Hoạt chất Bortezomib làm nguyên liệu điều trị đa u tuỷ xương, HAY

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-------------------------------
NGUYỄN TUẤN ANH
PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ CẤU TRÚC CỦA HOẠT CHẤT
BORTEZOMIB TỔNG HỢP ĐƯỢC LÀM NGUYÊN LIỆU THUỐC
ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐA U TUỶ XƯƠNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ : HOÁ HỌC
Hà Nội 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
--------------------------------
NGUYỄN TUẤN ANH
PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ CẤU TRÚC CỦA HOẠT CHẤT
BORTEZOMIB TỔNG HỢP ĐƯỢC LÀM NGUYÊN LIỆU THUỐC
ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐA U TUỶ XƯƠNG
CHUYÊN NGÀNH: HOÁ HỌC
MÃ SỐ: 8440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ : HOÁ HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. ĐẶNG THỊ TUYẾT ANH
Hà Nội 2019

i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Phân tích hàm lượng và cấu
trúc của hoạt chất Boterzomib tổng hợp được làm nguyên liệu điều trị bệnh đa u
tuỷ xương” là do tôi thực hiện với sự hướng dẫn của TS.Đặng Thị Tuyết Anh.
Đây không phải là bản sao chép của bất kỳ một cá nhân, tổ chức nào. Các kết
quả thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin trong luận văn là do tôi tiến hành,
trích dẫn, tính toán và đánh giá.Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những nội
dung mà tôi đã trình bày trong luận văn này.
Hà Nội, Ngày tháng năm 2019
HỌC VIÊN
Nguyễn Tuấn Anh

ii
LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.Đặng Thị Tuyết Anh Phó
phòng Hóa Dược - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt
Nam đã dành rất nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp em
hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các anh, chị và đồng nghiệp phòng Hóa
dược - Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo
mọi điều kiện để em học tập và hoàn thành tốt luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Hoá Học ,tập thể các thầy
cô, anh chị và các bạn tại Viện Hoá Học đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt
quá trình hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn Học Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam
đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn
thành luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn đến đề tài chương trình Hoá Dược Mã số:
CNHD.ĐT.076/17-19 để em có thể tham gia và thực hiện luận văn này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Học viên
Nguyễn Tuấn Anh

iii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU............................................................................................................... 1
1.1 TỔNG QUAN VỀ BORTEZOMIB................................................................ 2
1.1.1 Cấu trúc hoá học..........................................................................................................2
1.1.2 Hoạt tính của Bortezomib .........................................................................................2
1.2TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ DỤNG
TRONG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI......................................................................... 3
1.2.1 Phương pháp sắc ký cột.............................................................................................3
1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ...............................................................6
1.2.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ...............................................8
1.2.5. Phương pháp phổ khối lượng (MS).......................................................................9
1.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH................................................... 10
1.3.1 Tính đặc hiệu..............................................................................................................10
1.3.2 Độ chính xác...............................................................................................................10
1.3.3. Độ đúng ......................................................................................................................11
1.4.4. khoảng tuyến tính.....................................................................................................11
1.4.5. Miền giá trị ................................................................................................................12
1.4.6. Giới hạn phát hiện....................................................................................................13
1.4.7. Giới hạn định lượng.................................................................................................13
CHƯƠNG II........................................................................................................ 15
THỰC NGHIỆM................................................................................................. 15
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU................................ 15
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................. 15
2.2.1Chuẩn bị mẫu Bortezomib tổng hợp ............................................................15
2.2.2 Phương pháp phân tích cấu trúc ............................................................................18
2.2.2.1 Phương pháp đo phổ hồng ngoại..................................................... 18

iv
2.2.2.2 Phương pháp phổ MS....................................................................... 19
2.2.2.3 Phương pháp phổ NMR.................................................................... 19
2.2.3 Phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC ...............................................19
2.2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký.................................................. 19
2.2.3.2 Chuẩn bị mẫu ................................................................................... 19
2.2.3.3 Tính thích hợp của hệ thống............................................................. 20
2.2.3.4 Khoảng tuyến tính và miền giá trị.................................................... 20
2.2.3.5 Độ đúng và khoảng xác định của phương pháp .............................. 20
2.2.3.6 Giới hạn phát hiện và Giới hạn định lượng..................................... 21
2.2.3.7 Độ chính xác..................................................................................... 21
2.2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu................................................................ 22
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................... 23
3.1 PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC BORTEZOMIB............................. 23
3.1.1 Xác định cấu trúc của hợp chất 2 ..........................................................................23
3.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất 3..................................................................................24
3.1.3 Xác định cấu trúc hợp chất 4..................................................................................25
3.1.4 Xác định cấu trúc hợp chất Bortezomib 5...........................................................26
3.2 PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BORTEZOMIB ........................ 29
3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống...................................................................................29
3.2.2 Khoảng tuyến tính.....................................................................................................30
3.2.3 Độ đúng và khoảng xác định của phương pháp.................................................31
3.4.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .........................................................32
3.4.5 Độ chính xác...............................................................................................................33
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 36
PHỤ LỤC............................................................................................................ 39

v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Tên gọi
IR Infrared Spectrometry
MS Mass Spectrometry
NMR Nuclear Magnetic Resonance
1
H-NMR 1
H-Nuclear Magnetic Resonance Spectrocopy
13
C-NMR 13
C-Nuclear Magnetic Resonance Spectrocoy
HPLC High-performance Liquid Chromatography
LDA lithium diisopropylamide
THF Tetrahydrofuran
MECN Acetonitrile
MeOH Methanol
EtOAc Ethyl acetate
EDCI 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimide
HBTU
2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-
tetramethyluronium hexafluorophosphate
TBTU
2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-
tetramethyluronium tetrafluoroborate
TFA Trifluoroacetic acid
HOBt Hydroxybenzotriazole

vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Quy trình phân tách các chất trên sắc ký cột................................................4
Hình 2: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng............................................................5
Hình 3: Cách tính giá trị Rf ........................................................................................6
Hình 4: Sơ đồ hệ thống HPLC ...................................................................................7
Hình 5: Sơ đồ cải tiến tổng hợp Bortezomib............................................................16
Hình 6: 1
H-NMR của hợp chất 2 ..............................................................................23
Hình 7: Phổ 13
C- NMR của chất 2............................................................................24
Hình 8: Phổ 1
H-NMR của hợp chất 3.......................................................................24
Hình 9: Phổ IR của hợp chất 4 .................................................................................25
Hình 10: Phổ 1
H-NMR của hợp chất 4.....................................................................26
Hình 11: Phổ FTIR của hợp chất 5...........................................................................26
Hình 12: Phổ 1
H-NMR của hợp chất 5.....................................................................27
Hình 13: Phổ 13
C NMR của hợp chất 5....................................................................28
Hình 14: Phổ HRMS của hợp chất Bortezomib.......................................................28
Hình 15: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ Bortezomib và diện tích
pic .............................................................................................................................31
Hình 16: Sắc ký đồ HPLC của Bortezomib tại điều kiện tối ưu chất chuẩn............34
Hình 17: Sắc ký HPLC của Bortezomib mẫu tổng hợp ...........................................34

vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống.................................... 29
Bảng 2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của Bortezomib ......................... 30
Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của Bortezomib.................................. 31
Bảng 4: Kết quả khảo sát độ lặp lại tạo LOD.......................................... 32
Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại của Bortezomib................................ 33

1
MỞ ĐẦU
Bortezomib có tên thương mại là velcade là thuốc kháng ung thư thế hệ
mới được dùng trong điều trị bệnh đa u tuỷ xương, đa u tuỷ là bệnh ung thư của
tương bào trong tuỷ xương. Bệnh chiếm khoảng 10% tổng số các ca bệnh máu
ác tính trên toàn thế giới, với khoảng 15.200 trường hợp mắc mới mỗi năm,
đứng hàng thứ 2 trong số các bệnh máu ác tính, chi phí điều trị bệnh đa u tuỷ
xương ở Việt Nam bằng thuốc bortezomib(velcade) nhập ngoại là rất đắt giá của
1 lọ Velcade 3,5 mg xuất xứ từ Bỉ có giá khoảng 25 triệu đồng / lọ (3,5 mg), từ
Pháp - khoảng 22 triệu đồng / lọ 3,5 mg và từ Ấn Độ - khoảng 14 triệu đồng.
Ở nước ta hiện nay, trong quá trình tìm hiểu chưa có nghiên cứu nào về
việc tổng hợp và phân tích định lượng của bortezomib được công bố, chính vì
vậy đề tài đã nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp sản phẩm bortezomib dựa
vào các ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp tổng hợp công bố trên thế
giới nhằm mục đích tạo điều kiện cho bệnh nhân sử dụng thuốc với giá thành rẻ
hơn. Tuy nhiên, để đánh giá độ tinh khiết và hàm lượng sản phẩm bortezomib
tổng hợp được chúng tôi đã xây dựng phương pháp định lượng bằng HPLC ghép
đầu dò UV. Theo hướng nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đề tài “ phân tích
hàm lượng và cấu trúc của hoạt chất Bortezomib tổng hợp được làm nguyên
liệu điều trị bệnh đa u tuỷ xương” với mục tiêu như sau:
1. Cải tiến quy trình tổng hợp Bortezomib làm nguyên liệu thuốc điều trị
bênh đa U tuỷ xương
2. Xây dựng phương pháp xác định cấu trúc Bortezomib
3. Xác định hàm lượng của bortezomib bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao ghép detector UV

2
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ BORTEZOMIB
1.1.1 Cấu trúc hoá học
Tên IUPAC: (R)-3-methyl-1-((S)-3-phenyl-2-(pyrazine-2-carboxamido)
propanamido) butylboronic acid
Công thức phân tử: C19H25BN4O4
Khối lượng phân tử: 238.237g.mol-1
1.1.2 Hoạt tính của Bortezomib
Bortezomib là chất ức chế thuận nghịch hoạt động giống chymotrypsin
có thể ức chế các proteasome 25S của tế bào động vật có vú. bortezomib ngăn
chặn sự phân giải protein ảnh hưởng đến dòng thác tín hiệu bên trong tế bào,
dẫn đến chết tế bào [1-4].
Kết quả thử nghiệm lâm sàng cho thấy rằng bortezomib là thuốc độc
tính tế bào đối với nhiều loại tế bào ung thư khác nhau. Các nghiên cứu lâm
sàng bao gồm nhiều bệnh nhân trên toàn thế giới đã xác nhận hiệu quả và tính
năng của Bortezomib trong điều trị cho bệnh đa u tủy. Bortezomib giúp đẩy
lùi bệnh một phần hoặc hoàn toàn trong 30-50% các trường hợp. 20% Các

3
trường hợp không đáp ứng bortezomib đơn thuần có thể đáp ứng với điều trị
phối hợp bortezomib với dexamethason hoặc melphalan và prednisone
Ngoài ra, Bortezomib (Velcade) cũng được dùng để điều trị cho bệnh
nhân u lympho tế bào mantle đã nhận được ít nhất 1 đợt điều trị trước đó.
Nghiên cứu mới đây của các nhà nghiên cứu Hy Lạp công bố trên tạp chí
Arthritis & Rheumatism của Trường ĐH Thấp khớp học Hoa Kỳ (ACR) [5] cho
thấy thuốc sinh học bortezomib (Velcade) có thể trở thành thuốc điều trị viêm
khớp dạng thấp có triển vọng.
1.2 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ
DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
1.2.1 Phương pháp sắc ký cột
Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng. Trong sắc ký cột, chất hấp
phụ pha tĩnh được nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà có thể
triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh.
Giống như sắc ký lớp mỏng, phương pháp này cũng dựa vào độ phân cực
của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột
chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong quá
trình sắc ký. Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố
tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột.
Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: Silicagel phải được hoạt hóa ở 120°C trong
4 giờ trước khi đưa lên cột. Cột sắc ký phải là một khối đồng nhất, phải thật khô
và lắp thẳng đứng trên một giá cố định vững chắc.
Nhồi cột: Chất hấp phụ phải được phân tán đồng đều trong cột. Có 2 cách
nhồi cột: nhồi khô và nhồi ướt với dung môi. Sau khi đưa chất hấp phụ lên cột,
rót dung môi vào cột và để chạy liên tục một thời gian để ổn định cột và không
được để khô dung môi trong cột.

4
Đưa chất cần phân tách lên cột: Phải đưa chất lên cột sao cho chất phân
tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều cách đưa
chất lên cột: phương pháp dùng đĩa giấy, cho thẳng dung dịch chất cần phân tách
lên cột, trộn chất cần phân tách với một lượng chất hấp phụ…
Rửa cột: Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà
áp dụng cách rửa cột bằng áp suất thường hoặc áp xuất nén. Hứng dịch chảy ra ở
đáy cột theo phân đoạn, theo thời gian hoặc bằng ống nghiệm cùng thể tích.
Hình 1: Quy trình phân tách các chất trên sắc ký cột
1.2.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Các bước trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Hình ):
Chuẩn bị bản mỏng:Bản mỏng được bảo quản trong bình hút ẩm. Dùng
bút chì mềm kẻ bản mỏng. Vạch đường chấm chất phân tích (cách mép dưới của
bản mỏng 1,2 cm), đường giới hạn di chuyển của dung môi (cách mép trên của
bản mỏng 0,8 cm) và đánh dấu vị trí chấm chất (các vết chấm cách nhau 0,5 cm
và cách hai bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm).
Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Dùng ống mao quản hoặc micropipet
chấm chất lên các vị trí đã đánh dấu. Các vết chấm phải nhỏ, lượng chất phải

5
đồng đều, không quá lớn dễ kéo vết hoặc chồng vết, cũng không quá nhỏ khó
hiện vết bằng thuốc thử.
Triển khai sắc ký: Bình triển khai thường là bình thủy tinh, có nắp đậy kín và
đáy phải bằng. Lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình. Pha hệ dung môi với
tỷ lệ thích hợp và vừa đủ, rót vào bình triển khai. Lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung
môi. Đặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở
trên bề mặt của lớp dung môi triển khai. Đậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không
đổi. Khi dung môi chạy đến đường giới hạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khô
bản mỏng rồi hiện vết.
Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bước sóng
254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử (thuốc thử dùng trong đồ án là Ce(SO4)2).
Hình 2: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng
Hiện nay, chủ yếu sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254,
kích thước 20×20 cm, dày 0,2 mm. Sắc ký lớp mỏng là công cụ đắc lực trong
nghiên cứu dược liệu vì đơn giản, ít tốn thiết bị và dung môi mà lại đạt hiệu
quả cao.
Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha
động di chuyển qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích. Pha tĩnh là
chất hấp phụ được lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, được trải mỏng đồng
nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc kim loại. Pha động là một hệ
dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định tùy
theo mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử

6
trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động, với
những tốc độ khác nhau. Kết quả, thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng.
Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di
chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng
dịch chuyển của dung môi (Hình 3). Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến giá trị Rf.
Hình 3: Cách tính giá trị Rf
1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao: (High-performance liquid chromatography);
viết tắt: HPLC) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định
lượng từng thành phần trong hỗn hợp. Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để
đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa hỗn hợp mẫu, qua
một cột sắc ký. Cột sắc ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn. Mỗi thành phần
trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng
của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự phân tách các thành phần
khì mà chúng chảy ra khỏi cột

7
.
Hình 4: Sơ đồ hệ thống HPLC
HPLC đã và đang được sử dụng cho những mục đích sản xuất, nghiên
cứu, pháp lý và y dược [6].
Sắc ký có thể được mô tả là một quá trình dịch chuyển khối lượng liên
quan tới hấp phụ. HPLC dựa trên hệ thống bơm để đẩy chất lỏng đã bị nén và
hỗn hợp mẫu qua một cột đổ bằng một chất hấp phụ, dẫn tới sự phân tách của
các thành phần trong mẫu. Những thành phần của hỗn hợp mẫu được tách ra
khỏi nhau bởi mức độ tương tác khác nhau với các hạt hấp phụ. Chất lỏng bị nén
là hỗn hợp dung môi ví dụ nước, acetonitrile hay methanol và được gọi là "pha
động". Thành phần và nhiệt độ của pha động đóng vai trò chính trong quá trình
phân tách bằng cách tác động lên nhưng tương tác xảy ra giữa những thành phần
trong mẫu và chất hấp phụ ở cột.
Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có khả năng dò tìm lượng mẫu
nhỏ đến 200pg, tách những hỗn hợp phức tạp với độ phân giải cao. Khi phân
tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân
tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các thuốc không bền với
nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký. Những cơ hội áp dụng HPLC hầu như

8
không giới hạn, do đó HPLC đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong
khoa học và công nghiệp [7-11].
1.2.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) là phương pháp vật lý hiện đại
nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp phổ biến được sử
dụng là phổ 1
H-NMR và 13
C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử 1
H và 13
C có
momen từ. Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có
thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường. Đó là spin hạt nhân
có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [12].
Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt
nhân 1
H và 13
C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc trưng cho
các hạt nhân 1
H và 13
C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt
nhân 1
H thì:
)(10. 6
ppm
o
xTMS





Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt
nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa
một các tổng quát như sau:
)(10. 6
ppm
o
xchuan





Trong đó: νchuan, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân
mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao
quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1
H và 13
C
trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến
chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học

9
của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu
hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [13].
Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt
trong chất được khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên
mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1
H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12
ppm, đối với 13
C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm.
Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân không
tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân phổ có
thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách tín hiệu
cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có từ tính ở
cạnh nhau. Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết. Giá trị J phụ thuộc
vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn
giữa các tương tác [13].
Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các hợp
phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút ra kết
luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau [12].
1.2.5. Phương pháp phổ khối lượng (MS)
Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử
trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e. Sau đó
phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận được phổ khối lượng. Dựa vào
phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên
cứu. [10,14].
Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân
tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định được
cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong những thông số

10
quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu
khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau.
1.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
1.3.1 Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác định
chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt
của các chất khác (tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất,…)
có trong mẫu thử.
Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu: Sắc
ký đồ của mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê
với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Sắc ký đồ của mẫu trắng,
mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời
gian lưu chất chuẩn [15-18].
1.3.2 Độ chính xác
Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử
riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất
cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện. Độ chính xác cũng
còn được coi là mức độ dao động của các kết quả đo lường riêng biệt so với giá
trị trung bình [15-18].
Phương pháp xác định
Độ lặp lại: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá trị
của quy trình phân tích (3 lần phân tích/ nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định lượng
tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%.
Yêu cầu Tiêu chuẩn cho giá trị RSD phụ thuộc nhiều vào loại phân tích
mẫu phân tích. Đối với các quy trình định lượng thường quy, RSD dễ dàng đạt
trên dưới 2%. Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác ở khoảng 20% ở

11
giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao hơn. Giá trị RSD càng
nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [19].
1.3.3. Độ đúng
Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần giữa giá trị tìm
thấy so với giá trị thực thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một
mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [15-18]. Độ đúng bị ảnh hưởng bởi
sai số hệ thống.
Phương pháp xác định Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định
lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy
trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau). Đại lượng đặc
trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo công thức sau:
Độ đúng hay tỉ lệ thu hồi (%) =
Lượng hoạt chất thu hồi
x 100 %
Lượng hoạt chất thêm vào
Trong đó: 𝑋 là giá trị mẫu đo được
µ là giá trị mẫu theo lý thuyết.
Yêu cầu Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình
xử lý mẫu và nồng độ phân tích. Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục
hồi thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [15,16]. Tỷ lệ phục hồi càng
gần giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao.
1.4.4. khoảng tuyến tính
Khoảng tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả
của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại
lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x).
Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, khoảng tuyến tính được biểu thị bằng
phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R2
[15-18]

12
- Khoảng tuyến tính cần được khảo sát ở khoảng 10 (ít nhất 5 [16, 18]
hoặc 6 [15, 17]) mức nồng độ khác nhau.
- Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của
phương pháp. Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu. Khi thẩm định
phương pháp, mỗi nồng độ cần được đo ít nhất 3 lần [15].để kiểm tra độ lặp của
các nồng độ chuẩn.
Đánh giá khoảng tuyến tính bằng các phương pháp thống kê thích hợp:
trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra tính
thích hợp của phương trình
Yêu cầu Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,90 ≤ R2 ≤ 1 [16].
1.4.5. Miền giá trị
Miền giá trị của một quy trình phân tích là khoảng giữa nồng độ cao và
nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử với bất kì nồng độ
nào trong khoảng này đều phải đáp ứng về độ chính xác lẫn độ đúng và tính chất
tuyến tính của phương pháp [15-18]. Miền giá trị thường được biểu thị bằng
khoảng nồng độ mà ở khoảng nồng độ này vẫn còn sự phụ thuộc tuyến tính giữa
giá trị đo được và nồng độ [15-18].
Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính của một khoảng nồng độ nhất định.
Sau đó thiết lập bằng cách khẳng định là khoảng này có đáp ứng độ tuyến tính
có thể chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không. Yêu cầu Với quy trình định
lượng nguyên liệu và thuốc, yêu cầu tối thiểu của miền giá trị là phải đạt 80% –
120% nồng độ của mẫu thử [15-18].

13
1.4.6. Giới hạn phát hiện
Giới hạn phát hiện (LOD) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất
của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải
xác định chính xác hàm lượng [15-18].
- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định
bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ
nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định vẫn
phát hiện được.
- Phương pháp lập tỷ số tín hiệu phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp
dụng với quy trình có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử
tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOD
là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 – 3.
- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc: LOD = 3,3 ×
SD
a
Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng
SD: độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. SD được tính bằng hai cách: dựa
vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường chuẩn định lượng.
1.4.7. Giới hạn định lượng
Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp
nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ
chính xác phù hợp [15-18].
- Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác:
LOQ được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập
mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định
vẫn định lượng được với độ đúng và độ chính xác chấp nhận được.

14
- Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương
pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu thu
được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOQ là nồng độ
mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10.
Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc: LOD = 10 x
SD
a
Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn độ
SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. SD được tính bằng hai cách: dựa vào
độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường cong chuẩn độ

15
CHƯƠNG II
THỰC NGHIỆM
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1 Nguyên liệu
Các hóa chất phục vụ cho việc tổng hợp hữu cơ và dung môi được mua
của hãng Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ).Bột silicagel cho sắc ký cột 100 - 200
mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silicagel đế nhôm Art. 5554 DC - Alufolien
Kiesel 60 F254 (Merck).Chất chuẩn bortezomib, các dung môi ACN, Axit formic
để chạy sắc ký HPLC đều của hãng Merch, độ tinh khiết trên 99%.
2.1.2 Thiết bị nghiên cứu
Để xác nhận cấu trúc chúng tôi tiến hành bằng các phương pháp được sử
dụng trên các thiết bị sau: Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được đo
trên máy Gallenkamp của Anh, Phổ 1
H-NMR (500MHz) và 13
C-NMR
(125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500
MHz, Phổ khối của các chất nghiên cứu được ghi trên máy Hewlett Packard
Mass Spectrometer 5989 MS hoặc LC- MSD- Trap- SL, Hệ thống HPLC - DAD
3000 (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) trang bị bốn bơm cao áp và bộ tiêm mẫu tự
động. Cột sắc ký RP-C18( kích thước cột 4,6 x 250 nm, kích thước hạt 3m)
thiết bị xử lý tín hiệu là hệ thống máy vi tính với hệ điều hành Microsoft
Windows 7 trang bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản
7.1.2.1478.
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Chuẩn bị mẫu Bortezomib tổng hợp
Mẫu bortezomib tổng hợp được chuẩn bị bằng cách tiến hành tìm hiểu
những ưu và nhược điểm các phương pháp nghiên cứu của một số tác giả và
phương pháp tổng hợp sau:

16
- Tổng hợp bortezomib đi từ pinanediol boronic este[20].
- Tổng hợp bortezomib từ N-pyrazinoyl-L-phenylalanine[21].
- Tổng hợp bortezomib bằng phương pháp Ellman[22].
- Tổng hợp bortezomib anhydride từ pinacol 2-methylpropane-1-
boronate[23].
Từ các kết quả nghiên cứu bước đầu của nhóm tác giả, nhận thấy rằng
mỗi phương pháp tổng hợp bortezomib đều có ưu điểm và nhược điểm nhất
định. Các phương pháp tổng hợp bortezomib đã được công bố cho thấy, để tổng
hợp bortezomib phải thực hiện qua phản ứng Matteson tổng hợp muối ammoni
chlorid trong điều kiện nhiệt độ rất thấp (dưới -20o
C). Đây là vấn đề khó khăn
khi thực hiện để nâng quy mô, hiệu suất. Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi đề
xuất quy trình đơn giản qua 4 bước phản ứng phù hợp với quy mô nghiên cứu tại
phòng thí nghiệm và điều kiện tại Việt Nam như hinh 5.Từ đó mẫu bortezomib
tổng hợp được dùng làm nguyên liệu để phân tích xác định cấu trúc và xây dựng
phương pháp xác định hàm lượng.
Hình 5: Sơ đồ cải tiến tổng hợp Bortezomib

17
Quy trình tổng hợp chất 2: (1R)-(S)-pinanediol 1-ammonium
trifluoroacetate-3-methylbutane-l-boronate 1 (100mg, 1mmol) được hòa tan
trong 5ml CH2Cl2, sau đó cho lần lượt tác nhân EDC.HCl (60mg, 1,2 mmol),
HOBt (42mg, 1,2 mmol) và diisopropyletylamin DIPEA (0,1ml, 2,5mmol) và
Boc-L-phenylalanine (70 mg, 1 mmol) vào bình phản ứng. Hỗn hợp phản ứng
được khuấy ở nhiệt độ 0o
C 12 giờ. Sau đó, loại bỏ diclometan ở áp suất thấp,
thêm vào hỗn hợp phản ứng 60 ml etyl axetat. Pha hữu cơ được rửa lần lượt với
nước DI (2 x 40 mL), dung dịch acid phosphoric 1% (2 x 40 mL), dung dịch
K2CO3 2% (2 x 40 mL), và nước muối (2 x 40 mL). Mỗi pha nước được chiết lại
2 lần bằng etyl axetat. Pha hữu cơ sau đó được gộp lại, làm khan bằng muối
natri sulfat, lọc và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được hợp chất 2 dưới
dạng chất bọt màu trắng. Sau khi tinh chế bằng cột silica gel, thu được sản phẩm
2 sạch với hiệu suất phản ứng là 80%.
Quy trình tổng hợp chất 3: hợp chất 2 (200mg, 1mmol) được hòa tan
trong 5ml CH2Cl2 ở nhiệt độ 0o
C, sau đó TFA (3mmol) được nhỏ giọt từ từ vào
bình phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ 0o
C trong 3h. Sau đó,
loại bỏ diclometan ở áp suất thấp, thêm dung môi toluen, cô quay phản ứng để
loại bỏ dung môi triệt để. Sản phẩm sau khi cô quay có dạng bột trắng là muối 3
(hiệu suất 90%) được sử dụng cho phản ứng tiếp theo mà không cần tinh chế.
Quy trình tổng hợp chất 4: Muối ammonium chloride 3 (100mg, 1mmol)
được hòa tan trong 5ml CH2Cl2, sau đó cho lần lượt tác nhân EDC.HCl (51mg,
1,2 mmol), HOBt (36mg, 1,2 mmol) và diisopropyletylamin DIPEA (0,1ml, 2,5
mmol) và pyrazine-2-carboxylic acid (27 mg, 1 mmol) vào bình phản ứng. Hỗn
hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ 0o
C 12 giờ. Sau đó, loại bỏ diclometan ở
áp suất thấp, thêm vào hỗn hợp phản ứng 60 ml etyl axetat. Pha hữu cơ được rửa
lần lượt với nước DI (2 x 40 mL), dung dịch acid phosphoric 1% (2 x 40 mL),

18
dung dịch K2CO3 2% (2 x 40 mL), và nước muối (2 x 40 mL). Mỗi pha nước
được chiết lại 2 lần bằng etyl axetat. Pha hữu cơ sau đó được gộp lại, làm khan
bằng muối natri sulfat, lọc và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được hợp chất
4 dưới dạng chất bọt màu trắng. Sau khi tinh chế bằng cột silica gel, thu được
sản phẩm 4 sạch với hiệu suất phản ứng là 85%.
Quy trình tổng hợp hợp chất Bortezomib 5: N-(2-pyrazinecarbonyl)-L-
phenylalanine-L-leucine borate 4 (100 mg, 1 mmol) được hòa tan bằng
MeOH (0,4ml) trong bình cầu đáy tròn. Sau đó thêm isobutyl boronic acid
(35 mg, 1,8 mmol) trong hexan (0,4ml), acid HCl 1N (0,3 ml) được nhỏ giọt
từ từ vào và hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 4h. Hỗn
hợp phản ứng được chia làm 2 lớp riêng biệt, sau phản ứng được chiết với
hexan (30ml x 3 lần). Phân lớp MeOH cô quay loại dung môi, thêm NaOH
2N để trung hòa đến pH = 6-6,5 và được chiết bằng EtOAc (30ml x 3 lần).
Pha hữu cơ sau đó được gộp lại, làm khan bằng muối natri sulfat, lọc và loại
bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được hợp chất bortezomib 5 dưới dạng chất
bọt màu trắng. Sau khi tinh chế bằng cột silica gel, thu được sản phẩm
bortezomib 5 (44 mg) sạch với hiệu suất phản ứng là 60%.
2.2.2 Phương pháp phân tích cấu trúc
2.2.2.1 Phương pháp đo phổ hồng ngoại
Mẫu sau khi được tiến hành kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng TLC là đã sạch
ta tiến hành đem đo phổ hồng ngoại bằng cách trộn mẫu Bortezomib thật đồng
đều với KBr theo tỉ lệ 1:10 hoặc 1:100 rồi ép thành viên mỏng hầu như trong
suốt bằng máy ép thuỷ lực sau đó tiền hành đo phổ trên thiết bị FT-IR spectrum
TWO DTGS tại phòng Hoá Dược – Viện Hoá Học – Viện hàn lâm khoa học và
công nghệ Việt Nam.

19
2.2.2.2 Phương pháp phổ MS
ta tiến hành đem đo phổ HR-MS tại Viện Hoá Học – Viện hàn lâm khoa học và
công nghệ Việt Nam.
2.2.2.3 Phương pháp phổ NMR
ta tiến hành đo phổ 1H-NMR và 13
C-NMR .Mẫu bortezomib được hoà tan trong
dung môi CDCl3 sau đó cho mẫu được hoà tan vào ống NMR và tiến hành đặt
đo trên máy thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân phân giải cao tại Viện Hoá Học –
Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam
2.2.3 Phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC
2.2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký
Dựa trên cơ sở tham khảo một số tài liệu định lượng bortezomib bằng
phương pháp HPLC [7,24] và có một số thay đổi nhỏ, đã chọn ra được điều
kiện như sau: Pha tĩnh cột sắc ký RP-C18( kích thước cột 4,6 x 250 nm, kích
thước hạt 3m), pha động Methanol:H2O:Acid formic tỉ lệ 63:37:0,1 thể tích
tiêm mẫu 20 μl, tốc độ dòng 1 ml/phút, thời gian sắc ký 10 phút, nhiệt độ cột
được duy trì ở 350
C bước sóng 270nm.
2.2.3.2 Chuẩn bị mẫu
Dung môi Acetonitril dùng làm mẫu trắng, pha dung dịch thử gốc bằng
cách cân chính xác 25 mg Bortezomib vào bình định mức 50 ml tương ứng với
nồng độ định lượng là 100%, hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi pha mẫu và
lắc đều.Dung dịch thử được xác định bằng cách hút chính xác 5 ml dung dịch
trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều, lọc qua
màng lọc 0,45 µm.

20
Để xác định dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 25 mg Bortezomib
chuẩn vào bình định mức 50 ml hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi
Acetonitril lắc đều. Sau đó pha dung dịch chuẩn bằng cách hút chính xác 5 ml
dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc
đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.
2.2.3.3 Tính thích hợp của hệ thống
Tiến hành kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký tiêm lặp lại 6 lần dung
dịch chuẩn. Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic Bortezomib giữa các lần
tiêm lặp lại ≤ 2,0 %. Lần lượt tiêm dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ
thống sắc ký.
2.2.3.4 Khoảng tuyến tính và miền giá trị
Từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng bằng dung môi pha mẫu để thu được
các dung dịch chuẩn có nồng độ Bortezomib biến thiên trong khoảng 0,025 –
0,075 mg/ml Bortezomib (tương ứng 50 – 150 % nồng độ định lượng). Tiêm các
dung dịch này vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ. Tiến hành phân tích các
mẫu, xác định phương trình hồi quy giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic
tín hiệu. Xác đinh giá trị R2
.
Khoảng xác định được suy ra từ kết quả độ đúng và độ tuyến tính (Từ giá
trị nhỏ nhất đến giá trị lớn nhất của độ đúng).
2.2.3.5 Độ đúng và khoảng xác định của phương pháp
Sử dụng dung dịch chuẩn ở phần chuẩn bị mẫu ta chuẩn bị các mẫu thử
sau mỗi mức nồng độ tiến hành 3 mẫu thử.
+ Dung dịch mẫu 80 %: Cân chính xác khoảng 20 mg Bortezomib chuẩn
vào bình định mức 50 ml, hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi pha mẫu, lắc
đều. Hút chính xác 5 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung
môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

21
môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm
môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.
2.2.3.6 Giới hạn phát hiện và Giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện được xác định bằng cách pha loãng dần dung dịch
chuẩn Bortezomib đến khi tỷ lệ tín hiệu thu được gấp khoảng 3 lần độ nhiễu
đường nền.
Giới hạn định lượng (LOQ): giới hạn định lượng của phương pháp được
xác định dựa trên giới hạn phát hiện: LOQ = 3,3 x LOD.
Tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch thu được, ghi lại các sắc ký đồ và xác
định RSD của diện tích píc.
2.2.3.7 Độ chính xác
Độ chính xác là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt với giá trị thực khi
lặp lại quy trình phân tích nhiều lần. Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ đúng.
Độ lặp lại: Acetonitril được sử dụng làm dung dịch chuẩn.Pha dung dịch
thử bằng cách cân chính xác 25 mg mẫu bortezomib tổng hợp vào bình định
mức 50 ml, hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi pha mẫu, lắc đều. Hút chính
xác 5 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa
đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Hàm lượng (%) của Bortezomib (C19H25BN4O4) tính theo chế phẩm đã
làm khô được tính theo công thức:

22
Trong đó:
ST: Diện tích pic Bortezomib trên sắc ký đồ dung dịch thử
SC: Diện tích pic Bortezomib trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn
C: Nồng độ Bortezomib trong mẫu chuẩn (mg/ml)
mT: Lượng cân mẫu thử (mg)
a: Hàm lượng nước trong chế phẩm (%)
Tiến hành định lượng phân tích 6 mẫu bortezomib dung dịch thử độc
lập.Xác định hàm lượng các hoạt chất có trong các mẫu thử theo trung bình diện
tích pic Bortezomib của dung dịch chuẩn .Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ
lệch chuẩn tương đối RSD (%) giữa giá trị các lần định lượng
2.2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu
Để xử lý số liệu kết quả của các giá trị đo được qua mỗi lần đo. Dùng toán
thống kê để xử lý số liệu các kết quả với phần mềm Microsoft Excel 2010. Một
số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả:
- Gía tri trung bình:
- Độ lệch chuẩn:
- Độ lệch chuẩn tương đối:

23
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC BORTEZOMIB
Hợp chất được xác định cấu trúc bằng phương pháp đo phổ khối , phổ
hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR.
3.1.1 Xác định cấu trúc của hợp chất 2
Hình 6: 1
H-NMR của hợp chất 2
Trên phổ 1
H-NMR của hợp chất 2 xuất hiện đầy đủ tín hiệu cộng hưởng
của 46 proton bao gồm tín hiệu đặc trưng 5 proton vòng thơm, 24 proton của 8
nhóm methyl cộng hưởng tại δH = 1,40 (s, 15H); 1,28 (s, 3H); 0,82 (s, 9H). 2
proton của nhóm –NH cộng hưởng tại δH = 6,04 (s, brs 1H,); 5,01 (s, brs 1H,).

24
Hình 7: Phổ 13
C- NMR của chất 2
Trên phổ 13
C-NMR của hợp chất 2 xuất hiện đầy đủ tín hiệu cộng hưởng
của 29 nguyên tử Cacbon bao gồm tín hiệu đặc trưng của nhóm cacbonyl δC
171,7; 5 nhóm methine sp (δC 136,6; 129,4; 129,3; 128,6; 125,8); 4 nhóm
methine (δC 40,1; 39,6; 38,8; 38,4); 3 nhóm methylen (38,1; 37,5; 35,6); 8 nhóm
methyl δC (28,6; 28,2 27,1; 25,3; 25,3; 24,0; 23,0; 21,9) và 2 cacbon bậc 4
3.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất 3
Hình 8: Phổ 1

25
Trên phổ IR cũng được thể hiện các tín hiệu đặc trưng λ= 3323cm-1
(NH); λ= 2929cm-1
(-CH); λ=1692; 1648cm-1
(C=O); 1499; 1367; 1282; 1250;
1170; 1030; 744; 699 cm-1
.
Trên phổ 1
nhóm methyl cộng hưởng tại δH = 1,35 (s, 3H); 1,27 (s, 3H); 0,82 (s, 6H), 0,76
(s, 3H) 1 proton của nhóm –NH cộng hưởng tại δH = 6,81 (s, brs 1H,); 3 nhóm
methylen δH = (4,25 (m, 2H); 3,23-3,20 (m, 2H); 1,39-1,36 (m, 2H)), 6 nhóm
R1–CH-R2 (3,11 (t, 1H, J = 6,5 Hz); 2,32-2,27 (m, 1H); 2,18-2,16 (m, 1H); 2,00
(t, 1H, J = 5,5 Hz); 1,89-1,88 (m, 1H); 1,78 (d, 1H, J = 11,0 Hz))
3.1.3 Xác định cấu trúc hợp chất 4
Sau khi tinh chế bằng cột silica gel, thu được sản phẩm 4 sạch với hiệu
suất phản ứng là 85%
4000 4503500 3000 2500 2000 1750 1500 1250 1000 750 500
100
79
80
82
84
86
88
90
92
94
96
98
cm-1
%T
1651.80cm-1
1520.03cm-1
2927.86cm-1
1374.68cm-1
3333.78cm-1
1020.35cm-1
1238.56cm-1
1280.79cm-1
1122.84cm-1
1466.75cm-1
700.10cm-1
1077.74cm-1
744.45cm-11727.39cm-1 923.28cm-1
3785.70cm-1
1738.37
1579.08
1453.67
2953.56
2870.18
Hình 9: Phổ IR của hợp chất 4
Trên phổ IR cũng được thể hiện các tín hiệu đặc trưng λ= 3333cm-1
(NH);
λ= 2929cm-1
(-CH); λ=1727; 1651cm-1
(C=O);

26
Hình 10: Phổ 1
Trên phổ 1
nhóm methyl cộng hưởng tại δH = 1,38 (s, 3H); 1,28 (s, 3H); 0,84 (s,
6H);0,81(s,3H).2 proton của nhóm –NH cộng hưởng tại δH = 8,36 (d, 1H, J =
8,0 Hz); 7,23-7,20 (m, 1H)
3.1.4 Xác định cấu trúc hợp chất Bortezomib 5
Cấu trúc của sản phẩm bortezomib 5 đã được chứng minh bằng phổ IR,
1
H-NMR, 13
C-NMR, HPLC, HRMS. Trên phổ IR của sản phẩm 1 xuất hiện một
số tín hiệu đặc trưng của một số nhóm chức có mặt trong phân tử.
4000 4503500 3000 2500 2000 1500 1000 500
100
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
cm-1
%T
1516.28cm-1
1682.58cm-1
1403.92cm-1
2954.57cm-1
1020.79cm-1
1294.06cm-1
1153.20cm-1
1201.33cm-1
701.81cm-1
3321.23cm-1
754.18cm-1
2870.27
2927.99
3204.24
3385.66
Hình 11: Phổ FTIR của hợp chất 5

27
Trên Phổ IR Tín hiệu hấp thụ tại 3385 cm-1
đặc trưng cho nhóm -OH, tín
hiệu hấp thụ tại 3204 cm-1
đặc trưng cho nhóm -NH, tín hiệu hấp thụ tại 1682
cm-1
đặc trưng cho nhóm carbonyl (C=O).Ngoài ra còn xuất hiện các dao động
hóa trị của liên kết C=C vòng thơm tại 1516 và 1403 cm-1
, các dao động biến
dạng của liên kết C-O tại 1153 cm-1
.
Hình 12: Phổ 1
Trên phổ 1
H NMR của chất 1 xuất hiện đầy đủ các tín hiệu đặc trưng của
các proton có mặt trong phân tử. Tám tín hiệu proton của vòng thơm cộng
hưởng tại vị trí 9,14-7,27 ppm. Tín hiệu proton của trong CHNH cho một tín
hiệu multiple tại vị trí 4,83-4,80ppm.Sáu proton của nhóm -CH3 cộng hưởng tại
vị trí 0,86 -0,81.

28
Hình 13: Phổ 13
C NMR của hợp chất 5
Phổ 13
C NMR của sản phẩm 5 cũng xuất hiện đầy đủ 19 nguyên tử carbon
có mặt trong phân tử.
A1 #4371 RT: 19.50 AV: 1 NL: 7.00E5
T: FTMS + p ESI Full ms [50.0000-750.0000]
384.5 384.6 384.7 384.8 384.9 385.0 385.1 385.2 385.3 385.4 385.5 385.6 385.7 385.8 385.9
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
RelativeAbundance
385.2928
Hình 14: Phổ HRMS của hợp chất Bortezomib 5

29
Trên phổ HRMS của hợp chất cho pic ion [M+H]+
m/z = 385,2928 phù
hợp với công thức phân tử của bortezomib là C19H25BN4O4. Qua các dữ kiện vừa
phân tích IR, NMR, MS cho phép xác định cấu trúc của sản phẩm 5 là phù hợp
với các kết quả đã nghiên cứu trước.
3.2 PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BORTEZOMIB
3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống
Kết quả hiển thị trên sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện các pic có thời
gian lưu tương ứng với thời gian của pic Bortezomib trên sắc ký đồ dung dịch
chuẩn .
Trên sắc ký đồ dung dịch thử cho pic thời gian lưu tương ứng với thời
gian lưu của pic Bortezomib trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn (khoảng 7,7%)
Bảng 1: Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống
Stt
Thời gian lưu
(phút)
Diện tích pic
1 7,763 1194,2
2 7,771 1198,7
3 7,776 1193,5
4 7,768 1199,8
5 7,766 1184,0
6 7,754 1191,5
TB 7,766 1193,6
RSD (%) 0,10 0,48
Nhận xét: RSDthời gian lưu < 1,0 %; RSDdiện tích pic < 2,0 % đáp ứng đúng yêu
cầu độ đặc hiệu cho thấy hệ thống phù hợp để định lượng Bortezomib trong mẫu
tổng hợp

30
3.2.2 Khoảng tuyến tính
Kết quả khảo sát sự tương quan giữa y (diện tích pic Bortezomib) và x
(nồng độ Bortezomib) bằng phương pháp bình phương tối thiểu, kết quả cho
thấy: hệ số r2
= 0,9997 (=> r = 0,9998 ≥ r = 0,998); chứng tỏ có sự tương quan
tuyến tính giữa nồng độ Bortezomib và diện tích pic tương ứng.
Bảng 2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của Bortezomib
Stt
% so với
định lượng
Thể tích dung
dịch chuẩn
gốc
Bortezomib
(ml)
Bình
định
mức
(ml)
Nồng độ
Bortezomib
(mg/ml)
Diện tích pic
Bortezomib
1 50 1 20 0,0254 589,3
2 80 4 50 0,0406 951,6
3 100 5 50 0,0507 1193,6
4 120 3 25 0,0609 1441,6
5 150 3 20 0,0761 1779,3
Hệ số tương quan r 0,9998
Hệ số góc 23544,6069
Hệ số chắn (intercept) 3,7476
% Y 0,31 %
Tiến hành xây dựng đường chuẩn bortezomib bằng excel ta được phương
trình đường chuẩn như hình 15

31
Hình 15: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ Bortezomib
và diện tích pic
3.2.3 Độ đúng và khoảng xác định của phương pháp
Mỗi mức nồng độ tiến hành 3 mẫu thử cho kết quả trong bảng sau:
Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của Bortezomib
Mẫu
Lượng
chuẩn
Bortezomi
b thêm vào
(mg)
Diện tích pic
Bortezomib
Lượng
Bortezomib
tìm lại
(mg)
% Thu hồi
80% 21,03 984,0 21,13 100,5 TB:99,9
%
RSD:0,7
%
80% 20,41 942,2 20,23 99,1
80% 20,14 939,5 20,17 100,2
100% 25,46 1185,3 25,45 100,0 TB:99,7
%
RSD:0,3
%
100% 25,41 1181,7 25,37 99,9
100% 25,73 1190,2 25,56 99,3
120% 31,35 1475,3 31,68 101,0 TB:100,%
RSD:0,8
%
120% 30,07 1395,0 29,95 99,6
120% 30,45 1410,4 30,29 99,5
TB (%) 99,9
RSD (%) 0,61

32
Nhận xét: % thu hồi trong khoảng 98,0 % – 102,0 % với RSD =0,61% < 2 %
Khẳng định Phương pháp định lượng Bortezomib trong mẫu tổng hợp đạt yêu cầu về
độ đúng. Sự tương quan tuyến tính giữ nồng độ và diện tích pic trong khoảng nồng
độ Bortezomib từ 0,025 – 0,075 mg/ml ) tương ứng nồng độ Bortezomib bằng 50%
đến 150% so với nồng độ định lượng. Kết quả này cho thấy tại nồng độ Bortezomib
bằng 80 % đến 120 % so với nồng độ định lượng có độ đúng, độ lặp lại tốt và nằm
trong khoảng tuyến tính. Như vậy khoảng xác định của phương pháp là trong giới
hạn từ 80 % đến 120 % so với nồng độ định lượng
3.4.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện được xác định tại dung dịch chuẩn có nồng độ ≈ 1,25
µg/ml cho đáp ứng píc gấp khoảng 3 lần độ nhiễu đường nền. Tiến hành sắc ký
6 lần dung dịch cho kết quả độ lặp lại của diện tích pic của dung dịch có nồng
độ ở mức giới hạn phát hiện được ghi trong bảng 4.
Bảng 4: Kết quả khảo sát độ lặp lại tạo LOD
STT
Thời gian lưu
(phút)
Diện tích pic S/N
1 7,848 30,6 3,0
2 7,718 34,5 3,1
3 7,748 33,1 3,1
4 7,775 28,9 3,3
5 7,847 32,0 3,1
6 7,805 34,1 3,1
T.bình 7,790 32,2 3,1
RSD
(%)
0,680 6,69 (< 10%)
=> LOD ≈ 1,25 µg/ml và LOQ = 1,25 x 3,3 ≈ 3,75 µg/ml.

33
3.4.5 Độ chính xác
Để đánh giá hàm lượng bortezomib chính xác nhất chúng tôi tiến hành
đánh giá độ lặp lại bằng cách tiêm 6 mẫu thử trên sắc ký cho kết quả số liệu ở
bảng 5:
Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại của Bortezomib
stt Lượng cân chuẩn: 25 mg
Diện tích pic TB mẫu chuẩn: 1250,1
Lượng cân
mẫu thử
(mg)
Diện tích
pic
% Hàm lượng
1 25,71 1253,9 98,6
2 25,03 1248,4 100,8
3 25,01 1214,7 98,2
4 25,04 1218,2 98,5
5 25,39 1229,6 97,9
6 25,11 1231,1 99,1
Kết quả định lượng trung bình (n = 6):
98,9 %
RSD (n=12): 1,07 %
Nhận xét: RSD (n=6) ≤ 3,0 % => Phương pháp đạt yêu cầu về độ lặp lại.
Qui trình phân đáp ứng các yêu cầu về độ đặc hiệu, độ tuyến tính và khoảng xác
định, độ đúng, độ lặp lại, thích hợp để định tính, định lượng nguyên liệu
Bortezomib trong mẫu tổng hợp

34
Hình 16: Sắc ký đồ HPLC của Bortezomib tại điều kiện tối ưu chất chuẩn
Hình 17: Sắc ký HPLC của Bortezomib mẫu tổng hợp

35
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết Luận:
Sau thời gian thực hiện luận văn này đã thu được các kết quả nghiên cứu
như sau:
1. Đã xây dựng được quy trình cải tiến tổng hợp bortezomib đạt hàm
lượng 98,9% qua 4 bước phản ứng phù hợp với điều kiện thực tế ở Việt Nam
2. Dựa vào các phương pháp phân tích hoá lý hiện đại đã xác định được
cấu trúc của hợp chất bortezomib và các sản phẩm trung gian
3. Đã thẩm định quy trình định lượng bortezomib bằng phương pháp
HPLC với đầu dò UV-Vis tại bước sóng 270nm. Quy trình định lượng đạt tính
tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, độ lặp lại, độ đúng, khảo sát được tính tuyến
tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp.
Kiến Nghị:
1. Mở rộng nghiên cứu chuyên sâu hơn về tổng hợp bortezomib nhằm đạt
hiệu suất cao hơn góp phần giảm chi phí điều trị hơn nữa cho bệnh nhân
2. Mở rộng đối tượng nghiên cứu, có thể xác định hàm lượng của các
dược phẩm khác bằng phương pháp HPLC

36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bross, P. F.; Kane, R.; Farrell, A. T.; Abraham, S.; Benson, K.; Brower, M.
E.; Bradley, S.; Gobburu, J. V.; Goheer, A.; Lee, S.-L.; Leighton, J.; Liang, C.
Y.; Lostritto, R. T.; McGuinn, W. D.; Morse, D. E.; Rahman, A.; Rosario, L. A.;
Verbois, S. L.; Williams, G.; Wang, Y.-C.; Pazdur, R. Clin. Cancer Res. 2004,
10, 3954-3964.
2. Bonvini, P.; Zorzi, E.; Basso, G.; Rosolen, A. Leukemia 2007, 21, 838-842.
3. Kisselev, A. F.; Goldberg, A. L. Chem. Biol. 2001, 8, 739-758.
4. Adams, J. Proteasome Inhibitors in Cancer Therapy, Humana: Totowa, NJ,
2004, 17-38.
5. Yannaki, E.; Papadopoulou, A.; Athanasiou, E.; Kaloyannidis, P.; Paraskeva,
A.; Bougiouklis, D.; Palladas, P.; Yiangou, M.; Anagnostopoulos, A. Arthritis
Rheum. 2010, 62, 3277-33288.
6. Gerber, F; Krummen, M; Potgeter, H; Roth, A; Siffrin, C; Spoendlin, C.
“Practical aspects of fast reversed-phase high-performance liquid
chromatography using 3μm particle packed columns and monolithic columns in
pharmaceutical development and production working under current good
manufacturing practice”. Journal of Chromatography A 1 036 ( 2):133.
(2004). PMID 15146913. doi:10.1016/j.chroma.2004.02.056
7. Vụ khoa học và đào tạo – Bộ Y tế "Kiểm nghiệm dược phẩm", NXB Y học,
(2005), 68-110.
8. Bùi Xuân Vững "Cơ sở Hóa phân tích Định lượng", Trường Đại học Sư phạm
Đà Nẵng. (2012),

37
9. Bilal Yilmaz Emrah Alkan "Spectrofluorometric and Spectrofluorometric and
UV Spectrofluorometric Methods for the Determination of Flurbiprofen in
Pharmaceutical Preparations", Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(4). (2015),
10. McGeer Patrick L, Schulzer Michael, et al. "Arthritis and antiinflammatory
agents as possible protective factors for Alzheimer's disease A review of 17
epidemiologic studies", Neurology, (1996), 47(2), 425- 432.
11. Vikrant Kokane and Sonali Naik "Formulation and evaluation of topical
flurbiprofen gel using different gelling agents", World Journal of Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences, (2014), 3(9), 654-663.
12. Mei Chenghan, Li Bin, et al. "Liquid chromatography-tandem mass
spectrometry for the quantification of flurbiprofen in human plasma and its
application in a study of bioequivalence", Journal of Chromatography (2015), B,
993, 69-74.
13. Meister Sabrina, Zlatev Iavor, et al. "Nanoparticulate flurbiprofen reduces
amyloid-β 42 generation in an in vitro blood–brain barrier model", Alzheimer's
research & therapy, (2013), 5(6), 51.
14. Murray Kermit K, Boyd Robert K, et al. (2013), "Definitions of terms
relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations)", Pure and Applied
Chemistry, (2013), 85(7), 1515-1609.
15. Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm ,"Thẩm định phương pháp
trong phân tích hoá học và vi sinh vật",NXB Khoa học và Kỹ thuật, (2010),
10-59.
16. Bộ Y tế ,"Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đai học)", Nhà xuất
bản giáo dục Việt Nam, (2012), 135-184.

38
17. Smith Graeme ,"European Medicines Agency guideline on
bioanalytical method validation: what more is there to say?", Bioanalysis,
(2012), 4(8), 865-868.
18. Use The International Council for Harmonisation of Technical Requirements
for Pharmaceuticals for Human ,"Validation of analytical procedures: text and
methodology", Q2(R1), (2005), 6-13.
19. PGS.TS. Trần Tử An "Hóa phân tích, Phân tích dụng cụ", Nhà xuất bản Y
học, tập 2.(2007).
20. Adams, J.; ma, Y.; Stein, R.; Baevsky, M.; Grenier, L.; Plamondon, L.
Patent US 5780454, 1998.
21. Ivanov, A. S.; Zhalina, A. A.; Shishnov, S. V. Teterhedron 2009, 65,
7105- 7108
22. Pickersgill, I. F.; Bishop, J. E.; Koellner, C.; Gomez, J. -M.; Geiser, A.; Hett,
R. Patent US 7714159 B2, 2010.
23. Henschke, J. P.; Xie, A.; Chen, Y. F. Patent US 0289699 A1, 2012.
24. Albert KS, Gillespie WR, et al. "Determination of flurbiprofen in human
serum by reverse‐phase high‐performance liquid chromatography with
fluorescence detection", Journal of pharmaceutical sciences, 73(12), 1823-1825,
(1984).

39
PHỤ LỤC
Phụ Lục 1: Phổ 1
H NMR của chất 2

40
C- NMR của chất 2
Phụ Lục 3: Phổ MS của chất 2
4000 4503500 3000 2500 2000 1500 1000 500
100
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
cm-1
%T
1516.28cm-1
1682.58cm-1
1403.92cm-1
2954.57cm-1
1020.79cm-1
1294.06cm-1
1153.20cm-1
1201.33cm-1
701.81cm-1
3321.23cm-1
754.18cm-1
2870.27
2927.99
3204.24
3385.66
Phụ Lục 4: Phổ FTIR của chất 2

41
H NMR của chất 3
4000 4503500 3000 2500 2000 1750 1500 1250 1000 750 500
100
79
80
82
84
86
88
90
92
94
96
98
cm-1
%T
1170.24cm-1
1648.58cm-1
1367.77cm-1
2929.19cm-1
1693.24cm-1
1499.50cm-1
1250.34cm-1
3323.25cm-1
1282.76cm-1
1453.95cm-1
699.28cm-1
1030.15cm-1
1078.10cm-1
2870.98
2955.49
3030.62
1124.19
1054.80
746.17
1531.01

42
H của hợp chất 4
4000 4503500 3000 2500 2000 1750 1500 1250 1000 750 500
100
79
80
82
84
86
88
90
92
94
96
98
cm-1
%T
1651.80cm-1
1520.03cm-1
2927.86cm-1
1374.68cm-1
3333.78cm-1
1020.35cm-1
1238.56cm-1
1280.79cm-1
1122.84cm-1
1466.75cm-1
700.10cm-1
1077.74cm-1
744.45cm-11727.39cm-1 923.28cm-1
3785.70cm-1
1738.37
1579.08
1453.67
2953.56
2870.18

43
4000 4503500 3000 2500 2000 1500 1000 500
100
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
cm-1
%T
1516.28cm-1
1682.58cm-1
1403.92cm-1
2954.57cm-1
1020.79cm-1
1294.06cm-1
1153.20cm-1
1201.33cm-1
701.81cm-1
3321.23cm-1
754.18cm-1
2870.27
2927.99
3204.24
3385.66
Phụ Lục 9: Phổ FTIR của hợp chất 5
Phụ Lục 10: Phổ 1H-NMR của hợp chất 5

44
Phụ Lục 11: Phổ 13C của hợp chất 5
A1 #4371 RT: 19.50 AV: 1 NL: 7.00E5
T: FTMS + p ESI Full ms [50.0000-750.0000]
384.5 384.6 384.7 384.8 384.9 385.0 385.1 385.2 385.3 385.4 385.5 385.6 385.7 385.8 385.9
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
RelativeAbundance
385.2928
Phụ Lục 12: Phổ MS của hợp chất 5

45
Phụ Lục 13: Phổ HPLC của mẫu chuẩn Bortezomib
Phụ Lục 14: Phổ HPLC của mẫu Bortezomib tổng hợp

Hoạt chất Bortezomib làm nguyên liệu điều trị đa u tuỷ xương, HAY

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (18)

Similar to Hoạt chất Bortezomib làm nguyên liệu điều trị đa u tuỷ xương, HAY

Similar to Hoạt chất Bortezomib làm nguyên liệu điều trị đa u tuỷ xương, HAY (20)

More from Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864

More from Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Hoạt chất Bortezomib làm nguyên liệu điều trị đa u tuỷ xương, HAY