûng cuûa caây ngoø. Noàng ñoä OA toái thích laø 60 ppm. Taïi noàng ñoä naøy troïng löôïng töôi cuûa ngoø taêng 165,145%, naêng suaát taêng 60,76%. Taát caû caùc loâ coù xöû lyù OA ñeàu coù naêng suaát cao hôn so vôùi ñoái chöùng.
  • 21. 21 − OA laøm taêng soá hoa/caây vaø tyû leä hoa höõu hieäu vaø naêng suaát cuûa laïc ôû taát caûc caùc noàng ñoä nghieân cöùu. Saûn löôïng laïc taêng 1,77 – 7,48 taï/ha vaø ñaït cao nhaát (26,83 taï/ha, taêng 38,66%) ôû noàng ñoä OA toái thích (80 ppm). 1.4.2. Nhöõng nghieân cöùu ngoaøi nöôùc Naêm 2003, caùc nhaø nghieân cöùu ôû Tröôøng Ñaïi hoïc Nagasaki, Nhaät Baûn ñaõ nghieân cöùu khaû naêng kích thích söï phaùt trieån reå caây caø roát vaø luùa cuûa caùc Oligo uronate chöa baûo hoaø töø alginate. Caùc oligo uronate chöa baûo hoaø ñöôïc chuaån bò nhôø moät enzyme alginate lyase tieâu hoaù polymannuronate ( PM ) vaø polyguluronate ( PG ), ñöôïc tinh saïch töø Pseudomonas sp. Söï phaùt trieån cuûa reå ñöôïc xaùc ñònh bôûi söï daøi ra cuûa reå caây caøroát vaø caây luùa ñöôïc uû trong moâi tröôøng coù chöùa 0,8% agar trong boùng toái. PG vaø PM khoâng coù khaû naêng kích thích söï phaùt trieån reå nhöng khi ta troän laãn caùc enzyme tieâu hoaù PG thì noù laïi coù khaû naêng kích thích söï phaùt trieån cuûa reå cuûa hai loaïi caây naøy ôû noàng ñoä toái thieåu laø 0,5mg/ml, khaû naêng kích thích söï phaùt trieån reå laø cöïc ñaïi ôû noàng ñoä 0,75 mg/ml. Hình 1.4.2a: AÛnh höôûng cuûa hoãn hôïp Oligomanuronate (Oligo-M) chöa baûo hoaø vaø hoãn hôïp Oligoguluronate (Oligo-G) chöa baûo hoaø leân söï daøi ra cuûa reå caây caø roát (a) vaø caây luùa (b). Ñoä daø i cuû a reå (cm) Thôøi gian (ngaøy) Ñoä daø i cuû a reå (cm) Thôøi gian (ngaøy) Ñoä daø i cuû a reå (cm)
  • 22. 22 Haït gioáng cuûa hai loaïi caây naøy ñöôïc ñaët trong moâi tröôøng agar ôû 250 C, trong boùng toái. Khi chieàu daøi cuûa reå ñaït töø 1 – 1,5cm sau 5 – 6 ngaøy thì tieán haønh caét reå vaø ñem uû trong moâi tröôøng coù chöùa hoån hôïp oligo-G vaø oligo-M ôû noàng ñoä 0,5mg/ml. Reå ñöôïc uû trong boùng toái vaø xaùc ñònh chieàu daøi sau 4 – 5 ngaøy uû.[13] Hai nhaø nghieân cöùu Iwasaki vaø Matsubara, Vieän Nghieân cöùu Thöïc phaåm thuoäc Quaän Kagawa, Takamatsu, Nhaät Baûn ñaõ nghieân cöùu vieäc tinh cheá caùc oligosacharide alginate với khaû naêng kích thích phaùt trieån reå cuûa caây rau dieáp. Keát quaû cho thaáy, natri alginate ñöôïc thuyû phaân bôûi alginate lyase töø Corynebacterium sp., vaø sau ñoù tinh cheá saûn phaåm nhôø quaù trình sieâu loïc (UF). Khi xöû lyù dung dòch oligo natri alginate baèng phöông phaùp sieâu loïc döôùi aùp suaát 0,15 Mpa, toác ñoä cuûa doøng chaûy khoaûng 0,6m/s, haàu heát caùc alginate khoâng ñöôïc phaân caét ñöôïc loaïi boû hoaøn toaøn. Phaàn alginate ñöôïc giöõ laïi laø moät hoãn hôïp cuûa disacharide tôùi octosacharide vaø coù khaû naêng kích thích söï phaùt trieån chieàu daøi reå caây rau dieáp ( khoaûng 2 laàn so vôùi maãu ñoái chöùng) ôû Ñoä daø i cuû a reå (cm) Noàng ñoä (mg/ml) Hình 1.4.2b: AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä hoãn hôïp oligo-G ñeán söï daøi ra cuûa reå caây caøroát (□) vaø luùa (■). Ñoä daøi cuûa reå xaùc ñònh sau 8 vaø 14 ngaøy. Hình 1.4.2c: AÛnh höôûng cuûa möùc ñoä ñoàng truøng hôïp oligo-G ñeán söï daøi ra cuûa reå caây caøroát (□) vaø luùa (■). Ñoä daøi cuûa reå xaùc ñònh sau 8 vaø 15 ngaøy. (noàng ñoä 0,75mg/ml) Ñoä daø i cuû a reå (cm)
  • 23. 23 noàng ñoä trong khoaûng 200 – 300 µg/ml. Möùc ñoä aûnh höôûng khaùc nhau cuûa caùc oligoalginate ñöôïc xaùc ñònh baèng caùch thöû töøng oligoalginate coù möùc ñoä phaân caét maïch khaùc nhau. Tri-, tetra-, penta- vaø hexasacharide ñeàu coù khaû naêng kích thích söï phaùt trieån reå cuûa caây rau dieáp. [14] 1.5. Toång quan sô löôïc veà caùc phöông phaùp nghieân cöùu 1.5.1. Phöông phaùp phaân laäp vi sinh vaät[6],[8] Phaân laäp vi sinh vaät laø quaù trình taùch rieâng vi sinh vaät ñoù töø maãu vaät hoaëc quaàn theå vi sinh vaät ban ñaàu ñeå thu gioáng ôû daïng thuaàn khieát. Caùc vi sinh sinh vaät thuaàn khieát chæ bao goàm caùc teá baøo ñöôïc sinh ra töø teá baøo ban ñaàu. Haàu heát caùc öùng duïng coâng ngheä sinh hoïc ñeàu lieân quan ñeán vieäc söû duïng gioáng thuaàn. Phaàn lôùn caùc phöông phaùp phaân laäp gioáng thuaàn khieát ñeàu döïa treân kyõ thuaät pha loaõng, thöôøng goàm caùc böôùc sau: chuaån bò maãu, taêng sinh maãu ( neáu soá löôïng vi sinh vaät coù trong maãu ít ), pha loaõng maãu, caáy maãu leân moâi tröôøng thaïch ñaëc hieäu, uû maãu ôû ñieàu kieän thích hôïp, kieåm tra vaø phaùt hieän khuaån laïc ñaë tröng, choïn khuaån laïc ñaëc tröng ñem taïo gioáng thuaàn vaø kieåm tra gioáng thuaàn. 1.5.2. Phöông phaùp baûo quaûn gioáng vi sinh vaät Baûo quaûn gioáng vi sinh vaät hay coøn goïi laø giöõ gioáng vi sinh vaät. Baûo quaûn nhaèm laøm chaäm quaù trình hoâ haáp vaø trao ñoåi chaát cuûa teá baøo vi sinh vaät, ngaên caûn söï sinh saûn cuûa chuùng, ñoàng thôøi khoâng laøm thay ñoåi phaåm chaát ban ñaàu cuûa gioáng, coù nghóa laø gioáng ñöôïc baûo quaûn toát thì seõ coù caùc quaù trình sinh lyù, sinh hoùa gioáng nhö ban ñaàu neáu gaëp ñöôïc ñieàu kieän sinh tröôûng gioáng nhö ban ñaàu. Gioáng ñem ñi baûo quaûn phaûi ôû traïng thaùi thuaàn khieát vaø trong traïng thaùi sinh, lyù toát.
  • 24. 24 Coù nhieàu phöông phaùp baûo quaûn gioáng vi sinh vaät, nhö phöông caáy chuyeàn ñònh kyø leân moâi tröôøng môùi , phöông phaùp giöõ gioáng treân moâi tröôøng thaïch coù phuû lôùp daàu khoaùng, phöông phaùp giöõ gioáng treân caùt hay haït, hay phöông phaùp ñoâng khoâ. 1.5.3. Phöông phaùp nghieân cöùu hình thaùi vi sinh vaät.[6] Vi sinh vaät laø nhöõng cô theå soáng voâ cuøng nhoû beù. Phaàn lôùn caùc vi sinh vaät khoâng theå quan saùt baèng maét thöôøng maø phaûi nhôø ñeán ñoä phoùng ñaïi cuûa kính hieån vi. Chính vì theá, kính hieån vi laø moät duïng cuï voâ cuøng quan troïng, khoâng theå thieáu trong vieäc nghieân cöùu ñaëc tính hình thaùi cuûa vi sinh vaät cuõng nhö hình daùng, kích thöôùc, khaû naêng di ñoäng, söï hình thaønh baøo töû, sinh saûn…. Caùc tieâu baûn taïm thôøi ñöôïc söû duïng ñeå quan saùt hình thaùi vi sinh vaät Ñoái vôùi tieâu baûn taïm thôøi coù nhuoäm maøu, thuoác nhuoäm vi sinh vaät phaûi khoâng ñoäc hoaëc ít ñoäc ñoái vôùi vi sinh vaät caàn quan saùt vaø phaûi pha loaõng ñeán noàng ñoä nhaát ñònh ñeå ñaûm baûo vi sinh vaät vaãn coøn soáng vaø di ñoäng. Teá baøo soáng vaø teá baøo cheát coù theå phaân bieät khi nhuoäm maøu vôùi xanh methylene. Methylene coù maøu xanh khi khoâng coù söï hieän dieän cuûa hydro vaø khoâng coù maøu khi coù maët cuûa hydro. Khi caùc teá baøo ôû traïng thaùi nghæ ( traïng thaùi ôû pha oån ñònh treân ñöôøng cong sinh tröôûng ), maëc duø coøn soáng nhöng khoâng coù khaû naêng khöû maøu xanh cuûa methylene thaønh khoâng maøu. Do ñoù, neân quan saùt teá baøo ôû giai ñoaïn ñaàu cuûa pha taêng tröôûng. Cuõng coù theå nghieân cöùu hình thaùi vi sinh vaät baèng phöông phaùp nhuoäm cuûa Christian Gram. Nhuoäm Gram khoâng nhöõng giuùp phaân bieät vi khuaån nhôø caùc ñaëc ñieåm cuûa hình thaùi vaø söï saép xeáp cuûa teá baøo maø coøn cung caáp thoâng tin veà lôùp voû teá baøo. Khi nhuoäm theo phöông phaùp naøy teá baøo vi khuaån Gram döông coù lôùp voû teá baøo taïo bôûi peptidolycan seõ coù maøu tím coøn vi khuaån Gram
  • 25. 25 aâm coù lôùp voû teá baøo moûng hôn ( do coù ít peptidolycan ) vaø ñöôïc bao boïc bôûi lôùp maøng moûng seõ coù maøu hoàng. 1.5.4. Phöông phaùp nuoâi caáy vi sinh vaät sinh enzyme vaø thu nhaän cheá phaåm enzyme[3][4][5][7] 1.5.4.1. Phöông phaùp nuoâi caáy Ñeå thu ñöôïc enzyme coù hai phöông phaùp nuoâi caáy vi sinh vaät khaùc nhau veà nguyeân taéc. Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët hay phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu hay coøn goïi laø nuoâi caáy chìm, trong nuoâi caáy chìm coù phöông phaùp nuoâi caáy chìm hai böôùc. 1. Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët Trong phöông phaùp nuoâi beà maët vi sinh vaät phaùt trieån treân beà maët cuûa moâi tröôøng dinh döôõng ñaëc tröng ôû theå raén ñaõ ñöôïc laøm aåm vaø voâ truøng. Trong moâi tröôøng dinh döôõng ngöôøi ta thöôøng cho theâm caùc chaát caûm öùng caàn thieát cho söï toång hôïp enzyme naøo ñoù hoaëc moät soá chaát dinh döôõng boå sung nguoàn nitô,photpho nhö nöôùc chieát ngoâ, khoai taây, dòch chieát naám men… Ñeå ñaûm baûo ñoä xoáp cuûa moâi tröôøng caàn coù caùc chaát taïo ñoä xoáp nhö traáu tyû leä töø 10 – 20%. Tröôùc khi gieo caáy vi sinh vaät moâi tröôøng caàn phaûi ñöôïc voâ truøng ñeå ñaûm baûo khoâng bò laây nhieåm vi sinh vaät laï trong khi nuoâi. Ñeå nuoâi caáy be maët ngöôøi ta thöôøng duøng maønh maønh hoaëc khung ñuïc loã ñeå trong phoøng kín. Phöông phaùp nuoâi beà maët thöôøng thích hôïp ñeå nuoâi caáy caùc teá baøo naám moác vì khaû naêng phaùt trieån maïnh neân ít bò taïp nhieãm. 2. Phöông phaùp nuoâi caáy chìm Phöông phaùp nuoâi caáy chìm vi sinh vaät phaùt trieån trong moâi tröôøng loûng coù suïc khí vaø khuaáy ñaûo lieân tuïc. Nguoàn cung caáp cacbon phuï thuoäc vaøo töøng loaïi vi sinh vaät sinh enzyme. Trong thöïc teá saûn xuaát ngöôøi ta coøn duøng caû moät soá saûn phaåm thuûy phaân cuûa tinh boät ñeå taïo nguoàn cacbon deã daøng ñöôïc ñoàng
  • 26. 26 hoùa. Coøn nguoàn nitô ngöôøi ta hay duøng nguoàn nitô höõu cô nhö cao ngoâ, dòch chieát naám men, khoâ laïc… Ngoaøi ra trong thaønh phaàn moâi tröôøng cuõng caàn boå sung theâm caùc chaát khoaùng. Moâi tröôøng nuoâi caáy caàn ñöôïc ñònh möùc phoái cheá coù tröø hao löôïng hôi nöôùc baùm vaøo thaønh bình vaø thanh truøng tröôùc khi caáy gioáng. Thöôøng thanh truøng moâi tröôøng baèng caùch suïc hôi nöôùc tröïc tieáp ôû nhieät ñoä 1210 C trong voøng 60 – 90 phuùt ñoái vôùi caùc moâi tröôøng chöùa caùc nguyeân lieäu boät, ñaïm thoâ vaø 20 – 30 phuùt ñoái vôùi caùc moâi tröôøng coù chöùa ñöôøng. Trong quaù trình nuoâi caáy phaûi suïc khí voâ truøng vaø khuaáy ñaûo lieân tuïc. Thôøi gian keùo daøi töø 1 – 4 ngaøy tuøy thuoäc vaøo töøng loaïi vi sinh vaät. Trong nuoâi caáy chìm vieäc khoáng cheá pH , ñieàu kieän yeám khí vaø voâ truøng laø nhöõng ñieàu kieän ñaëc bieät quan troïng vaø ñöôïc chuù yù nhieàu hôn nuoâi caáy beà maët. 3. Phöông phaùp nuoâi chìm hai böôùc Theo phöông phaùp naøy caùc teá baøo vi sinh ñöôïc nuoâi trong thieát bò ñeå phaùt trieån toái ña, sau ñoù ñöôïc chuyeån tôùi thieát bò leân men sinh toång hôïp enzyme, trong ñoù thaønh phaàn moâi tröôøng khaùc vôùi ñieàu kieän phaùt trieån cuûa vi sinh vaät. Phöông phaùp naøy coù öu ñieåm laø khoâng coù chaát kích thích, saûn löôïng enzyme cao vaø chæ caàn moät löôïng nhoû chaát dinh döôõng. Phöông phaùp naøy coù nhieàu thuaän lôïi trong vieäc kieåm tra vaø taïo ñieàu kieän toát cho caùc pha rieâng bieät ñoù laø pha sinh tröôûng vaø pha cheá taïo enzyme, vì vaäy hieäu quaû cao. 1.5.4.2. Thu hoài cheá phaåm enzyme Caùc cheá phaåm enzyme ñöôïc öùng duïng trong thöïc teá vôùi nhieàu daïng khaùc nhau. Trong moät soá tröôøng hôïp, canh tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät coù chöùa enzyme ñöôïc söû duïng tröïc tieáp khoâng caàn taùch taïp chaát neáu caùc taïp chaát ñoù khoâng gaây taùc haïi ñaùng keå ñeán saûn phaåm vaø kyõ thuaät saûn xuaát sau naøy ( ví duï: saûn xuaát röôïu, da)
  • 27. 27 Cuõng coù nhieàu tröôøng hôïp ngöôøi ta caàn ñeán cheá phaåm enzyme tinh khieát vôùi möùc ñoä khaùc nhau tuøy theo yeâu caàu söû duïng ( ví duï: coâng nghieäp deät, coâng nghieäp ñöôøng töø tinh boät, y hoïc, nghieân cöùu khoa hoïc …). Enzyme raát deã bò giaûm hoaït tính döôùi taùc duïng cuûa caùc taùc nhaân beân ngoaøi do ñoù khi tinh cheá enzyme caàn traùnh söï bieán tính proâteâin, gaây aûnh höôûng xaáu ñeán hoaït tính cuûa enzyme, caàn tieán haønh quaù trình thu hoài nhanh ôû nhieät ñoä thaáp. Noùi chung khoâng coù moät quy trình chung ñeå chieát xuaát vaø tinh cheá enzyme. Tuøy theo töøng tröôøng hôïp maø ngöôøi ta aùp duïng caùc phöông phaùp chieát xuaát vaø tinh cheá khaùc nhau.
  • 28. 28 Chöông 2 NOÄI DUNG VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 2.1. Noäi dung nghieân cöùu. Nhöõng noäi dung nghieân chính trong ñeà taøi ñöôïc trình baøy treân sô ñoà sau: Sô ñoà 2.1: Nhöõng noäi dung nghieân cöùu chính. Phaân laäp, tuyeån choïn chuûng vi khuaån sinh toång hôïp alginate lyase trong töï nhieân. Nuoâi caáy chuûng vi sinh vaät ôû 37o C, trong 2 ngaøy Sinh khoái vaø taùch chieát alginate lyase töø moâi tröôøng nuoâi caáy vi khuaån. Böôùc ñaàu phaân caét caùc alginate khaùc nhau baèng alginate lyase Xaùc ñònh hoaït ñoä alginate lyase Thu thaäp soá lieäu vaø ñöa ra keát luaän Nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa moät soá yeáu toá ñeán khaû naêng phaân caét alginate cuûa alginate lyase Nghieân cöùu taùch chieát alginate lyase töø dòch sinh khoái baèng dung moâi thích hôïp Ñònh danh vi sinh vaät sinh
  • 29. 29 2.2. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu[3][6][7][8] 2.2.1. Phaân laäp vi sinh vaät baèng kyõ thuaät pha loaõng 2.2.2. Kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa vi sinh vaät baèng phöông phaùp caáy ria vaø soi kính hieån vi 2.2.3. Giöõ gioáng vi sinh vaät baèng phöông phaùp caáy truyeàn ñònh kyø leân moâi tröôøng. 2.2.4. Xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme baèng phöông phaùp ño ñoä nhôùt 2.2.5. Xaùc ñònh nhieät ñoä vaø pH baèng nhieät keá vaø pH keá 2.2.6. Xaùc ñònh soá löôïng teá baøo baèng phöông phaùp caáy gaït 2.2.7. Thu hoài cheá phaåm enzyme baèng phöông phaùp keát tuûa 2.2.8. Ñònh danh vi sinh vaät baèng phöông phaùp giaûi trình töï gene 16S 2.2.9. Xöû lyù soá lieäu baèng phaàn meàm Microsoft Office Excel 2.3. Phöông phaùp boá trí thí nghieäm 2.3.1. Boá trí nghieäm phaân laäp chuûng vi khuaån trong töï nhieân coù khaû naêng sinh toång hôïp algL Alginate 1% Ñoå xuoáng ñaát Laáy maãu ñaát hoøa vaøo nöôùc tieät truøng Caáy vaøo moâi tröôøng agar chöùa 1,5% algiante natri Nuoâi caáy ôû 37o C trong 02 ngaøy
  • 30. 30 Sô ñoà 2.3.1: Boá trí thí nghieäm phaân laäp chuûng vi khuaån coù khaû naêng sinh toång hôïp algL Rong Naâu ñöôïc uû trong ñaát một thời gian cho ñeán khi bò muõn ra. Khi thấy rong ñã bị phân hủy, chuaån bò 100 ml dung dòch alginate 1%, ñoå xuoáng khoaûng 30cm2 ñaát ñaõ uû rong Naâu, ñònh kyø 2 ngaøy moät laàn, tieán haønh lieân tuïc trong 02 thaùng. Sau ñoù laáy khoaûng 1 g ñaát ôû ñoä saâu töø 3 -5 cm cho vaøo 5ml nöôùc tieät truøng, troän ñeàu treân maùy troän maãu, ñeå oån ñònh roài laáy 10 µl huyeàn phuø noåi treân beà maët caáy trang vaøo 10 ml moâi tröôøng thaïch agar coù chöùa 1,5 % alginate natri nhö nguoàn cacbon cô baûn, uû ôû 37o C trong 02 ngaøy. 2.3.2. Sô ñoà boá trí thí nghieäm löïa choïn chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång hôïp algL cao Khuaån laïc vi sinh vaät sau khi phaân laäp Thu hoài dòch enzyme Nuoâi caáy vaø sinh khoái vi sinh vaät Phaân caét dung dòch alginate 1% Löïa choïn chuûng vi sinh thích hôïp - Nhieät ñoä: 370 C - pH = 7,0 – 7,5 - tyû leä E/S = 4/10
  • 31. 31 Sô ñoà 2.3.2: Boá trí thí nghieäm löïa choïn chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång hôïp algL cao Moâi tröôøng vaø ñieàu kieän nuoâi caáy − Thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy (moâi tröôøng I) Na-alginate : 0,5% Pepton : 0,1% Dòch chieát naám men: 0,5% CaCl2 : 0,5% pH : 7,0 -7,5 − Thaønh phaàn moâi tröôøng sinh khoái (moâi tröôøng II) Na-alginate : 0,5% Pepton : 0,5% Dòch chieát naám men : 0,1% NaCl : 0,5% KH2PO4 : 0,1% MgSO4 : 0,1% pH : 7,0 -7,5 Sau khi phaân laäp treân moâi tröôøng agar coù chöùa 1,5% alginate ôû 370 C trong 2 ngaøy, khuaån laïc cuûa caùc vi sinh vaät khaùc nhau coù khaû naêng phaân caét natri alginate seõ phaùt trieån treân beà maët cuûa thaïch. Duøng que caáy voâ khuaån laáy moät ít caùc khuaån laïc naøy hoøa vaøo 10ml nöôùc caát voâ truøng, roài pha loaõng ñeán 105 laàn, sau ñoù laáy 10µl caáy trang leân moâi tröôøng thaïch I, nuoâi caáy 2 ngaøy ôû 370 C trong tuû aám. Ñeán khi treân moâi tröôøng thaïch chæ coù nhöõng khuaån laïc ñaõ choïn phaùt trieån(coù theå coi laø thuaàn khieát) thì sinh khoái caùc chuûng vi sinh vaät naøy trong bình tam giaùc coù chöùa 10 ml moâi tröôøng loûng II (ñaõ löïa choïn) ôû nhieät ñoä
  • 32. 32 phoøng trong 2 ngaøy treân maùy laéc vôùi toác ñoä 250v/p, tieáp tuïc laáy 3ml dòch sinh khoái töø 10ml treân ñoå vaøo bình tam giaùc 500ml chöùa 100ml moâi tröôøng loûng II roài sinh khoái trong ñieàu kieän töông töï. Töø 100ml dòch sinh khoái treân laáy tieáp 90ml ñoå vaøo bình tam giaùc 1000ml chöùa 500ml moâi tröôøng loûng II vaø sinh khoái ôû nhieät ñoä phoøng, 370 C, treân maùy laéc 250v/p. Löu yù: − Que caáy voøng sau khi laáy khuaån laïc vi sinh vaät treân moâi tröôøng thaïch phaûi ñöôïc khöû truøng treân ngoïn ñeàn coàn tröôùc khi laáy tieáp moät khuaån laïc vi sinh vaät khaùc. − Ñoái vôùi caùc khuaån laïc vi sinh vaät khaùc nhau, tieán haønh nuoâi caáy vaø sinh khoái trong caùc hoäp loàng vaø bình tam giaùc khaùc nhau. Laøm laïnh dòch sinh khoái thu ñöôïc xuoáng 30 C, roài ly taâm vôùi toác ñoä 10.000v/p ôû nhieät ñoä 100 C trong 30’. Thuyû phaân dung dòch natri alginate baèng caùc dòch enzyme thu ñöôïc sau ly taâm ôû ñieàu kieän nhaát ñònh ñeå löïa choïn chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång enzyme cao. 2.3.3. Sô ñoà boá trí thí nghieäm kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa chuûng vi sinh vaät ñöôïc löïa choïn Chuûng vi sinh vaät ñaõ löïa choïn Pha loaõng baèng nöôùc voâ truøng Caáy leân moâi tröôøng thaïch I Kieåm tra khuaån laïc hoaëc soi döôùi kính hieån vi Pha loaõng baèng nöôùc voâ truøng
  • 33. 33 Sô ñoà 2.3.3: Boá trí thí nghieäm kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa chuûng vi sinh vaät ñaõ löïa choïn Duøng que caáy voøng laáy moät ít khuaån laïc cuûa vi sinh vaät ñaõ löïa choïn hoøa trong 1ml nöôùc caát tieät truøng, tieáp tuïc pha loaõng baèng caùch dùng pipet laáy 0,1 ml töø oáng nghieäm ban ñaàu ñoå sang oáng nghieäm coù chöùa 0,9ml nöôùc caát tieät truøng, tieáp tuïc pha loaõng baèng caùch laáy 0,1ml töø oáng nghieâm thöù 2 ñoå sang oáng nghieäm thöù 3 coù chöùa 0,9 ml nöôùc caát tieät truøng, tieán haønh töông töï cho ñeán oáng nghieäm thöù 5, ta thu ñöôïc dung dòch vi sinh vaät ñöôïc pha loaõng 105 laàn. Laáy 0,1 ml dung dòch vi sinh vaät töø oáng nghieäm thöù 5 caáy trang leân moâi tröôøng thaïch I trong hoäp loàng petri ñaõ chuaån bò tröôùc. Ñeå dung dòch vi sinh vaät ngaám vaøo moâi tröôøng trong vaøi phuùt. Laät ngöôïc hoäp loàng petri ñaõ caáy vi sinh vaät, nuoâi trong tuû aám ôû 370 C, trong thôøi gian 2 ngaøy. Sau 2 ngaøy nuoâi caáy kieåm tra caùc khuaån laïc moïc treân moâi tröôøng thaïch, neáu caùc khuaån laïc moïc rieâng leû coù hình daïng, maøu saéc gioáng nhau thì coù theå keát luaän chuûng vi sinh vaät laø thuaàn khieát, hoaëc coù theå kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa vi sinh vaät baèng caùch soi döôùi kính hieån vi hoaëc caáy trang. 2.3.4. Sô ñoà boá trí thí nghieäm thu dòch enzyme algL töø moâi tröôøng sinh khoái 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 1ml 0,9ml 0,9ml 0,9ml 0,9ml Sinh khoái Ly taâm 10000v/p, 30’ Dòch enzyme Vi sinh vaät thuaàn khieát
  • 34. 34 T heo taøi lieäu tham khaûo thì quaù trình thu dòch enzyme phaûi tieán haønh ôû nhieät ñoä laïnh 50 C. Tuy nhieân, do ñieàu kieän thí nghieäm neân dòch sinh khoái ñöôïc laøm laïnh xuoáng 30 C roài ly taâm ôû nhieät ñoä 100 C vôùi toác ñoä 10000 v/p trong 30 phuùt. 2.3.5. Sơ ñồ bố trí thí nghiệm thử nghiệm phaân caét caùc loại Natri alginate khaùc nhau bằng dung dịch enzyme thu ñược Alginate Thaùi Lan (A1) Alginate Tröôøng ÑH Nha Trang(A3) Alginate Trung Quoác(A2) Saûn phaåm sau phaân caét Phaân caét Nhieät ñoä: 370 C pH = 7,0 ÷ 7,5 Thôøi gian: 20’, 40’, 60’ 10 / 4 = S E Ño ñoä nhôùt Sô ñoà 2.3.4: Boá trí thí nghieäm thu dòch enzyme töø dòch sinh khoái
  • 35. 35 Sô ñoà 2.3.5: Thí nghieäm phaân caét caùc loaïi natri alginate khaùc nhau baèng dung dòch enzyme thu ñöôïc Caùc maãu natri alginate khaùc nhau ñöôïc maõ hoùa laø caùc maãu A1, A2, A3 vaø pha thaønh 100 ml dung dòch 1%, ñöïng trong bình tam giaùc 250 ml, theâm vaøo moãi bình 40 ml dung dòch enzyme vöøa thu ñöôïc, ñieàu chænh pH = 7,0 – 7,5 roài tieán haønh phaân caét ôû nhieät ñoä 370 C trong thôøi gian 20’, 40’, 60’. Ño ñoä nhôùt saûn phaåm thu ñöôïc ở 200 C. 2.3.6. Sô ñoà boá trí thí nghieäm xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme Sô ñoà 2.3.6: Boá trí thí nghieäm xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme Xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme baèng phöông phaùp ñoä nhôùt Nguyeân taéc: theo taøi lieäu nghieân cöùu cuûa caùc taùc giaû A. Nakagawa, T. Ozaki, K. Chubachi, T. Hosoyama thuoäc chuyeân ngaønh Sinh hoïc – Tröôøng Ñaïi hoïc Teikyo vaø Khoa sinh hoïc öùng duïng – Tröôøng Ñaïi hoïc Utsunomiya. Ñeå xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme algL coù 2 phöông phaùp, phöông phaùp ñoä nhôùt vaø 100ml dung dòch natri alginate 1% Phaân caét - Dung dòch enzyme 5 ÷ 40 ml - pH = 7,0 ÷ 7.5 - t0 = 37 0 C - thôøi gian: 20’ Saûn phaåm sau phaân caét Ño ñoä nhôùt Keát luaän
  • 36. 36 phöông phaùp so maøu vôùi axit uronic. Vôùi phöông phaùp ñoä nhôùt thì moät ñôn vò hoaït ñoä cuûa enzyme algL ñöôïc ñònh nghóa laø löôïng enzyme laøm giaûm 50% ñoä nhôùt cuûa dung dòch natri alginate 1% trong 20 phuùt. Phaân caét natri alginate vôùi 5 ÷ 40 ml ( böôùc nhaûy 5ml) dung dòch enzyme trong 20’, sau ñoù tieán haønh ñoä nhôùt vaø xaùc ñònh moät ñôn vị hoạt ñộ töông öùng vôùi bao nhieâu ml dung dòch enzyme. Tieán haønh: Chuaån bò 9 bình tam giaùc 250 ml coù chöùa 100 ml dung dòch natri alginate 1%, trong ñoù moät bình ñoái chöùng vaø 8 bình coøn laïi laàn löôït ñöôïc boå sung töø 5 ÷ 40 ml (böôùc nhaûy 5 ml) dung dòch enzyme, phaân caét ôû nhieät ñoä 370 C, treân maùy laéc toác ñoä 250 v/p trong 20 phuùt. Ño ñoä nhôùt cuûa dung dịch baèng nhôùt keá roto ở 200 C. 2.3.7. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät vaø khaû naêng phaân caét cuûa algL Khuaån laïc vi sinh vaät Sinh khoái 1 Sinh khoái 2 12h 24h 36h 48h 60h 72h Ly taâm Phaân caét alginate - pH = 7,0 – 7,5 - To = 370 C - 10 2 = S E thời gian = 20’
  • 37. 37 Sô ñoà 2.3.7. Boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán khaû naêng thuyû phaân alginate Duøng que caáy voøng voâ truøng laáy moät ít khuaån laïc vi sinh vaät treân moâi tröôøng thaïnh I roài sinh khoái laàn 1 trong bình tam giaùc 500ml coù chöùa 100 ml moâi tröôøng II trong 12h ôû nhieät ñoä phoøng treân maùy laéc toác ñoä 250 v/p. Chuaån bò 6 bình tam giaùc 500ml coù chöùa 100ml moâi tröôøng II coù ñaùnh soá thöù töï töø 1 ñeán 6 ñeå sinh khoái laàn 2 baèng caùch: laàn löôït laáy 10ml dung dòch sinh khoái laàn 1 ñaõ qua 12h sinh khoái cho vaøo laàn löôït 6 bình tam giaùc noùi treân, ñaët 6 bình tam giaùc leân maùy laéc toác ñoä 250 v/p, ôû nhieät ñoä phoøng vaø sinh khoái ôû caùc thôøi gian khaùc nhau. Bình tam giaùc 1 sinh khoái trong 12h, bình tam giaùc 2 sinh khoái trong 24h, laàn löôït cho caùc bình tam giaùc 3,4,5,6 sinh khoái vôùi thôøi gian laàn löôït laø 36h, 48h, 60h, 72h. Sau khi ñaït thôøi gian sinh khoái, tieán haønh ly taâm dòch sinh khoái vôùi toác ñoä 10.000 v/p ôû nhieät ñoä 100 C trong thôøi gian 30 phuùt. Dòch enzyme thu ñöôïc sau khi ly taâm ñöôïc duøng ñeå phaân caét dung dòch alginate 1%, töø ñoù xaùc ñònh ñöôïc söï aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy vi sinh vaät ñeán khaû naêng phaân caét alginate cuûa enzyme alginte lyase. Söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät ñöôïc xaùc ñònh baèng caùch ñeám teá baøo baèng phöông phaùp caáy gaït
  • 38. 38 2.3.8. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL Sô ñoà 2.3.8: AÛnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL Chuaån bò 12 bình tam giaùc 250 ml chöùa 100 dung dòch alginate 1%, trong ñoù moät bình ñoái chöùng chæ phaân caét vôùi 40ml dung dòch enzyme, 1 bình phaân caét vôùi 40ml dòch enzyme ñaõ ñöôïc xöû lyù vôùi 1mM EDTA, 5 bình tam giaùc phaân caét vôùi dòch enzyme ñaõ ñöôïc boå sung 2mM caùc muoái kim loaïi, 5 bình coøn laïi phaân caét baèêng enzyme ñaõ xöû lyù 1mM EDTA vaø 2mM caùc muoái kim loaïi. Caùc muoái kim loaïi ñöôïc söû duïng laø: CaCl2, MnCl2, MgCl2, CuCl2, FeCl2. Phaân caét trong thôøi gian 20 phuùt, sau ñoù ño ñoä nhôùt vaø xaùc ñònh ñöôïc aûnh höôûng cuûa caùc ion kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL. Dung dòch natri alginate 1% Phaân caét pH = 7,0 ÷ 7,5 to = 370 C Caùc muoái kim loaïi 10 4 = S E thời gian = 20’ Saûn phaåm sau phaân caét Ño ñoä nhôùt Keát luaän
  • 39. 39 2.3.9. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL Sô ñoà 2.3.9. Nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL Söï aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL ñöôïc thí nghieäm töø 10 ÷ 60o C, vôùi böôùc nhaûy laø 10. Dung dòch natri alginate 1% Phaân caét pH = 7,0 ÷ 7,5 to = 10 ÷ 60 0 C 10 4 = S E thời gian = 20’ Saûn phaåm sau phaân caét Ño ñoä nhôùt Keát luaän
  • 40. 40 2.3.10. Sô ñoà boá trí thí nghieäm nghieân cöùu choïn taùc nhaân keát tuûa thích hôïp ñeå thu hoài algL töø dòch enzyme Sô ñoà 2.3.10. Boá trí thí nghieäm ngieân cöùu choïn taùc nhaân keát tuûa thích hôïp ñeå taùch chieát AlgL Tieán haønh thí nghieäm thu hoài cheá phaåm enzyme thoâ töø dòch sinh khoái baèng muoái trung tính (NH4)2SO4 (theâm tröïc tieáp vaøo dòch enzyme cho tôùi khi baõo hoøa, thöôøng laø ñaït 70%, luoân giöõ dòch enzyme ôû nhieät ñoä 40 C). Coàn 600 vaø acetol ñöôïc theâm vaøo dòch enzyme vôùi tyû leä 1:1, giöõ ôû nhieät ñoä 40 C trong 12h. Sau ñoù ly taâm ñeå thu hoài cheá phaåm enzyme thoâ. Laøm laïnh (4 0 C) Keát tuûa 12h ôû 4 0 C Ly taâm 1000 v/p Dòch enzyme Enzyme thoâ - (NH4)2SO4 baõo hoøa - Dung moâi: Coàn 600 , acetol -pH = 7,0 – 7,5 - T0 = 4 0 C - Tyû leä = 1:1 Phaân caét Na-alg 1% Choïn dung moâi thích hôïp - E/S = 0,5g/100ml - T0 = 370 C - pH = 7,0 – 7,5 - thời gian = 20’
  • 41. 41 CHÖÔNG 3 KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU VAØ THAÛO LUAÄN 3.1. Keát quaû nghieân cöùu phaân laäp chuûng vi sinh vaät trong töï nhieân coù khaû naêng sinh toång hôïp enzyme algL Nhaän xeùt: Sau 2 ngaøy nuoâi caáy ôû nhieät ñoä 370 C, treân cuøng moät moâi tröôøng thaïch chæ coù natri alginate1,5% laø nguoàn cacbon cô baûn thaáy coù 2 loaïi khuaån laïc phaùt trieån, moät coù maøu traéng söõa vaø moät coù maøu môõ gaø. Tieáp tuïc phaân laäp 2 loaïi vi sinh vaät naøy ôû noàng ñoä pha loaõng 10-5 treân moâi tröôøng thaïch, khuaån laïc cuûa 2 loaïi naøy phaùt trieån nhö hình 3.1a vaø 3.1b. Döïa vaøo hình 3.1a vaø 3.1b thaáy raèng treân moâi tröôøng thaïch, khuaån laïc cuûa 2 chuûng vi sinh vaät naøy ñeàu coù hình troøn, phaùt trieån rieâng leû tuy nhieân khuaån laïc maøu traéng söõa coù ñöôøng kính (1÷2mm) lôùn hôn so vôùi khuaån laïc maøu môõ gaø (1mm), khuaån laïc maøu traéng söõa cuõng phaùt trieån vôùi maät ñoä daøy hôn so vôùi khuaån laïc maøu môõ gaø. Töø keát quaû nghieân cöùu coù theå keát luaän raèng caû hai chuûng vi sinh vaät naøy ñeàu coù khaû naêng sinh toång hôïp enzyme alginate lyase. Tuy nhieân, khoâng Hinh 3.1a: VSV coù khuaån laïc maøu traéng söõa (C1) Hinh 3.1b: VSV coù khuaån laïc maøu môõ gaø (C2)
  • 42. 42 theå keát luaän raèng chuûng naøo coù khaû naêng sinh toång hôïp enzyme alginate coù hoaït löïc cao hôn. 3.2. Kết quả thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật coù khả năng sinh algL cao C1: Alginate lyase thu ñöôïc töø vi sinh vaät coù khuaån laïc maøu traéng söõa C2: Alginate lyase thu ñöôïc töø vi sinh vaät coù khuaån laïc maøu môõ gaø Kết quả số liệu thể hiện mức ñộ hao tổn ñộ nhớt của dung dịch Na-alginate 1% ñược trình bày ở bảng 3.2 thuộc phụ lục 1. Nhaän xeùt Khi phaân caét dung dòch Na-alginate 1% baèng dòch enzyme alginate lyase thu ñöôïc töø hai chuûng vi sinh vaät ñaõ phaân laäp trong cuøng moät ñieàu kieän thì enzyme thu ñöôïc töø hai chuûng naøy ñeàu laøm cho ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate giaûm ñi ñaùng keå, trong 20 phuùt ñaàu phaân caét ñoä nhôùt cuûa Na-alginate1% giaûm maïnh hôn 50%, khi thôøi gian phaân caét keùo daøi thì ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate tieáp tuïc giaûm nhöng giaûm khoâng maïnh nhö ban ñaàu. Thôøi gian (phuùt) Ñoà thò 3.2. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% theo thôøi gian phaân caét Ñoä nhôù t hao toå n (%) 0.0 0.0 79.9 75.4 65.7 71.3 67.9 57.5 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 0 20 40 60 C1 C2 Thôøi gian (phuùt)
  • 43. 43 Keát quaû thí nghieäm cuõng cho thaáy raèng dòch enzyme C1 coù hoaït löïc maïnh hôn so vôùi dòch enzyme C2, baèng chöùng laø trong cuøng moät ñieàu kieän phaân caét nhöng dòch enzyme C1 laøm giaûm ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% maïnh hôn so vôùi C2. Ñieàu naøy cuõng deã hieåu bôûi vì coù theå nhieàu vi sinh vaät cuøng sinh toång hôïp moät enzyme, song khoâng phaûi chuùng ñeàu coù khaû naêng sinh toång hôïp enzyme coù hoaït löïc nhö nhau, ngay caû treân caû nhöõng chuûng cuøng gioáng, cuøng loaøi. Hôn nöõa, ñaëc ñieåm vaø tính chaát sinh lyù, sinh hoùa cuûa töøng chuûng vi sinh vaät coù yù nghóa quyeát ñònh quaù trình sinh toång hôïp enzyme cuõng nhö hoaït löïc cuûa enzyme. [3][4][5] Keát luaän: Töø hai chuûng vi sinh vaät ñaõ phaân laäp ñöôïc, choïn chuûng vi sinh vaät coù khuaån laïc maøu traéng söõa ñeå tieáp tuïc nuoâi caáy vaø thu nhaän enzyme alginate lyase.
  • 44. 44 3.3. Keát quaû thí nghieäm kieåm tra tính thuaàn khieát cuûa vi sinh vaät ñaõ choïn Nhaän xeùt: Treân moâi tröôøng thaïch I, khuaån laïc cuûa vi khuaån maøu traéng söõa phaùt trieån rieâng bieät vaø coù hình daïng gioáng nhau, coøn khi soi döôùi vaät kính daàu 100x ta thaáy teá baøo vi sinh vaät naøy coù hình que, daøi töø 2÷4 µm, roäng töø 0,5÷1 µm, bắt màu hồng nên ñây là vi sinh vật gram âm. Ta cuõng thaáy ñöôïc raèng khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng thaïch I vôùi ñaày ñuû caùc chaát dinh döôõng thì khuaån laïc Hình 3.3a. Khuaån laïc vi sinh vaät maøu traéng söõa treân moâi tröôøng thaïch I Hình 3.3b. Khuaån laïc vi sinh vaät maøu traéng söõa treân moâi tröôøng thaïch chæ coù Na-alginate 1,5% vaø soi döôùi kính hieån vi vaät kính 100x
  • 45. 45 cuûa vi sinh vaät naøy phaùt trieån maïnh hôn, maät ñoä daøy hôn vaø kích thöôùc cuûa caùc khuaån laïc ñoàng ñeàu hôn so vôùi moâi tröôøng thaïch chæ coù Na-alginate 1%. Keát luaän: Döïa vaøo caùc taøi lieäu nghieân cöùu veà vi sinh vaät [2][6][8] coù theå keát luaän chuûng vi sinh vaät ñaõ thuaàn khieát. 3.4. Keát quaû thí nghieäm phaân caét caùc loaïi natri alginate baèng dung dòch enzyme thu ñöôïc 1 2 3 0 ,0 ,0 ,0 20 5,7 4,0 2,8 40 5,3 2,1 1,0 60 8,2 8,5 6,9 Na-alginate Thôøi gian (phuùt) Ñoà thò 3.4. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa caùc dd Na-alginate 1% khaùc nhau theo thôøi gian phaân caét Thôøi gian (phuùt) Ñoä nhôù t hao toå n (%) Baûng 3.4. Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa caùc dung dòch Na-alginate khaùc nhau 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 0 20 40 60 A1 A2 A3
  • 46. 46 A1: Dung dòch Na-alginate do Thaùi Lan saûn xuaát A2: Dung dòch Na-alginate do Trung Quoác saûn xuaát A3: Dung dòch Na-alginate do Tröôøng ÑH Nha Trang saûn xuaát Keát quaû soá lieäu theå hieän möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa caùc dd Na- alginate khaùc nhau ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.4 vaø phuï luïc 1. Nhaän xeùt: Töø keát quaû thí nghieäm, cho thaáy raèng khi phaân caét baèng enzyme algL thì caùc loaïi Na-alginate khaùc nhau bò phaân caét ôû caùc möùc ñoä khaùc nhau, ta cuõng nhaän thaáy raèng trong khoaûng thôøi gian ñaàu thì khi phaân caét ôû cuøng moät ñieàu kieän, loaïi Na-alginate coù ñoä nhôùt cao hôn thì möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuõng lôùn hôn . Cuï theå laø, dung dòch A1 coù ñoä nhôùt ban ñaàu laø 34,6 mPa.s, cao hôn so vôùi A2 (17,2) vaø A3 (26,8) thì trong 20 phuùt ñaàu phaân caét ñoä nhôùt cuûa A1 bò hao toån tôùi 67,6% trong khi ñoù A2 hao toån 52,3% coøn A3 laø 62,6%, thôøi gian phaân caét keùo daøi thì söï hao toån cuûa ba loaïi Na-alginate naøy laø gaàn nhö nhau. Thaûo luaän Enzyme algL tham gia caét ñöùt lieân keát 1-4 glucozit giöõa α – L – guluronate vaø axit β – D – manuronate cuûa ñaïi phaân töû alginate, maø soá löôïng lieân keát 1-4 glucozit phuï thuoäc vaøo troïng löôïng phaân töû cuûa alginate, hay noùi caùch khaùc phuï thuoäc vaøo ñoä nhôùt cuûa dung dòch alginate. n
  • 47. 47 Trong thôøi gian ñaàu, do A1 coù ñoä nhôùt lôùn neân soá löôïng lieân keát 1-4 glucozit bò phaân caét bôùi algL laø nhieàu hôn so vôùi A2 vaø A3 neân ñoä nhôùt cuûa A1 bò hao toån nhieàu hôn. Khi keùo daøi thôøi gian phaân caét thì caùc oligo alginate naøy tieáp tuïc bò caét ngaén maïch, ñoä nhôùt cuûa caùc dung dòch Na-alginate tieáp tuïc bò hao toån. Thôøi gian phaân caét keùo dài thì caùc oligo alginate trong caùc dung dòch Na-alginate naøy coù troïng löôïng gaàn töông ñöông nhau, nhöng do A1 coù noàng ñoä caùc oligo alginate lôùn hôn so vôùi A2 vaø A3 neân duø möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa A1 laø lôùn hôn nhöng ñoä nhôùt cuûa dung dòch A1 vaãn cao hôn so vôùi A2, A3. 3.5 Keát quaû ñònh danh vi sinh vaät Maãu vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc göûi ñònh danh taïi Coâng ty TNHH Nam Khoa – Thaønh phoá Hoà Chí Minh. Keát quaû ñònh danh nhö sau: 3.5.1. Keát quaû phaân laäp chuûng vi sinh vaät treân caùc moâi tröôøng phaân laäp khaùc nhau Thaïch maùu UriSelect 4 Agar Mac Conkey Agar Hektoen enteric agar Hình 3.5.1. Khuaån laïc vi sinh vaät phaân laäp treân caùc moâi tröôøng khaùc nhau
  • 48. 48 Nhaän xeùt: Khi nuoâi caáy chuûng vi sinh vaät ñaõ phaân laäp ñöôïc treân caùc moâi tröôøng khaùc nhau, quan saùt thaáy raèng khuaån laïc phaùt trieån treân caùc moâi tröôøng khaùc nhau ñeàu coù hình daïng troøn ñoàng nhaát, maøu saéc gioáng nhau vaø ñaëc tröng cho moãi moâi tröôøng. Keát luaän: Chuûng vi sinh vaät ñaõ thuaàn khieát. 3.5.2. Keát quaû nhuoäm Gram vaø sinh hoùa ñònh danh baèng heä thoáng IDS14GNR Hình 3.5.2. Hình aûnh teá baøo vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc Quan saùt keát quaû nhuoäm gram cuûa coâng ty Nam Khoa ta thaáy truøng vôùi keát quaû nghieân cöùu ban ñaàu. Chuûng vi sinh vaät phaân laäp coù daïng hình que vaø coù gram aâm. Thöû nghieäm Keát quaû Thöû nghieäm Keát quaû Oxidase - Indol - Urease + Di ñoäng - H2S - NO3 →NO2 + LCD + Citrate +
  • 49. 49 Glucose + VP + PAD - ONPG + Esculin + Malonate + 3.5.3. Keát quaû giaûi trình töï gene 16S treân maùy CEQ 8000 vaø tra cöùu treân BLAST SEARCH Baûng 3.5.2. Keát quaû thöû nghieäm sinh hoùa ñònh danh
  • 50. 50 Hình 3.5.3. Sô ñoà giaûi trình töï gene 16S cuûa chuûng vi sinh vaät phaân laäp Keát luaän: Chuûng vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc laø chuûng Klebsiella sp Klebsiella sp laø vi khuaån gram aâm, khoâng di ñoäng, teá baøo coù hình que, coù khaû naêng thuûy phaân lieân keát glucozit trong esculin taïo esuletin vaø glucose, coù theå söû duïng Malonat laøm nguoàn dinh döôõng cacbon, coù khaû naêng sinh toång hôïp Urease, chuyeån hoùa nitrate thaønh nitrite, leân men glucose, lactose. Chuûng
  • 51. 51 0.0 0.0 24.6 44.8 57.5 63.8 67.5 72.8 71.6 69.4 2.2 5.2 9.0 13.8 18.7 21.6 24.6 27.2 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Na-alg +dịch E Na-alg +nước cất Klebsiella sp khoâng coù khaû naêng sinh indol, khoâng sinh enzyme oxydase, khoâng khöû H2s. 3.6. Keát quaû thí nghieäm xaùc ñònh hoaït ñoä enzyme Nhö phaàn boá trí thí nghieäm ñaõ trình baøy, trong phöông phaùp ñoä nhôùt thì moät ñôn vò hoaït ñoä enzyme lyase laø löôïng enzyme caàn thieát ñeå laøm ñoä nhôùt cuûa natri alginate 1% giaûm 50% trong 20 phuùt. Töùc laø döïa vaøo löôïng cô chaát bò maát ñi trong thôøi gian nhaát ñònh öùng vôùi noàng ñoä enzyme xaùc ñònh.[3][22] Keát quaû soá lieäu theå hieän söï hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% theo noàng ñoä enzyme ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.6 – phuï luïc 1. Nhaän xeùt: Töø keát quaû thu ñöôïc ta cuõng coù theå thaáy ñöôïc aûnh höôûng cuûa noàng ñoä Enzyme ñeán möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate. Ta thaáy raèng ban ñaàu khi noàng ñoä enzyme algL taêng thì ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate S E (/ 100ml S) Ñoä nhôù t hao toå n (%) Ñoà thò 3.6a. Möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% theo noàng ñoä Enzyme
  • 52. 52 0.0 57.5 56.0 53.7 50.7 47.0 44.8 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 0 10 11 12 13 14 15 Na-alg+dịch E 1% hao huït ñaùng keå, tuy nhieân khi 100 25 = S E trôû leân thì möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% giaûm daàn. Moät ñieàu deã nhaän thaáy nöõa treân ñoà thò 3.7 laø ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na- alginate 1% bò hao huït 44,8% vaø 57,5% khi phaân caét laàn löôït vôùi 10 vaø 15 ml enzyme algL. Vaäy ñeå xaùc ñònh ñôn vò hoaït ñoä cuûa enzyme algL ta phaûi tieán haønh phaân caét Na-alginate 1% vôùi löôïng algL töø 10 ÷15 ml. Ñoà thò 3.6b cho thaáy raêng ñoä nhôùt cuûa Na-alginate 1% bò hao huït ñi 50% khi phaân caét vôùi 12ml dòch enzyme algL. Ñieàu naøy coù nghóa raèng moät ñôn vò hoaït ñoä cuûa Enzyme algL töông öùng vôùi 12 ml dòch enzyme, hay noùi caùch khaùc trong 20 phuùt 12ml dòch enzyme laøm giaûm 50% ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1%. S E (/ 100ml S) Ñoä nhôù t hao toå n (%) Ñoà thò 3.6b. Möùc ñoä hao huït ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% theo noàng ñoä Enzyme
  • 53. 53 3.7. Keát quaû thí nghieäm aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät vaø khaû naêng phaân caét cuûa algL do vi sinh vaät sinh ra Nhaän xeùt vaø thaûo luaän: Trong 12h nuoâi caáy ñaàu, vi khuaån baét ñaàu thích nghi vôùi moâi tröôøng vaø tieát enzyme ra moâi tröôøng ñeå söû duïng nguoàn dinh döôõng saún coù trong moâi tröôøng. Trong thôøi gian naøy soá löôïng teá baøo chöa taêng maïnh vì chuû yeáu chuùng söû duïng chaát dinh döôõng ñeå phaùt trieån veà kích thöôùc chöù chöa sinh saûn. Löôïng enzyme algL trong 12h ñaàu ñöôïc tieát ra moâi tröôøng cuõng coù hoaït löïc khaù maïnh, trong 20 phuùt phaân caét noù laøm ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na- alginate 1% hao huït 61,9%. Khi thôøi gian nuoâi caáy laø 24h, luùc naøy söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät ñang ôû giai ñoaïn phaùt trieån maïnh, soá teá baøo cuûa chuùng taêng nhanh töø 14.10-5 teá baøo/1ml taêng leân 52.105 teá baøo/1ml. Löôïng enzyme algL cuõng ñöôïc tieát ra nhieàu hôn, khaû naêng phaân caét alginate cuõng taêng leân, tieáp tuïc nuoâi caáy ñeán Soá teá baø o /ml (.10 5 ) Ñoä nhôù t hao toå n (%) 0 14 52 40 24 12 27 0.0 59.7 47.4 47.4 49.3 63.8 61.9 0 10 20 30 40 50 60 0 12 24 36 48 60 72 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 Sinh trưởng Độ nhớt Ñoà thò 3.7. Aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån cuûa Klebsiella sp vaø hoaït ñoä enzyme algL
  • 54. 54 36h, thôøi gian naøy dinh döôõng trong moâi tröôøng nuoâi caáy ñaõ daàn caïn kieät neân teá baøo vi sinh vaät baét ñaàu cheát, khaû naêng phaân caét cuûa enzyem algL baét ñaàu giaûm, tuy nhieân möùc ñoä giaûm laø khoâng nhieàu. Tieáp tuïc keùo daøi thôøi gian nuoâi caáy, luùc naøy chaát dinh döôõng ñaõ caïn kieät, caùc saûn phaåm cuûa quaù trình baøi tieát ñaõ tích tuï nhieàu neân laøm teá baøo vi sinh vaät cheát ñi, hoaëc chuyeån sang daïng baøo töû, caùc saûn phaåm baøi tieát cuõng laøm cho pH cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy taêng leân ñaây chính laø nguyeân nhaân laøm bieán tính vaø giaûm hoaït löïc cuûa enzyme algL, neân khi thu hoài dòch enzyme algL thì khaû naêng phaân caét cuûa noù ñaõ giaûm ñi nhieàu.[2][5] Theo ñoà thò 3.7, thaáy raèng khaû naêng phaân caét cuûa algL toát nhaát trong khoaûng 24h – 36h, enzyme algL ñöôïc tieát ra trong thôøi gian naøy cuõng coù hoaït löïc toát. Töø keát quaû thu ñöôïc ta choïn thôøi gian nuoâi caáy caáy chuûng Klebsiella sp ôû 370 C trong thôøi gian 24h. 3.8. Keát quaû thí nghieäm nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc ion kim loaïi ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL 72.8 16.4 81.0 75.4 54.9 66.4 31.3 39.6 45.9 67.9 76.9 83.6 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 DC EDTA CaCl2 MnCl2 MgCl2 CuCl2 FeCl2 EnZyme + Ion kim loại EnZyme + EDTA + Ion kim loại Ñoä nhôù t hao toå n (%) Ñoà thò 3.8. AÛnh höôûng caùc ion kim loaïi ñeán hoaït löïc cuûa enzyme algL
  • 55. 55 Nhaän xeùt: Töø keát quaû nghieân cöùu cho thaáy EDTA coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán khaû naêng hoaït ñoäng cuûa enzyme algL, khi xöû lyù dòch enzyme algL vôùi 1mM EDTA thì möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% chæ laø 16,4%. Tuy nhieân, khi tieáp tuïc theâm 2mM muoái CaCl2 thì hoaït löïc cuûa enzyme algL laïi ñöôïc phuïc hoài trôû laïi, thaäm trí maïnh hôn so vôùi ban ñaàu, baèng chöùng laø khi xöû lyù tieáp vôùi CaCl2 thì möùc ñoä hao toån ñeán 83,6%, taêng 13% so vôùi maãu ñoái chöùng. Vôùi caùc muoái kim loaïi nghieân cöùu, chæ coù Ca2+ laøm taêng hoaït löïc cuûa algL coøn haàu heát caùc ion kim loaïi coøn laïi ñeàu ít nhieàu laøm giaûm khaû naêng hoaït ñoäng cuûa enzyme algL, trong ñoù Mn2+ aûnh höôûng ít nhaát ñeán hoaït ñoäng cuûa algL. Khi xöû lyù keát hôïp giöõa EDTA vaø caùc muoái kim loaïi, nhaän thaáy raèng söï kìm haûm cuûa caùc muoái ñoái vôùi enzyme algL giaûm daàn. EDTA laø moät amino axit coù khaû naêng coâ laäp caùc ion kim loaïi hoùa trò II, III, vì vaäy khi xöû lyù dòch enzyme algL vôùi EDTA coù theå EDTA keát hôïp vôùi moät ion kim loaïi hoùa trò II trong trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme algL neân laøm cho enzyme giaûm khaû naêng hoaït ñoäng, khi theâm ion CaCl2 vaøo dòch enzyme thì Ca2+ keát hôïp vôùi EDTA vaø giaûi phoùng cho ion kim loaïi trong trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme algL, ñoàng thôøi Ca2+ coøn coù taùc duïng hoaït hoùa hoaït ñoäng cuûa enzyme algL, laøm taêng möùc ñoä lieân keát giöõa enzyme algL vaø Na-alginate neân laøm cho ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate bò hoån maïnh hôn so vôùi ban ñaàu.
  • 56. 56 Cô cheá söï kìm haõm hoaït ñoäng algL cuûa caùc ion kim loaïi nhö Mg2+ , Cu2+ , Fe2+ trong ñeà taøi naøy chöa coù ñieàu kieän nghieân cöùu cuï theå, nhöng coù theå giaû thuyeát raèng caùc ion kim loaïi naøy laøm thay ñoåi caáu truùc trung taâm hoaït ñoäng cuûa algL theo chieàu höôùng khoâng coù lôïi, neân laøm giaûm khaû naêng lieân keát giöõa algL vaø natri alginate. Khi coù maët EDTA, EDTA seõ moät phaàn taïo phöùc vôùi caùc ion kim loaïi hoùa trò II naøy vaø giaûi phoøng cho trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme algL, giuùp cho enzyme hoaït ñoäng trôû laïi. Coù theå loaïi boû tröôøng hôïp caùc ion kìm haõm naøy laø caùc chaát kìm haõm caïnh tranh vì caáu truùc cuûa caùc muoái naøy khoâng gioáng vôùi natri alginate, hôn nöõa noàng ñoä cuûa caùc muoái naøy nhoû hôn nhieàu so vôùi noàng ñoä natri algiante. Keát luaän : Ñeå taêng khaû naêng hoaït ñoäng cuûa algL, neân xöû lyù algL baèng 1mM EDTA vaø tieáp sau ñoù boå sung theâm 2mM CaCl2 hoaëc MnCl2. Caàn loaïi boû söï coù maët cuûa caùc muoái MgCl2, CuCl2, FeCl2 trong moâi tröôøng hoaït ñoäng cuûa algL vì chuùng laøm giaûm ñaùng keå khaû naêng hoaït ñoäng cuûa algL. 3.9. Keát quaû nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa algL Ñoà thò 3.9. Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng phaân caét cuûa enzyme algL Độ nhớt 0 32.1 53.7 67.9 75 69 52.2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 ĐC 10 20 30 40 50 60 Nhiệt ñộ Độ nhớt hao tổn (%) Độ nhớt
  • 57. 57 Nhaän xeùt Khi phaân caét ôû nhieät ñoä thaáp 10o C thì möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa Na- alginate thaáp (32,1%), tuy nhieân khi nhieät ñoä theâm 100 C thì möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa Na-alginate baét ñaàu taêng maïnh vaø khi phaân caét ôû nhieät ñoä 400 C, trong 20’ ñoä nhôùt cuûa Na-alginate bò hao toån 75%. Döïa vaøo ñoà thò 3.9 ta thaáy raèng enzyme algL hoaït ñoäng toát trong khoaûng nhieät ñoä töø 35 ÷ 450 C, trong khoaûng nhieät ñoä lôùn hôn 500 C, hoaït ñoäng cuûa enzyme algL bò giaûm maïnh, neáu tieáp tuïc taêng nhieät ñoä thì enzyme algL seõ bò ñình chæ hoaït ñoäng. Thaûo luaän Nhö ñaõ bieát, theo quy luaät cuûa phaûn öùng do enzyme xuùc taùc, thoâng thöôøng vaän toác cuûa phaûn öùng caøng taêng khi nhieät ñoä taêng, tuy nhieân do enzyme coù baûn chaát protein neân khi taêng nhieät ñoä ñeán moät giôùi haïn naøo ñoù thì vaän toác phaûn öùng seõ bò giaûm do enzyme bò bieán tính. Trong khoaûng nhieät ñoä maø enzyme chöa bò bieán tính thì heä soá nhieät ñoä cuûa ña soá enzyme khoaûng 1,4 – 2. Coù nghóa laø khi taêng nhieät ñoä leân 100 C thì toác ñoä phaûn öùng taêng leân töø 1,4 – 2 laàn. Khi baét ñaàu coù söï bieán tính protein thì xaõy ra hai heän töôïng: moät maët toác ñoä phaûn öùng vaãn taêng theo söï taêng nhieät ñoä, maët khaùc vaän toác bieán tính enzyme xaûy ra nhanh hôn. Keát quaû laø toác ñoä phaûn öùng giaûm daàn vaø bò ñình chæ hoaøn toaøn.[3][7] Trong khoaûng nhieät ñoä töø 10 – 20 0 C, hoaït ñoäng cuûa algL yeáu, nhöng luùc naøy protein chöa bò bieán tính neân khi taêng nhieät ñoä leân trong khoaûng töø 30 – 40 0 C thì hoaït ñoäng cuûa algL ñöôïc phuïc hoài trôû laïi, ñaây cuõng chính laø lí do laøm cho ñoä nhôùt cuûa dung dòch natri alginate hao toån maïnh so vôùi maãu ban
  • 58. 58 ñaàu. Nhöng khi nhieät ñoä phaân caét tieáp tuïc taêng leân 50 – 60 0 C thì söï bieán tính enzyme baét ñaàu xaûy ra neân laøm giaûm khaû naêng phaân caét Na-alginate, baèng chöùng laø khi phaân caét ôû nhieät ñoä naøy möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt cuûa Na-alginate 1% chæ laø khoaûng 50%. Keát luaän: Maëc duø khi phaân caét ôû 400 C thì hoaït ñoäng cuûa enzyme algL laø maïnh nhaát, nhöng cuõng cao hôn khoâng ñaùng keå khi phaân caét ôû nhieät ñoä 370 C. Do ñoù, ta neân choïn phaân caét ôû nhieät ñoä 370 C vì coù theå tieát kieäm ñöôïc veà maët kinh teá. 3.10. Keát quaû thí nghieäm choïn taùc nhaân keát tuûa thích hôïp ñeå taùch chieát algL töø dòch enzyme Taùc nhaân keát tuûa ÑC (NH4)2SO4 Axetol Coàn 600 Ñoä nhôùt (mPa.s) 26,8 2,3 4,6 5,4 Möùc ñoä hao toån ñoä nhôùt (%) 0 91,4 82,8 79,9 Löôïng E thu ñöôïc (g/500ml) 0 1,04 1,12 1,36 Nhaän xeùt Khi keát tuûa enzyme algL baèng coàn 600 C thì löôïng enzyme keát tuûa thu ñöôïc lôùn hôn so vôùi Axetol vaø muoái Amoni sunphat, tuy nhieân hoaït ñoä cuûa cheá phaåm enzyme algL thoâ thu ñöôïc khi keát tuûa baèng muoái (NH4)2SO4 laïi maïnh nhaát, baèng chöùng laø khi phaân caét 100ml dung dòch Na-alginate 1% baèng 0,5g cheá phaåm enzyme thoâ trong 20’ thì ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% bò giaûm ñeán 91,4%. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích nhö sau: Coù theå caùc dung moâi naøy gaây voâ hoaït algL neân laøm giaûm khaû naêng hoaït ñoäng cuûa algL hôn nöõa chuùng coøn keát tuûa nhöõng Pr taïp khoâng phaûi laø algL neân khoái löôïng Pr thu ñöôïc lôùn hôn so Bảng 3.10. Ảnh höôûng cuûa taùc nhaân keát tuûa ñeán khoái löôïng protein thu hoài vaø hoaït ñoäng cuûa algL
  • 59. 59 vôùi keát tuûa baèng muoái. Trong khi ñoù muoái trung tính ôû noàng ñoä baûo hoøa thì coù theå keát tuûa ñöôïc toái ña löôïng algL trong dòch enzyme vaø muoái trung tính ít gaây giaûm hoaït löïc cuûa algL hôn so vôùi dung moâi neân duø löôïng Enzyme thu ñöôïc thaáp nhöng cheá phaåm naøy phaàn lôùn laø algL. Keát luaän: Duøng muoái trung tính Amoni sunphat ôû noàng ñoä baûo hoøa ñeå taùch chieát enzyme algL ra khoûi dòch sinh khoái. Quaù trình keát tuûa tieán haønh ôû nhieät ñoä laïnh 40 C trong 12h.
  • 60. 60 3.11. Ñeà xuaát quy trình thu hoài cheá phaåm enzyme algL töø vi khuaån Klebsiella sp Sô ñoà 3.11. Quy trình thu hoài cheá phaåm enzyme algL thoâ töø dòch sinh khoái vi khuaån Klebsiella sp Sinh khoái Gioáng vi sinh vaät Laøm laïnh Ly taâm 1 Dòch enzyme Keát tuûa baèng (NH4)2SO4 Ly taâm 2 Cheá phaåm enzyme thoâ Saáy khoâ Nghieàn mòn Baûo quaûn Xaùc ñònh hoaït ñoä Xaùc ñònh hoaït ñoä
  • 61. 61 Giaûi thích quy trình 1. Sinh khoái Tröôùc khi sinh khoái, chuûng Klebsiella sp ñöôïc nuoâi caáy treân moâi tröôøng thaïch I, nuoâi ôû 370 C trong 2 ngaøy. Khuaån laïc cuûa Klebsiella sp seõ phaùt trieån treân moâi tröôøng thaïch I, duøng que caáy voâ khuaån laáy moät ít khuaån laïc vi sinh vaät treân moâi tröôøng thaïch I, hoøa ñeàu vaøo 10ml moâi tröôøng dinh döôõng (II) chöùa trong bình tam giaùc 100ml, sinh khoái 2 ngaøy ôû nhieät ñoä 370 C treân maùy laéc 250v/p, tieáp tuïc laáy 3ml töø 10ml dòch sinh khoái naøy ñoå vaøo 100 ml moâi tröôøng dinh döôõng ñöïng trong bình tam giaùc 250 ml roài sinh khoái ôû ñieàu kieän töôïng töï, tieáp tuïc laáy 9ml töø 100 ml dòch sinh khoái ñoå vaøo 500ml moâi tröôøng dinh döôõng chöùa trong bình tam giaùc 1000ml vaø sinh khoái ôû ñieàu kieän töông töï. 2. Ly taâm 1 Dòch sinh khoái ñöôïc laøm laïnh vaø ly taâm ôû 40 C, thôøi gian 30’ vôùi toác ñoä 10.000 v/p 3. Keát tuûa baèng (NH4)2SO4 Dòch enzyme ñöôïc laøm laïnh xuoáng 4o C, theâm tröïc tieáp muoái (NH4)SO4 daïng boät vaøo dòch enzyme cho ñeán khi baõo hoøa, trong quaù trình keát tuûa phaûi luoân duy trì nhieät ñoä cuûa dòch enzyme ôû 40 C. Sau ñoù, dòch enzyme ñöôïc giöõ ôû nhieät ñoä 40 C trong 12h tröôùc khi ly taâm ñeå taùch cheá phaåm enzyme algL thoâ. 4. Ly taâm 2 Ly taâm ôû toác ñoä 12.000 v/p, nhieät ñoä 4o C, thôøi gian 30 phuùt ñeå taùch keát tuûa 5. Xaùc ñònh hoaït ñoä
  • 62. 62 Khi thu ñöôïc cheá phaåm algL thoâ, tieán haønh xaùc ñònh hoaït ñoä cuûa algL theo phöông phaùp ñoä nhôùt. 6. Saáy khoâ Sau khi xaùc ñònh ñöôïc hoaït ñoä enzyme, cheá phaåm enzyem algL ñöôïc saáy khoâ sau ñoù nghieàn mòn, roài baûo quaûn. Caàn löu yù raèng, algL bò giaûm hoat löïc ôû 500 C trôû leân, neân khi saáy cheá phaåm algL caàn saáy ôû nhieät ñoä thaáp, coù theå saáy laïnh ôû nhieät ñoä 30 – 350 C. Sau khi saáy khoâ, algL caàn ñöôïc xaùc ñònh laïi hoaït ñoä ñeå xaùc ñònh aûnh höôûng cuûa cheá ñoä saáy ñeán hoaït ñoä cuûa algL, cheá phaåm enzyme algL khoâ ñöôïc nghieàn mòn roài baûo quaûn.
  • 63. 63 CHÖÔNG 4 KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ XUAÁT YÙ KIEÁN 4.1. Keát luaän Töø nhöõng keát quaû nghieân cöùu ta coù theå keát luaän moät soá vaán ñeà sau: 1. Ñaõ phaân laäp ñöôïc chuûng vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång hôïp enzyme algL treân moâi tröôøng thaïch coù chöùa 0,5% Na-alginate; 0,5% NaCl; 0,1% pepton vaø 0,5% dòch chieát naám men. 2. Ñaõ thu ñöôïc cheá phaåm enzyme algL thoâ töø moâi tröôøng sinh khoái vi sinh vaät. Moâi tröôøng sinh khoái vi sinh vaät nhö sau: - Thaønh phaàn moâi tröôøng sinh khoái (moâi tröôøng II) Na-alginate : 0,5% Pepton : 0,5% Dòch chieát naám men : 0,1% NaCl : 0,5% KH2PO4 : 0,1% MgSO4 : 0,1% pH : 7,0 -7,5 3. Ñaõ xaùc ñònh ñöôïc 1 ñôn vò hoaït ñoä enzyme algL theo phöông phaùp ñoä nhôùt laø 12ml/20’ (coù nghóa laø vôùi 12ml dung dòch enzyme algL laøm cho ñoä nhôùt cuûa dung dòch Na-alginate 1% giaûm xuoáng 50% trong 20 phuùt). 4. Ñaõ xaùc ñònh ñöôïc thôøi gian sinh khoái thích hôïp cho chuûng vi sinh vaät sinh toång hôïp algL laø 24h. Khi sinh khoái trong voøng 24h thì söï phaùt trieån cuûa
  • 64. 64 vi sinh vaät naøy maïnh, ñoàng thôøi algL do chuùng sinh toång hôïp cuõng coù hoaït löïc cao. 5. Ñaõ ñònh danh ñöôïc chuûng vi sinh vaät phaân laäp ñöôïc laø Klebsiella sp. Ñaây laø tröïc khuaån gram aâm, khoâng di ñoäng, coù khaû naêng leân men, glucoza vaø lactoza, teá baøo coù hình que, khuaån laïc coù hình troøn maøu traéng söõa treân moâi tröôøng phaân laäp I. 6. Ñaõ nghieân cöùu ñöôïc söï aûnh höôûng cuûa ion kim loaïi ñeán hoaït ñoäng cuûa AlgL. 7. Khoaûng nhieät ñoä toái thích cho hoaït ñoäng cuûa algL laø töø 30 – 40 0 C, coøn ôû nhieät ñoä töø 10 – 30 0 C hoaït ñoäng cuûa algL bò kìm haõm tuy nhieân khi naâng nhieät thì hoaït ñoäng cuûa algL ñöôïc phuïc hoài trôû laïi, khi nhieät ñoä taêng leân treân 500 C algL bò bieán tính giaûm khaû naêng hoaït ñoäng, ñoàng thôøi khoâng coù khaû naêng phuïc hoài hoaït ñoäng khi haï xuoáng nhieät ñoä toái thích. 8. Ñeå thu hoài cheá phaåm enzyme algL thoâ, neân söû duïng taùc nhaân keát tuûa laø muoái trung tính (NH4)2SO4 baõo hoøa, thôøi gian keát tuûa 12h ôû nhieät ñoä 4 0 C. 4.2. Ñeà xuaát yù kieán Töø nhöõng vaán ñeà ñaõ nghieân cöùu ñöôïc trong ñeà taøi, xin ñöôïc ñeà xuaát caùc yù kieán sau: 1. Ñeà taøi chöa nghieân cöùu söï aûnh höôûng cuûa tyû leä caùc thaønh phaàn chaát dinh döôõng trong moâi tröôøng nuoâi caáy ñeán söï phaùt trieån vaø hoaït ñoä cuûa enzyme algL do vi sinh vaät sinh toång hôïp neân, vì vaäy caàn môû roäng nghieân cöùu theâm söï aûnh höôûng cuûa caùc chaát dinh döôõng vaø coù theå löïa choïn ñöôïc moâi tröôøng nuoâi caáy, sinh khoái toái öu cho söï phaùt trieån vaø hoaït ñoä algL cuûa vi sinh vaät ñaõ phaân laäp. 2. Nghieân cöùu phöông phaùp tinh saïch enzyme algL nhö phöông phaùp haáp phuï khoâng ñaëc hieäu hay phöông phaùp trao ñoåi ion, ñeå taêng hoaït löïc cuûa
  • 65. 65 algL vaø xaùc ñònh hoaït ñoä cuûa algL theo phöông phaùp so maøu cuõng nhö laø xaùc ñònh ñöôïc khoái löôïng phaân töû cuûa algL. 3. Nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc chaát gaây bieán tính protein cuõng nhö pH ñeán hoaït ñoä cuûa enzyme algL. 4. Nghieân cöùu phaân caét Na-alginate baèng kieàm, axit maïnh vaø so saùnh keát quaû vôùi phöông phaùp phaân caét baèng enzyme. 5. Nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa caùc oligo alginate coù khoái löôïng phaân töû khaùc nhau ñeán khaû naêng naåy maàm cuûa haït gioáng vaø khaû naêng phaùt trieån cuûa thöïc vaät. Beân caïnh ñoù môû roäng nghieân cöùu öùng duïng cuûa caùc oligo alginate trong lónh cöïc thöïc phaåm, sinh hoïc vaø döôïc hoïc.
  • 66. 66 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Taøi lieäu trong nöôùc 1. Traàn Thò Luyeán, Ñoã Minh Phuïng, Ngoâ Ñaêng Nghóa, Nguyeãn Anh Tuaán (2000), “Cheá bieán rong bieån”. Nhaø xuaát baûn Noâng Nghieäp. 2. Nguyeãn Thò Xuyeán (1996), “ Ñaïi cöông vi sinh vaät”. Nhaø xuaát baûn Noâng Nghieäp Thaønh phoá Hoà Chí Minh. 3. Nguyeãn Troïng Caån, Nguyeãn Thò Hieàn, Ñoã Thò Giang, Traàn Thò Luyeán (1998), “Coâng ngheä Enzyme”. Nhaø xuaát baûn Noâng Nghieäp. 4. Leâ Ngoïc Tuù, Leâ Vaên Trö vaø caùc taùc giaû. “Enzyme töø vi sinh vaät”. Nhaø xuaát baûn Khoa hoïc – Kyõ thuaät, Haø Noäi. 5. Löông Ñöùc Phaåm, Hoà Söôûng (1978), “ Vi sinh vaät toång hôïp”. Nhaø xuaát baûn Kyõ thuaät. 6. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Phan Thò Huyeàn, Nguyeãn Aùnh Tuyeát (2006) “ Thí nghieäm vi sinh vaät hoïc “ . Nhaø xuaát baûn Ñaïi hoïc Quoác gia TP. Hoà Chí Minh. 7. Leâ Ngoïc Tuù vaø coäng söï (2002), “ Hoùa Sinh Coâng nghieäp”. Nhaø xuaát baûn Khoa hoïc - Kyõ thuaät Haø Noäi . 8. Traàn Linh Thöôùc (2003), “ Phöông phaùp phaân tích vi sinh vaät”. Nhaø Xuaát baûn Giaùo duïc. 9. Nguyen Quoc Hien, Naotsugu Nagasawa, Le Xuan Tham, Fumio Yoshii, Vo Huy Ñang, Hiroshi Mitomo, Keizo Makuuchi vaø Tamikazu Kume. “Growth – promotion of plant with depolymerized alginates by irradiation”. Nuclear Research Institute, DaLat, Viet Nam. 10. Nguyeãn Thaùi Hoøa, Nguyeãn Thò Aùi Nhung (2002),” Nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa aligoalginate ñeán khaû naêng naûy maàm cuûa haït thoùc gioáng”. Taïp chí Khoa hoïc, Ñaïi hoïc Hueá.
  • 67. 67 Taøi lieäu nöôùc ngoaøi 11. Gacesa P. (1988) Alginates. Carbohydr Polym 8:161–182. 12. Biological effect of radiation-degraded alginate on flower plant in tisue culture. Graduate School of Agricutural Life Sciences, University of Tokyo. 13. Root – Growth promoting Acivity of Unsaturated oligomer Uronate from Alginate on Carrot and Rice plant. Graduate School Biodemical Sciences, Nagasaki University, Japan. 14. Iwasaki, Matsubara. “Purification of alginate oligosacharides with root growth-promoting activity toward lettuce”. 15. Preparation and structure elucidation of alginate oligosaccharides degraded by alginate lyase from Vibro sp. 510. Institute of Marine Drug and Food, Ocean University of China, China. 16. A structural basis for depolymerization of alginate by polysaccharide lyase family-7. Devision of Agronomy and Horticultural Science, Graduate School of Agriculture, Kyoto University, Japan. 17. Manabu Kitamikado, Chao-Huang Tseng, Kuniko Yamaguchi vaø Takasi Nakamura. Two Types of Bacterial Alginate Lyases. Depament of fisheries, Faculty Agriculture, Kyushu University, Japan. 18. Thiang Yian Wong, Lori A. Preston and Neal L Schiller. ALGINATE LYASE: Review of Major Sources and Enzyme Characteristics, Structure- Function Analysis, Biological Roles and Applications. Division of Biomedical Sciences, University of California. 19. Wataru Hashimoto, Osamu Miyake, Keiko Momma, Shigeyuki Kawai and Kousaku Murata. Molecular Indentification of Olicoalginate Lyase
  • 68. 68 of Sphingomonas sp. Strain A1 as one of the Enzymes Required for Complete Depolimerization of Alginate.Research Institure for Food Sience, Kyoto University, Japan. 20. Scott CD. (1982) Immobilized cells: a review of recent literature. Enzyme Microb Technol 9:66–73. 21. A novel alginate lyase from a marine bacterium Agarivorans Albus Ykw-34: purification and characterization 22. Nakagawa A, Ozaki T, Chubachi K, Hosoyama T, Okubo T, Iyobe S, Suzuki T. (1998) An effective method for isolating alginate lyase-producing Bacillus sp. ATB-1015 strain and purification and characterization of the lyase. J Appl Microbiol 84:328–335. 23. Sutherland IW. (1995) Polysaccharide lyases. FEMS Microbiol Rev 16:323–347. 24. Scott CD. (1987) Immobilized cells: a review of recent literature. Enzyme Microb Technol 9:66–73. 25. Yonemoto Y, Tanaka H, Yamashita T, Kitabatake N, Ishida Y, Kimura A, Murata K. (1993) Promotion of germination and shoot elongation of some plants by alginate oligomers prepared with bacterial alginate lyase. J Ferment Bioeng 75:68–70. 26. Iwamoto Y, Xu X, Tamura T, Oda T, Muramatsu T. (2003) Enzymatically depolymerized alginate oligomers that cause cytotoxic cytokine production in human mononuclear cells. Biosci Biotechnol Biochem 67:258– 263. 27. Uchida M. (1995) Enzyme activities of marine bacteria involved in Laminaria thallus decomposition and the resulting sugar-release. Mar Biol
  • 69. 69 123:639–644. 28. Uchida M, Nakata K, Maeda M. (1997) Introduction of detrital food webs into an aquaculture system by supplying single cell algal detritus produced from Laminaria japonica as a hatchery diet for Artemia nauplii. Aquaculture 154:125–137. 29. Elyakova LA, Favorov VV. (1974) Isolation and certain properties of alginate lyase VI from the mollusk Littorina sp. Biochem Biophys Acta 358:341 30. Iwamoto Y, Araki R, Iriyama K, Oda T, Fukuda H, Hayashida S, Muramatsu T. (2001) Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain No. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci Biotechnol Biochem 65:133–142. 31. Hu X, Jiang X, Hwang HM. (2006) Purification and characterization of an alginate lyase from marine bacterium Vibrio sp. mutant strain 510-64. Curr Microbiol 53:135–140.
  • 70. 70 PHUÏ LUÏC 1. CAÙC KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU BảnghiệuchuẩntheoñộnhớtcủadungdịchSucrose 0 20 40 60 80 100 120 140 160 2 2.5 3.2 4.4 6.2 9.5 15.5 28.3 58.9 Độ nhớt mPa.s 400 600