＠第194回農林交流センターワークショップ

1. 画像解析の基礎知識
第 194 回農林交流センターワークショップ
「 植物科学・作物育種におけるフェノーム解析
- はじめて画像解析を行う研究者のための入門実習 - 」
2015-09-17 10:20-11:10 (50分)
東京大学 大学院新領域創成科学研究科 / エルピクセル(株)
朽名 夏麿

2. 'wet' な研究室
植物細胞の形
現象: 分裂，生長，形態変化
対象: 細胞骨格，オルガネラ，細胞形状
手法: 可視化と共焦点顕微鏡等での観察

3. エルピクセル株式会社
生命科学研究の現場におけるデータ取得から解析までを支援すべく，
東大 院新領域 馳澤研 の出身メンバー 3 名で 2014 年 3月 設立．

4. 生命現象のスケールと画像
超微細構造 細胞 組織 個体
個体群
地球環境
2000 km200 nm
オルガネラ
塩基配列
生体分子
器官
0.1 nm
(10-10 m)
10 nm
(10-8 m)
10 µm
(10-5 m)
10 mm
(10-2 m) 1 m
1 km
(103 m)
105 km
(108 m)
画像 (バイオイメージング)
電顕 衛星画像
スケール
デジタル画像は生命科学の広いスケールで扱われる実験データ．
その解析法を習得することで，電子顕微鏡や光学顕微鏡から，
デジタルカメラ，そして人工衛星までをも研究ツールとできる．
もちろん生物学以外にも多方面に応用可能である
(ネット上のデータの 80% が画像等の非構造化データと言われる)．

5. 生命科学における画像解析のもつ厄介さ
多次元 (時間，立体，波長…)
データサイズ・枚数
自動化・計算機支援に向く
* 相反する性質．
* 手法を確立してもなかなか pay しない …．
* 「最新の画像処理技術」が要るのか??
多様性(生物種，部位，観察法…)
多目的性 (何に着目するか)
研究者(人間)の柔軟性が不可欠
数・形・長さ100 ms/img
1024*1024 pixel/img
12 bits/pixel
→ 4 GiB / 5 min
動き濃度, 電位
t, z, λ
位置・局在
属人性 (誰が撮ったのか)
著作権，創作的側面．

6. 撮影前後に不可欠な作業
見ること．
隅から隅まで，研究対象やモニタに近付いたり離れたりしつつ，見る．
微妙な変化や異常に気付くよう注視したり，時にはリラックスして
眺めたりする．
表示上の"明るさ"をさまざまに設定し，必ず一度は「サチる」状態
までコントラストを上げる．
ズーム機能によって，必ず「画素」の大きさが認識できる倍率まで
拡大する．
回転(Image > Transform -...)，白黒反転(Image > Lookup Tables >
Invert LUT)，擬似色表示(Image > Lookup Tables > ...)も有効．
描くこと．
模写，スケッチする．下手とか絵心がないとか言わないで必ずやる．
要は「観察」．観察力がないと画像解析は失敗するし，
画像解析を身につけると観察力は増す．

7. デジタル画像解析をはじめる前に
撮影:
撮像法(顕微鏡，カメラ，スキャナ他)と機種
設定: 機種，レンズ，光(照明，透過光，励起光)，露光(露出)時間，
フレーミング，フォーカス，背景，被写体との距離，
ピンホール径，カメラ設定(ビニング等)，ゲイン
留意点: S/N(シグナル-ノイズ比)，ダメージ，ボケ，ブレ，
サチュレーション，撮像条件の変動
適切な画像解析の環境
良いソフトウェア: 現時点では ImageJ / Fiji を勧める．
マシン: OSは問わない．速くてメモリが多いもの．64 bit OS 推奨．
良いモニタを正しく設定して使う．

8. 器官〜個体レベルの形態イメージング
・撮像機器
一眼レフカメラ
コンパクトデジカメ
スキャナ (フラットベッド式，シートフィード式)
・撮影の状況や環境
光の向き，量，スペクトル．→ S/N，色再現性，ハイライト
背景 (background)．→ 領域抽出のしやすさ
屋内 or 屋外．
日照，風，作業従事者に対する負荷．
・ファイルフォーマット
RAW(NEF等)，TIFF，JPEG(圧縮率)

9. 一眼レフ vs コンパクトデジカメ
http://www.antaresdigicame.org/photo_gallery/camera/camera75.html
http://www.hugorodriguez.com/articulos/nikond1h.htm http://kakaku.com/item/K0000019084/images/

10. http://www.antaresdigicame.org/photo_gallery/camera/camera75.html
TIFF vs JPEG

11. ImageJ は実験室みたいなもの
ImageJ の「機能」: 約 500
Fiji (ImageJ ＋ α ) の「機能」: 約 900
(command finder 上の登録数)

12. ImageJ のメニュー と 画像解析の流れ
大雑把な流れ
cf. 実験のプロトコル，料理のレシピ
画像処理1 画像処理2…

13. ノイズ抑制だけでも多くの方法がある
Coll B et al. (2005) CVPR 2005, vol 2, 60-65.

14. Coll B et al. (2005) CVPR 2005, vol 2, 60-65.
A non-local algorithm for image denoising (NL-means)

15. Coll B et al. (2005)
NL means を画像解析の前処理で使ってよいのか?
定量解析には?
パターン認識には?

16. ←画像情報: 159x153 pixels; 8-bit; 24K
画素と画素数
(3200%) ： 拡大・縮小率
画像ウインドウ左上に青い枠が表示されている場合，
ウインドウに画像全域が収まっていない．
現在表示されている部位が，画像全域のどこに相当する
かを示している．
159
153
画素, pixel (picture element)
* Voxel
* Binning

17. 座標系と画素と輝度
←画像情報: 159x153 pixels; 8-bit; 24K
y
x
(x,y) = (0, 0)
輝度 35
(3, 0)
輝度30
(3, 2)
輝度 21
ImageJ では左上を原点(0, 0)とし，右に X 軸，下にY軸が伸びる．
各画素には輝度 (強度，intensity．明度 brightness とも言う)
が割り当てられている．
※ 「0 から数えること」「左上が原点であること」 に注意．

18. 座標系と画素と輝度
y
(x,y) = (0, 0)
輝度 35
(3, 0)
輝度30
(3, 2)
輝度 21
x
Excel で開いた例
表示を縮小
159列
159
153
153行
File - Save As - Text Image…

19. PowerPoint 等での強拡大に注意
PowerPoint や Photoshop 等で補間を
ともなう"強拡大"をするとデジタル的
な解像度や分解能と関係なく擬似的
にズームしたようになるが，解像度や
分解能が上がる訳ではない．
データ解釈を誤らないよう注意．
PowerPoint
で拡大
補間なし
補間あり
Mac OSX の PowerPoint では，また
さらに異なる補間のされ方 (ぼかし方)になる！

20. 輝度ヒストグラム
位置情報を無視した上で，全画素について
輝度の分布を可視化したもの．
輝度の基本的な統計量(最小，最大，平均，
標準偏差等)も表示されている．

21. 輝度のタイプ
(0, 0)
輝度 35
(3, 0)
輝度30
(3, 2)
輝度 21
8-bit: 0～255 の整数(integer)
16-bit: 0～65535 の整数(integer)
32-bit: 浮動小数点数(float)
実数の近似値．±3.4*1038 の
範囲で7桁位の精度．
グレイスケール画像, 濃淡画像
輝度のデータ型．
ビット深度(bit depth), bits per pixel,
量子化ビット数等とも呼称．
カラー画像
≠白黒画像
8-bit Color: 使わない．
RGB Color: 赤緑青の3チャネルを
重ねることによるカラー表現．
各チャネルのデータ型は8-bit，
16-bit, 32-bit のいずれかで，
チャネル間では統一されている．

22. 輝度のビット深度
8-bit: 0～255 の整数(integer)
16-bit: 0～65535 の整数(integer)
32-bit: 浮動小数点数(float)
実数の近似値．±3.4*1038 の
範囲で7桁位の精度．
グレイスケール画像, 濃淡画像
≠白黒画像
原画像のビット深度はカメラによって異なり，8～16 bits/pixel が主．
12 bits/pixel (212 , 0～4095) や 14 bits/pixel (214 , 0～16383)の
カメラで得た画像は 16 bits/pixel の画像フォーマットとして扱う
(大は小を兼ねる)．
輝度には必ずノイズが混じるので，深度が大きい方が一概に
高性能というわけではない．
画像処理的には内部で 32-bit (float) を用いることも多い
(小数やマイナスの値が扱えるので) ．
輝度
位置(pixel)8 bits/pixel
28 ＝256 段階
0
255

23. 動きの解析

24. スタック画像
時系列画像(動画像，動画，XYT)
や，焦点面を変えて撮影した連続
画像(立体画像，XYZ)はともに
スタック画像として操作できるが，
ZとTの区別が無いことに注意．
スタック画像を構成する2次元画像
をスライスとかフレームと呼ぶ．
ステータスバーの z=2 は
「Z座標の値が2」を示す
(0から数えている． 0-origin) ．
画像情報欄の 3/10 は
「全10枚中3枚目」を示す
(1から数えている．1-origin)．
表示中のスライスを変更
再生 (速度設定: Image - Stacks - Tools - Animation Options...)
タバコ培養細胞
微小管プラス端

25. Brightness & Contrast, Image - Type - 8-bit
動き解析のための輝度投影
Image - Stacks - Z Project - Max Intensity
最大輝度投影
Plugins - kbi - Kbi_StkFilter - maxHsvProject
輝度投影(疑似色)
time

26. 動き解析のための粒子追跡
輝度投影
(疑似色)
1スライス目 10スライス目
平均速度:
(pixel/slice) T: スライス数
T－1

27. 動き解析のためのカイモグラフ
最大輝度投影
Plugins - kbi - Kbi_DynProf - kymoStatic
位置
時間
p
t 平均速度:
(pixel/slice)
1スライス目 10スライス目

28. オプティカルフロー

29. 動き解析のためのオプティカルフロー法
シロイヌナズナ胚軸表皮 小胞体
CSU, EM-CCD, 50 ms * 100 frame
Plugins - kbi - Kbi_DynProf - kymoStatic
位置
時間
Plugins - kbi - Kbi_Flow

30. まとめ

31. なぜ画像解析をするのか?
* 撮影した画像をどのように扱うか，という問題．
典型的な何枚かを原稿に貼り付け，legend を書いて終わり?
定量性，そして客観性．
同じ画像から，解析次第で様々な情報が引き出せる．
* 何のために可視化したり撮影するのか，という問題．
可視化，撮像，解析までトータルに考えて実験計画を立てる．
研究者のツールとしての画像解析，という段階へ．

32. もう少し詳しく学ぶには
省略したが重要な事項
* blur (ボケ) と PSF(点像分布関数, point-spread function)．
蛍光ビーズによるPSF測定．blur の影響と対策．
* ノイズ，とくにGaussノイズとショットノイズ．ノイズ抑制．
* 背景 (background) 輝度の高さと分布の扱い．
参考になる本
* 「細胞工学」誌 連載中の “ImageJ 定量階梯” (2013年12月号～)
* 田村秀行 (2002) 「コンピュータ画像処理」
オーム社，ISBN-13: 978-4274132643
* Burger W & Burge MJ (2007) Digital Image Processing:
An Algorithmic Introduction using Java
Springer, ISBN-13: 978-1846283796
※ ImageJ 本．バイオ指向．プラグインの作例が豊富．
参考になるサイト
英語なら ImageJ 公式サイトを起点に充実．