Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn bacillus sp. trong thức ăn chăn nuôi thủy sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TRÙN QUẾ
VÀ ỨNG DỤNG VÀO CHẾ PHẨM LÊN MEN
TỪ VI KHUẨN BACILLUS SP. TRONG
THỨC ĂN CHĂN NUÔI THỦY SẢN
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : CN. ĐỖ THỊ TUYẾN
Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ NHỚ
MSSV: 1151110243 Lớp: 11DSH03
TP. Hồ Chí Minh, 2015

Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những nội dung trong bài đồ án là do tôi thực hiện dưới sự
hướng dẫn trực tiếp của cô CN. Đỗ Thị Tuyến. Tôi cam đoan các kết quả nghiên cứu
đưa ra trong luận án này dựa trên các kết quả thu được trong quá trình thực hiện đề
tài, hoàn toàn trung thực không sao chép bất kì kết quả nghiên cứu nào của tác giả
khác. Nội dung trong đồ án có tham khảo và sử dụng một số thông tin, tài liệu từ các
nguồn sách hay công trình nghiên cứu khác đều được đều được trích dẫn rõ ràng và
liệt kê trong danh mục tài liệu tham khảo. Nếu có vi phạm quy chế hay gian trá tôi
xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Sinh viên thực hiện
Trần Thị Nhớ

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với Ban
Giám Hiệu cùng các thầy cô của trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí
Minh, đặc biệt là các thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường
đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm tôi học tập tại trường cũng như đã
tạo điều kiện cho tôi thực tập để tích lũy kinh nghiệm cho công việc sau này.
Để hoàn thành tốt khóa luận này tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Cô
CN. Đỗ Thị Tuyến đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cũng như quan tâm, động viên và
tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Sinh Học Nhiệt
Đới đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài.
Bên cạnh sự cố gắng hết mình của bản thân, tôi cũng thầm biết ơn sự ủng hộ,
quan tâm và động viên của gia đình, bạn bè – những người thân yêu luôn là chỗ dựa
vững chắc cho tôi trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng tôi xin kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong
sự nghiệp cao quý. Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trong Viện Sinh Học Nhiệt
Đới luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
TP. HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015
Sinh viên thực hiện
Trần Thị Nhớ

i
MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt............................................................................................v
Danh mục các hình......................................................................................................vi
Danh mục các bảng ....................................................................................................vii
Danh mục các sơ đồ ................................................................................................. viii
Danh mục các đồ thị................................................................................................. viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ...................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề..............................................................................................................1
1.2. Mục đích................................................................................................................2
1.3. Yêu cầu..................................................................................................................2
1.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................2
1.5. Kết cấu của đồ án ..................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................3
2.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus sp.........................................................................3
2.1.1. Phân loại .............................................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm chung của chi Bacillus.......................................................................4
2.1.3. Khả năng tạo bào tử ...........................................................................................4
2.1.4. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus sp. trong nuôi trồng thủy sản ........................6
2.1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus sp.............7
2.2. Enzyme protease....................................................................................................8
2.2.1. Giới thiệu chung về protease..............................................................................8
2.2.2. Phân loại protease.............................................................................................10
2.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật...................................................12
2.2.4. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease .............13
2.2.5. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease.........15
2.2.6. Ứng dụng protease vi sinh vật..........................................................................16
2.3. Trùn quế...............................................................................................................17
2.3.1. Phân loại và đặc điểm của trùn quế .................................................................17
2.3.2. Đặc tính sinh học của trùn quế.........................................................................18

ii
2.3.3. Đặc tính sinh lý của trùn quế ...........................................................................19
2.3.4. Sự sinh sản và phát triển ..................................................................................20
2.3.5. Tác dụng của trùn quế......................................................................................20
2.3.6. Bổ sung Trùn quế và BIO – T trong chăn nuôi ...............................................22
2.4. Chế phẩm probiotics............................................................................................24
2.4.1. Định nghĩa về Probiotics..................................................................................24
2.4.2.Vai trò của probiotics trong chăn nuôi thủy sản...............................................24
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.........................................................26
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.......................................................................26
3.2. Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu...........................................................26
3.2.1. Vật liệu .............................................................................................................26
3.2.2. Hóa chất............................................................................................................27
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu........................................................................28
3.3. Môi trường phân lập, định danh và giữ giống ....................................................28
3.4. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................29
3.4.1. Sơ đồ tổng quan thí nghiệm .............................................................................29
3.4.2. Phương pháp phân lập Bacillus sp...................................................................30
3.4.2.1. Hoạt hóa giống Bacillus sp. ..........................................................................30
3.4.2.2. Phân lập các chủng Bacillus sp.....................................................................30
3.4.2.3. Cấy giữ gống Bacillus sp.. ............................................................................30
3.4.2.4. Tăng sinh chủng Bacillus sp. ........................................................................30
3.4.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc .........................31
3.4.3. Phương pháp định danh bằng đặc điểm sinh lý, sinh hóa ...............................31
3.4.3.1. Phương pháp nhuộm Gram...........................................................................31
3.4.3.2. Test khả năng di động ...................................................................................33
3.4.3.3. Test catalase ..................................................................................................33
3.4.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh Indol ..................................................................34
3.4.3.5. Thử nghiệm Methyl Red (MR).....................................................................35
3.4.3.6. Thử nghiệm khả năng sử dụng đường ..........................................................36

iii
3.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học........................................................36
3.4.4.1. Khả năng kháng khuẩn..................................................................................36
3.4.4.2. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme protease ..............................37
3.4.4.3. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease .....37
3.4.4.4. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme protease .....................................38
3.4.5.Phương pháp xác định thành phần sinh hóa cơ bản cho trùn quế....................38
3.4.5.1. Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu..........................................................38
3.4.5.2. Phương pháp định lượng khoáng tổng số bằng quang phổ kế .....................39
3.4.5.3. Phương pháp xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (định lượng
Nitơ tổng số)...............................................................................................................40
3.4.5.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Anson
cải tiến.........................................................................................................................41
3.4.5.5. Phương pháp Lowry xác định hàm lượng acid amin ...................................44
3.4.6. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm protease....................45
3.4.6.1. Xác định nhiệt độ tối ưu................................................................................45
3.4.6.2. Xác định pH tối ưu........................................................................................45
3.4.7. Khảo sát và chọn lọc điều kiện thủy phân protein trùn quế ............................46
3.4.7.1. Khảo sát nồng độ cơ chất..............................................................................46
3.4.7.2. Khảo sát nồng độ enzyme .............................................................................47
3.4.7.3. Khảo sát thời gian thủy phân ........................................................................47
3.4.8. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm. .............................................................48
3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu..................................................49
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................50
4.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp.......................50
4.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp. từ các chế phẩm Probiotic...................50
4.1.2. Nhuộm Gram....................................................................................................52
4.1.3. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa.........................................................................52
4.1.3.1. Khả năng di động ..........................................................................................52
4.1.3.2. Khả năng sinh catalase..................................................................................53

iv
4.1.3.3. Khả năng sinh indol ......................................................................................54
4.1.3.4. Thử nghiệm methyl red.................................................................................54
4.1.3.5. Khả năng lên men các loại đường.................................................................55
4.2. Đánh giá các hoạt tính sinh học ..........................................................................58
4.2.1. Đánh giá khả năng kháng khuẩn......................................................................59
4.2.2. Định tính khả năng sinh enzyme protease .......................................................59
4.3. Xác định thành phần sinh hóa cơ bản của trùn quế............................................60
4.4. Kết quả xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme thu được từ chế
phẩm............................................................................................................................61
4.4.1. Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của protease.........................61
4.4.2. Kết quả xác định pH tối ưu cho hoạt động của protease.................................62
4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân........63
4.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme bổ sung vào quá trình thủy
phân.............................................................................................................................65
4.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân ...................67
4.8. Thủy phân trùn quế với các điều kiện tối ưu đã chọn ........................................70
4.9. Quy hoạch thực nghiệm ......................................................................................71
4.10. Đánh giá hiệu quả sản phẩm .............................................................................77
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...............................................................78
5.1. Kết luận................................................................................................................78
5.2. Kiến nghị .............................................................................................................79
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................80

v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
OD Optical density
UI Unit International
MR Methyl red
CFU Colonies Form Unit
TCA Trichloroacetic acid
EDTA Etilendiamin tetraaxetic axit
NL Nguyên liệu
CPE Chế phẩm enzyme

vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 2.1. Bacillus sp....................................................................................................3
Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử.....................................................................................5
Hình 2.3. Cấu trúc 3D của protease.............................................................................8
Hình 2.4. Trùn quế.....................................................................................................18
Hình 2.5. Trùn quế trong chăn nuôi ..........................................................................22
Hình 3.1. Mẫu chế phẩm probiotic dùng để phân lập...............................................26
Hình 3.2. Chủng Escherichiacoli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus – Viện
Sinh Học Nhiệt Đới TP. HCM...................................................................................27
Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc phân lập từ các mẫu..................................................50
Hình 4.2. Hình ảnh nhuộm Gram của các chủng 1, 5 và 6.......................................52
Hình 4.3. Kết quả thử khả năng di động của chủng 1, 5 và 6...................................53
Hình 4.4. Kết quả thử khả năng tạo catalase của 3 chủng 1, 5 và 6 .........................53
Hình 4.5. Kết quả thử nghiệm khả năng sinh indol của 3 chủng 1, 5 và 6...............54
Hình 4.6. kết quả thử nghiệm methyl red của 3 chủng 1, 5 và 6..............................54
Hình 4.7. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 1.....................55

vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease............................13
Bảng 2.2. Hàm lượng dinh dưỡng của bột trùn và bột cá .........................................22
Bảng 3.1. Thí nghiệm dựng đường chuẩn Tyrosin ...................................................42
Bảng 3.2. Xác định hàm lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu.....................42
Bảng 3.3. Lập đường chuẩn Albumin .......................................................................44
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (% w/v).................................................46
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (%) .......................................................47
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân..........................................................48
Bảng 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp. từ các chế phẩm.........................51
Bảng 4.2. Kết quả thử nghiệm các đặc tính sinh lý, sinh hóa của 3 chủng đã khảo sát
.....................................................................................................................................58
Bảng 4.3. Kết quả vòng tan xác định khả năng kháng khuẩn của 3 chủng ..............59
Bảng 4.4. Kết quả xác định vòng phân giải casein của enzyme protease thu nhận từ
3 chủng sau 48 giờ......................................................................................................59
Bảng 4.5. Thành phần sinh hóa trong thịt trùn quế dùng để thủy phân....................60
Bảng 4.6. Điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân thịt trùn quế bằng enzyme thương
phẩm và enzyme chế phẩm ........................................................................................70
Bảng 4.7. Kết quả so sánh các chỉ tiêu giữa hai sản phẩm thịt trùn sau thủy phân......
.....................................................................................................................................70
Bảng 4.8. Mã hóa các biến số thực nghiệm theo các yếu tố ảnh hưởng...................71
Bảng 4.9. Ma trận kế hoạch hóa đối với 4 yếu tố......................................................71
Bảng 4.10. Kết quả hàm lượng acid amin theo thực nghiệm và theo phương trình hồi
quy ..............................................................................................................................72
Bảng 4.11. Kết quả bj và bij............................................................................................................................... 73
Bảng 4.12. Xử lý số liệu tại tâm................................................................................73
Bảng 4.13. Bảng kiểm định Student..........................................................................74
Bảng 4.14. Kết quả so sánh một số chỉ tiêu giữa các tỷ lệ trộn ................................77

viii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân loại protease...........................................................................10
Sơ đồ 3.1. Quá trình tiến hành thí nghiệm.................................................................29
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme chế phẩm.......................61
Đồ thị 4.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme chế phẩm...............................63
Đồ thị 4.3. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng
độ cơ chất khác nhau..................................................................................................64
Đồ thị 4.4. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng
độ enzyme khác nhau .................................................................................................66
Đồ thị 4.5. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qua trình thủy phân với các
mức thời gian khác nhau ............................................................................................68

1
Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm
enzyme sản xuất ngày càng nhiều và được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực của đời
sống con người như: Công nghệp da, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, chăn
nuôi, y tế,...và là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình thúc đẩy sự phát
triển của ngành chế biến thức ăn thủy sản. Trong những năm gần đây thủy sản đã trở
thành nền kinh tế mũi nhọn ở nước ta, sản lượng thủy sản ngoài đáp ứng nhu cầu tiêu
thụ trong nước mà còn xuất khẩu ra thị trường các nước Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản,
Hàn Quốc...Để tăng năng suất và lợi nhuận người nuôi đã tăng mật độ giống, sử dụng
thuốc hóa học để phòng và trị bệnh đã làm xáo trộn hệ sinh học tự nhiên, ô nhiễm
môi trường và thêm vào đó là ảnh hưởng đến chất lượng thủy sản. Với mục đích bảo
vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ môi trường sống không
bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại
thuốc, mà thay vào đó là các sản phẩm sinh học giúp tăng cường sức đề kháng bệnh,
tăng khả năng hấp thụ dưỡng chất, hay làm sạch môi trường nước bằng cách bổ sung
thêm những vi sinh vật có lợi. Chế phẩm sinh học hay còn gọi là “probiotic” bao gồm
các vi sinh vật sống có lợi, có tính đối kháng cao khi được đưa vào đường ruột sẽ tạo
sự cân bằng có lợi của hệ sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật có hại. Ngoài ra,
những chế phẩm sinh học còn cải thiện tốt quá trình tiêu hoá (nhờ những hệ enzyme
vi sinh vật, hoặc những sản phẩm chuyển hóa trong quá trình lên men của chúng),
giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh.
Thêm vào đó, việc ứng dụng trùn quế vào thức ăn làm tăng hàm lượng đạm hữu
cơ trong thức ăn chăn nuôi cũng là một trong những hướng nghiên cứu chính nhận
được nhiều sự quan tâm của cả các nhà khoa học và người chăn nuôi. Với hàm lượng
protein thô cao, hàm lượng đạm của trùn tương đương với bột cá, là thức ăn lý tưởng
để nuôi thủy sản. Trùn còn chứa nhiều loại acid amin,vitamin, chất khoáng cần thiết
cho gia súc, gia cầm và thủy sản. Đặc biệt, thịt trùn còn có các loại kích thích tố sinh
trưởng tự nhiên mà trong bột cá không có. Thức ăn chăn nuôi có bột trùn sẽ không

2
có mùi tanh và khét của cá và dầu cá, hấp dẫn với vật nuôi, lại bảo quản được lâu hơn
thức ăn có dùng bột cá. Tuy nhiên protein có trong thịt trùn tươi thường khó tiêu hóa
nên thủy phân bằng protease mang lại nhiều ưu điểm như: Không độc hại, cắt đứt các
liên kết peptid tạo các amino acid đơn giản giúp quá trình tiêu hóa, hấp thụ tốt hơn.
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và
ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp. trong thức ăn chăn
nuôi thủy sản”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Chọn lọc được chủng Bacillus sp. có khả năng sinh enzyme protease cao.
Xác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân trùn quế bằng
enzyme protease để ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập chủng Bacillus sp. từ các chế phẩm thức ăn chăn nuôi thủy sản.
Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein trùn quế bằng
enzyme protease: nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme và thời gian thủy phân.
So sánh khả năng thủy phân của enzyme protease thương phẩm và enzyme
protease từ chế phẩm lên men vi khuẩn Bacillus sp.
Tối ưu hóa thực nghiệm quá trình thủy phân trùn quế.
1.4. Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng các phương pháp như: phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, phương
pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2013 và phần mềm statgraphics.
1.5. Kết cấu của đồ án
Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:
Chương 1: Mở đầu.
Chương 2: Tổng quan tài liệu.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.
Chương 4: Kết quả và thảo luận.
Chương 5: Kết luận và kiến nghị.

3
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus sp.
2.1.1. Phân loại
Bacillus có khả năng chịu đựng và tồn tại trong thời gian dài ở điều kiện bất lợi,
nên đa số chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn.
Theo khóa phân loại của Bergey, chi Bacillus được phân loại như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Fimicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Chi Bacillus là một chi lớn, đa dạng và thuộc họ Bacillaceae. Với một số loài
thường gặp trong tự nhiên như: Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus
mensentericus, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, bacillus Brevis,
Bacillus simplex,...
Hình 2.1. Bacillus sp.
(http://nuoitomsu.blogspot.com/2013/03/vai-tro-cua-vi-khuan-bacillus-
sp-trong.html)

4
2.1.2. Đặc điểm chung của chi Bacillus (Nguyễn Thị Yến Thu, 2011)
Vi khuẩn Bacillus là một chi gồm các vi khuẩn hình que hay trực khuẩn, Gram
(+), đường kính khoảng 0,2 – 2 µm, dài 2 – 8 µm, thường ở dạng đơn hoặc chuỗi dài,
chiều dài của chúng phụ thuộc vào điều kiện môi trường trong suốt quá trình phát
triển. Phần lớn các chủng vi khuẩn Bacillus có nhiệt độ sinh trưởng ở mức trung bình,
với nhiệt độ tối ưu vào khoảng 35 – 45oC, cũng có một số chủng có nhiệt độ tối ưu
khá cao khoảng 65oC.
Là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có khả năng sinh catalase, bất động
hay di động nhờ tiêm mao, có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ, muối rộng, tồn tại được ở
điều kiện bất lợi trong thời gian dài như một số loài ưa lạnh có thể sinh trưởng và
hình thành nội bào tử ở 0oC, pH sinh trưởng rất khác nhau từ 2 – 11 nên đa số chúng
rất phổ biến trong tự nhiên và có thể phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như: đất,
nước, thức ăn,…
Hầu hết là vi khuẩn hoại sinh, có mặt khắp nơi trong tự nhiên, phần lớn chúng
cư trú trong đất. Vi khuẩn Bacillus có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ đơn giản
như đường, amino acid, các acid hữu cơ và có thể chuyển hóa các nguồn carbon như
methanol, cellulose hay lên men các hỗn hợp carbonhydrat tạo glycerol và butanediol.
Các chủng Bacillus được nghiên cứu nhiều do có khả năng tổng hợp được nhiều
loại enzyme ngoại bào như: protease, amylase, cellulose, phytase,... tùy thuộc vào
nguồn cơ chất khác nhau sẽ sinh enzyme khác nhau như nguồn cơ chất là cellulose
thì sẽ sinh tổng hợp enzyme cellulase,...Nhiều trong số các enzyme ngoại bào này là
enzyme thủy phân của các phân tử hữu cơ lớn, chính vì thế vi khuẩn này có nhiều
ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như công nghệ sản xuất chất tẩy rửa, công
nghiệp thực phẩm, bánh kẹo, đồ uống, công nghệ dược phẩm, công nghệ thuộc da,
công nghệ dệt và trong xử lý chất thải.
2.1.3. Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus là khả năng tạo bào tử trong
những điều kiện nhất định. Bào tử không hình thành trong suốt quá trình hoạt động
tăng trưởng và phân chia tế bào, thường khi gặp điều kiện bất lợi về môi trường, thiếu

5
dinh dưỡng,…thì nội bào tử mới được hình thành. Bào tử có hình oval và có khuynh
hướng phình ra ở một đầu, do đặc điểm cấu tạo và đặc tính sinh lý nên bào tử được
cho là dạng tồn tại bền vững nhất được tìm thấy trong tự nhiên của tế bào, tồn tại lâu
dài trong điều kiện khắc nghiệt.
Quá trình hình thành bào tử gồm các bước:
 Hình thành vách ngăn.
 Sự tạo tiền bào tử.
 Tạo lớp vỏ bào tử.
 Sự tổng hợp các lớp vỏ bào tử.
 Sự giải phóng bào tử.
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân
tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc và tạo thành
tiền bào tử (prospore). Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp màng. Tiền bào tử
phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng phân giải
và bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử
hút nước và bị trương ra. Sau đó vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát
Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử
www.biol.lu.se/cellorgbiol/membprot/pop sv.html

6
triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào sinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai
Phương, 2004).
2.1.4. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus sp. trong nuôi trồng thủy sản
Sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus trong môi trường với một số lượng lớn sẽ
xảy ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và
nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất
dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh
trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Thuận, 1976).
Triển vọng ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. trong nhiều lĩnh vực đời sống, đặc
biệt là trong nuôi trồng thủy sản là rất to lớn. Một số loài thuộc nhóm vi khuẩn
Bacillus như: B. subtilis, B. aterrimus. B. niger, B. pumilis, B. panis, B. vulgarus, B.
nigrificans, B. natto, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. megaterium, B.
mesentericus…đã được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản với vai trò:
 Cải thiện sức khỏe, cung cấp nguồn dinh dưỡng trực tiếp và hỗ trợ tiêu hóa.
 Tăng cường các phản ứng miễn dịch và cải thiện môi trường nước như phân
hủy các chất thải hữu cơ, giảm chất độc NH3 và H2S, giảm chất dư thừa tích tụ ở đáy
ao, giảm phát sinh khí độc và mùi hôi.
 Ức chế các tác nhân gây bệnh bằng cách tiết ra các chất kháng sinh, cạnh tranh
dinh dưỡng và môi trường sống.
 Khả năng sinh các enzyme phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát
triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh (như vi khuẩn Vibrio) giữ cho môi trường luôn
ở trạng thái cân bằng là đặc tính nổi trội của nhóm vi khuẩn này.
Trong quá trình hình thành bào tử, Bacillus thường sản sinh ra các hoạt chất có
hoạt tính sinh học và ứng dụng được trong nhiều lĩnh vực. Verschuere (2000) đã
nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp. đóng vai trò quan trọng trong việc cải
thiện chất lượng nước do vi khuẩn này đạt hiệu quả cao trong quá trình chuyển đổi
vật chất hữu cơ thành CO2. Do vậy, Bacillus sp. làm giảm tích lũy chất hữu cơ và các
chất hòa tan (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007). Một số loài của nhóm vi
khuẩn Bacillus sp. (B. Subtilis, B. Licheniformis, B. Megaterium,…) dùng để làm

7
sạch môi trường nhờ khả năng sinh các enzyme (protease, amylase, cellulase,
kitinase) phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi
sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng giữ cho môi trường luôn ở trạng
thái cân bằng sinh học (Tăng Thị Chính, Đinh Thị Kim, 2006). Bacillus còn có khả
năng tổng hợp các chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật phát triển quá
mức như Vibrio, Aeromnas,…(Nguyễn Thị Ngọc Huyền, 2012).
2.1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus sp.
Vijayabaska et al. (2008) ứng dụng thành công các vi sinh vật có lợi mà cụ thể
là nhóm vi khuẩn Bacillus sp. trong nuôi cá rô phi nhằm hạn chế mầm bệnh do vi
khuẩn A. Hyrophila gây ra. Sugama, Tsumura (1998) đã sử dụng chủng Bacillus BY
– 9 bổ sung vào bể (18 m3) nuôi ấu trùng tôm sú với mật độ 106 CFU/ml. Kết quả cho
thấy chủng vi khuẩn này có khả năng ức chế được vi khuẩn Vibrio harveji và tỉ lệ
sống của tôm ở giai đoạn OL  10 ở bể bổ sung vi khuẩn đạt cao hơn (46,1%) so với
đối chứng (10,6%). Nghiên cứu của Phạm Thị Tuyết Ngân (2011) về quần thể vi
khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú cho thấy chất lượng nước ao
nuôi được cải thiện, đồng thời mật độ Vibrio ở các nghiệm thức bổ sung Bacillus thấp
hơn so với đối chứng. Graslund et al., cho thấy 86% người nuôi tôm ở Thái Lan đã
sử dụng chế phẩm vi sinh hoặc dẫn xuất men vi sinh để cải thiện chất lượng nước và
bùn đáy ao nuôi (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Huyền, 2012).
Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus lên chất lượng nước và mùn bã hữu
cơ trong bể nuôi tôm sú đã được nghiên cứu. Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức bổ sung
3 loài vi khuẩn Bacillus bao gồm Bacillus B8, B37 và B38 với mật độ 105 CFU/ml
và 1 đối chứng (không bổ sung vi khuẩn). Kết quả cho ta thấy tỉ lệ sống ở nghiệm
thức B37 cao nhất (93,33 ± 1,65%), còn đối chứng thấp nhất (69,52 ± 1,65%) (p <
0,05). Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối về chiều dài và trọng lượng của tôm cao nhất ở
B37 lần lượt là 1,659 ± 0,034 mm/ngày và 0,45 ± 0,02 g/ngày, trong khi đó ở nghiệm
thức đối chứng là thấp nhất với các chỉ số tương ứng là 0,677 ± 0,017 mm/ngày và
0,14 ± 0,01 g/ngày. Như vậy hiệu quả xử lí môi trường của các chủng vi khuẩn bổ

8
sung được khẳng định, trong đó hiệu quả xử lý tốt nhất ở nghiệm thức dòng B37
(Phạm Thị Tuyết Ngân, Trương Quốc Phú, 2010).
Theo tài liệu của Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), ứng dụng của Bacillus:
 Trong chăn nuôi: viện bào chế Pharimex và viện Pasteur Nha Trang đã sản
xuất chế phẩm Biousubtyl để trị bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con. Từ năm 1983
đến nay Viện Vaccin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất thuốc Biosubtyl dạng bột khô rất
thuận tiện cho người sử dụng. Ngoài ra, Bacillus subtilis còn được phối trộn với một
số chủng nấm mốc, nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM,
Probiotic.
 Trồng trọt: Bacillus subtilis được ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như
nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae...Ngoài ra còn ứng dụng
nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch. Nghiên cứu sản xuất thử chế
phẩm Bactophyl (Bacillus subtilis) do trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá
chất, Bộ Nông Nghiệp tại TP. HCM trừ các loại nấm bệnh trên rau cải. Hồ Thị Mỹ
Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội đã sản xuất chế
phẩm Subtin (Bacillus subtilis) phòng trừ nấm bệnh Ostrinia furnacalis trên bắp.
2.2. Enzyme protease
2.2.1. Giới thiệu chung về protease (Trần Thị Nhã Uyên, 2010)
Hình 2.3. Cấu trúc 3D của protease
(http://www.hoahocngaynay.com/vi/nghien-cuu-giang-day/bai-nghien-
cuu/1241-ung-dung-enzyme-trong-nganh-cong-nghiep-.html)

9
Protease là những esterase thủy phân protein, chúng xúc tác cho quá trình thủy
phân liên kết peptide CONH của phân tử protein và cắt liên kết peptide giữa các
L  acid amin thành các acid amin tự do, một ít peptide ngắn, pepton.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh
vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày
bê...). Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ưu điểm nhất như
vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc đã được gia tăng sử dụng như là một nguồn cung cấp
protease đã cải thiện được đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều
hơn. Đặc biệt vi khuẩn là nguồn sản xuất protease tương đối lí tưởng vì những ưu
điểm như: có hoạt tính mạnh như chỉ với một lượng nhỏ có thể chuyển hóa một lượng
cơ chất lớn, có cường độ sinh sản rất mạnh và tổng hợp enzyme với tốc độ rất nhanh
chóng, trong thời gian ngắn có thể thu được một lượng lớn enzyme. Hệ protease vi
sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu
trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng
nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
Một số protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công nghiệp và sử dụng
rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, y học. Các
loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus cereus,
Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số loài nấm mốc: Aspergillus
oryzae, Aspergillus niger…(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Cơ chất của tất cả các loại protease là các phân tử protein gồm nhiều các amino
acid nối với nhau bằng liên kết peptide tạo nên một hay nhiều chuỗi polypeptide có
cấu trúc rất phức tạp và chúng phân giải các liên kết peptide tạo các acid amin đơn
giản, dễ hấp thu. Các nguồn giàu protein như: thịt động vật, cá, trứng, đậu tương…

10
2.2.2. Phân loại protease (Trần Thị Nhã Uyên, 2010)
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4).
 Dựa vào tính đặc hiệu với cơ chất có thể chia protease thành hai nhóm:
 Endopeptidase: protease thủy phân peptide ở giữa mạch.
 Exopeptidase: protease phân cắt các liên kết peptide ở đầu mạch.
 Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia
thành hai loại:
 Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide.
 Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
 Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:
Carboxypeptidase
Aminopeptidase
Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)
Peptidase (Protease)
(E.C.3.4)
Serine proteinase
Metallo proteinase
Aspartic proteinase
Cystein proteinase
Endopeptidase
(E.C. 3.4.21-99)
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân loại protease

11
 Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc Serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc
tác của enzyme. Các Serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm
tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
 Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cysteine proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin,
bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cysteine
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất
rộng.
 Aspartic proteinase: hầu hết các Aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,
renin. Các Aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
 Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các Metallo proteinase
thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của
EDTA.
 Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
 Protease acid: pH = 2 – 4 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp
bánh kẹo.
 Protease trung tính: pH = 7 – 8 chúng thường được sản xuất từ các loài vi
khuẩn như Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus.
 Protease kiềm: pH = 9 – 11, trong trung tâm hoạt động của các enzyme
protease này có serin.
Nhưng tác dụng tối ưu của protease còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất. Vì
cùng một protease của cùng một chủng vi khuẩn khi thủy phân casein, hemoglobin
hay gelatin sẽ thể hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau.

12
 Dựa vào nguồn thu nhận enzyme:
 Protease động vật: có trong tụy tạng (đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài
nhất và có chứa nhiều enzyme nhất) và dạ dày bê.
 Protease thực vật: có 3 loại protease thực vật như Bromelain (thu từ quả, chồi
và vỏ dứa), Papain (có trong nhựa của lá, thân, quả đu đủ) và Ficin (thu được
từ nhựa cây cọ).
 Protease vi sinh vật: phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm
nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces
và một số và một số loại nấm men.
2.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật
Protease có thể ở 2 dạng chính là protease nội bào (hiện diện trong tế bào) và
protease ngoại bào (được tiết vào môi trường nuôi cấy) và có những vai trò khác nhau
đối với hoạt động sống của vi sinh vật. Protease ngoại bào thường phân giải protein
và các cơ chất cao phân tử khác có trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp
để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ. Cho đến nay, các loại protease ngoại bào được nghiên
cứu kĩ hơn nhiều so với protease nội bào.
Vi sinh vật tiết ra enzyme ngoại bào phân giải protein và chuyển hóa thành các
phân tử có khối lượng phân tử nhỏ (các polypeptide, oligopeptide). Các chất này tiếp
tục phân hủy thành các acid amin nhờ Peptidase ngoại bào hoặc xâm nhập ngay vào
tế bào rồi mới chuyển hóa thành acid amin. Một phần các acid amin này được vi sinh
vật sử dụng để tổng hợp nên protein của chúng, phần khác được phân giải tạo thành
NH3 và các sản phẩm khác.
Quá trình này được gọi là sự khoáng hóa hay amon hóa. Đó là quá trình chuyển
hóa các hợp chất hữu cơ thành dạng vô cơ (NH3) (trích Nguyễn Thị Ngọc Huyền,
2012).
Acid amin
Polypeptid
Protease
Protein
Peptidase
NH3

13
Protease nội bào thì cho đến nay còn đang được nghiên cứu và cũng chưa biết
rõ vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroishi (1976), các protease nội bào có thể
có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể hoàn thành một số chức
năng như phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào để hình thành các
acid amin và để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S.
Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này có thể có
nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật. Protease nội bào
cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptide đã được tổng hợp
(Waller, 1963 ; Pine, 1969). Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có tác dụng phân
huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến, hoặc cũng có thể tham gia vào quá
trình sinh trưởng của vi sinh vật (trích dẫn bởi Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005).
Bảng 2.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease
Vi khuẩn Xạ khuẩn Nấm mốc
Bacillus subtilis
Bac. cereus
Bac. thermophillus
Bac. circulans
Bac. brevis
Clostridium perfriugens
Cl. histoluticum
Cl. porogens
Streptomyces grisus
Str. rimous
Str. fradiae
Str. feacatis
Str. rectus var proteolyticus
Aspergillus oryzae
Asp. niger
Asp. owamori
Asp. candidus
Asp. favus
Mucor pusilus
Rhizopus niveus
(Nguyễn Đức Lượng, 2002)
2.2.4. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease
Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng
trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần
môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh
vật và tổng hợp enzyme.
Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện
tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất

14
đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng phong toả của
chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản
trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất
tương ứng của enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn,
Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác.
Về phương pháp nuôi cấy hiện nay người ta thường dùng hai phương pháp sau:
 Nuôi cấy bề mặt
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát
triển trên bề mặt môi trường. Sử dụng môi trường nuôi dạng rắn hoặc bán rắn hay
trên bề mặt dạng lỏng.
Môi trường lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường tạo thành váng
khuẩn ngăn cách pha lỏng và pha khí. Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung
dịch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme (Nguyễn
Đức Lượng, 2004).
Ở môi trường bán rắn để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng
môi trường người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường. Vi
sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường
và sinh tổng hợp enzyme nội bào và ngoại bào. Độ ẩm thích hợp của môi trường đặc
là 55  65%.
Ưu điểm của phương pháp bề mặt là dễ thực hiện và khi bị nhiễm vi sinh vật lạ
thường xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ vì vậy ta dễ dàng xử lý. Nhưng nhược điểm
là tốn nhiều diện tích, khó cơ giới hóa và tự động hóa.
 Nuôi cấy bề sâu (nuôi cấy chìm)
Phương pháp này sử dụng môi trường dạng lỏng và được thực hiện trong những
thùng lên men. Trong thiết bị lên men thường lắp đặt hệ thống cánh khuấy, hệ thống
cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh pH và nồng độ các chất dinh dưỡng. Trong đó hệ
thống diều hòa không khí và khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn do chúng làm xáo trộn môi
trường làm tế bào vi sinh vật phân bố đều, tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và tế

15
bào vi sinh vật đồng thời dòng khí được cung cấp và thải ra liên tục giúp cho sự sinh
sản và phát triển, làm tăng khả năng tạo enzyme của vi sinh vật.
Ưu điểm của phương pháp này là ít tốn diện tích và dễ cơ giới hóa nhưng nhược
điểm là dễ bị nhiễm và khó kiểm soát.
2.2.5. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease
(Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009)
Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật
chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : ẩm độ, nhiệt độ, pH, thời gian hoạt
động, thành phần môi trường...
Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh
tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp. Mỗi
loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp và có khác nhau trong khoảng từ 40oC – 60oC,
đa số hoạt độ của protease cao nhất ở 50oC. Tuy nhiên, hầu hết các vi sinh vật sinh
tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ, bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao
hơn nhiệt độ thích hợp và chịu ảnh hưởng của cơ chất, pH môi trường và thời gian
tác dụng…Ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ hoạt động thích hợp thì hoạt động của protease
giảm vì nhiệt độ cao làm biến đổi hay hư hỏng cấu trúc của enzyme. Nhiệt độ mà
protease mất hoàn toàn hoạt độ gọi là nhiệt độ tới hạn. Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 0oC
đa số protease vi khuẩn bị giảm hoạt tính nhưng không bị mất hoạt độ, do đó hoạt
động của protease có thể tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên cũng có một số protease
bị mất hoạt tính trong quá trình đông khô.
Ảnh hưởng của pH môi trường: khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi
trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật, hơn nữa pH môi
trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Ngược lại,
trong phương pháp bề sâu pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự tích luỹ protease
trong môi trường. Vì pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất,
trung tâm hoạt động của protease, phức chất protease – cơ chất và ảnh hưởng đến độ
bền của protease. Đa số protease vi khuẩn đều bền ở pH trung tính từ 6,2 – 7,4, pH
thích hợp cho nhiều protease gần bằng 7.

16
Ảnh hưởng của độ thông khí: có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp
protease và khác nhau tùy theo từng loài vi sinh vật. Trong một số trường hợp thiếu
oxi tuy kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại tăng quá trình tổng hợp
protease, tuy nhiên sự thiếu khí mạnh sẽ kìm hãm sự sinh tổng hợp protease và lượng
oxi thích hợp cho sự tổng hợp protease khác nhau ở các loại vi sinh vật.
Ảnh hưởng của độ ẩm: thông thường các loài vi khuẩn đòi hỏi độ ẩm cao hơn
nấm mốc, độ ẩm thích hợp nhất là khoảng 60 – 70%.
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: thời gian nuôi cấy đối với vi khuẩn để sinh
tổng hợp enzyme cực đại là khoảng 36 – 48 giờ. Tuy nhiên để phân giải protein đạt
hiệu suất cao nhất, đòi hỏi thời gian lâu hơn, để enzyme phân giải đối với cơ chất tự
nhiên.
Ảnh hưởng thành phần môi trường: thành phần môi trường như nguồn carbon,
nitơ, khoáng chất và các yếu tố vi lượng có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của
enzyme. Nếu trong môi trường có chứa các yếu tố gây biến tính protease như acid
hoặc kiềm đặc hay muối kim loại nặng ở nồng độ cao thì protease sẽ bị mất hoạt tính.
2.2.6. Ứng dụng protease vi sinh vật (Trần Thị Nhã Uyên, 2010)
Trong công nghiệp: protease được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực
phẩm khác nhau và một số ngành công nghiệp nhẹ như: ngành chế biến cá, thịt, sữa,
làm bánh mì, thuộc da, dệt, phim ảnh, dùng làm trong bia và nước quả hay trong sản
xuất rượu…
Ngoài ra protease còn được sử dụng bổ sung vào các loại xà phòng, kem đánh
răng, kem bôi mặt…có tác dụng lọai bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn hoặc
làm sạch cao răng chữa viêm lợi. Các loại xà phòng chứa protease có tác dụng tẩy mồ
hôi và các vết bẩn protein như vết máu ở quần áo, drap ở bênh viện…
Trong công nghệ thực phẩm: protease ứng dụng trong công nghệ chế biến sữa
và các sản phẩm từ sữa. Sữa là loại thực phẩm chứa các chất dinh dưỡng đầy đủ và
cân đối nhất. Các sản phẩm từ sữa là rất đa dạng và phổ biến. Từ nguyên liệu sữa,
người ta đã cho ra vô vàn các sản phẩm có cấu trúc, trạng thái và hương vị khác nhau.
Các sản phẩm từ sữa có thể ở dạng rắn như các fomat với kết cấu hình thù và tính

17
cảm vị đặc trưng, dạng hạt đơn điệu như trong các sữa bột, dạng đặc mịn màng như
trong các sữa chua, dạng lỏng như trong các sữa cô đặc với đường. Trong đó, mảng
sản phẩm lên men truyền thống từ sữa vô cùng phong phú như là bơ, fomat, kefir,
yoghurt,…
Trong công nghiệp dược phẩm và y học: protease được sử dụng để sản xuất các
thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein cho những người bị bệnh tiêu hoá kém do
dạ dày, tuỵ tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme, chữa bệnh nghẽn tĩnh
mạch. Protease cũng được dùng làm tiêu mủ ở các vết thương, các ổ viêm, làm thông
đường hô hấp và thuỷ phân sơ bộ protein làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Sản
xuất các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trưng.
Trong chăn nuôi: sử dụng protease để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm
tăng khả năng hấp thu của động vật, dùng sản xuất các dịch thuỷ phân giàu đạm bổ
sung vào thức ăn cho gia cầm và thủy sản.
Trong công nghiệp da: thành phần quan trọng nhất của da là collagen, dưới tác
dụng của protease các chất nhờn được tách ra, một số sợi liên kết collagen bị phá hủy.
Kết quả là da có độ mềm nhất định giúp tách lông thú ra khỏi da dễ dàng mà không
làm ảnh hưởng đến chất lượng của da.
2.3. Trùn quế
2.3.1. Phân loại và đặc điểm của trùn quế
Trùn quế có tên khoa học là Perionyx excavates, có vị trí phân loại:
Ngành: Annelides (ngành giun đốt)
Phân ngành: Clitellata (phân ngành có đai)
Lớp: Olygochaeta (lớp giun ít tơ)
Họ: Megascocidae (họ cự dẫn)
Chi: Pheretima
Loài: Perionyx excavatus (trùn quế)
Trùn quế là động vật không xương sống, cơ thể phân đốt, phần đầu thoái hóa,
có mang đai sinh dục, các hệ bên trong cơ thể như hệ tuần hoàn, hệ thần kinh, hệ bài
tiết…cũng sắp xếp theo đốt. Mỗi đốt mang một đôi hạch thần kinh giúp cho trùn ghi

18
nhận cảm giác và phản ứng đáp trả của cơ thể đối với môi trường ngoài rất nhạy bén.
Chúng thuộc nhóm trùn ăn phân, thường sống trong môi trường có nhiều chất hữu cơ
đang phân hủy, trong tự nhiên ít tồn tại với phần thể lớn và không có khả năng cải
tạo đất trực tiếp như một số loài trùn địa phương sống trong đất.
Trùn quế là một trong những giống trùn đã được thuần hóa, nhập nội và đưa vào
nuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ. Đây là loại trùn mắn đẻ, xuất hiện rải
rác ở vùng nhiệt đới, dễ bắt bằng tay, vì vậy rất dễ thu hoạch.
2.3.2. Đặc tính sinh học của trùn quế
Kích thước trùn quế trưởng thành từ 10 – 15 cm, bề ngang của con trưởng thành
có thể đạt 0,1 – 0,2 cm, thân hơi dẹt, có màu từ đỏ đến màu mận chín (tùy theo tuổi),
màu nhạt dần về phía bụng, hai đầu hơi nhọn. Cơ thể trùn có hình thon dài nối với
nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành tơ (Bùi Minh Tuấn, 2012).
Trùn quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu oxy và thải CO2 trong môi
trường nước, điều này giúp cho chúng có khả năng sống trong nước nhiều tuần, thậm
chí trong nhiều tháng.
Hệ thống bài tiết bao gồm một cặp thận ở mỗi đốt, các cơ quan này bảo đảm
cho việc bài tiết các chất thải chứa đạm dưới dạng amoniac và urea. Trùn quế nuốt
thức ăn bằng môi ở lỗ miệng, lượng thức ăn mỗi ngày được nhiều nhà khoa học ghi
nhận là tương đương với trọng lượng cơ thể của nó. Sau khi qua hệ thống tiêu hóa
với nhiều vi sinh vật cộng sinh, chúng thải qua phân ra bên ngoài và rất giàu dinh
dưỡng, những vi sinh vật cộng sinh có ích trong hệ thống tiêu hóa này theo phân ra
Hình 2.4. Trùn Quế

19
khỏi cơ thể trùn nhưng vẫn còn có thể hoạt động ở “màng dinh dưỡng” trong một thời
gian dài. Đây là một trong những nguyên nhân làm cho phân trùn có hàm lượng dinh
dưỡng cao và có hiệu quả cải tạo đất tốt hơn dạng phân hữu cơ phân hủy bình thường
trong tự nhiên (Nguyễn Thị Xuân Thanh, 2009).
2.3.3. Đặc tính sinh lý của trùn quế (Bùi Minh Tuấn, 2012)
Trùn quế rất nhạy cảm, thường sống trên mặt đất, thích sống nơi môi trường ẩm
ướt, tối, có nhiều chất hữu cơ đang phân hủy và độ pH ổn định. Chúng phản ứng
mạnh với ánh sáng, nhiệt độ và biên độ nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn.Tế
bào da của trùn quế rất mỏng, thường xuyên tiết ra chất nhờn để bảo vệ cơ thể và
thích ứng với điều kiện chui rúc trong môi trường tối và ẩm.
Những điều kiện môi trường ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển
của trùn quế:
 pH: trùn quế chịu được phổ pH khá rộng từ 4  9 thích hợp nhất là 6,8  7,5;
nếu pH quá thấp chúng sẽ bỏ đi.
 Nhiệt độ: nhiệt độ thích hợp nhất với trùn quế nằm trong khoảng từ 20 – 35oC,
ở nhiệt độ khoảng 30oC và độ ẩm thích hợp, chúng sinh trưởng và sinh sản rất
nhanh. Ở nhiệt độ quá thấp, chúng sẽ ngừng hoạt động và có thể chết, hoặc khi
nhiệt độ của luống nuôi lên quá cao cũng bỏ đi hoặc chết. Chúng có thể chết
khi điều kiện khô và nhiều ánh sáng nhưng chúng lại có thể tồn tại trong môi
trường nước có thổi oxy.
 Độ ẩm: nước là thành phần quan trọng chiếm 75 – 90% khối lượng cơ thể trùn
quế, độ ẩm thích hợp nhất cho trùn quế sinh trưởng và sinh sản là 60 – 70%.
 Không khí: trùn quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu oxy và thải
CO2, do đó môi trường sống của chúng đòi hỏi phải thoáng khí, lưu ý loại bỏ
các chất khí có hại cho trùn như: Clo (Cl2), amoniac (NH3), H2S, SO2, SO3,
CH4,…
Trùn quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng, chúng ăn bất kỳ chất thải hữu cơ
nào có thể phân hủy trong tự nhiên như rác đang phân hủy, phân gia súc, gia

20
cầm…Tuy nhiên, những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ hấp dẫn chúng hơn,
giúp cho chúng sinh trưởng và sinh sản tốt hơn.
Trong tự nhiên, trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, gần cống rảnh, hoặc nơi có
nhiều chất hữu có dễ phân hủy và thối rữa như trong phân động vật, rác hoai mục.
Chúng rất ít hiện diện trên các đồng ruộng canh tác dù nơi đây có nhiều rác thải hữu
cơ, có lẽ vì tỷ lệ C/N của những chất thải này thường cao, không hấp dẫn và không
đảm bảo độ ẩm môi trường thường xuyên.
2.3.4. Sự sinh sản và phát triển (Tiêu Thị Ngọc Thảo, 2008)
Trùn quế sinh sản rất nhanh trong điều kiện khí hậu nhiệt đới tương đối ổn định
và có độ ẩm cao như điều kiện của khu vực phía Nam. Theo nhiều tài liệu, từ một cặp
ban đầu trong điều kiện sống thích hợp có thể tạo ra từ 1.000 – 1.500 cá thể trong một
năm. Trùn quế là sinh vật lưỡng tính, chúng có đai và các lỗ sinh dục nằm ở phía đầu
của cơ thể, có thể giao phối chéo với nhau để hình thành kén ở mỗi con, kén được
hình thành ở đai sinh dục, trong mỗi kén mang từ 1 – 20 trứng. Kén có hình dạng
thon dài, hai đầu túm nhọn lại gần giống như hạt bông cỏ, ban đầu có màu trắng đục,
sau chuyển sanh xanh nhạt rồi vàng nhạt, mỗi kén có thể nở từ 2 – 10 con.
Khi mới nở, con nhỏ như đầu kim có màu trắng, dài khoảng 2 – 3 mm, sau 5 –
7 ngày cơ thể chúng sẽ chuyển dần sang màu đỏ và bắt đầu xuất hiện một vằn đỏ
thẫm trên lưng. Khoảng từ 15 – 30 ngày sau, chúng trưởng thành và bắt đầu xuất hiện
đai sinh dục, từ lúc này chúng bắt đầu có khả năng bắt cặp và sinh sản. Con trưởng
thành khỏe mạnh có màu mận chín và có sắc ánh kim trên cơ thể.
2.3.5. Tác dụng của trùn quế
Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy: hiếm có loài động vật nào có giá trị hấp
dẫn như trùn quế. Trùn quế được sử dụng trực tiếp hoặc phối trộn làm thức ăn cao
cấp nuôi gia súc, gia cầm, thủy sản; thậm chí làm thực phẩm cho con người; dùng sản
xuất mỹ phẩm, dược phẩm; trùn phân hủy rác hữu cơ, bảo vệ môi trường; phân trùn
thải ra là một trong những loại phân hữu cơ thiên nhiên giàu dinh dưỡng nhất mà con
người từng biết.

21
Ứng dụng trong chăn nuôi: trùn quế là loại thức ăn giàu đạm, chất lượng cao để
tăng hàm lượng dinh dưỡng trong thức ăn cho gia súc, gia cầm và nhất là đối với các
loài thủy sản đồng thời còn có thể giảm chi phí cho thức ăn chăn nuôi.
Với hàm lượng protein cao của trùn quế tương đương với trong bột cá thường
dùng làm thức ăn chăn nuôi, thêm vào đó là thịt trùn quế có chứa các acid amin, lipit,
vitamin, khoáng chất, hay các loại kích thích tố sinh trưởng cao hơn trong bột cá
(A.F.Md. Hasanuzzaman, Sk.Z. Hossian, M. Das, 2010). Bột thức ăn chứa thịt trùn
quế không có mùi tanh hay mùi khét như bột cá nên có thể hấp dẫn được vật nuôi tốt
hơn và dễ bảo quản trong thời gian dài.
Trùn quế nhất là trùn tươi rất tốt làm thức ăn cho gà, lợn, thỏ và như một nguồn
bổ sung dinh dưỡng cho các loài thủy sản. Thêm vào đó trong thịt trùn quế còn chứa
một lượng thấp acid glutamic nên khi dùng làm thức ăn chăn nuôi hàng ngày sẽ giúp
tăng tốc độ sinh trưởng, tăng năng suất trứng, tăng khả năng sinh sản và sức kháng
bệnh của tôm, cá. Trùn quế rất dễ nuôi và sinh sản nhanh nên có thể sản xuất một
lượng lớn trùn trong thời gian ngắn giúp giảm giá thành thức ăn, có tiềm năng thay
thế cho nguồn protein động vật bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, đóng vai trò quan
trọng trong nuôi trồng và sản xuất thủy sản hiện nay.
Theo W.T.Mason (Đại học Phlorida – Mỹ): trùn, nhất là trùn tươi, là thức ăn lý
tưởng để nuôi thủy sản, nhất là sản xuất con giống ba ba, rùa, lươn, tôm, cá chình,
đặc biệt là nuôi cá tầm – một loài cá quý để ăn và sản xuất món trứng cá muối đắt
tiền. Nếu cho chúng ăn trùn tươi hằng ngày bằng 10 – 15% trọng lượng cơ thể sẽ tốt
hơn bất cứ loại thức ăn nào khác, tốc độ sinh trưởng sẽ tăng từ 15 – 40%, năng suất
trứng tăng lên 10%. Nếu trộn 2 – 3% bột trùn dùng để nuôi, năng suất sẽ tăng trên
30%, giá thành thức ăn giảm 40 – 60%, đồng thời tăng sức sinh sản và khả năng
kháng bệnh của tôm, cá. Điều này rất có ý nghĩa khi thức ăn chăn nuôi đắt đỏ như
hiện nay.
Hiệp hội nuôi gà của Mỹ cho rằng: trùn là phương án hàng đầu cung cấp protein
chất lượng cao, rẻ nhất, dễ nhất cho vật nuôi, đặc biệt là gà, thì năng suất trứng tăng
17 – 25%, tốc độ sinh trưởng tăng 56 - 100%. Đặc biệt nếu nuôi gà bằng thức ăn có

22
trùn tươi thì hầu như gà không bị bệnh; trong khi nếu nuôi gà không có trùn thì tỷ lệ
mắc bệnh cúm gà 16 – 40%. Trùn quế còn chứa trên 8% axit glutamic, nên khi sử
dụng làm thức ăn chăn nuôi thì vật nuôi khỏe, chóng lớn, đẻ khỏe, ít bệnh tật và sẽ
cho thịt thơm ngon hơn hẳn so với vật nuôi thông thường. Vì vậy ngày càng có nhiều
hãng sản xuất thức ăn công nghiệp quan tâm đưa bột trùn vào thức ăn chăn nuôi để
tạo sự khác biệt so với thức ăn thông thường, nâng cao khả năng cạnh tranh sản phẩm
trên thị trường.
Bảng 2.2. Hàm lượng dinh dưỡng của bột trùn và bột cá
Chỉ tiêu Bột trùn Bột cá
Protein (%) 45,60 – 47,53 37,87 – 61,28
Lipit (%) 7,59 – 8,47 4,18 – 8,88
Tro (%) 23,54 – 24,88 18,68 – 44,36
Độ ẩm (%) 67,84 – 74,08 8,26 – 31,53
(A.F.Md. Hasanuzzaman, Sk.Z. Hossian, M. Das, 2010)
2.3.6. Bổ sung trùn quế và BIO – T trong chăn nuôi
Hình 2.5. Trùn quế trong chăn nuôi
(http://trunque.blogspot.com)

23
Nguyễn Minh Triết (2008) thử nghiệm trùn quế và chế phẩm vi sinh lên sinh
trưởng và phát triển của vịt xiêm. Khảo sát mức độ trùn quế 5%, chế phẩm vi sinh
5‰ và 10‰ vào khẩu phần thức ăn cho vịt xiêm trong giai đoạn từ 1 – 84 ngày. Kết
quả cho thấy trọng lượng bình quân của các nghiệm thức thí nghiệm (1886,9; 1723,1;
1891,9) cao hơn so với nghiệm thức đối chứng (1400,6) và hệ số chuyển hóa thức ăn
của nghiệm thức thí nghiệm (3,7765; 3,8601; 3,4928) cũng thấp hơn hẳn so với
nghiệm thức đối chứng (5,54).
Trong nghiên cứu của Sakthika.T, Ronald. J, Siva Kumar.V, Felicitta. J (2014)
khảo sát sự ảnh hưởng trong bữa ăn của cá cho ăn thức ăn viên (NT1) và cá cho ăn 2
bữa ăn khác nhau từ trùn quế được nuôi bằng cây lục bình nước (NT2), kiểm tra các
thông số tăng trọng của cá sau 60 ngày cho thấy: cá được nuôi ở NT2 cho tỉ lệ tăng
trọng lên 51,87%, tốc độ tăng trưởng tăng 22,22%, giảm 51,43% tỷ lệ chuyển đổi
thực phẩm và tăng hiệu quả protein lên 55,29% so với NT1. Điều này có ý nghĩa về
mặt sinh thái và giá trị kinh tế trong ngành thủy sản.
Theo tác giả C.O. Monebi và A. Ugwumba (2013) khảo sát sự ảnh hưởng của
tỷ lệ thức ăn bột trùn thay cho bột cá đến trọng lượng và tốc độ tăng trưởng của cá
giống từ 0, 5, 25, 50, 75, 100% bột trùn (NT1, NT2, NT3, NT4, NT5). Kết quả cho
thấy trọng lượng cơ thể cá giống tăng 5% mỗi ngày trong vòng 9 tuần và giảm dần từ
tuần thứ 10 trừ cá nuôi ở NT5, tốc độ tăng trưởng cao nhất trong cá nuôi ở NT3 là
1,5% còn thấp nhất đối với cá nuôi ở NT1 là 1,2%. Tỷ lệ cá sống cao từ 72 – 73,3%
ở NT3, NT4, NT5 và thấp nhất ở NT1 và NT6. Tỷ lệ hiệu quả protein cao nhất ở NT3
(1,0) và thấp nhất ở NT6 (0,5), tỷ lệ chuyển đổi thức ăn cao nhất ở NT6 (3,1) và thấp
nhất ở NT4 (1,6). Sự khác biệt giữa NT1 và NT6 là không đáng kể nhưng khác nhau
đáng kể so với NT3, NT4, NT5. Vậy việc thay thế bột cá sang bột trùn từ 50 – 75%
phù hợp với hiệu suất tăng trưởng và khả năng sử dụng chất dinh dưỡng của cá giống.

24
2.4. Chế phẩm probiotics
2.4.1. Định nghĩa về Probiotics
Có rất nhiều định nghĩa về probiotics như probiotics là những vi khuẩn hoặc
nấm men có ích hỗ trợ khôi phục lại sự cân bằng trong đường ruột. Chúng còn được
gọi là “vi khuẩn thân thiện” hay “lợi khuẩn”, những vi khuẩn này được bổ sung vào
chế độ ăn nhằm cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột để cải thiện sức khỏe.
Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001): “Probiotics là các vi sinh vật sống khi
đưa vào cơ thể theo đường tiêu hóa với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khỏe tốt cho
vật chủ”.
Định nghĩa của Tổ chức Lương Nông Thế giới (FAO): “Probiotics là những vi
sinh vật sống khi được sử dụng với một lượng tương thích sẽ mang lại lợi ích cho sức
khỏe của vật chủ”.
Định nghĩa khác: “Probiotics là vi sinh vật sống bổ sung trong thức ăn vật nuôi,
gây tác động có lợi cho vật chủ bởi sự cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường
ruột” (Isolauri et al., 2004).
2.4.2. Vai trò của probiotics trong chăn nuôi thủy sản (Nguyễn Thị Ngọc
Huyền, 2012)
Theo Phạm Thị Tuyết Ngân (2007) probiotic là hỗn hợp bổ sung mang bản chất
của các vi sinh vật sống tác động có lợi đối với vật chủ nhờ cải thiện hệ vi sinh liên
kết với vật chủ hoặc sống tự do trong môi trường, nó giúp cải thiện việc sử dụng thức
ăn hoặc tăng cường giá trị dinh dưỡng của thức ăn, ngoài ra probiotic còn giúp tăng
khả năng đề kháng của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc nhờ vào sự cải thiện chất
lượng của môi trường sống. Probiotics là công nghệ thân thiện với môi trường và
đang có xu hướng được ứng dụng rộng rãi trên thế giới và ở Việt Nam. Nghiên cứu
của Lê Đình Duẩn và ctv (2007) về nuôi thử nghiệm tôm sú bằng chế phẩm sinh học
cho kết quả rất khả quan, các chế phẩm sinh học không những làm tăng khả năng
phân giải các chất hữu cơ, làm sạch và ổn định môi trường nước mà còn làm tăng
năng suất gấp hai lần so với đối chứng.

25
Ngày nay việc đưa những sản phẩm probiotics vào nuôi trồng thủy sản đang
được quan tâm và ứng dụng nhiều với những lợi ích như:
 Cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh hay tạo ra những hoạt chất ức chế kìm hãm
sự phát triển của chúng.
 Cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của động
vật thủy sản.
 Giúp cải thiện hệ tiêu hóa cho vật nuôi nhờ những vi sinh vật hữu ích đường
ruột có trong thức ăn.
 Hấp thu hay phân hủy các thức ăn thừa, vật chất hữu cơ thải ra trong môi trường
nước giúp cải thiện môi trường.
 Kích thích hệ miễn dịch không đặc hiệu của tôm cá, nâng cao sức đề kháng.
Ngoài ra, việc ứng dụng những vi sinh vật hữu ích vào môi trường ao nuôi không
những cải thiện chất lượng nước, phát triển bền vững mà còn gia tăng năng suất,
gia tăng tỷ lệ sống, giảm thiểu mầm bệnh trong môi trường và cải thiện hệ số
thức ăn.

26
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian tiến hành từ tháng 5/2015 đến tháng 8/2015 tại phòng thí nghiệm
trường đại học Công Nghệ TP. HCM.
3.2. Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu
3.2.1. Vật liệu
Trùn quế tươi được mua tại trại nuôi trùn ở trung tâm công nghệ sinh học 
Quận 12  Thành phố Hồ Chí Minh.
Enzyme thương phẩm: enzyme Alcalase (sản phẩm thương mại của công ty
Novozyme, thành phố Hồ Chí Minh).
Nguồn vi sinh vật: phân lập các chủng Bacillus sp. từ những chế phẩm đang
được lưu hành tại các đại lý buôn bán thức ăn thủy sản ở Đồng bằng sông Cửu Long.
Hình 3.1. Mẫu chế phẩm probiotic dùng để phân lập

27
3.2.2. Hóa chất
Hóa chất dùng pha môi trường: Agar, pepton, giá đậu, cao nấm men, NaCl.
Hóa chất khảo sát đặc tính sinh hóa: MgSO4, K2HPO4, NH4H2PO4, phenol red,
bromothymol blue.
Thuốc thử: H2O2, methyl red, phenol red, Kovacs’.
Thuốc nhuộm Gram: Gentian violet, Lugol, Fucshin
Hóa chất chuẩn pH: NaOH (0,1 N), HCl (0,1 N).
Dung dịch Tyrosine chuẩn
Dung dịch casein 1%
Dung dịch trichloroacetic acid (TCA) 5%
Dung dịch albumin: 0,1%
Thuốc thử Folin đã được pha sẵn.
Dung dịch thuốc thử Lowry gồm:
 Dung dịch A: cân 2 g Na2CO3 hòa tan trong NaOH 0,1 N thành 100 ml.
 Dung dịch B: cân 0,5 g CuSO4.5H2O hòa tan trong dung dịch citrate natri
1% tạo thành 100 ml.
Hình 3.2. Chủng Escherichiacoli, Salmonella sp.,
Staphylococcus aureus– Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP. HCM

28
 Dung dịch C: là hỗn hợp của dung dịch A và B theo tỷ lệ 49 : 1 (sử dụng
trong ngày).
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
Các máy móc, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu được sử dụng trong phòng thí
nghiệm của trường đại học Công Nghệ TP. HCM.
- Cân điện tử - Tủ sấy, tủ ấm
- Kính hiển vi quang học - Bể ủ nhiệt
- Nồi hấp thanh trùng - Tủ cấy vô trùng
- Bình tam giác - Máy lắc
- Tủ lạnh, tủ lạnh sâu - Máy đo pH
- Máy đo OD - Máy khuấy từ
- Máy Kjeldahl - Máy li tâm
Các dụng cụ khác như: Ống nghiệm, đĩa petri, đầu tuýp, đũa thủy tinh, lam kính,
cốc thủy tinh, que trang, que cấy, pipetman, pipet, ống đong, nồi đun, bếp điện, giấy
lọc, bông thấm...
3.3. Môi trường phân lập, định danh và giữ giống
Môi trường phân lập và giữ giống (MT1): môi trường nước chiết giá đậu pepton
cao nấm men agar. (Phụ lục 1.1)
Môi trường nhân giống: môi trường nước chiết giá đậu pepton cao nấm men
(MT2). (Phụ lục 1.2)
Môi trường khảo sát đặc điểm sinh học: môi trường Clark cluck, môi trường lên
men các loại đường. (Phụ lục 1.6; 1.7)

29
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Sơ đồ tổng quan thí nghiệm
Định tính khả năng
sinh enzyme protease
Xác định hoạt tính
kháng khuẩn
sinh học
Định danh bằng
phương pháp sinh lý,
sinh hóa
Phân lập chủng
Bacillus sp.
Mẫu chế phẩm Probiotic
Hoạt hóa giống
Pha loãng mẫu
Cấy giống
Thuần khiết giống
Quan sát, nhuộm
Gram
Test khả năng di
động
Test IMVIC
Test khả năng sử
dụng đường
Xác định nhiệt độ tối
ưu: 35oC đến 65oC
Xác định pH tối ưu:
6,0; 6,5; 7,0; 7,5;
8,0; 8,5
protease bằng phương
pháp Anson cải tiến
Xác định điều kiện
tối ưu cho hoạt động
của chế phẩm
protease
Xác định hàm lượng acid amin
bằng phương pháp Lowry
Tối ưu hóa quá trình
Thủy phân trùn quế
Xác định thành phần
nguyên liệu trùn tươi
Khảo sát nồng độ cơ
chất tối ưu: 5, 10,
15, 20, 25, 30 (%)
Khảo sát nồng độ
Enzyme tối ưu: 0,5;
1; 1,5; 2; 2,5; 3(%)
Khảo sát thời gian
thủy phân: Từ 0 
20 giờ
Sơ đồ 3.1. Quá trình tiến hành thí nghiệm

30
3.4.2. Phương pháp phân lập Bacillus sp.
3.4.2.1. Hoạt hóa giống Bacillus sp.
Tiến hành hoạt hóa giống vi sinh vật từ 6 chế phẩm vi sinh: cân 0,1 g cho mỗi
chế phẩm bổ sung vào môi trường MT2, sau đó ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng từ 18 –
24 giờ.
Mẫu trước khi nuôi cấy đều phải đem hoạt hóa giống với mục đích: giúp cho
quá trình nuôi cấy diễn ra nhanh hơn và vi sinh vật hoạt động trở lại sau thời gian bảo
quản trong chế phẩm.
3.4.2.2. Phân lập các chủng Bacillus sp.
Phân lập chủng Bacillus sp. từ chế phẩm sinh học thức ăn chăn nuôi thủy sản
trên môi trường MT1.
Hút 1 ml mẫu đã hoạt hóa cho vào 9 ml nước muối sinh lý (đã khử trùng), lắc
đều để có độ pha loãng 10-1. Sau đó pha loãng thành các nồng độ 10-2,10-3, 10-4,10-5,
10-6, 10-7. Hút 0,1 ml mẫu từ 3 nồng độ 10-3, 10-4, 10-5 cho vào môi trường thạch MT1
đã chuẩn bị trong các đĩa petri vô trùng, dùng que trải dàn đều dịch trên bề mặt đĩa
thạch. Đĩa sau khi cấy được ủ từ 1 đến 2 ngày ở nhiệt độ 37oC. Mỗi nồng độ được
trải trên 2 đĩa môi trường MT1.
Khi khuẩn lạc mọc, quan sát hình thái, màu sắc để lựa chọn sơ bộ khuẩn lạc
thuộc chủng Bacillus sp. Khuẩn lạc đặc trưng được tách ra và cấy ria nhiều lần để tạo
dòng thuần chủng, sau đó cấy vào môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm, giữ
giống ở nhiệt độ thấp (< 4oC).
3.4.2.3. Cấy giữ gống Bacillus sp.
Cấy các giống Bacillus sp. đã được hoạt hóa cấy sang ống thạch nghiêng chứa
môi trường MT1. Ủ khoảng 37oC trong 48 giờ. Sau đó đem giữ lạnh và cấy chuyền
giống hàng tháng.
3.4.2.4. Tăng sinh chủng Bacillus sp.
Cấy giống từ ống thạch nghiêng sang erlen có chưa môi trường MT2, nuôi cấy
lắc ở nhiệt độ thường trong vòng 2 giờ. Dịch tăng sinh sau đó được được xác định
mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.

31
3.4.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (Nguyễn Đức
Lượng và ctv, 2006)
 Nguyên tắc
Trên môi trường MT1, xem như mỗi tế bào sẽ phát triển thành 1 khuẩn lạc, dựa
vào số khuẩn lạc mà ta xác định được số lượng tế bào trong một lượng mẫu ban đầu.
 Cách tiến hành
Chuẩn bị 15 – 20 ml dung dịch môi trường MT1 đã được hấp khử trùng và đổ
MT vào mỗi đĩa petri, để nguội. Pha loãng thập phân mẫu bằng nước cất đã hấp khử
trùng để được dịch pha loãng từ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7. Hút 0,1 ml các dung dịch
trên vào từng đĩa môi trường MT1 đã được chuẩn bị trước, mỗi nồng độ cấy vào 2
đĩa. để tránh mất nước cho môi trường, ủ ở nhiệt độ phòng và sau 48 giờ ghi nhận kết
quả số khuẩn lạc trên các đĩa (25 – 300). Nhân số khuẩn lạc đếm đươc trên đĩa petri
với hệ số pha loãng, tính giá trị trung bình số khuẩn lạc từ 1 g hay 1 ml mẫu.
Số khuẩn lạc có trong 1 ml mẫu ban đầu được tính theo công thức:
Số khuẩn lạc =
∑N
n1∗ v1 ∗f1 + n2∗ v2∗ f2+ . . .+ ni ∗ vi ∗ fi
(CFU/ml)
Với:
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa có từ 25 – 300 khuẩn lạc.
ni: số đĩa có khuẩn lạc trong khoảng đếm được ở một nồng độ pha loãng i.
vi: thể tích dịch pha loãng I cho vào mỗi đĩa petri.
fi: bậc pha loãng.
CFU: (Colonies Form Unit) đơn vị hình thành khuẩn lạc.
3.4.3. Phương pháp định danh bằng đặc điểm sinh lý, sinh hóa
3.4.3.1. Phương pháp nhuộm Gram
 Mục đích
Giúp ta phân biệt vi khuẩn thành hai nhóm lớn: vi khuẩn Gram dương (Gram 
positive) bắt màu tím và vi khuẩn Gram âm (Gram  genative) bắt màu hồng. Ngoài
ra nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so với soi vi khuẩn sống.

32
 Nguyên tắc
Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày, dạng lưới cấu tạo bởi peptodoglycan
có khả năng giữ phức hợp tím tinh thể  iod. Trong khi đó lớp thành tế bào của vi
khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có lớp màng lipid đôi bên ngoài.
Sau khi nhuộm với phức hợp tím tinh thể  iod, mẫu được xử lý tiếp với cồn
96o, làm mất nước của lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó làm
giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến tế bào giữ phức hợp tím tinh thể  iod
bên trong tế bào.
Đối với vi khuẩn Gram âm, cồn 96o đóng vai trò làm chất hòa tan lớp lipid đôi
bên ngoài. Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể  iod.
Sau đó khi nhuộm lại với thuốc thử Fuchsin thì tế bào vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu
hồng của thuốc thử Fushin.
Bước 1: cho một giọt nước cất lên lam kính sạch, dùng que cấy lấy một ít sinh
khối từ khuẩn lạc, trang đều và để khô tự nhiên hoặc hơ qua ngọn lửa đèn cồn (nhằm
làm vết bôi mau khô, giết chết tế bào vi sinh vật, cố định vi sinh vật).
Bước 2: nhỏ một giọt thuốc nhuộm Crystal/Gentian Violet lên vết mẫu đã được
cố định trong vòng 30 giây, rửa lại bằng nước cất (tránh để tia nước tiếp xúc trực tiếp
với mẫu).
Bước 3: nhỏ một giọt dịch Iot/Lugol lên vết mẫu trong vòng 1 phút đến, sau đó
rửa lại bằng nước cất.
Bước 4: tẩy cồn 96o cho đến khi hết màu thuốc nhuộm (khoảng 30 giây), sau đó
rửa ngay bằng nước cất.
Bước 5: nhỏ một giọt thuốc thử Fuchsin lên vết mẫu trong khoảng một phút, sau
đó rửa bằng nước cất. Dùng giấy thấm khô và đem mẫu đi quan sát dưới kính hiển vi
với độ phóng đại 100X với lớp dầu khoáng.
 Quan sát:
Gram “+” sẽ bắt màu tím; Gram “” sẽ bắt màu hồng.

33
3.4.3.2. Test khả năng di động
 Mục đích
Xác định khả năng di động của vi sinh vật trong môi trường thạch mềm.
 Nguyên tắc
Vi sinh vật di động nhờ cấu trúc protein gọi là tiêm mao có nhiều ở vi khuẩn
hình que, một số vi khuẩn hình cầu. Khả năng di động là một trong những căn cứ có
thể dùng để phân biệt vi sinh vật. Khả năng này được quan sát dựa vào sự tăng trưởng
và di động của vi sinh vật vào bên trong môi trường thạch mềm. (+) khi vi sinh vật
mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh. Là () khi vi sinh vật
chỉ mọc theo đường cấy trong khi môi trường xung quanh vẫn trong.
 Tiến hành
Sử dụng môi trường thạch mềm chứa 0,5% agar. Môi trường được đun tan và
phân phối vào ống nghiệm. Các ống nghiệm này được hấp khử trùng và làm nguội ở
trạng thái đứng.
Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối từ khuẩn lạc thuần chủng, cấy bằng cách đâm
sâu đầu que cấy vào giữa ống thạch đứng chứa môi trường thạch có 0.5% agar. Các
ống môi trường được ủ ở 37oC trong 24  48 giờ rồi quan sát.
Nếu vi khuẩn mọc dọc theo vết cấy và mọc lan ra xung quanh, chứng tỏ chúng
có khả năng di động. Còn nếu vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy mà không mọc lan ra
xung quanh thi chứng tỏ chúng không có khả năng di động.
3.4.3.3. Test catalase
 Mục đích
Xác định xem vi sinh vật có enzyme catalase hay không.
 Nguyên tắc
Các vi sinh vật hiếu khí hay kị khí tùy ý chứa chuỗi chuyền điện tử có
cytochrome đều có enzyme catalase (trừ Streptococcus sp.). Enzyme này là một trong
các thành viên của hệ thống các enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương
bởi các dẫn xuất độc tính cao của oxy phân tử trong tế bào hiếu khí và kị khí tùy ý.

34
Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với
oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi chuyền điện tử tạo H2O2.
Phần lớn các chủng vi khuẩn lactic có phản ứng catalase âm tính nhưng đặc biệt
có một số loài thuộc chi Pedioccocus lại có phản ứng catalase dương tính gọi là
“catalase giả” như P. pentosaceus do chúng không nhạy cảm với cyanide và azidem
và không chứa nhóm giả của Hame (C34H32O4N2Fe).
 Tiến hành
Dùng que cấy lấy sinh khối khuẩn lạc thuần trên môi trường MT1 đặt lên lam
sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên khuẩn lạc. Hoặc có thể thử trên đĩa petri, nhỏ trực
tiếp H2O2 30% lên khuẩn lạc trên bề mặt thạch và quan sát hiện tượng sủi bọt bằng
mắt thường.
 Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện.
 Phản ứng (): không có bọt khí xuất hiện.
 Lưu ý
Khi thử nghiệm trên lame không được đảo lộn trình tự tiến hành. Nên dùng
khuẩn lạc đã nuôi trong thời gian từ 18 – 24 giờ để tránh phản ứng âm tính giả. H2O2
30% không bền và dễ bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng nên cần giữ lạnh dung
dịch và kiểm tra hoạt tính trước khi dùng.
3.4.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh indol
 Mục đích
Phát hiện các vi sinh vật có khả năng sinh indol  các vi sinh vật có hệ enzyme
tryptophanase.
 Nguyên tắc
Tryptophan là một acid amin có thể bị chuyển hóa bởi một số vi sinh vật có hệ
enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm có chứa gốc indol và các dẫn xuất của
chúng trong môi trường canh trypton. Trong môi trường nuôi cấy bằng thuốc thử
Kovacs’ hay Ehrlish’s. Indol sẽ kết hợp với thuốc thử para –
dimethylaminobenzaldehyde (có trong thuốc thử Kovacs’) tạo thành phức chất
quinon có màu đỏ.

35
Chuẩn bị: môi trường canh Trypton, thuốc thử Kovacs’.
Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn từ môi trường thạch cấy vào trong môi trường
canh Trypton và nuôi vi khuẩn ở 37oC khoảng 24 – 48 giờ, nhỏ vài giọt ether vào
canh khuẩn để kéo indol lên trên bề mặt môi trường, thêm thêm vài giọt thuốc thử
Kovacs’. Để yên 3 phút, quan sát hiện tượng và đọc kết quả.
Quan sát môi trường:
 Phản ứng dương tính (+): xuất hiện vòng màu đỏ trên bề mặt môi trường.
 Phản ứng âm tính (-): không xuất hiện vòng màu đỏ (môi trường không
đổi màu).
3.4.3.5. Thử nghiệm Methyl Red (MR)
 Mục đích
Xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các sản phẩm acid trong môi trường
glucose.
 Nguyên tắc
Một số vi sinh vật có khả năng sử dụng đường glucose có trong môi trường làm
cho pH môi trường giảm (sinh axit). Khi đó, thuốc thử methyl-red vẫn giữ nguyên
màu đỏ (MR dương tính). Ngược lại, nếu vi sinh vật không sử dụng nguồn glucose
mà chỉ sử dụng nguồn nitrogen trong môi trường làm cho pH môi trường trở nên kiềm
và thuốc thử methyl-red chuyển từ màu đỏ sang màu vàng (MR âm tính).
Chuẩn bị: môi trường Clark Lubs, thuốc thử methyl-red, ống giống vi khuẩn.
Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn cấy vào trong ống nghiệm chứa môi trường
Clark Lubs, nuôi ở nhiệt độ 37oC – 2 - 5 ngày. Sau đó, nhỏ 3 – 5 giọt thuốc thử methyl
– red vào ống nghiệm và đọc kết quả.
 Phản ứng MR dương tính: môi trường có màu đỏ.
 Phản ứng MR âm tính: môi trường màu vàng.

36
3.4.3.6. Thử nghiệm khả năng sử dụng đường
 Mục đích
Thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn carbonhydrate của các vi sinh vật.
 Nguyên tắc
Vi sinh vật có khả năng khác nhau trong việc sử dụng các nguồn carbon khác
nhau để tăng trưởng, khi sử dụng các nguồn carbon để lên men, tùy vào phương thức
lên men mà các sản phẩm tạo ra sẽ khác nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ, CO2 .
Trong tất cả các trường hợp, các sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH của môi trường
dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.
 Phương pháp
Môi trường lên men các loại đường: glucose, saccharose, galactose và lactose
với pH 7,4. Chỉ thị pH môi trường là phenol red, màu đỏ sẽ chuyển sang vàng khi pH
môi trường dưới 6,8 (môi trường bị acid hóa). Bổ sung đường với nồng độ 1% và
chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2. Phân môi trường vào các ống nghiệm và khử trùng ở nhiệt
độ 121oC trong 10 phút. Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm, ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ
và đọc kết quả.
 Phản ứng (-): môi trường vẫn giữ nguyên màu đỏ.
 Phản ứng (+): môi trường chuyển sang vàng.
3.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học
3.4.4.1. Khả năng kháng khuẩn
 Nguyên tắc
Dựa trên sự khuếch tán của kháng sinh trong môi trường thạch, nơi có chất
kháng sinh khuếch tán đến thì nơi đó vi sinh vật kiểm định không phát triển được và
tạo ra vòng vô khuẩn trên môi trường thạch đĩa (Đặng Ngọc Phương Uyên, 2007).
Trong thí nghiệm chúng tôi dùng phương pháp đục lỗ thạch và đo vòng kháng
khuẩn. Chọn 3 vi khuẩn gây bệnh đường ruột gồm: E.coli, Salmonella và
Staphylococcus để khảo sát tính kháng khuẩn của các chủng Bacillus sp.

37
Nuôi vi khuẩn Bacillus sp. trong môi trường MT2 ở nhiệt độ phòng, sau 36 giờ
lấy dịch nuôi trong điều kiện vô trùng. Sau đó, đổ 15 ml môi trường MT1 vào các đĩa
petri đã khử trùng, để nguội chờ môi trường đông đặc. Tiếp theo dùng khuyên đục lỗ
đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt môi trường tạo thành các giếng (đường kính
khoảng 0,5 cm). Dùng pipet hút 1 ml vi khuẩn kiểm định vào môi trường và trải đều,
sau đó dùng pipet hút 0,1ml dịch vi khuẩn Bacillus sp. đã được lọc nhỏ vào các giếng
trong đĩa petri, để khô và ủ trong 48 giờ trong tủ ấm. Sau thời gian nuôi cấy thích
hợp, đo đường kính vòng kháng khuẩn.
3.4.4.2. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme protease
Để xác định khả năng thủy phân protein của các chủng vi khuẩn Bacillus sp
chúng tôi tiến hành thực hiện theo phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường MT1
có bổ sung 1% cơ chất casein.
Nuôi vi khuẩn Bacillus sp. trong môi trường MT2 ở nhiệt độ phòng, sau 36 giờ
lấy dịch nuôi trong điều kiện vô trùng. Sau đó, đổ 15 ml môi trường MT1 có chứa
casein vào các đĩa petri đã khử trùng, để nguội chờ môi trường đông đặc. Tiếp theo
dùng khuyên đục lỗ đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt môi trường tạo thành
các giếng (đường kính khoảng 0,7 cm).
Dùng pipet hút 0,1 ml dịch tăng sinh vi khuẩn Bacillus sp. đã được lọc nhỏ vào
các giếng trong đĩa petri, để đĩa vào tủ lạnh 2 tiếng để dịch có thể khuyếch tán đều
vào môi trường, sau đó để vào tủ ấm. Sau 48 giờ thử bằng thuốc thử HgCl2 1% nhỏ
lên bề mặt nuôi cấy. Nếu vi khuẩn sinh enzyme protease thì sẽ tạo một vòng trong
suốt xung quanh giếng, do các protein bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với
HgCl2. Các vùng chưa phân giải sẽ có màu trằng đục mờ.
3.4.4.3. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease
Chuẩn bị và cấy vào môi trường MT3 với lượng giống sử dụng là 10%, độ ẩm
60 – 65%. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ.

Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn bacillus sp. trong thức ăn chăn nuôi thủy sản

Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn bacillus sp. trong thức ăn chăn nuôi thủy sản

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn bacillus sp. trong thức ăn chăn nuôi thủy sản

Similar to Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn bacillus sp. trong thức ăn chăn nuôi thủy sản (20)

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY

More from TÀI LIỆU NGÀNH MAY (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn bacillus sp. trong thức ăn chăn nuôi thủy sản