Pisana forma opširnije

1. 1
UNIVERZITET U TUZLI
Prirodno-matematički fakultet
Primijenjena biologija
SEMINARSKI RAD IZ PREDMETA MOLEKULARNA BIOLOGIJA
‘’Tehnologija rekombinantne DNK’’
Mentor: Dr.sc Amela Hercegovac, docent Studenti: Kadrić Melisa
Emić Irma
Tuzla, 5.11.2017

2. 2
SADRŽAJ
1. UVOD......................................................................................................................................... 3
2. RAZRADA TEME.................................................................................................................... 4
2.1 Tehnologija rekombinantne DNA......................................................................................... 4
2.2 Kreiranje rekombinantne DNA ............................................................................................. 5
2.3 Karakteristike organizama sa rekombinantnom DNA .......................................................... 6
2.4 Primjena tehnologije rekombinantne DNK........................................................................... 7
2.4.1 Rekombinantni himozin.................................................................................................. 8
2.4.2 Rekombinantni ljudski insulin........................................................................................ 8
2.4.3 Rekombinantni ljudski hormon rasta (HGH, somatotropin) .......................................... 9
2.4.4 Rekombinantni faktor zgrušavanja krvi, faktor VIII ...................................................... 9
2.4.5 Zlatna riža ....................................................................................................................... 9
2.4.6 Usjevi otporni na herbicide............................................................................................. 9
2.5 Restrikcijski enzimi............................................................................................................. 10
2.6 Vektori za kloniranje........................................................................................................... 11
2.6.1 Plazmidi ........................................................................................................................ 11
2.6.2 Bakteriofag λ................................................................................................................. 13
2.6.3 Kozmidi ........................................................................................................................ 14
2.6.4 Eukariotski plazmidi ........................................................................................................ 15

3. 3
1. UVOD
Rekombinantna DNK je vrsta DNK koja nastaje umjetnim putem.
Ne postoji u prirodi, nego laboratorijskom genskom rekombinacijom
(primjerice molekulsko kloniranje) različitih vrsta. Ovim se prenosi gen jedne vrste
u genom sasvim druge vrste, biljne i životinjske i stvara se sekvencija nukleinske
kiseline koja ne postojiu prirodi. Rekombinantnu DNK moguće je napraviti jer su
sve molekule DNK svih organizama iste hemijske strukture, a razlikuju se samo
u nukleotidnom nizu unutar te strukture.
Genska rekombinacija se primjenjuje radi proizvodnje vakcina, inzulina i dr.
Rekombinantna DNK često se koristi u kontekstu plazmida - kratkih kružnih
dijelova DNK s nekoliko gena na njima. Ubacivanjem plazmida u bakterije i
uzgajanjem tih bakterija na tanjiru s agarom (kako bi se izolirali klonovi stanica
bakterija), znanstvenici mogu molekularno klonirati ubačeni fragment DNK. Za
reakciju spajanja vektorske i strane DNK upotrebljava se naziv rekombinacija in
vitro, dokse produktreakcije naziva rekombinantnom DNK. Da bi se molekule
rekombinantne DNK autonomno replicirale, treba ih unijeti u bakterijske ili kakve
druge za to prikladne stanice.

4. 4
2. RAZRADATEME
2.1 Tehnologija rekombinantne DNA
Tehnologija rekombinantne DNA predstavlja niz molekularno-genetičkih metoda
uz pomoć kojih je moguće mijenjati nasljednu tvar stanice. Razdoblje
rekombinantne DNA tehnologije započelo je otkrićem restrikcijskih enzima, 70.-
tih godina prošlog stoljeća. 1978. dodijeljena je Nobelova nagrada za fiziologiju i
medicinu W. Arberu, H. Smithu i D. Nathansu za njihov rad na otkriću
restrikcijskih enzima (endonukleaza). Tehnologija rekombinantne DNA naziva se i
genetičko inženjerstvo; predstavlja novu biotehnologiju koja se razvila u posljednje
2 decenije. Primjena ove tehnologije u fundamentalnim istraživanjima je
omogućila ogroman napredak biohemije, ćelijske biologije, genetike i drugih
bioloških nauka. Tehnike genetičkog inženjerstva pružaju mogućnost da se pristupi
detaljnom upoznavanju I razumijevanju složenih bioloških pojava kao što su
mehanizmi kojim eukariotske ćelije kontrolipku ekspresiju svojih genoma u toku
razvića, imunološki odgovor, ćelijska dioba, onkogeneza itd. Ali pored toga što
obezbjeđuju preduslov za ogroman napredak u upoznavanju života, one pružaju
čovjeku mogućnostdag a mijenja. Ove tehnike su našle široku primjenu ne samo u
naučnim istraživanjima već u mnogim drugim oblastima ljudske djelatnosti, kao
što su medicina, veterina, farmacija, agronomija, šumarstvo zaštita životne
sredine, tako da u velikoj mjeri utiču na poboljšanje kvaliteta života čovječanstva.
Tehnologija DNK obuhvata niz tehnika uz pomoć kojih se može manipulirati
malim fragmentima hromozomske DNK ili pojedinačnim genima, u cilju
ispitivanja i mijenjanja njihove strukture, proučavanja mehanizama putem kojih se
reguliše njihova ekspresija, upoznavanja structure i uloge njihovih proteinskih
produkata itd. Tehnike koje se koriste za izolovanje pojedinih gena iz hromozoma i
njihovo ugrađivanje u molekule DNK, koji se mogu unijeti u ćeliju u kojoj će se
autonomno replicirati ispitivani gen, poznate su kao kloniranje DNK.

5. 5
Slika br. 1 Ubacivanje ljudskog gena u plazmidnu DNA; rekombinantni plazmid umnožava se u
bakterijskoj stanici te se u određenom trenutku strani gen prepisuje i prevodi u polipeptidni
produkt.
2.2 Kreiranje rekombinantne DNA
U kreiranju rekombinantne DNK primjenjuju se posebnemetode odgovarajućeg
laboratorijskog procesa. Formiranje rekombinantne DNA zahtijeva vektor za
kloniranje – DNK molekula koja se replicira unutar žive ćelije. Vektori su
uglavnom izvedeni iz plazmida ili virusa, a predstavljaju relativno male segmente
DNK koji sadrže potrebne genetičke signale za replikaciju, kao i dodatne elemente
radi lakšeg umetanja u stranu DNK, identifikaciju ćelije koje sadrže rekombinantne
DNK, i, gdje je to moguće, ispoljavanje strane DNK. Izbor vektora za kloniranja
molekula ovisi o izboru organizma domaćina, veličine DNK koji se klonira o tome
i da li i na koji način se ispoljava strana DNK. Segmenti DNK se mogu
kombinirati koristeći razne metode, kao što su kloniranje pomoćurestrikcijskih
enzimia/ ligaza ili Gibsonovim sklopom.

6. 6
U standardnom protokolu kloniranja, kloniranje DNK fragmenata u osnovi
uključuje sedam koraka:
 Izbor domaćina organizma i vektora za kloniranje;
 Priprema vektora DNK;
 Priprema DNK za kloniranje;
 Kreiranje rekombinantne DNK;
 Uvođenje rekombinantne DNK u organizam domaćina;
 Izbor organizama koji sadrže rekombinantnu DNK, i
 (Pregled i izbor (skrining) klonova sa željenim DNK umecima i biološkim
svojstvom.
Slika br. 2 Ubacivanje stranog gena u plazmidnu DNK – rekombinantna DNK
2.3 Karakteristike organizama sa rekombinantnom DNA
U većini slučajeva, organizmi koji sadrže rekombinantnu DNK imaju
normalne fenotipove. To se odnosina njihov izgled, ponašanje i metabolizam, koji
su obično nepromijenjeni, a jedini način da se pokaže prisustvo rekombinantne
sekvence je da se ispita sama DNK, obično koristeći polimeraznu lančanu reakciju
(PCR test).
Ako je u rDNK sekvenci kodirajući gen koji se izražava, onda se prisustvo RNK i /
ili proteinskog proizvoda rekombinantnog gena mogu otkriti, obično
pomoćuRTPCR ili Western blot metodom hibridizacijezapadne hibridizacije.
Ukupne fenotipske promjene nisu norma, osim ako izabrani i modificirani
rekombinantni gen unesen da se generira biološka aktivnost u organizmu

7. 7
domaćina. Dodatni fenotipovi koji se pojeve, uključuju toksičnost na organizam
domaćina uzrokovanu proizvodom rekombinantnog gena, posebno ako je
proteinska ekspresija prekomjerno izražena u neodgovarajućjm ćelijama ili
tkivima.
U nekim slučajevima, rekombinantna DNK može imati pogubne efekte čak i ako
nije izražena. Jedan mehanizam koji dovodido te pojave da se to dogodi
je insercijska inaktivacija, u kojoj je rDNK umetnuta u gen ćelije domaćina. U
nekim slučajevima, istraživači koristite ovaj fenomen za "nokaut" gena da odrede
njihovu biološku funkciju i značaj. Drugi mehanizam kojim umetnuta
rDNA hromosomsku DNK može uticati na ekspresije gena je za neprikladna
aktivacija prethodno neispoljenih gena ćelije domaćina. To se može dogoditi, na
primjer, kada se fragment rekombinantne DNK koji sadrži aktivni promotornalazi
pored prethodno "tihog" gena ćelije domaćina ili kada gen ćelije domaćina svojom
funkcijom obuzda ekspresiju gena putem insercijske inaktivacije rekombinantne
DNK.
2.4 Primjena tehnologije rekombinantne DNK
Rekombinantna DNK se široko koristi u biotehnologiji, medicini i istraživanjima.
Danas, rekombinantni proteii i drugi proizvodi koji su rezultat upotrebe
tehnologije rDNA se nalaze u suštini, u svakoj zapadnoj
apoteci, ljekarskom ili veterinarskom uredu, medicinskim laboratorijama za
ispitivanje i biološka istraživanja. Osim toga, organizmi koji su izmanipulisani
korištenjem tehnologije rekombinantne DNK, kao i proizvodi dobijeni iz tih
organizama, pronašli u svoj put u mnogim farmama, supermarketima, medicinskim
ormarima pa čak i prodavnicama životinja, kao što su one koje se bave
prodajom GloFish i drugim genetički modificiranih sorti i varijeteta.
Najčešća primjena rekombinantne DNK je u osnovnim istraživanjima, u kojimam
je ta tehnologija važna za većinu dosadašnjih aktivnosti u biološkim i
biomedicinskim naukama. Rekombinantna DNK se koristi i za identifikaciju,
mapiranje i sekvenciranje gena, kao utvrđivanje njihova funkcija. SonderDNK se
upotrebljavaju u analizi ekspresije gena unutar pojedinih ćelija i širom tkiva cijelog
organizma. Rekombinantni proteini su široko koriste kao reagensi u
laboratorijskim eksperimentima i za generiranje sonde antitijela za ispitivanje
sinteze proteina u ćeliji i organizamu.
Mnoge dodatnepraktične primjene rekombinantne DNK mogu se naći u industriji,
proizvodnji hrane, humanoj i veterinarskoj medicini, poljoprivredi, i
bioinžinjerstvu. U nastavku su identificirani neki specifični primjeri.

8. 8
2.4.1 Rekombinantni himozin
Pronađen u sirilu, himozin je enzim potreban za proizvodnju sira. To je bio prvi
genetički modificirani prehrambeni aditiv koji se koristi u komercijalne svrhe.
Tradicionalno, hymozin je dobijan iz sirila, koje je vađeno iz četvrtog želuca
mlijekom hranjenih teladi. Naučnici su kreirali nepatogeni soj(K-12) za
bakterije Escherichia coli, za laboratorijsku proizvodnju velikih količina enzima.
Ovaj mikrobiološki proizvod rekombinantnog enzima, strukturno je identičan sa
telećim, troškovi su neuporedivo manji, pa se proizvodi u ogromnim količinama.
Danas je oko 60% od tvrdog sira u USA napravljeno upotrebom rekombinantnog
himozina. Od 1990. godine, nadležna agencija za hranu i lijekove (FDA) je
odobrila ovakav himozin deklaracijom "općenito priznato kao sigurno" (GRAS),
na osnovu podataka koji pokazuju da je enzim bio siguran.
2.4.2 Rekombinantniljudski insulin
Gotovo u potpunostije zamijenio inzulin dobijen iz životinjskih izvora (npr svinja
i goveda), za liječenje insulinske zavisni dijabetes. Rekombinantne insulin je
sintetiziran umetanjem ljudskog inzulinskog gena ljudskog u Escherichia
coli ili kvasac (Saccharomyces cerevisiae koji onda proizvode inzulin za ljudsku
upotrebu.
Slika br.3 Proizvodnja humanog inzulina

9. 9
2.4.3 Rekombinantniljudski hormon rasta (HGH, somatotropin)
Potreban je pacijentima čija žlijezda hipofiza stvara nedovoljne
količine hormona za podrškunormalnog rasta i razvoja. Prije nego što je postao
dostupanrekombinantni HGH, za terapeutsku upotrebu je dobijan iz hipofize
žlijezda leševa. Ova nesigurna praksa je, kod pacijenata u razvoju, dovela do
pojave Creutzfeldt-Jakobove bolesti. Rekombinantni HGH eliminira ovaj problem,
a danas se masovno koristi u terapeutske svrhe. Također je zloupotrebljen i kao
stimulirajuća droga za poboljšanje spremnosti sportista i drugih osoba.
2.4.4 Rekombinantnifaktor zgrušavanja krvi, faktor VIII
Faktor VIII zgrušavanja krvi koji se daje pacijentima s oblicima poremećaja
krvarenja, kao što je hemofilija. Oni nisu u stanju da proizvedu faktor VIII u
količinama koje omogućavaju normalno zgrušavanje krvi. Prije razvoja
rekombinantnog faktora VIII, protein je dobijen obradomvelikih količina ljudske
krvi iz više donatora, koja je imala vrlo visok rizik od prijenosa krvno prenosivih
zaraznih bolesti, na primjer HIV-a i hepatitisa B.
2.4.5 Zlatna riža
Razne rekombinantne riže su konstruirana tako da imaju ekspresiju enzima,
odgovornih za biosintezu β-karotena. Obećavaju značajno smanjenje
učestalosti nedostatka vitamina A u svjetskoj populaciji. Zlatna riža riže trenutno
nije u upotrebi, dok se ne riješe regulatorna pitanja njenih svojstava.
2.4.6 Usjeviotporni na herbicide
Oficijelne sorte važnih poljoprivrednih kultura (uključujući
i soju, kukuruza sirak, uljanu repicu, lucerku i pamuk) su razvijene u pravcima koji
podrazumijevaju rekombinantni gen koji rezultira otpornošćuna herbicid
glifosat a pojednostavljuje suzbijanje korova. Ovi usjevi se zajednički
komercijalno koriste u nekoliko zemalja.

10. 10
2.5 Restrikcijskienzimi
Restrikcijski enzimi ili endonukleaze su oni enzimi koji su sposobnirazdvajati
(sjeći) sekvence baznih parova na bazno-specifičnim mjestima u molekuli DNK.
Restrikcijski enzimi režu (sijeku) molekulu DNK na određene bazne sekvence tako
da svaki do sada izolirani enzim ima "svoju" prepoznatljivu sekvencu koju izdvaja.
To omogućava usmjereno „parčanje“ DNK pri čemu nastaju definirani dijelovi
određene dužine i poznatih krajnjih sekvenci. Zato su ovi enzimi među
najdjelotvornijim i najšire primjenjivanim sredstvima u ciljanim istraživanjima u
oblasti genetičkog inženjerstva i biotehnologije. Pomoćuovih biološki aktivnih
supstancimoguće je izdijeliti duge makromolekule DNK u fragmente koji su
pogodniza dalje manipuliranje. Specifičnost mjesta rezanja omogućava bolje
upoznavanje specifične strukture pojedinih sekvenci DNK. Poznato nekoliko
stotina restrikcijskih enzima za različite pozicije specifičnih rezova.
Rezovi molekula DNK tvore sekvence koje mogu imati dvije vrste krajeva:
 oni koji su na krajevima koji strše i označavaju se kao ljepljivi
krajevi (eng. sticky ends). Ovi enzimi su veoma praktični za primjenu u
genetičkom inženjerstvu jer se dva različita fragmenta DNK lako spojiti
hibridizacijom između jednolančanih krajeva, pod uslovom da su oba
fragmenta dobijena iz pomoć istog enzima (tada su njihovi krajevi
komplementarni);
 glatki rezovi bez stršećih DNK krajeva, a zovu se tupi krajevi (blunt ends).
Jedan od primjera u prvoj kategoriji je restrikcijski enzim EcoRI, a u drugoj
restrikcijski enzim HaeIII, npr.
Slika br.4 Restrikcijske endonukleaze tip II nakon cijepanja ostavljaju ljepljive ili tupe krajeve

11. 11
1. po svojoj strukturi i da li režu svoj DNK supstratna svom mjestu
prepoznavanja ili je
2. njihovo mjesto prepoznavanja i reza odvojeno od drugih. Da bi se rezala
molekula DNK, treba imati na umu da svi restrikcijski enzimi čine dva reza,
jednom kroz svaku okosnicu lanca (šećer-fosfat), tj. obalanca nukleotida u
dvojnoj spirali.DNK.
Unutar prokariota, restrikcijski enzimi selektivno sijeku stranu DNK u procesukoji
se zove restrikcija, dok je sopstvenaDNA zaštićen modificiranim enzimom
(metiltransferaza), koja blokira rezanje prokariotske DNK. Zajedno, ova dva
procesaformiraju restrikcijski sistema modifikacije.Detaljno je istraživano je preko
3.000 restrikcijskih enzima, a više od njih 600 su pripremljeni za komercijalni
promet. Ovi enzimi se rutinski upotrebljavaju za DNK modifikacije
u molekulskom kloniranju. Ovi enzimi nose troslovne nazime koji predstavljaju
skraćenice od imena bakterije iz koje su izolovani. Npr. Enzim izolovan iz
bakterije E. coli nosi naziv Eco, enzimi z bakterije Bacillus amyloliqucfacicns je
Bam.
2.6 Vektori za kloniranje
Vektor (u genetici) je generali naziv za molekule aminokiselina koje pri
eksperimentima kloniranja služe kao nosioci stranih DNK. U popularnom jeziku
genetičara vektor se često naziva genferi. Poznajemo različite vektore, ali isto tako
i različite forme prenošenja strane DNK u jedan drugi živi organizam. Vektor
može biti samo jedana noseća molekula strane DNK, ali isto tako može dodatno
samostalno realizirati transfer gena u ciljanu stanicu. Zajedno sa kloniranom DNK
on čini rekombiniranu DNK molekulu. Najpoznatiji vektorski sistemi u genetici
su: plazmidi, bakteriofagi, virusi, kosmidi i bakterije.
Fragment DNA bilo kojeg porijekla može se ugraditi u plazmidnu ili virusnu DNA
koja služi kao vector za kloniranje. Vektor se potomunosi u ćeliju domaćina
(bakterijsku ili eukariotsku) u kojoj će se replikovati uz učešćeenzima domaćinove
replikativne mašinerije, tako da se zajedno sa vektorskom DNA umnožava i
ispitivani fragment.
2.6.1 Plazmidi
Plazmidi su mali kružni molekuli dvolančane DNA koji se prirodno nalaze u
bakterijama i ćelijama kvasca, a repliciraju se nezavisno od genoma. Oni često
sadrže neke za bakteriju veoma važne gene, kao što su geni koji obezbjeđuju
otpornostna antibiotike. Plazmidi koji se koriste kao vektori za kloniranje

12. 12
najčešće su modifikovani tako da najbolje zadovolje potrebeeksperimentatora.
Tipičan plazmidni vector sadrži:
a) replikativni početak koji omogućuje replikaciju plazmidne DNK u ćeliji
domaćinu,
b) bar jedan gen koji obezbjeđuje otpornostćelije domaćina na određeni
antibiotic, tako da se ćelije u koje je unseen plasmid mogu razlikovati po
osjetljivosti na dati antibiotic
c) restrikciona mjesta čije prisustvo omogućuje da se ispitivani fragment DNA
dobijen uz pomoć jedne restrikcione endonukleaze može lako ugraditi u
plazmidnu DNK koja se z ate potrebe presijeca istim enzimom.
Slika br.5 Stvaranje rekombinantnog plazmida
Plazmidi se obično konstruišu tako da sadrže nekoliko različitih restrikiconih
mjesta koncentrisanih u jednom dijelu plazmidne DNK koji se naziva polilinker.
Na taj način se jedan tip plazmida može koristiti za kloniranje fragmenata DNK
dobijenih različitim restrikcionim enzimima.

13. 13
2.6.2 Bakteriofagλ
Za kloniranje nešto dužih segmenata DNK kao vektor se najčešće koristi
bakteriofag λ. Ovaj virus može poslužiti kao pogodanvector zbog toga što se
trećina njegovom genoma može zamijeniti stranom DNK, a da to ne utiče na
virulenstnost, tj. sposobnostvirusa da inficira bakterijsku stanicu. Genom ovog
virusa je linearna DNK molekula u kome su strukturni geni za protein virusnog
omotača smješteni u desnom I lijevom kraju, a sredina virusne DNK se može za
potrebe kloniranja, zamijeniti restrikcionim mjestima za različite enzyme. Krajevi
virusnog genoma su jednolančani I bitni za pakovanje virsune DNK u proteinski
omotač. Kada se u genom virusa ugradi ispitivani segment strane DNK, dobijeni
hibridni molekul se može in vitro, pod odrešenim uslovima spakovati u virusni
omotač tako da se dobiju virulentni virusi koji će prilikom inficiranja bakterije
ubaciti svoj genom a time I ispitivani fragmenti DNK u bakterijsku ćeliju. U ćeliji
domaćinu replikuje se virusni genom, sintetišu protein omotača I pakuju nove
virusne partikule koje će lizirati bakterijsku ćeliju.
Slika br.6 Bakteriofag lambda

14. 14
2.6.3 Kozmidi
Za potrebe kloniranja velikih fragmenata DNK konstruisani su kozmidi, kao
vektori koji predstavljaju kombinaciju korisnih osobina plazmida i bakteriogafa.
Plazmidi sa tzv. cos mjestima su kozmidi (cos mjesto čini jednolančana DNA od
12 baza, to su kohezivni ili ljepljivi krajevi, takva mjesta ima u svom genomu fag
lambda). To su mali krućni molekuli DNK koji sadrže replikativni početak
plazmida, jedan ili nekoliko markera za selekciju, više različitih restrikicionih
mjesta u koje se može graditi ispitivani fragment DNK i dijelove genoma
bakteriofaga koji su neophodni za in vitro pakovanje u virusni omotač. Kozmidi se
u bakterijama replikuju na sličan način kao plazmidi.
Slika br. 7 Kozmid, plazmid sa cos mjestom koji se prenosi u bakteriju preko bakteriofaga lamda.

15. 15
2.6.4 Eukariotski plazmidi
Stanica kvasca, S. cerevisiae, ima prirodni plazmid oko 2 mm dužine, pa se takav
plazmid koristi za unos gena. To se radi na sljedeći način: konstruira se bakterijski
plazmid sa CEN (centromer) regijom i izvorom replikacije kvasca i telomernom
sekvencom kromosoma kvasca. Tako konstruirani plazmid je YAC (Yeast
Artificial Chromosome). YAC može nositi veliki dio strane DNA (250 - 2000 kb i
više;to je vrlo pogodno upravo za eukariotske gene) koja se prenosi iz generacije u
generaciju u stanici kvasca.
Slika br.8 E. coli plazmid pBR322 modificiran za kvasce. Ovaj plazmid se može replicirati i u
stanici kvasca i u E. coli jer ima oba izvora replikacije te CEN regiju. Ako se linearizira te se na
krajeve dodaju telomerne sekvence nastaje umjetno stvoreni kromosom kvasca (YAC) koji se
koristi za kloniranje velikih dijelova DNA.