Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 HOẶC https://www.facebook.com/garmentspace/ https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT TẦN SỐ GENE PIT-1 (PITUITARY
SPECIFIC TRANSCRIPTION FACTOR 1) TRÊN ĐÀN GÀ
TÀU VÀNG NUÔI TẠI MỘT TRUNG TÂM
GIỐNG VẬT NUÔI
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn: Th.S LÊ THỊ THU HÀ
Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ THÙY TIÊN
MSSV: 0851110247 Lớp: 08DSH2
TP. Hồ Chí Minh, 8/2012

2. i
Khoa: Môi trường & CNSH
PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
(Phiếu này được dán ở trang đầu tiên của quyển báo cáo ĐATN)
1. Họ và tên sinh viên/ nhóm sinh viên được giao đề tài (sĩ số trong nhóm: 01):
Họ và tên sinh viên: NGUYỄN THỊ THÙY TIÊN
MSSV: 0851110247 Lớp: 08DSH2
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
2. Tên đề tài: Khảo sát tần số gen PIT-1 (Pituitary specific transcription factor 1)
trên đàn gà Tàu vàng nuôi tại một Trung Tâm Giống Vật Nuôi.
3. Các dữ liệu ban đầu:
 Tài liệu tổng quan
 Các bài báo khoa học trong và ngoài nước
4. Các yêu cầu chủ yếu:
 Lấy mẫu máu gà Tàu vàng tại Trung Tâm Giống Vật Nuôi
 Tách chiết DNA các mẫu máu
 Xác định tần số gene PIT-1 bằng kỹ thuật PCR – RFLP
5. Kết quả tối thiểu phải có:
 Tách chiết được DNA trong mẫu máu
 Sản phẩm PCR có kết quả tốt
 Enzyme cắt giới hạn cho kết quả đặc hiệu và xác định được tần số gene
PIT-1 trên đàn gà Tàu vàng
Ngày giao đề tài: 02/04/2012 Ngày nộp báo cáo: 01/08/2012
Chủ nhiệm ngành
(Ký và ghi rõ họ tên)
TP. HCM, ngày …. tháng …. năm ……
Giảng viên hướng dẫn chính
(Ký và ghi rõ họ tên)
Giảng viên hướng dẫn phụ
(Ký và ghi rõ họ tên)

3. ii
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc
LỜI CAM ĐOAN
Tôi tên là Nguyễn Thị Thùy Tiên, sinh viên trường Đại học Kỹ thuật Công
nghệ Tp.Hồ Chí Minh, Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, lớp 08DSH2.
Tôi xin cam đoan tất cả các số liệu trích dẫn trong đồ án này là trung thực
được lấy từ quá trình nghiên cứu thực tế tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học,
Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam. Tự tôi đã thực hiện tất cả các nội
dung trong đồ án của mình mà không có sự sao chép đồ án nào khác dưới mọi hình
thức.
Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng Khoa Môi trường và Công
nghệ Sinh học, trước ban giám hiệu trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Tp.Hồ Chí
Minh về lời cam đoan của mình.
Tp.Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 07 năm 2012
Người viết
Nguyễn Thị Thùy Tiên

4. iii
LỜI CÁM ƠN
Để hoàn thành quá trình học đại học và được làm đồ án tốt nghiệp này, em xin
gửi lời cám ơn chân thành đến quý thầy cô trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ
Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là các thầy cô Khoa Môi trường và Công nghệ
Sinh học đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu về chuyên
ngành cũng như về cuộc sống trong suốt thời gian em học tập tại trường.
Em cũng gửi lời biết ơn sâu sắc đến Thạc sĩ Lê Thị Thu Hà và Thạc sĩ Phạm
Minh Nhựt đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được làm đồ án ở Viện Khoa học Kỹ
thuật Nông nghiệp miền Nam và tận tình hướng dẫn nghiên cứu, giúp đỡ, động viên
em trong suốt thời gian làm đồ án tại đây.
Ngoài ra, em cũng gửi lời cám ơn đến trại gà giống nơi em xuống lấy mẫu,
cùng các cô chú trên Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam và các anh
chị ở Phòng thí nghiệm (anh Nam, chị Hiền…) đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều
kiện tốt nhất cho em hoàn thành tốt đồ án này.
Không kém phần quan trọng, em xin gửi lời biết ơn đến gia đình những người
đã luôn chăm sóc động viên và là chỗ dựa vững chắc về tinh thần giúp em vượt qua
khó khăn. Và lời cám ơn đến tất cả những người bạn – tập thể lớp 08DSH2 đã giúp
đỡ tôi trong suốt 4 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin cám ơn thầy cô Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã dành
thời gian đọc và phản biện đề tài.
Xin chân thành cám ơn!
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2012

5. iv
MỤC LỤC
PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP.......................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... ii
LỜI CÁM ƠN ........................................................................................................... iii
MỤC LỤC................................................................................................................. iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ............................................................................... ix
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tìm hiểu chung về gà............................................................................................5
1.1.1 Sơ lược về nguồn gốc của gà........................................................................5
1.1.2 Tình hình chăn nuôi gà tại Việt Nam............................................................6
1.1.3 Một số giống gà địa phương.........................................................................7
1.1.3.1 Gà Ri ....................................................................................................7
1.1.3.2 Gà Đông Tảo........................................................................................7
1.1.3.3 Gà Hồ...................................................................................................8
1.1.3.4 Gà Mía .................................................................................................8
1.1.3.5 Gà Ác....................................................................................................8
1.1.3.6 Gà Tre ..................................................................................................8
1.1.3.7 Gà Nòi..................................................................................................9
1.1.3.8 Gà Tàu vàng.........................................................................................9
1.2 Gà Tàu vàng và các nghiên cứu trên gà Tàu vàng tại Việt Nam ........................11
1.2.1 Tìm hiểu chung về gà Tàu vàng..................................................................11
1.2.2 Các nghiên cứu trên gà Tàu vàng tại Việt Nam.........................................12
1.3 Các nghiên cứu gene PIT-1 trên gà.....................................................................13
1.4 Giới thiệu về DNA..............................................................................................15
1.4.1 Cấu trúc DNA .............................................................................................15
1.4.2 Phương pháp tách chiết DNA.....................................................................16

6. v
1.4.3 Định tính DNA bằng phương pháp điện di.................................................17
1.5 Phương pháp PCR...............................................................................................17
1.5.1 Nguyên tắc ..................................................................................................17
1.5.2 Phản ứng PCR............................................................................................18
1.5.3 Các yếu tố tham gia ảnh hưởng đến phản ứng PCR..................................20
1.5.3.1 Taq polymerase..................................................................................20
1.5.3.2 Mồi .....................................................................................................20
1.5.3.3 Các nucleotide....................................................................................21
1.5.3.4 Dung dịch đệm ...................................................................................21
1.5.3.5 DNA mẫu............................................................................................22
1.5.3.6 Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR ..................................................22
1.5.3.7 Nhiệt độ và pH ...................................................................................23
1.5.3.8 Ứng dụng của kỹ thuật PCR ..............................................................23
1.6 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật PCR-RFLP.........................................24
1.6.1 Kỹ thuật RFLP............................................................................................24
1.6.2 Kỹ thuật PCR – RFLP ................................................................................26
1.7 Enzyme cắt giới hạn............................................................................................26
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian và địa điểm..........................................................................................30
2.2 Nội dung nghiên cứu...........................................................................................30
2.3 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ..............................................................................30
2.3.1 Vật liệu........................................................................................................30
2.3.2 Hóa chất .....................................................................................................30
2.3.2.1 Hóa chất dùng trong ly trích DNA.....................................................30
2.3.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng khuếch đại DNA ..............................31
2.3.2.3 Hóa chất dùng trong phương pháp điện di........................................31
2.3.3 Dụng cụ.......................................................................................................31
2.4 Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................32
2.4.1 Thu thập mẫu..............................................................................................32

7. vi
2.4.2 Tách chiết DNA ..........................................................................................33
2.4.3 Định tính DNA bằng phương pháp điện di.................................................35
2.4.4 Ứng dụng phương pháp PCR – RFLP khảo sát đa hình gene PIT-1 .........37
2.3.4.1 Tiến hành phản ứng PCR...................................................................37
2.4.4.2 Kiểm tra sản phẩm PCR ....................................................................39
2.4.4.3 Tiến hành cắt sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn...................40
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Thu thập và bảo quản mẫu ..................................................................................42
3.2 Hiệu quả tách chiết DNA....................................................................................42
3.3 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR .........................................................................43
3.3.1 Kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2...................................................43
3.3.2 Kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4...................................................45
3.4 Cắt sản phẩm PCR bằng RE ...............................................................................46
3.4.1 Sản phẩm PCR gene PIT-1.2 được cắt bằng enzyme TaqI ........................46
3.4.2 Sản phẩm PCR gene PIT-1.4 được cắt bằng enzyme EcoRI......................48
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 Kết luận ...............................................................................................................53
4.2 Kiến nghị.............................................................................................................53
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................54

8. vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
­ bp: base pair
­ cDNA: complementary Desoxyribose Nucleic Acid
­ ctv: cộng tác viên
­ DNA: Desoxyribose Nucleic Acid
­ dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate
­ EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid
­ GH: Growth Hormone
­ GHF-1: Growth Hormone Facetor -1
­ MAS: Marker Assisted Selection
­ MR: Maker
­ mRNA: messenger Riconucleic Acid
­ PCR: Polymerase Chain Reaction
­ PIT-1: Pituitary specific transcription factor 1
­ PTN: Phòng Thí Nghiệm
­ PRL: Prolactin
­ QTL: Quantative Trait Locus
­ RAPD: Random Amplified Polymorphic Desoxyribose Nucleic Acid
­ RE: restriction enzyme
­ RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
­ SDS: Sodium Sodecyl Sulphate
­ SNP: Single nucleotide polymorphism
­ SSR: Single Sequence Repeat
­ TBE: Tris-Boric acid-EDTA
­ Tm: melting temperature
­ TSH- β: Thyroid Stimulating Hormone - β
­ UV: Ultraviolet

9. viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần bộ Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps....... 30
Bảng 2.2: Trình tự đoạn mồi PIT-1.2 và PIT-1.4..................................................... 37
Bảng 2.3: Thành phần hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR................................... 38
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR .......................................................... 38
Bảng 2.5: Thành phần hóa chất trong phản ứng cắt bằng RE.................................. 40
Bảng 3.1: Tỷ lệ tách chiết DNA tổng số .................................................................. 43
Bảng 3.2: Tỷ lệ kiểu gene và tần số gene PIT-1.2.................................................... 47
Bảng 3.3: Tỷ lệ kiểu gene và tần số gene PIT-1.4 .................................................. 50
Bảng 3.4: Tổng hợp kiểu gene và tần số gene PIT-1 ............................................... 51

10. ix
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Một số giống gà địa phương được nuôi ở Việt Nam ............................... 10
Hình 1.2: Gà Tàu vàng............................................................................................. 11
Hình 1.3: Quy trình khuếch đại DNA ...................................................................... 19
Hình 1.4: Nguyên tắc của kỹ thuật RFLP ............................................................... 25
Hình 2.1: Mẫu máu gà Tàu vàng sau khi lấy về PTN.............................................. 33
Hình 2.2: Bộ kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps ........................... 34
Hình 2.3: Bộ điện di ................................................................................................. 36
Hình 2.4: Máy chạy PCR ......................................................................................... 39
Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số..................................................... 42
Hình 3.2: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2 ................................... 44
Hình 3.3: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4 ................................... 45
Hình 3.4: Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt bằng enzyme TaqI ................................. 46
Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kiểu gene của gene PIT-1.2 .................................. 47
Hình 3.6: Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt bằng enzyme EcoRI ............................... 49
Hình 3.7: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kiểu gene của gene PIT-1.4 ................................. 50

11. Đồ án tốt nghiệp
 1 
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Trong vài chục năm trở lại đây, ngành chăn nuôi gia cầm trên thế giới đã đạt
được nhiều thành tựu to lớn. Sản phẩm trứng và thịt gia cầm không ngừng tăng lên.
Có được thành tựu đó là do việc ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật về di truyền giống,
dinh dưỡng, công nghệ sinh học, các thành tựu về cơ giới hóa, điện khí hóa trong
chăn nuôi gia cầm nhất là chăn nuôi gia cầm công nghiệp. Mặt khác, xuất phát từ
việc hiểu biết sâu sắc và khai thác triệt để các đặc điểm sinh học vốn có của gia cầm
đã đưa lại hiệu quả cao trong chăn nuôi.
Trong ngành nông nghiệp nước ta, chăn nuôi gà chiếm 72 – 73 % tổng đàn
gia cầm hàng năm. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã xây dựng chiến
lược phát triển chăn nuôi gia cầm Việt Nam giai đoạn 2006 – 2015. Theo đó, ngành
chăn nuôi phải phấn đấu đến năm 2015 tăng tỷ trọng thịt gia cầm lên 32 % tổng sản
lượng thịt các loại, trong đó sản lượng thịt gà phải đạt 88 % tổng đàn gia cầm – đạt
350 triệu con, khối lượng thịt 1.992.000 tấn, sản lượng trứng 9.236 tỷ quả. (Trích
dẫn: Tình hình chăn nuôi gà giai đoạn 2001 – 2005 và phương hướng phát triển
giai đoạn 2006 – 2015. Cục chăn nuôi)
Hiện nay chăn nuôi gà Tàu vàng để lấy thịt và trứng là một nghề rất phổ biến
và được phân bố nhiều ở các tỉnh thành trong cả nước. Do chất lượng thịt thơm
ngon, gà có sức sống tốt, khả năng thích nghi cao, chống chịu bệnh tốt. Công tác
giống đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả của ngành chăn nuôi,
chính vì vậy chọn lọc và lai tạo các giống vật nuôi luôn được các nhà khoa học
quan tâm. Ngày nay với sự phát triển của các kỹ thuật hiện đại trong sinh học, đã
hình thành xu hướng nghiên cứu chọn lọc giống vật nuôi dựa vào các chỉ thị DNA.
Chọn lọc giống vật nuôi dựa vào các chỉ thị DNA, sẽ rút ngắn thời gian, tăng khả
năng chính xác và hiệu quả hơn đối với các tính trạng kinh tế ở vật nuôi. Việc kiểm
soát di truyền của tính trạng sẽ giúp cải thiện năng suất và sinh lý ở gà (Li và ctv,
1990).

12. Đồ án tốt nghiệp
 2 
Gene PIT-1 (Pituitary specific transcription factor 1) – yếu tố phiên mã đặc
hiệu ở tuyến yên là một gene trong họ gene mã hoá cho các protein đóng vai trò
quan trọng trong quá trình phát triển của cơ thể. PIT-1 đóng vai trò như một gene
điều hòa các hormone sinh trưởng như GH, prolactin và gene hormone tuyến giáp
TSH-β. Do vậy, PIT-1 đã được khuyến cáo như 1 gene ứng viên cho tính trạng sản
xuất (Bodner và ctv, 1988; Li và ctv, 1990; Cohen và ctv, 1996; Miyai và ctv,
2005). Đa hình gene PIT -1 có liên quan đáng kể đến khả năng tăng trưởng cơ thể
và những đặc điểm thành phần thân thịt ở gà.
Hiện nay, với nhu cầu thực tế ngày càng cao về các sản phẩm thịt gà sạch thì
việc làm sao để chọn lọc tạo giống gà Tàu vàng có năng suất cao, cải thiện khả năng
tăng trọng mà vẫn giữ được đặc điểm quý của gà Tàu vàng là vấn đề thực sự đáng
quan tâm của các nhà khoa học. Một trong số giải pháp đó là việc khai thác các
gene quy định năng suất tăng trọng và đưa ra hướng chọn lọc tạo giống gà thương
phẩm có năng suất tốt là hết sức cấp bách hiện nay. Xuất phát từ thực tế trên, được
sự cho phép của Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, trường Đại học Khoa
học Kỹ thuật Công nghệ Tp.Hồ Chí Minh với sự hướng dẫn trực tiếp của Th.S Lê
Thị Thu Hà chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Khảo sát tần số gene PIT-1 (Pituitary
specific transcription factor 1) trên đàn gà Tàu vàng nuôi tại một Trung Tâm
Giống Vật Nuôi”.
2. Tình hình nghiên cứu
 Các nghiên cứu về gà Tàu vàng: Nguyễn Văn Bắc và ctv (2005) đã nghiên
cứu về khả năng sinh trưởng và sinh sản của gà Tàu vàng Việt Nam; Trần Văn Tịnh
và ctv (2011) đã nghiên cứu chọn lọc và nhân thuần nâng cao năng suất gà Tàu
vàng; nhóm tác giả Trần Xuân Hoàn và Phạm Doãn Lân (2000) đã nghiên cứu phân
tích gene hormone sinh trưởng ở gà Ri bằng kỹ thuật PCR – RFLP. Trên đà gà Tàu
vàng cho đến nay chưa thấy kết quả nghiên cứu nào dựa vào chỉ thị gene được công
bố.
 Các nghiên cứu về gene PIT-1 trên gà: kết quả của Nie và ctv (2008) cho
rằng đa hình gene PIT-1 (MR1 – MR5) trong quần thể gà có tác động đến tính trạng

13. Đồ án tốt nghiệp
 3 
tăng trưởng, thành phần thân thịt và không có tác động đến đặc điểm béo ở gà. Theo
Rodbari và ctv (2011) cho thấy đa hình gene PIT-1 nhờ vào gene đánh dấu có ý
nghĩa đáng kể với sự tăng trưởng cơ thể và thành phần thân thịt ở gà thương phẩm
tại Iran. Jiang và ctv (2004) báo cáo rằng các đột biến A980T của cDNA gen PIT-1
ở gà tương quan đáng kể với khối lượng cơ thể ở 8 tuần. Nie và ctv (2005) đã phát
hiện 23 SNP trong gen Pit-1 ở gà bằng kỹ thuật HPLC, có 3 trong khu vực 3' UTR
có 16 ở trong vùng intron, và có 57 bp indel (đoạn khuyết/điểm gắn) trong intron 2.
57 bp indel trong intron 2 bị ảnh hưởng đáng kể bởi trọng lượng cơ thể, trọng
lượng cơ ngực và trọng lượng cơ bắp chân ở gà 1 – 8 tuần tuổi (Qiu và ctv, 2006).
Chưa có nghiên cứu chính thức nào về ảnh hưởng của gene PIT-1 trên gà
Tàu vàng tại Việt Nam.
3. Mục đích nghiên cứu
Xác định tần số gene PIT-1 trên đàn gà Tàu vàng nuôi tại một Trung Tâm
Giống Vật Nuôi.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
 Lấy mẫu máu gà Tàu vàng tại Trung Tâm Giống Vật Nuôi.
 Tách chiết DNA từ mẫu máu.
 Xác định tần số gene PIT-1 bằng kỹ thuật PCR – RFLP.
5. Phương pháp nghiên cứu
 Sử dụng bộ Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps để tách chiết
DNA.
 Xác định gene PIT-1 bằng phản ứng PCR với bộ Kit Green Master Mix, 2X.
 Xác định tần số gene bằng kỹ thuật PCR – RFLP (sử dụng RE).
6. Các kết quả đạt được của đề tài
 Tách chiết DNA khi sử dụng bộ Kit EZ-10 Spin Column cho kết quả thành
công cao đạt 95,12 %.

14. Đồ án tốt nghiệp
 4 
 Phản ứng PCR khi sử dụng bộ Kit Green Master Mix, 2X với mồi PIT-1.2
(599 bp) và mồi PIT-1.4 (442 bp) cho kết quả thành công 100 %.
 Phản ứng cắt của gene PIT-1.2 với enzyme TaqI cho 3 kiểu gene: AA chiếm
12,5 %, kiểu gene BB chiếm 12,5 %, kiểu gene AB chiếm tỷ lệ cao nhất 75 %. Tần
số gene A (0,5), tần số gene B (0,5).
 Phản ứng cắt của gene PIT-1.4 với enzyme EcoRI cho 3 kiểu gene: AA
chiếm 30,77 %, kiểu gene BB chiếm 12,82 %, kiểu gene AB chiếm tỷ lệ cao nhất
56,41 %. Tần số gene A (0,6), tần số gene B (0,4).
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Chương I. Tổng quan tài liệu
Chương II. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Chương III. Kết quả và thảo luận
Chương IV. Kết luận và kiến nghị

15. Đồ án tốt nghiệp
 5 
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tìm hiểu chung về gà
1.1.1 Sơ lược về nguồn gốc của gà
Để có bằng chứng chính xác về tổ tiên sống hoang dã của gia cầm, các nhà
khoa học đã nghiên cứu những dạng động vật hoang hiện nay còn đang sống có
quan hệ họ hàng với chúng. Hầu hết các nhà nghiên cứu về gia cầm của thế giới đều
cho rằng gà hoang miền Bắc Ấn Độ hay gà Banquiva (Gallus gallus murghi) một
trong bốn loại hình của gà rừng là được thuần hóa đầu tiên.
Nguồn gốc của gà rừng Bắc Ấn Độ phân bố từ thượng nguồn sông Ấn tới
miền Nam Gođovani, từ Đông đến Đông Nam dãy núi Hymalaya. Gà Banquiva
thường đẻ 10 – 12 trứng trong tổ bằng cỏ khô và lá cây. Sau 20 – 21 ngày ấp thì
trứng nở. Lúc trưởng thành khối lượng cơ thể gà mái đạt 0,7 kg, gà trống đạt 1 – 1,1
kg. Gà trống có bộ lông sặc sỡ nhiều màu: lông cổ có màu vàng da cam đến vàng,
lông thân màu đỏ nâu và lông cánh ánh đen, lông bụng pha lẫn màu đen. Gà mái có
bộ lông từ vàng nhạt, vàng trắng đến hoa mơ. Màu sắc mỏ, chân cũng không đồng
nhất: vàng đậm, vàng nhạt và đen. Sự thuần hóa đầu tiên của gà nhà vào thời kỳ đồ
đồng. Vị trí của gà nhà trong hệ thống động vật được sắp xếp theo sự phát sinh và
nguồn gốc của chúng (Lê Hồng Mận – Nguyễn Thanh Sơn, 2001).
Gà nhà (Gallus gallus domesticus) là loài vật nuôi có từ hàng ngàn năm
trước với bằng chứng khảo cổ học cho thấy gà đã tồn tại ở Trung Quốc cách đây
8.000 năm (FAO, 2004). Gà nuôi được thuần hóa từ gà rừng nhiệt đới thuộc Châu
Á, trải qua quá trình thuần hóa, chọn lọc (tự nhiên và nhân tạo) đã hình thành nên
các dòng, giống khác nhau theo hướng thịt, trứng và kiêm dụng. Trong hệ thống
phân loại sinh giới, gà nhà có vị trí phân loại như sau:
 Giới: Ðộng vật (Animalia)
 Ngành: Ðộng vật có xương sống (Chordata)
 Lớp: Chim (Aves)

16. Đồ án tốt nghiệp
 6 
 Bộ: Gà (Galiformes)
 Họ: Trĩ (Phasianidae)
 Giống: Gallus
 Loài: Gallus gallus
 Phân loài: Gallus gallus domesticus
1.1.2 Tình hình chăn nuôi gà tại Việt Nam
Theo số liệu thống kê, năm 2010 số lượng gia cầm đạt hơn 300 triệu con, sản
lượng thịt đạt 615 nghìn tấn. Tổng sản phẩm chăn nuôi trong nước đạt 4.006 nghìn
tấn thịt, 306 nghìn tấn sữa tươi và 5,87 tỷ quả trứng (Báo cáo Hội nghị phát triển
Chăn Nuôi – Thú Y, 2011). Theo chủ trương của Nhà nước về phát triển chăn nuôi,
trong đó chăn nuôi gia cầm nói chung phấn đấu tăng tỷ trọng thịt gia cầm lên 32 %
trong năm 2015 so với tổng sản lượng thịt các loại (năm 2003 là 16 – 17 %), tăng
sản lượng thịt gà nói riêng lên 88 % năm 2015 (năm 2010 là 82 %). Dự kiến giai
đoạn 2011 – 2015, tốc độ tăng đàn là 8,5 % trên 1 năm, sản lượng thịt tăng 10,9 %.
Đến năm 2015 số lượng gà dự kiến đạt 350 triệu con; sản lượng thịt đạt 1.992 nghìn
tấn; sản lượng trứng 9.236 triệu quả. Để đạt được mục tiêu đó cần phải có những
giải pháp thực hiện, một trong số các giải pháp là nhập nội các giống gà ngoại cùng
với việc phát triển, bảo tồn các giống gà địa phương.
Vật nuôi bản địa nói chung và gia cầm nói riêng ngày càng được quan tâm
bởi khả năng thích nghi, chịu đựng được với khí hậu khắc nghiệt và chất lượng thịt
thơm ngon. Ngoài ra, gà địa phương còn là nguồn nguyên liệu cho bảo tồn, đa dạng
nguồn gene và là giống nền để lai tạo với gà cao sản cải thiện năng suất gà địa
phương. Mặt khác, chất lượng thịt gà địa phương được nhiều người tiêu dùng ưa
thích hơn thịt gà công nghiệp, đặc biệt là người Châu Á bởi thịt hơi dai, có mùi vị
thơm ngon. Ngoài ra, hàm lượng chất béo thấp, protein cao, hàm lượng collagen
tổng số của cơ đùi và cơ ngực cao (Wattanachant và ctv, 2004; Promwatee và
Duangjinda, 2010). Nhược điểm của giống gà bản địa là khả năng sinh sản thấp,
sinh trưởng chậm và chi phí thức ăn rất cao đã làm giảm hiệu quả kinh tế và từ đó

17. Đồ án tốt nghiệp
 7 
cản trở đến việc phát triển chăn nuôi các giống gà bản địa ở quy mô trang trại. Điều
này đồng nghĩa với việc thoái hóa và biến mất của nhiều nguồn gene gà bản địa quý
hiếm đã được cảnh báo từ rất lâu.
Cùng với sự tiến bộ của sinh học phân tử, phương pháp chọn lọc dựa trên chỉ
thị phân tử hay chọn lọc giống dựa vào dấu chuẩn (MAS) hiện nay rất dễ dàng, kinh
tế hơn và hiệu quả hơn cho các tính trạng tăng năng suất, tính trạng tăng chất
lượng… của vật nuôi nói chung và của gà nói riêng. Vì di truyền số lượng không
thể phân tích được các kiểu gene đơn lẻ. Hay nói cách khác, gen đánh dấu liên kết
với QTL (Quantative Trait Locus) – điều khiển nhiều đặc điểm kinh tế quan trọng
như tăng trưởng, sản xuất trứng… cho phép chọn lọc trực tiếp trên các kiểu gene
(Lamont và ctv, 1996). Sử dụng kỹ thuật gene đánh dấu giúp cải thiện các đặc điểm
sản xuất, chất lượng. Do đó việc kiểm soát di truyền các tính trạng quan trọng sẽ
giúp cải thiện năng suất và sinh lý ở gà (Li và ctv, 1990).
1.1.3 Một số giống gà địa phương
1.1.3.1 Gà Ri
Phân bố rộng trên toàn miền đất nước nhưng đã bị pha tạp nhiều. Gà mái
lông có màu vàng, nâu, nâu nhạt, đen hoặc lốm đốm hoa mơ. Gà trống lông có màu
tía hoặc vàng, có nơi pha lông đen như ở vùng Sơn Tây, Ninh Bình. Gà Ri đa số có
mào đơn, da chân vàng, thịt vàng. Khối lượng 1 năm tuổi của con trống đạt 1,8 –
2,5 kg; con mái đạt 1,3 – 1,8 kg. Sản lượng trứng 90 – 110 quả/năm, khối lượng
trứng trung bình 42 – 43 gam. Thịt và trứng của gà Ri thơm ngon, tỷ lệ lòng đỏ cao
(33,8 %), gà có đặc tính nuôi con khéo nhưng tầm vóc nhỏ, trứng bé, sản lượng
trứng thấp.
1.1.3.2 Gà Đông Tảo
Gà này có xuất xứ từ thôn Đông Tảo, Khoái Châu, Hưng Yên. Gà mái lông
có màu nâu bạc. Gà trống lông có màu tía. Đặc điểm: đầu to, mào nụ, mắt sâu, chân
to xù xì có nhiều hàng vảy, xương to, nhiều thịt nhưng thịt không mịn, da đỏ, tiếng
gáy đục và ngắn. Gà trống trưởng thành nặng 3,5 – 4 kg, gà mái trưởng thành nặng

18. Đồ án tốt nghiệp
 8 
2,5 – 3 kg. Sản lượng trứng đạt 55 – 60 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 55 –
57 gam. Gà Đông Tảo có ưu điểm: tầm vóc lớn, khối lượng trứng to; nhược điểm:
xương to, đẻ ít, mọc lông muộn.
1.1.3.3 Gà Hồ
Gà có xuất xứ từ làng Hồ, Bắc Ninh. Gà mái lông có màu trắng sữa, màu vỏ
nhãn hay màu đất thô. Gà trống lông có màu tía, đầu cổ to, da đỏ. Đặc điểm: chân
hai hàng vảy, mào đơn. Gà trống trưởng thành nặng 3,5 – 4 kg, gà mái trưởng thành
nặng 2,5 – 3 kg. Sản lượng trứng đạt 50 – 55 quả/năm, khối lượng trứng trung bình
55 – 58 gam.
1.1.3.4 Gà Mía
Gà này có xuất xứ ở huyện Tùng Thiện, xã Phùng Hưng, Hà Tây. Gà mái
lông có màu nâu xám hoặc vàng. Gà trống lông có màu tía. Đặc điểm: đầu to, mắt
sâu, mào đơn, chân thô có 3 hàng vảy, da ở bụng có màu đỏ. Khối lượng gà trống
trưởng thành đạt 3,5 – 4 kg, gà mái trưởng thành đạt 2,5 – 3 kg. Sản lượng trứng 50
– 55 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 50 – 55 gam.
1.1.3.5 Gà Ác
Gà Ác được nuôi nhiều ở các tỉnh miền Tây Nam Bộ như: Trà Vinh, Long
An, Tiền Giang… Đặc điểm: gà có lông màu trắng xù như bông, tầm vóc nhỏ bé,
da, thịt, xương, mỏ, chân đều màu đen, mào có màu đỏ bầm, chân có hoặc không có
lông và có 5 ngón nên còn được gọi là “ngũ trảo”. Sản lượng trứng đạt 70 – 80
quả/năm, khối lượng trứng trung bình 30 – 32 gam. Đây là loại gà thuốc, bổ dưỡng
sức khỏe cho tất cả mọi người. Tỷ lệ sắt (Fe) trong thịt gà Ác cao hơn gà bình
thường 45 %, tỷ lệ acid amin cao hơn 25 %.
1.1.3.6 Gà Tre
Gà mái lông có màu xám xen lẫn màu trắng. Gà trống lông có màu vàng ở cổ
và đuôi, phần còn lại màu đen, lông dài. Đặc điểm: tầm vóc nhỏ, thịt thơm ngon,
đầu nhỏ, mào hạt đậu. Giai đoạn 6 tháng tuổi: gà trống nặng 0,8 – 0,85 kg; gà mái

19. Đồ án tốt nghiệp
 9 
nặng 0,6 – 0,62 kg. Sản lượng trứng đạt 50 – 60 quả/năm, khối lượng trứng trung
bình 21 – 22 gam. Ngoài công dụng cung cấp thịt và trứng thì gà Tre còn có thể làm
cảnh và thi chọi.
1.1.3.7 Gà Nòi
Gà Nói còn được gọi là gà Chọi. Số lượng gà này không nhiều, rải rác ở
nhiều nơi, thường nuôi để thi chọi gà. Đặc điểm: gà có màu lông đen xám, pha lẫn
màu vàng tươi, lông đuôi đen, đầu to, mỏ màu đen, mào hạt đậu, mắt đen có vòng
đỏ, cổ dài và to, thân dài rộng, lưng ngang phẳng, chân cao có vảy đen xám, cựa sắc
và dài. Giai đoạn 1 năm tuổi con trống nặng 2,5 – 3 kg, con mái nặng 1,8 – 1,9 kg.
Sản lượng trứng đạt 50 – 60 quả/năm, khối lượng trứng trung bình 45 – 50 gam.
1.1.3.8 Gà Tàu vàng
Phổ biến chủ yếu ở miền Nam, bị pha tạp nhiều. Đặc điểm: mào đơn hoặc
hạt đậu, lông vàng, chân có lông ở bàn chân, có khi ở cả ngón chân. Gà trống
trưởng thành nặng 3 kg, gà mái trưởng thành nặng 2 kg. Sản lượng trứng 70 – 90
quả/năm, khối lượng trứng trung bình 45 – 50 gam.
(Trích dẫn: Hội chăn nuôi Việt Nam, 2002. Chăn nuôi gà thả vườn và gà Tây. Nhà
xuất bản Nông Nghiệp).

20. Đồ án tốt nghiệp
 10 
Hình 1.1: Một số giống gà địa phương được nuôi ở Việt Nam. A: Gà Ri; B: Gà
Đông Tảo; C: Gà Hồ; D: Gà Mía; E: Gà Ác; F: Gà Tre; G: Gà Nòi; H: Gà Tàu
vàng (Nguồn: http://agriviet.com/home/threads/40829-cac-giong-ga-tren-the-
gioi#axzz21t2NH4Lj).

21. Đồ án tốt nghiệp
 11 
1.2 Gà Tàu vàng và các nghiên cứu trên gà Tàu vàng tại Việt Nam
1.2.1 Tìm hiểu chung về gà Tàu vàng
Gà Tàu vàng có ngoại hình khá đẹp, lông màu vàng đến vàng rơm, vàng sẫm,
cổ có cườm đen từ ít đến nhiều, có đốm đen ở cánh và đuôi. Chân màu vàng, da
màu vàng và thịt màu trắng. Mào gà Tàu vàng phần lớn là mào đơn và một số ít con
có mào nụ. Ngoài ra, một số con còn xuất hiện lông ở chân và ngón chân. Gà rất
nhanh nhẹn và ưa thích tìm kiếm mồi trong vườn. Gà Tàu vàng có trọng lượng vừa
phải thường vào giai đoạn 6 tuần tuổi gà trống có khối lượng 2 kg, gà mái có khối
lượng 1,4 kg. Gà Tàu vàng có khả năng sinh sản kém, nếu nuôi tập trung và áp dụng
kỹ thuật cai ấp thì tỷ lệ đẻ bình quân toàn đàn đạt 25 – 30 %. Nếu không áp dụng kỹ
thuật cai ấp thì tỷ lệ đẻ bình quân toàn đàn nhiều khi đạt dưới 20 %. Đặc thù của
giống gà Tàu vàng là đẻ sớm (khoảng 20 tuần tuổi), ham ấp và khéo nuôi con. Gà
mái bắt đầu đẻ lúc 17 – 20 tuần tuổi, năng suất trứng đạt từ 90 – 120 quả. Trọng
lượng trứng bình quân chỉ đạt 42 – 45 gam. Trong môi trường chăn thả và ấp tự
nhiên thì tỷ lệ nở thành công đạt từ 90 – 95 %. Còn khi nuôi nhốt và ấp máy theo lối
công nghiệp thì tỷ lệ nở thành công chỉ đạt 73 – 77 % (Át lát vật nuôi, 2004).
Hình 1.2: Gà Tàu vàng (Nguồn: http://iasvn.org/chuyen-muc-in-bai-viet/605.html)
Gà Tàu vàng được nuôi nhiều ở các tỉnh miền Đông và Tây Nam Bộ như Bà
Rịa Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Tây Ninh, Long An, Tiền Giang… số lượng
gà được nuôi nhiều nhất phải kể đến Long An, Tiền Giang, còn tại Tp.Hồ Chí Minh

22. Đồ án tốt nghiệp
 12 
gà được nuôi rải rác ở các huyện ngoại thành như Củ Chi, Hóc Môn. Gà Tàu vàng
là một trong số những giống gia cầm được ưa chuộng nhất trong chăn nuôi hộ gia
đình hay công nghiệp do chất lượng thịt thơm ngon, có sức sống tốt, khả năng thích
nghi cao, chống chịu bệnh tật tốt hơn gà công nghiệp. Tuy nhiên năng suất của
giống gà này tương đối thấp, khả năng tăng trưởng chậm. Trong những năm gần
đây, nhiều giống gà mới (Tam Hoàng, Lương Phượng, Sasso…) đã được du nhập
rất nhanh vào chăn nuôi gà thả vườn ở Nam Bộ. Tuy vậy giống gà Tàu vàng vẫn
được nuôi giữ trong nhiều hộ dân, một phần là do đặc tính sinh học quý báu của
giống gà này, một phần là do thị hiếu của người tiêu dùng ngày càng cao – người
tiêu dùng rất ưa chuộng và chấp nhận mua giá cao hơn các loại gà địa phương khác.
Gà Tàu vàng mái dầu thường có giá cao gấp hai lần gà Lương Phượng. Tập quán
nuôi và bán gà mái dầu, gà trống thiến vẫn còn tồn tại ở các tỉnh Nam bộ. Có thể
nói đây là đặc sản của vùng đất Nam bộ còn giữ được trong quá trình công nghiệp
hoá hiện nay, những món ăn đặc sản không thể thiếu khi bảo tồn văn hoá của mỗi
vùng đất (Đinh Công Tiến và Nguyễn Quốc Đạt, 2005).
1.2.2 Các nghiên cứu trên gà Tàu vàng tại Việt Nam
Kết quả nghiên cứu của Lâm Minh Thuận và ctv (2003) cho thấy tỷ lệ đẻ từ
25 tuần tuổi đến 52 tuần tuổi là khá cao đạt 41 – 62 %; về khả năng sinh trưởng thì
khối lượng con trống đạt từ 1,47 – 1,58 kg và con mái từ 1,17 – 1,33 kg lúc 12 tuần
tuổi. Khảo sát khả năng sản xuất thịt gà tại Bà Rịa Vũng Tàu khối lượng con trống
và con mái 12 tuần tuổi tương ứng là 1,95 – 2,04 kg và 1,49 – 1,6 kg, kết quả này
khá cách biệt với chính kết quả của tác giả nêu trên. Theo tác giả thì sự khác biệt
này là do quy mô nghiên cứu trên gà Tàu vàng nhỏ, kinh phí thấp chưa đáp ứng tốt
cho chương trình giống.
Trong nghiên cứu về gà Tàu vàng Nam Bộ của Nguyễn Văn Bắc và ctv
(2005) cho thấy khả năng sinh sản của gà khi nuôi nhốt thì năng suất trứng ở 40
tuần tuổi đạt 73,25 trứng/mái, nuôi gà chăn thả trong hộ dân thì năng suất trứng
năm đầu đạt 125 trứng/mái/năm, năm thứ 2 là 95 trứng/mái/năm. Gà Tàu vàng nuôi

23. Đồ án tốt nghiệp
 13 
lấy thịt theo phương thức nuôi nhốt ở giai đoạn 16 tuần tuổi khối lượng con trống
đạt 2 kg và khối lượng con mái đạt 1,4 kg, tỷ lệ sống sót của gà đạt 92,5 % và tiêu
tốn 3,79 kg thức ăn/mái. Nếu nuôi theo quy trình giống thì ở giai đoạn 19 tuần tuổi
khối lượng con trống đạt 1,94 kg, khối lượng con mái đạt 1,47 kg; tỷ lệ sống sót của
gà đạt 91 % và tiêu tốn 10,07 kg thức ăn/mái.
Kết quả nghiên cứu của Trần Văn Tịnh và ctv (2011), bước đầu đã chọn lọc
và lai tạo ra được quần thể gà Tàu vàng khá đồng nhất (trên 80 % quần thể lúc 1
ngày tuổi có màu lông vàng). Kết quả vào 14 tuần tuổi con trống có khối lượng 2,1
kg, con mái có khối lượng 1,4 kg; tỷ lệ sống sót của gà đạt 95,56 % và tiêu tốn 3,66
– 3,95 kg thức ăn/mái. Năng suất trứng thế hệ xuất phát (gà giống) là 94
trứng/mái/năm, các thế hệ tiếp theo đạt 100 – 110 trứng/mái/năm tăng 6 – 17 %.
Khối lượng trứng trung bình là 46 gam vào giai đoạn 40 tuần tuổi. Tuy nhiên, quần
thể chọn lọc còn nhỏ, vẫn còn phân ly, chưa tạo được dòng trống, dòng mái riêng
để khai thác tối đa tiềm năng giống (sinh trưởng, sinh sản).
1.3 Các nghiên cứu gene PIT-1 trên gà
POU (Pit-Oct-UNC) là một loại yếu tố phiên mã vùng có chứa hai vùng
được bảo tồn: một vùng đặc hiệu-POU và một vùng cân bằng-POU, yếu tố phiên
mã đặc hiệu ở tuyến yên (PIT-1, hoặc GHF-1, hoặc POU1F1) đã được chứng minh
để liên kết và mã hóa gene khởi động cho hormone tăng trưởng (GH), prolactin
(PRL) và hormone kích thích tuyến giáp-β (TSH-β) (Bodner và ctv, 1988; Cohen và
ctv, 1996; Miyai và ctv, 2005). Hoạt động sinh học khác của gene PIT-1 cũng đã
được báo cáo, như điều hòa sự phát triển của thùy trước tuyến yên và tăng sinh tế
bào tuyến yên, làm bất hoạt hoặc trì hoãn adrenarche (tuyến thượng thận) ở người,
liên quan đến kiểu hình lùn ở chuột , cũng như gây ra sự khác biệt giữa các tế bào
tiền thân gan và các tế bào sản xuất PRL (Li và ctv, 1990; Taha và ctv, 2005; Lee
và ctv, 2005). Gene PIT-1 ban đầu kích hoạt dưới sự kiểm soát của Phophet (PROP-
1), gene PIT-1 tự động quy định trong mRNA của nó và hiện diện trong bất kỳ loại
tế bào nào của tuyến yên, trong khi protein PIT-1 chủ yếu hiện diện trong

24. Đồ án tốt nghiệp
 14 
lactotrophs, somatotrophs và thyrotrophs, nơi tiết PRL, GH và TSH-β (Simmos DM
và ctv, 1990).
Cho đến nay, cDNA PIT-1 đã được xác định trong một loạt các loài và các
nghiên cứu trước đây cho thấy rằng gene PIT-1 bao gồm 6 exon trong động vật có
vú và 7 exon trong các loài chim và các loài cá, xem như là sự khác biệt trong chiều
dài tiền thân. cDNA của gene PIT-1 trên gà lần đầu tiên được phân lập và giải trình
tự bởi Tanaka và ctv (1999) và ba đồng dạng là PIT-1, PIT-1β và PIT-1ω được gây
ra bởi thay thế ghép nối cũng đã được phân lập và được tìm thấy bao gồm 335, 363,
và 327 acid amin tương ứng (Van và ctv, 2000). Thay thế ghép nối gene PIT-1 đã
được báo cáo ở các loài khác.Theo trình tự hệ gene gà phát hành tháng 5 năm 2006
(http:/ /mgc.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway), gene PIT-1 gà nằm ở nhiễm sắc thể số 1
(GGA1) và kéo dài hơn 14 kb (Nie và ctv, 2008).
 Một vài nghiên cứu gene PIT-1 trên gà:
 Kết quả nghiên cứu của Zahra Rodbari và ctv (2011) cho biết: các kiểu
gene và tần số gene ở locus gene PIT-1 cắt bằng enzyme TaqI cho kết quả kiểu gene
AA (0,61); kiểu gene AB (0,32); kiểu gene BB (0,07). Tần số gene A (0,77), tần số
gene B (0,23). Alen A xuất hiện thường xuyên hơn so với alen B và kiểu gene AA
cũng xuất hiện nhiều hơn các kiểu gene khác trong quần thể. Kiểm tra Chi-square
(P < 0,05) và được tính dựa theo định luật cân bằng Hardy-Weinberg. Kiểu gene ở
locus gene PIT-1 cắt bằng enzyme TaqI có mối liên quan đáng kể với trọng lượng
cơ thể, trọng lượng cơ ức, trọng lượng cánh (P  0,1). Không kiểu gene nào trong
đa hình gene PIT-1 có liên quan đáng kể đến đặc điểm béo ở gà.
 Kết quả nghiên cứu của Nie và ctv (2008) cho biết: 5 đa hình của gene
PIT-1 trong quần thể gà có liên quan đến tốc độ tăng trưởng của gà. Cụ thể MR1
(nằm ở vùng intron 2 – kích thước 387 hoặc 330 bp) có liên quan đáng kể đến
đường kính chân, trọng lượng trứng mới nở, chiều dài chân gà ở 84 ngày tuổi (P <
0,01); MR2 (nằm ở vùng intron 5 – kích thước 599 bp – được cắt bằng enzyme cắt
TaqI) có liên quan đáng kể với trọng lượng cơ thể ở 42 ngày tuổi và tăng khối
lượng trung bình hàng ngày ở giai đoạn 0 – 4 tuần tuổi (P < 0,05); MR3 (nằm ở

25. Đồ án tốt nghiệp
 15 
vùng intron 5 – kích thước 599 bp – được cắt bằng enzyme cắt MspI) có liên quan
đáng kể đến tăng khả năng tăng khối lượng trung bình hàng ngày ở giai đoạn 4 – 8
tuần tuổi (P < 0,05); MR4 (nằm ở vùng intron 5 – kích thước 442 bp – được cắt bởi
enzyme EcoRI) có liên quan đến chiều dài chân, đường kính chân ở 77 ngày tuổi,
trọng lượng cơ thể ở 84 ngày tuổi (P < 0,01); MR 5 (nằm ở vùng exon 6 – kích
thước 483 bp – được cắt bằng enzyme cắt TasI) có liên quan đáng kể với trọng
lượng cơ thể ở 35 ngày tuổi, đường kính chân ở 77 ngày tuổi và tăng khối lượng
trung bình hàng ngày ở giai đoạn 0 – 4 tuần tuổi. Không có sự liên quan đáng kể
của các SNP và kiểu gene với các tính trạng béo ở gà.
1.4 Giới thiệu về DNA (Desoxyribose Nucleic Acid)
1.4.1 Cấu trúc DNA
DNA là polymer của những nucleotide và là vật chất mang thông tin di
truyền của các hệ thống sống. Những nucleotide được nối với nhau bằng liên kết
phosphate 5’ – 3’. Cầu nối phosphate này là cầu nối ester đồng hóa trị, còn gọi là
cầu nối phosphodiester. Do những cầu nối phosphodiester, đại phân tử
polynucleotide có cấu trúc phân cực tại vị trí 3’ – hydroxyl (3’ – OH) và 5’ –
phosphate (5’ – P) ở đầu và cuối của bất cứ acid nucleic nào.
Mỗi nucleotide gồm nhóm phosphate, đường desoxyribose và một trong bốn
base (adenine, thymine, guanine và cytosine). Các base hữu cơ thuộc hai nhóm: các
purine gồm adenine và guanine; các pyrimidine gồm thymine, cytosine và uracil.
Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là
một chuỗi nucleotide. Hai mạch đơn liên kết với nhau nhờ các liên kết hydro hình
thành giữa các base bổ sung nằm trên hai mạch (A liên kết với T bằng hai liên kết
hydro và G liên kết với C bằng ba liên kết hydro). Mỗi mạch đơn là một trình tự có
định hướng với một đầu là đầu 5’ – phosphate tự do, đầu kia là đầu 3’ – hydroxyl tự
do (hướng quy ước là 5’ – 3’). Hướng của hai mạch đơn trong chuỗi xoắn kép là
ngược nhau, người ta gọi chúng là hai mạch đối song song.

26. Đồ án tốt nghiệp
 16 
Cầu nối hydro dễ bị phá vỡ làm hai dây đơn của phân tử DNA tách rời nhau,
tiến trình này gọi là sự biến tính (denaturation) và tiến trình ngược lại gọi là sự hồi
tính (renaturation). Phương pháp thường được sử dụng để tách hai dây đơn của
phân tử DNA là nhiệt độ hay các tác nhân hóa học (dung dịch kiềm, urê). Sau đó,
nếu điều chỉnh nhiệt độ (hạ dần nhiệt độ) và nồng độ muối thích hợp, các sợi đơn có
thể bắt cặp trở lại phân tử DNA ban đầu. Dây đơn DNA sẽ không hoàn nguyên một
cách hoàn toàn nếu nhiệt độ giảm quá nhanh như trong trường hợp đặt mẫu DNA
vào nước đá (trích dẫn Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
Tiến trình tách đôi phân tử DNA có thể được ghi nhận bằng nhiều phương
pháp. Phương pháp đơn giản và hiệu quả nhất là xem xét sự thay đổi của mật độ
quang (optical density). Những nucleotide hấp thụ tia cực tím với độ dài sóng tối đa
260 nm. Trong quá trình tách đôi dây, giá trị ở bước sóng 260 nm sẽ tăng nhiều trên
dây đơn so với dây đôi. Người ta sẽ có đồ thị giữa nhiệt độ và sự hấp thụ quang
phổ. Trong đó điểm giữa khoảng nhiệt độ trong quá trình tách đôi dây DNA được
gọi là nhiệt độ nóng chảy (Tm: melting temperature). Hình dạng của đường biểu
diễn giống nhau nhưng Tm thay đổi tùy theo thành phần base của DNA và một vài
yếu tố khác nhau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
1.4.2 Phương pháp tách chiết DNA
DNA được tách chiết từ mô và các cơ quan của động thực vật. Ở động vật
DNA được tách từ da, cơ vân, mô mỡ và từ máu. Quy trình cơ bản này gồm 3 bước:
 Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Tiến hành nghiền mô, tế bào
trong dung dịch SDS (sodium dodecyl sulphate) và proteinase (proteinase K). Hỗn
hợp này sẽ phá hủy màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường,
đồng thời phân hủy các protein liên kết DNA.
 Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong dung dịch chứa
DNA bằng hỗn hợp dung dịch phenol và chloroform kết hợp với phương pháp ly
tâm.

27. Đồ án tốt nghiệp
 17 
 Bước 3: Tủa dung dịch acid nucleic, thu nhận acid nucleic dạng cô đặc
trong ethanol hoặc isopropanol.
1.4.3 Định tính DNA bằng phương pháp điện di
Phương pháp điện di là phương pháp cho phép xác định kích thước của các
đoạn DNA dựa vào đặc tính cấu trúc của các DNA. Đó là các đại phân tử tích điện
âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác dụng của một điện trường, chúng sẽ
di chuyển về cực dương của điện trường. Tính di động của phân tử phụ thuộc vào
khối lượng phân tử (số lượng nucleotide hay cặp nucleotide) và nồng độ chất cấu
thành bản thạch (gel). Hai loại gel được sử dụng trong nghiên cứu DNA là
polyacrylamide và agarose.
Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, do thao tác đơn giản. Agarose là một
trong các dạng của polysaccharide. Agarose sẽ tạo thành hạt agarose sau khi tan ở
nhiệt độ cao hoặc đun sôi vài phút. Khi nguội lại những hạt agarose sẽ kết tụ lại với
nhau, giữa những hạt như vậy có những lỗ rất nhỏ. Tùy theo nồng độ của gel mà
kích thước của các lỗ nhỏ này khác nhau. Khi thay đổi nồng độ agarose, kích thước
lỗ giữa các hạt agarose cũng thay đổi. Nồng độ gel càng cao thì kích thước các lỗ
càng nhỏ và ngược lại. Trong điện trường, DNA di chuyển từ cực âm sang cực
dương vì DNA mang điện âm (do tính chất của gốc phosphate). Khi DNA di
chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ xát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tạo
ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch này của DNA. DNA có kích thước càng
lớn thì lực trở kháng càng mạnh do đó sự di chuyển càng chậm và ngược lại. Các
DNA cùng kích thước sẽ di chuyển về cùng vị trí và tạo thành các băng, các băng
này có thể được quan sát sau khi nhuộm chúng trong ethidium bromide và đặt dưới
tia tử ngoại (UV) (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
1.5 Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction)
1.5.1 Nguyên tắc
PCR là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase do Kary Mullis và
ctv phát minh năm 1985. Đây là một kỹ thuật phân tử tạo dòng DNA rất đơn giản

28. Đồ án tốt nghiệp
 18 
và hiệu quả. Thông qua PCR hàng triệu DNA đồng nhất được thu thập một cách dễ
dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysaccharide, DNA
không có chức năng di truyền và DNA có chức năng di truyền.
Tất cả các DNA polymerase khi tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch
khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA
ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA
polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được
hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase. Thật vậy, nếu cung cấp
hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, sẽ chỉ tổng
hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự
DNA xác định, ta phải có đủ thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ
sung chuyên biệt; các mồi này gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi
ngược (reverse primer).
1.5.2 Phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ
gồm 3 giai đoạn:
 Giai đoạn biến tính (Denaturation): tách chuỗi DNA từ sợi đôi thành 2 sợi
đơn. Nhiệt độ tăng lên 94 – 95 0
C đế tách 2 sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính,
vì nhiệt độ tăng sẽ phá vỡ cầu nối hydrogen của chuỗi DNA. Thời gian ở giai đoạn
này khoảng 30 giây đến 1 phút.
 Giai đoạn bắt cặp (Annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ
sung. Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi
DNA đơn. Nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 60 0
C và kéo dài 30 giây đến 1 phút.
Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn
toàn vào DNA mẫu, hay gắn 1 cách tùy tiện.
 Giai đoạn kéo dài (Extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi
DNA gốc. Nhiệt độ được tăng lên khoảng 72 0
C giúp cho DNA polymerase tác
dụng, vốn polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc

29. Đồ án tốt nghiệp
 19 
vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài 30 giây đến nhiều
phút.
Mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần
lặp lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số
nhân.
Hình 1.3: Quy trình khuếch đại DNA
(Nguồn: http://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/genomics/pcr.html)

30. Đồ án tốt nghiệp
 20 
1.5.3 Các yếu tố tham gia ảnh hưởng đến phản ứng PCR
1.5.3.1 Taq polymerase
Taq polymerase là các DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA theo
chiều 5’ – 3’. Phần lớn các DNA polymerase dùng một bản mẫu là DNA để làm
khuôn cho sự tổng hợp. Các DNA polymerase để hoạt động cần một cặp mồi
(primer). DNA polymerase được phân lập từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus
aquaticus, nó không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính. Taq polymerase cho phép
chúng ta có thể tổng hợp dây DNA mới có tính chất lặp đi lặp lại nhiều lần.
Taq polymerase có một mức tối hảo về nhiệt độ trong sinh tổng hợp DNA
(70 – 72 0
C). Ở khoảng nhiệt độ này, hoạt động đặc biệt của Taq polymerase có thể
cao như 150 nucleotide/giây/enzyme. Do đó người ta phải cố gắng phát triển ở
khoảng nhiệt độ 70 – 72 0
C trong vòng một phút (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị
Lang, 1999).
Taq polymerase nhạy cảm với ion Mg++
. Nồng độ tối hảo của Mg++
là 1,5 –
2,5 mM. Vì deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) có thể gắn với Mg++
, cho nên
nồng độ chính xác của Mg++
tùy thuộc vào nồng độ của dNTP. Các thành phần khác
ít mẫn cảm với Taq polymerase là KCl và Tris. Nồng độ Taq polymerase cao sẽ
hình thành nhiều sản phẩm giả. Nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp dẫn đến
không đủ số lượng enzyme xúc tác để tạo ra sản phẩm PCR (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 1999).
1.5.3.2 Mồi (Primer)
Chiều dài tối thiểu của mồi cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide.
Đối với việc khuếch đại các chuỗi có mức độ dị hợp cao thường sử dụng mồi có 28
– 35 nucleotide. Mồi khởi đầu cho quá trình tổng hợp mạch mới. Khi mồi bắt cặp
vào mạch khuôn thì Taq polymerase bắt đầu kéo dài chuỗi DNA.
Khái niệm quan trọng nhất của PCR là tối hảo giữa mồi và khuôn DNA. Nếu
nồng độ mồi cao quá hiện tượng primer – dimer (vật giả primer) sẽ xuất hiện giống

31. Đồ án tốt nghiệp
 21 
như trường hợp mẫu DNA loãng. Nếu tỉ lệ này quá nhỏ, kết quả sản phẩm PCR sẽ
không nhiều, nồng độ primer có thể biến động khoảng 0,1 – 1 mM (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 1999). Thông thường nồng độ mồi xuôi và mồi ngược phải bằng
nhau.
Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và
có hiệu quả cao. Việc chọn mồi là giai đoạn quan trọng quyết định của phương pháp
PCR và phải tuân thủ một số nguyên tắc:
 Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa
mồi “xuôi”, mồi “ngược” và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp
bổ sung giữa các thành phần khác nhau của mồi.
 “Nhiệt độ nóng chảy” Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt
quá xa. Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại
nhiều lần.
 Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không
trùng với các trình tự lặp lại trên gene.
 Trình tự nằm giữa hai mồi mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn, phản
ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 kb.
1.5.3.3 Các nucleotide
dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate. Đây là hỗn hợp 4 loại nucleotide:
dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp mạch mới.
Nồng độ dNTP biến thiên khoảng 50 – 400 M. Thường người ta khuyến cáo mỗi
loại được sử dụng là 200 M. Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân
bằng sẽ làm cho phát sinh các lỗi sao chép của Taq polymerase. (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 1999).
1.5.3.4 Dung dịch đệm
Thành phần quan trong nhất trong dung dịch đệm là Mg++
. Nó rất cần thiết
cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng

32. Đồ án tốt nghiệp
 22 
nhiệt độ nóng chảy của các DNA mạch kép. Nồng độ MgCl2 tối ưu là 1,5 mM, theo
Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (1999), nồng độ Mg++
cho phép là 1 – 10 mM.
Có thể tối hảo nồng độ Mg++
bằng đường cong chuẩn độ từ 1 đến 9 mM MgCl2 (dẫn
liệu của Trần Thị Dân, 2001).
Nồng độ ion Mg++
cao ngăn cản sự biến tính hoàn toàn của sản phẩm trong
mỗi chu kì. Ngược lại nếu nồng độ Mg++
quá thấp (< 0,5 mM), nó sẽ làm xấu đi quá
trình kéo dài chuỗi, trong đó Mg++
đóng vai trò co-factor của Taq polymerase. Một
vài ion Mg++
sẽ được kẹp giữ bởi dNTP trong phản ứng. Do đó, người ta cần phải
xác định nồng độ tối ưu của Mg++
nhằm đảm bảo kết quả số lượng sản phẩm và sự
chuyên tính của sản phẩm PCR.
1.5.3.5 DNA mẫu
Phản ứng PCR tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên có nhiều
nghiên cứu cho thấy chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt trên DNA thu nhận
trực tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu, mẫu khảo cổ... Lượng DNA mẫu sử dụng
cũng có khuynh hướng giảm từ 1 g xuống khoảng 20 ng nhằm giảm khuếch đại
“ký sinh” tạo các sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
Tỷ lệ mồi/DNA template (DNA xét nghiệm) ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng
PCR, nếu tỷ lệ này quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng primer – dimer, còn nếu quá thấp
sẽ có ít sản phẩm PCR (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Vì vậy cần xác
định hàm lượng DNA để việc bổ sung mồi cho phù hợp.
1.5.3.6 Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR
Số lượng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vượt quá 40 chu kỳ. Sở
dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số
lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả
khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau:
 Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
 Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.

33. Đồ án tốt nghiệp
 23 
 Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với
nhau.
1.5.3.7 Nhiệt độ và pH
Những enzyme sử dụng trong phản ứng PCR rất mẫn cảm với nhiệt độ.
Trong thao tác luôn giữ các chất đó trong đá lạnh và trả lại điều kiện bảo quản khi
đã dùng xong. Theo Trần Thị Dân (2001), sự thay đổi nhiệt độ của phản ứng có thể
ảnh hưởng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt của sản phẩm PCR. Để biến tính,
94 – 95 0
C là khoảng nhiệt độ thường sử dụng vì nếu lớn hơn 95 0
C thì Taq
polymerase nhanh chóng mất hoạt lực. Để kéo dài chuỗi, thường dùng 72 0
C vì
nhiệt độ này gần với nhiệt độ tối hảo cho Taq polymerase hoạt động.
Theo Bùi Chí Bửu, phức tạp nhất là nhiệt độ trong giai đoạn ủ bắt cặp, nhiệt
độ này là yếu tố quyết định của phản ứng, khoảng nhiệt độ này được xác định tùy
từng loại primer. Primer có trình tự càng nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng cao.
Tác giả cho rằng, nhiệt độ này khoảng 56 0
C sẽ cung cấp những cơ hội tốt nhất để
duy trì mức độ chuyên tính và hiệu quả cao. Nhiệt độ ủ có thể thay đổi lớn. Nếu
nhiệt độ ủ quá thấp sự bắt cặp các primer không chuyên biệt có thể xảy ra và làm
cho sản phẩm nhân lên quá mức. Nếu nhiệt độ ủ quá cao năng suất của sản phẩm
mong muốn giảm nhiều.
Hầu hết các enzyme, DNA mẫu được đệm trong môi trường tối ưu có pH =
8. Ở pH này DNA rất ổn định. Trong môi trường acid các bazơ purin rất dễ bị tách
khỏi sợi DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ. Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ
của phản ứng PCR thì pH có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8 (Hồ Huỳnh Thùy Dương,
1998).
1.5.3.8 Ứng dụng của kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ
nghiên cứu khoa học đến sản xuất và đời sống xã hội. Những ứng dụng chính của
kỹ thuật PCR là:

34. Đồ án tốt nghiệp
 24 
 Xác định các đoạn trình tự cần nghiên cứu.
 Phát hiện đột biến.
 Nghiên cứu quá trình tiến hóa phân tử.
 Phục hồi các gene đã tồn tại hàng triệu năm.
 Chọn giống vật nuôi, cây trồng.
 Lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn.
 Chuẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus…
 Chuẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung thư, các bệnh di truyền.
 Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm.
 Là kỹ thuật nền cho các kỹ thuật khác như RAPD, SSR…
1.6 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật PCR-RFLP
1.6.1 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Đây là phương pháp so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu
bằng một enzyme giới hạn (restriction endonuclease) nhằm tìm hiểu xem có hay
không đột biến điểm (làm mất hay xuất hiện một vị trí giới hạn mới) hoặc có hay
không sự thay đổi một trình tự DNA. Trường hợp trình tự DNA của hai cá thể cùng
loài hoàn toàn giống nhau về số lượng và kích thước thì sẽ có sự giống nhau về các
băng DNA. Ngược lại, nếu có xuất hiện đột biến điểm hoặc thay đổi một trình tự
đoạn DNA trên sợi DNA thì sẽ có sự khác nhau về các băng DNA.
Các bước để tiến hành kỹ thuật RFLP:
 Tiến hành phân lập DNA của sinh vật mong muốn kiểm tra sự đa hình
của DNA.
 Xác định enzyme cắt phù hợp nhất với genome của sinh vật kiểm tra.
 Tiến hành phân cắt mẫu DNA thu được với enzyme cắt.
 Chạy điện di sản phẩm cắt trên gel agarose hoặc polyarylamid.

35. Đồ án tốt nghiệp
 25 
 Tiến hành lai Southern blot với mẫu dò thích hợp.
 Xác định kích thước của các đoạn đa hình trên phim sau khi thực hiện
Southern blot và đưa ra kết luận.
Quá trình phân tích RFLP trên nhiễm sắc thể gặp rất nhiều khó khăn. Việc
xử lý enzyme giới hạn của DNA này sẽ tạo ra hàng triệu mảnh DNA có kích thước
rất khó phân biệt. Nếu chạy điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethium bromide
thì không dễ gì phát hiện ra được sự khác biệt giữa chúng. Kết quả ta nhận được
hình ảnh là một dãy liên tục gồm nhiều vệt đậm. Do đó việc thiết kế probe (mẫu dò)
để xác định đa hình trong kỹ thuật Sonthern blot là vô cùng quan trọng (Nguyễn
Tuấn Kiệt, 2009).
Hình 1.4: Nguyên tắc của kỹ thuật RFLP (Nguồn: Nguyễn Tuất Kiệt, 2009)
 Ưu điểm khi dùng RFLP:
 Thích hợp cho phân tích đa dạng di truyền đối với DNA có kích thước
nhỏ.
 Chi phí áp dụng thấp.
 Kỹ thuật này rất có ý nghĩa trong nghiên cứu dịch tễ học.
 Nhược điểm khi dùng RFLP:
 Dùng một lượng mẫu DNA lớn.

36. Đồ án tốt nghiệp
 26 
 Môi trường đệm đặc biệt quan trọng đối với hiệu quả hoạt động của
enzyme cắt khi phối hợp giữa các enzyme cắt với nhau.
 Độ chính xác không cao, kết quả không ổn định.
 Ứng dụng:
 Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể.
 Phân tích tương quan di truyền giữa các cá thể.
 Lập bản đồ di truyền phục vụ công tác chọn giống.
1.6.2 Kỹ thuật PCR – RFLP (polymerase chain reaction – restriction fragment
length polymorphism)
Nhằm khắc phục hiện tượng tạo ra quá nhiều băng DNA khi phân cắt
genome bằng một enzyme giới hạn và phải thiết kế probe thích hợp trong việc phân
tích sự đa hình DNA của kỹ thuật RFLP người ta đưa ra kỹ thuật PCR – RFLP.
PCR – RFLP là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng
kỹ thuật PCR trước. Sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA này bằng một enyme
thích hợp. Sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di và nhuộm ethium
bromide cho ta biết được sự đa hình của đoạn DNA (Nguyễn Tuấn Kiệt, 2009).
Như vậy quá trình thực hiện kỹ thuật PCR – RFLP gồm các giai đoạn sau:
 Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi thích hợp để phân lập đoạn DNA
cần phân tích sự đa hình.
 Tiến hành phân cắt đoạn DNA này với một enzyme cắt thích hợp.
 Chạy điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đưa ra kết
luận.
1.7 Enzyme cắt giới hạn (RE – restriction enzyme)
Hiện tượng giới hạn và enzyme giới hạn do Hamilton phát hiện đầu tiên
(1970) ở vi khuẩn Haemophilus influenzae, chủng Rd đặt tên là Hind II (Khuất Hữu
Thanh, 2003). Enzyme giới hạn (Restriction enzyme – RE) thuộc nhóm enzyme
edonuclease, có khả năng cắt những phân tử DNA sợi kép tại những điểm rất chính
xác. Mỗi RE nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA theo trình tự giới hạn (vị trí

37. Đồ án tốt nghiệp
 27 
giới hạn) 4 hoặc 6 cặp base. Đặc trưng quan trọng nhất của các trình tự giới hạn là
chúng có cấu trúc polindromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau
khi chúng được đọc theo chiều 5’ – 3’. Như vậy cắt giống nhau trên hai mạch
khuôn. Dựa vào khả năng nhận biết và cắt trình tự giới hạn, người ta chia enzyme
giới hạn làm 3 loại:
 Loại thứ nhất gồm các enzyme giới hạn nhận biết trình tự giới hạn di
chuyển dọc theo DNA, đến cách vị trí giới hạn khoảng 1.000 – 5.000 nucleotide cắt
tại đó và giải phóng vài chục nucleotide
 Loại thứ hai gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn cắt ngay
tại đó. Loại này được sử dụng nhiều trong kỹ thuật gene và công nghệ DNA tái tổ
hợp
 Loại thứ ba gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn và cắt ở vị
trí cách đó khoảng 20 nucleotide về phía trước.
Từ khả năng cắt của các RE nên chúng ta chỉ quan tâm đến các RE loại thứ
hai vì đó là nhóm duy nhất được sử dụng trong các thao tác sinh học phân tử. Mỗi
RE nhận biết một trình tự nucleotide đặc trưng. Các trình tự này thường bao gồm 4
– 8 nucleotide (thường là 4 hay 6). Các RE khác nhau có cùng một trình tự nhận
biết gọi là các đồng phân. Đối với một số RE, trình tự nhận biết không có tính
chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide của trình tự có thể được thay thế bởi
nucleotide khác.
Mỗi RE hoạt động tối ưu trong những điều kiện phản ứng xác định, nhất là
về mặt dung dịch đệm. Tốt nhất ta nên tuân thủ đúng các khuyến cáo của hãng sản
xuất. Các dung dịch đệm dùng cho phản ứng RE thường cơ bản khác nhau ở nồng
độ NaCl. RE sẽ giữ hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50 % glycerol nếu luôn
luôn được bảo quản ở -20 0
C. Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra vào
phút chót sau khi đã cho đủ các thành phần khác và giữ trong đá trong thời gian
càng ngắn càng tốt trước khi cất trở lại vào -20 0
C.

38. Đồ án tốt nghiệp
 28 
Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo thuận lợi
cho sự tiếp xúc enzyme – cơ chất. Tuy nhiên, phải đảm bảo thể tích RE không vượt
quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzyme.
 Enzyme giới hạn HhaI có vị trí cắt theo kiểu đầu so le:
5’ …GCG C… 3’
3’…C GCG… 5’
 Enzyme giới hạn PvuII có vị trí cắt theo kiểu đầu thẳng:
5’ …CAG CTG… 3’
3’ …GTC GAC… 5’ (Dấu mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí cắt)
Enzyme giới hạn cắt cả hai mạch DNA cùng một điểm tạo các đầu bằng (blunt
ends), các đầu bằng bị cắt của phân tử DNA không có khả năng tự kết hợp lại với
nhau. Ðể nối các đoạn DNA với nhau cần sử dụng enzym nối – DNA ligase hoặc
các adaptor chuyên dụng cho mỗi loại enzyme. Enzyme giới hạn nhận biết và cắt
phân tử DNA ở các vị trí lệch nhau giữa hai mạch đơn tạo nên các đầu so le (hay
đầu dính – cohesive ends). Các đầu so le tạo ra sau khi cắt có thể tự nối lại với nhau
mà không cần sự có mặt của enzyme nối DNA ligase (Khuất Hữu Thanh, 2003).
 Enzyme EcoRI và enzyme TaqI dùng trong đề tài nghiên cứu:
 Enzyme EcoRI là RE đầu tiên được phát hiện ở Escherichia coli, chủng
RY 13. Nó bao quanh các phân tử DNA ở điểm nó cần cắt (chuỗi GAATTC). Cắt
giảm một sợi xoắn kép DNA tại một điểm và sợi thứ hai tại một điểm bổ sung khác
(giữa base G và base A). Các phần tách ra đơn lẻ bị kẹt lại "đầu dính", mà cho phép
các phần bổ sung kết hợp lại. Các phần mới tham gia được ổn định bởi DNA ligase.
5’…G AATTC…3’
3’…CTTAA G…5’
 Enzyme TaqI là RE thứ nhất được tìm thấy ở vi khuẩn Thermus
aquaticus YT-1. Nó bao quanh các phân tử DNA ở điểm nó cần cắt (chuỗi TCGA).

39. Đồ án tốt nghiệp
 29 
Cắt giảm một sợi xoắn kép DNA tại một điểm và sợi thứ hai tại một điểm bổ sung
khác (giữa base T và base C). Các phần tách ra đơn lẻ bị kẹt lại "đầu dính", mà cho
phép các phần bổ sung kết hợp lại. Các phần mới tham gia được ổn định bởi DNA
ligase.
5’…T CGA…3’
3’…AGC T…5’

40. Đồ án tốt nghiệp
 30 
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian thực hiện đề tài từ 01/03/2012 đến 30/06/2012 tại Phòng thí ngiệm
Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam.
2.2 Nội dung nghiên cứu
 Thu thập mẫu máu gà Tàu vàng từ trại gà.
 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu.
 Thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu với 2 cặp primer.
 Tiến hành phản ứng cắt bằng kỹ thuật PCR – RFLP với 2 RE.
 Xác định tần số gene của gene PIT-1.
2.3 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ
2.3.1 Vật liệu
Mẫu máu gà Tàu vàng lấy từ Trung Tâm Giống Vật Nuôi thuộc địa phận tỉnh
Bình Dương, số lượng 41 mẫu.
2.3.2 Hóa chất
2.3.2.1 Hóa chất dùng trong ly trích DNA (sử dụng bộ Kit EZ-10 Spin Column
Genomic DNA Minipreps, Blood)
Bảng 2.1: Thành phần bộ Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps
EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps
Kit, Blood
Thể tích
TBP Buffer 120 ml
TBM Buffer 25 ml
TE (pH 8,0) 15 ml
Proteinase K 2 mg

41. Đồ án tốt nghiệp
 31 
Wash Solution 12 ml
Elution Buffer 5 ml
EZ-10 Spin Column 2.0-ml Collection Tube 50
Protocol 1
2.3.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng khuếch đại DNA
 GoTaq Green Master Mix (Promega)
 F Primer
 R Primer
 Nuclease free water
 DNA mẫu
2.3.2.3 Hóa chất dùng trong phương pháp điện di
 Gel agarose (Bio Basic)
 TBE 0,5 X (Bio Basic)
 Loading dye (Promega)
 Dung dịch ethidium bromide (Promega)
 Ladder 100 bp (Fermentas)
 SYBR 10.000X
2.3.3 Dụng cụ
 Buồng thao tác (Nuaire)
 Máy ly tâm lạnh (Hettich – Mikro 22 R)
 Lò vi ba (SamSung)
 Máy mini spin (Eppendorf)
 Cân điện tử (Sartoriuos)
 Máy ủ rung nhiệt (Eppendorf)
 Máy Vortex-Genie 2

42. Đồ án tốt nghiệp
 32 
 Máy PCR (Eppendorf)
 Máy điện di (Biorad)
 Tủ lạnh 40
C (Alaska)
 Tủ lạnh -200
C (Fiocchetti)
 Tủ lạnh -800
C (Sanyo)
 Máy chụp gel (UVP)
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Thu thập mẫu
 Các mẫu máu được lấy ngẫu nhiên trên đàn gà Tàu vàng được nuôi ở Trung
Tâm Giống. Mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch cánh gà vào buổi sáng trước lúc cho
gà ăn. Chúng tôi lấy tất cả 100 mẫu và được chia làm 2 đợt, nhưng chỉ sử dụng 41
mẫu cho nghiên cứu này:
 Đợt 1(04/2012): 17 mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18. (không có mẫu số 10)
 Đợt 2 (06/2012): 24 mẫu A31, A32, A33, A35, A36, A37, A38, A39,
A40, A41, A42, A43, A44, A45, A46, A47, A48, A49, A50, A51, A52, A53, A54,
A55 (không có mẫu số A34)
 Cách thu thập và bảo quản mẫu: lấy khoảng 1 – 1,5 ml máu ở mỗi cá thể gà.
Máu được cho vào ống nghiệm vô trùng có chứa sẵn Na2ETDA. Tất cả các mẫu
máu được mang về PTN của Viện. Chia mẫu ra làm 3 phần tương đương nhau bảo
quản ở -80 0
C (lưu trữ trong thời gian dài) hoặc -200
C (lưu trữ trong thời gian
ngắn), khi dùng thì tiến hành rã đông và phân tích.

43. Đồ án tốt nghiệp
 33 
Hình 2.1: Mẫu máu gà Tàu vàng sau khi lấy về PTN
2.4.2 Tách chiết DNA
Hiện nay có rất nhiều thuốc thử và bộ kit thương mại tiện lợi cho việc tách
chiết DNA (QiaGen, Promega, Bio Basic…). Người sử dụng có thể lựa chọn bộ kit
thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong đề tài nghiên cứu này,
chúng tôi sử dụng bộ kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps của hãng
Bio Basic.
Bộ kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps mang đến một phương
pháp nhanh chóng, đơn giản và hiệu quả tinh sạch DNA cao từ các nguồn khác
nhau như vi khuẩn, động vật, thực vật và máu. DNA được chọn lọc và hấp thụ vào
trong nền gel silica của EZ-10 Spin Column trong khi các thành phần khác và tạp
chất được rửa sạch đi. Bộ gene DNA được tách ra khỏi cột và dễ dàng sử dụng
trong bất kì ứng dụng nào bao gồm PCR, Southern blot…Các phương pháp tinh
sạch được sử dụng trong protocol không yêu cầu sử dụng thêm phenol, chloroform.
Chuẩn bị hóa chất trước khi tách chiết DNA:
 TBM Buffer: có thể gây kết tủa trên mẫu. Tốt nhất nên hòa tan chất kết tủa
bằng cách ủ ở 37 0
C
 Proteinase K: trước khi sử dụng thêm 150 l nước cất vào tube chứa 2 mg
Proteinase K tương ứng. Giữ ở -20 0
C để lưu trữ

44. Đồ án tốt nghiệp
 34 
 Wash Solution: trước khi sử dụng thêm 48 ml ethanol tuyệt đối vào 12 ml
Wash Solution. Ở những mức dung dịch rửa khác nhau đảm bảo tỉ lệ ethanol : Wash
Solution là 4 : 1.
 Elution Buffer: là 2,0 mM Tris-HCl pH 8,0  8,5. Có thể sử dụng TE Buffer
pH 8,0 hoặc nước nhưng năng suất thường thấp hơn 20 %.
Hình 2.2: Bộ kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps
Quy trình ly trích sử dụng bộ kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA
Minipreps, Blood gồm các bước sau:
 Bước 1: Lấy 500 l tất cả mẫu máu cho vào tube ly tâm 1,5 ml. Thêm
800 l TBP Buffer vào tube. Lắc nhẹ trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.
 Bước 2: Ly tâm 4.000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ dịch nổi, lấy cặn.
 Bước 3: Tiếp tục lặp lại bước trên đến khi cặn có màu trắng hoặc tím hoa
cà. Sau đó thêm vào 200 l TE Buffer.
 Bước 4: Thêm 500 l TBM Buffer vào tube ly tâm. Vortex mạnh và sau
đó thêm 3 l Proteinase K. Ủ ở 55 0
C trong 30 phút.
 Bước 5: Nếu chưa hòa tan thì ly tâm 5.000 vòng/phút trong 2 phút.
Chuyển dịch lỏng bên trên vào tube ly tâm 1,5 ml khác, sau đó thêm 260 l ethanol
tuyệt đối.

45. Đồ án tốt nghiệp
 35 
 Bước 6: Cho hỗn hợp qua cột EZ-10 Spin Column được đựng trong tube
2 ml (kèm theo bộ kit). Đem ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút. Loại bỏ dịch
phía dưới trong tube.
 Bước 7: Thêm 500 l Wash Solution và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1
phút.
 Bước 8: Lặp lại bước 7
 Bước 9: Bỏ dịch phía dưới tube. Ly tâm thêm 10.000 vòng/phút trong 1
phút để loại bỏ toàn bộ Wash Solution còn dư.
 Bước 10: Chuyển phần cột EZ-10 Spin Column bên trong qua một
Eppendorf 1,5 ml. Thêm 80 l Elution Buffer vào trung tâm màng cột. Ủ tube 50 0
C
trong 2 phút.
 Bước 11: Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút để tách DNA ra khỏi cột.
 Bước 12: Giữ lạnh DNA ở -20 0
C đến khi sử dụng.
Lưu ý: Tách chiết DNA phụ thuộc vào việc phân giải hay hòa tan các mô và
sự phân tách của DNA từ máu. Hầu hết các quy trình đều sử dụng hóa chất nguy
hiểm và có khả năng gây hại nếu chúng ta thao tác không cẩn thận. Do vậy nên
tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo
găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.
2.4.3 Định tính DNA bằng phương pháp điện di
Do đặc điểm tích điện âm của nhóm phosphate trên DNA, dưới tác dụng của
điện trường các đoạn DNA khác nhau sẽ di chuyển về phía cực dương với vận tốc
khác nhau tùy thuộc vào cấu trúc và kích thước của chúng. Gel agarose khi nấu
chảy rồi để đông lại sẽ hình thành cấu trúc mạng lưới, giúp ngăn cản dòng di
chuyển của DNA trong điện trường, nhờ đó mà các DNA có độ dài khác nhau sẽ
được phân tách rõ trên bản gel. Kết quả điện di sẽ được xem trực tiếp trên bản gel
có nhuộm ethidium bromide dưới đèn cực tím; do ethidium bromide có khả năng
gắn chèn giữa các base của DNA và phát huỳnh quang màu cam khi kích thích bằng
tia UV.

46. Đồ án tốt nghiệp
 36 
 Cân 1 g agarose cho vào 100 ml dung dịch TBE 0,5 X, lắc nhẹ cho agarose
phân tán đều.
 Đun sôi bằng lò vi ba cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến
khoảng 60 0
C.
 Đổ gel vào khay đã cài sẵn răng lược, chờ gel đông và ổn định.
 Sau khi gel đông lại thì rút răng lược ra và đặt khuôn gel vào bể điện di, đổ
đệm TBE 0,5 X vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2 – 5 mm.
 Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 l loading dye và 8 l DNA mẫu, đậy
nắp bản gel và cắm điện cực.
 Tiến hành điện di ở điều kiện 200 V, 400 mA, thời gian 30 phút.
 Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khay và nhuộm gel bằng dung
dịch ethidium bromide 10 g/ml trong 20 phút, lấy bản gel ra và rửa trong nước
sạch. Sau đó đưa vào máy UVP đọc kết quả. Nếu mẫu có DNA thì băng DNA sẽ
phát sáng dưới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm nhạt của băng
điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA.
Hình 2.3: Bộ điện di

47. Đồ án tốt nghiệp
 37 
2.4.4 Ứng dụng phương pháp PCR – RFLP khảo sát đa hình gene PIT-1
2.3.4.1 Tiến hành phản ứng PCR
Khảo sát sự khuếch đại DNA trên mẫu máu sau khi tách chiết với 2 primer
PIT-1.2 và PIT-1.4. Trình tự cặp mồi được nêu ở Bảng 2.2.
Bảng 2.2: Trình tự cặp mồi PIT-1.2 và PIT-1.4 (Nie và ctv, 2008).
Mồi Trình tự đoạn mồi (xuôi và ngược) Kích thước
PIT-1.2
F Primer: 5’ GGACCCTCTCTAACAGCTCTC 3’
599 bp
R Primer: 5’ GGGAAGAATACAGGGAAAGG 3’
PIT-1.4
F primer: 5’ GGGGATTTTGCCACTTTAGGG 3’
442 bp
R primer: 5’ TGGGTAAGGCTCTGGCACTGT 3’
Chuẩn bị mồi:
 Mồi ở trạng thái đông phải được rã đông và ly tâm để mồi lắng xuống
đáy ống trước khi mở.
 Mồi được sử dụng ở nồng độ 5 mM: pha loãng mồi gốc (100 mM) bằng
nước không có nuclease (2,5 l mồi gốc và 47,5 l nước).
Tùy theo điều kiện trong phòng thí nghiệm mà chúng ta chọn lựa hỗn hợp
Mix phản ứng cho phù hợp và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Trong đề
tài nghiên cứu này, phản ứng PCR được chúng tôi tiến hành dựa trên chu trình nhiệt
và các thành phần hóa chất theo bộ kit GoTaq Green Master Mix 2X của Promega
có thành phần 2X Green GoTaq Reaction Buffer (pH 8,5); 400 µM dATP; 400
µM dGTP; 400 µM dTTP; 400 µM dCTP; 3 mM MgCl2; Taq DNA polymerase và
chất đệm tải mẫu (yellow dye và blue dye) nên khi chạy gel không cần thêm chất
đệm tải mẫu (loading dye).

48. Đồ án tốt nghiệp
 38 
Bảng 2.3: Thành phần hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (l) sử dụng
GoTaq Green Master Mix, 2X 10
F Primer 5 mM 1
R Primer 5mM 1
DNA mẫu 1
Nuclease free water 7
 20
Ở đây chúng tôi tiến hành phản ứng PCR cho 16 mẫu đầu tiên có kết quả
tách chiết DNA tốt với mồi PIT-1.2 và 39 mẫu với mồi PIT-1.4. Mix hỗn hợp phản
ứng PCR sử dụng thể tích ở Bảng 2.3. Tiến hành đánh số theo thứ tự lên các
Eppendorf 0,2 ml; mix hóa chất vào các Eppendorf sử dụng thể tích ở Bảng 2.3 theo
đúng thứ tự và đoạn mồi cần thực hiện; sau đó đem ly tâm nhẹ để hỗn hợp lắng
xuống đáy Eppendorf; tiến hành khuếch đại DNA theo chu trình nhiệt được trình
bày ở Bảng 2.4 với a là nhiệt độ bắt cặp cho từng đoạn mồi.
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Bước Nhiệt độ (0
C) Thời gian (giây)
1 94 180
2 94 30
3 a 45
4 72 60
5 72 300
6 4 
Từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 35 lần

49. Đồ án tốt nghiệp
 39 
Lưu ý: Mẫu và thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR cần đặt
trong khay đá trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.
Hình 2.4: Máy chạy PCR
2.4.4.2 Kiểm tra sản phẩm PCR
Sau khi chạy PCR xong lấy mẫu ra và tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR với
từng đoạn mồi riêng biệt, xem kích thước đoạn gene có đúng như Nie và ctv (2008)
đã công bố không.
 Cân 1,65 g agarose cho vào 110 ml dung dịch TBE 0,5 X, lắc nhẹ cho
agarose phân tán đều.
 Đun sôi bằng lò vi ba cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Lấy ra cho vào 11
l SYBR – ít độc hại hơn ethidium bromide. Để nguội đến khoảng 600
C.
 Đổ gel vào khay đã cài sẵn răng lược, chờ gel đông và ổn định.
 Sau khi gel đông lại thì rút răng lược ra và đặt khuôn gel vào bể điện di, đổ
đệm TBE 0,5 X vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2 – 5 mm.
 Load mẫu PCR vào các giếng với 5 l cho mỗi giếng, để thang chuẩn
(Ladder) 100 bp ở giữa các mẫu cho dễ quan sát. Đậy nắp bản gel và cắm điện cực

50. Đồ án tốt nghiệp
 40 
 Tiến hành điện di ở điều kiện 180 V, 400 mA, thời gian 60 phút.
 Sau khi điện di xong lấy bản gel ra khỏi khuôn và đưa vào máy UVP đọc kết
quả.
2.4.4.3 Tiến hành cắt sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn
Dựa vào tính đặc hiệu của enzyme cắt giới hạn (Restriction enzyme – RE) là
chúng chỉ cắt đúng trình tự nhận diện, nên chúng tôi sử dụng nó để phân biệt các vị
trí đa hình trên gene hay trên một vùng trình tự xác định. Trong đề tài nghiên cứu
này, phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn được thực hiện dựa trên việc khuếch đại
trình tự một đoạn gene. Sau đó khi thực hiện phản ứng phân cắt và ủ qua đêm,
chúng tôi tiến hành điện di trên gel agarose 1,5 % nhằm xác định đa hình kiểu gene
PIT-1.
Bảng 2.5: Thành phần hóa chất trong phản ứng cắt bằng RE
Thành phần Thể tích (l) sử dụng
H2O deion 9
Buffer 10X 1
Enzyme 0,5
PCR Product 5
 15,5
Ủ 1 – 16 tiếng ở 650
C với enzyme TaqI và 37 0
C với enzyme EcoRI.
Sau khi kiểm tra sản phẩm PCR với các mẫu cho kết quả tốt, chúng tôi tiến
hành sử dụng enzyme cắt giới hạn TaqI và EcoRI để cắt các sản phẩm PCR thành
công ứng với mồi PIT-1.2 và mồi PIT-1.4. Ở đây, chúng tôi sử dụng thành phần hóa
chất ở Bảng 2.5 để tiến hành phản ứng cắt. Hóa chất sử dụng thích hợp cho cả 2
enzyme cắt giới hạn TaqI và EcoRI, trộn đều các thành phần phản ứng theo đúng
thứ tự và theo đúng enzyme cắt, ly tâm bằng máy spin vài giây rồi ủ tại nhiệt độ
hoạt động tối ưu của RE đó. Thời gian ủ từ 1 – 16 tiếng. Sản phẩm cắt sau đó được

51. Đồ án tốt nghiệp
 41 
đem điện di trên gel agarose nồng độ 1,5 % để phân biệt đoạn bị cắt và không cắt
(khả năng cắt đặc hiệu của RE), qua đó xác định đa hình kiểu gene và tần số gene
PIT-1 mong muốn. Quy trình điện di giống như quy trình điện di kiểm tra sản phẩm
PCR.

52. Đồ án tốt nghiệp
 42 
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Thu thập và bảo quản mẫu
Chúng tôi đã thu được 100 mẫu máu tại trại gà giống thuộc địa phận tỉnh
Bình Dương, nhưng chỉ tiến hành nghiên cứu 41 mẫu. Các mẫu máu lấy về đều tốt,
không bị đông. Hạn chế của việc lấy mẫu là đường đi hơi xa, phải đi vào lúc sáng
sớm lúc gà chưa ăn.
Mẫu máu không nên để lâu, cách bảo quản tốt nhất là chia ra và trữ ở -80 0
C,
khi lấy mẫu về thì nên dùng ngay trong 2 – 3 ngày.
3.2 Hiệu quả tách chiết DNA
Các mẫu máu (1 – 41) thu từ trại gà giống sau khi được ly trích DNA theo
protocol chuẩn Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA Minipreps thì được định
tính bằng cách điện di trên gel agarose 1 % và được đọc bằng máy UVP để kiểm tra
kết quả điện di.
Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
41
18 19 20 21 31
30
29
22 23 24 25 26 27 28 32 33 34 35 36 37 38 39 40

53. Đồ án tốt nghiệp
 43 
Dựa vào kết quả ở Hình 3.1 chúng tôi nhận thấy chất lượng DNA thu được khá
tốt, không bị đứt gãy. Việc sử dụng bộ Kit EZ-10 Spin Column Genomic DNA
Minipreps cho DNA tổng số từ các mẫu khá ổn định. Trong đó, giếng số 5 và 33
không thấy có sự hiện diện của DNA. Điều này có thể do quá trình lấy mẫu máu bị
đông một phần nên không ly trích được DNA, do thao tác kỹ thuật khi ly trích
DNA.
Tỷ lệ tách chiết DNA tổng số: được nêu trong Bảng 3.1
Bảng 3.1: Tỷ lệ tách chiết DNA tổng số
Số mẫu Tỷ lệ (%)
Sự hiện diện DNA tổng số 39 95,12
Không có sự hiện diện của DNA tổng số 2 4,88
Dựa vào kết quả trong Bảng 3.1 chúng thôi nhận thấy có 39 trong tổng số 41
mẫu có sự hiện diện của DNA tổng số chiếm tỉ lệ 95,12 %, chỉ có 2 mẫu không có
DNA tổng số nằm ở giếng số 5 và 33. Qua đó chúng tôi nhận thấy chất lượng DNA
ly trích được là khá cao, có thể dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử, khuếch đại
DNA.
3.3 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR
3.3.1 Kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2
Để tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2, chúng tôi chỉ thực hiện
trên 16 mẫu đầu tiên có kết quả tách chiết DNA thành công (trừ mẫu số 5) sử dụng
thể tích ở Bảng 2.3. Các mẫu được chọn có hàm lượng ly trích DNA cao, độ tinh
sạch tương đối chuẩn, phù hợp với yêu cầu của phản ứng PCR. Kết quả điện di
kiểm tra sản phẩm PCR được thực hiện trên gel agarose 1,5 % cùng với thang chuẩn
nồng độ để xác định được kích thước sản phẩm PCR. Tiến hành đọc bản gel trên
máy UVP.

54. Đồ án tốt nghiệp
 44 
Hình 3.2: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.2. Giếng 1 – 16: sản
phẩm PCR với mồi PIT-1.2 kích thước 599 bp; LD 100: Ladder 100 bp; ĐC (-): Đối
chứng âm
Với kết quả điện di Hình 3.2 chúng tôi nhận thấy được các băng sáng rất rõ thể
hiện quy trình PCR khá tốt, phát hiện được 100 % sự hiện diện của gene PIT-1.2
với kích thước sản phẩm PCR là 599 bp. Kết luận thành phần phản ứng và chu trình
nhiệt sử dụng cho đoạn mồi PIT-1.2 là thích hợp. Như vậy 16 sản phẩm PCR của
gene PIT-1 với mồi PIT-1.2 có thể dùng để tiến hành phản ứng cắt với enzyme cắt
giới hạn TaqI. Tuy nhiên, ladder 100 bp vẫn còn chưa phân tách rõ, có thể là do
thao tác khi load mẫu và điện di. Đối chứng âm được sử dụng để so sánh các mẫu
không cho sản phẩm PCR.
500 bp
599 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 ĐC
(-)
LD
100
9 10 11 12 13 14 15 16
LD
100

55. Đồ án tốt nghiệp
 45 
3.3.2 Kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4
Để tiến hành kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4, chúng tôi chỉ thực
hiện trên 39 mẫu có kết quả tách chiết DNA thành công (trừ mẫu số 5 và số 33) sử
dụng thể tích ở Bảng 2.3. Các mẫu được chọn có hàm lượng ly trích DNA cao, độ
tinh sạch tương đối chuẩn, phù hợp với yêu cầu của phản ứng PCR. Kết quả điện di
kiểm tra sản phẩm PCR được thực hiện trên gel agarose 1,5 % và được đọc trên
máy UVP.
Hình 3.3: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với mồi PIT-1.4. Giếng 1 – 39: sản
phẩm PCR của gene PIT-1.4 kích thước 442 bp; LD 100: Ladder 100 bp; ĐC (-):
Đối chứng âm
Dựa vào kết quả Hình 3.3 chúng tôi nhận thấy được băng ở các giếng sáng
rất rõ, đều và đẹp thể hiện quy trình PCR khá tốt, phát hiện được 100 % sự hiện
diện của gene PIT-1.4 với kích thước sản phẩm PCR là 442 bp. Kết luận thành phần
phản ứng và chu trình nhiệt sử dụng cho đoạn mồi PIT-1.4 là thích hợp. Như vậy 39
sản phẩm PCR của gene PIT-1 với mồi PIT-1.4 có thể được dùng để tiến hành phản
442 bp
500 bp
39
17 18 19 20 30
29
28
21 22 23 24 25 26 27 31 32 33 34 35 36 37 38
LD
100
ĐC
(-)
1 2 3 4 5 6 7 8 LD
100
bp
9 10 11 12 13 14 15 16

56. Đồ án tốt nghiệp
 46 
ứng cắt với enzyme cắt giới hạn EcoRI. Đối chứng âm được sử dụng để so sánh các
mẫu không cho sản phẩm PCR.
3.4 Cắt sản phẩm PCR bằng RE
3.4.1 Sản phẩm PCR gene PIT-1.2 được cắt bằng enzyme TaqI
Việc xử lý enzyme là một trong những công đoạn quan trọng trong việc xác
định đa hình kiểu gene và tần số xuất hiện gene PIT-1. Đây là công đoạn rất tốn
kém, đòi hỏi chi phí cao và kỹ thuật tốt khi thao tác trên số lượng mẫu lớn. Do đó,
việc xác định nồng độ cũng như thể tích của các enzyme tham gia vào quá trình
phân cắt sao cho hiệu quả nhất và kinh tế nhất là rất cần thiết.
Tiến hành xử lý enzyme cho 16 mẫu (trừ mẫu số 5) đã kiểm tra sản phẩm
PCR cho kết quả tốt. Sử dụng thể tích ở Bảng 2.5 để tiến hành cắt sản phẩm PCR
bằng enzyme cắt giới hạn TaqI sau đó ủ ở 65 0
C qua đêm. Tiến hành kiểm tra sự
phân cắt của enzyme trên gel agarose 1,5 % và đọc dưới máy UVP.
LD
100 1 2 3 4 5 6 7 8
LD
100
9 10 11 12 13 14 15 16
500 bp
AB
AB AB AB AB AB AB AB
599 bp
467 bp
132 bp
AB
AA BB AB BB AA AB AB