Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ
: https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
HOẶC
https://www.facebook.com/garmentspace/
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ
: https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
HOẶC
https://www.facebook.com/garmentspace/
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Tách dòng gen là tập hợp các kỹ thuật nhằm đưa một gen, một đoạn DNA cần thiết (DNA ensert) vào tế bào chủ (host cell), tạo điều kiện tích hợp để các tế bào chủ phân chia, tạo nên vô số các tế bào cùng mang một đoạn DNA insert giống nhau, tạo nên một dòng tế bào tái tổ hợp mang gen cần tách dòng.
DNA tái tổ hợp được chế tác với mục đích là để thực hiện một quá trình gọi là sự tách dòng. Tách dòng là sự tách lập và thu nhận nhiều bản sao đồng nhất của một gen hay của một mảnh đoạn DNA. Tách dòng có thể được đi kèm hoặc không được đi kèm với sự biểu hiện protein. Những áp dụng này của DNA tái tổ hợp dùng để thiết lập các ngân hàng bộ gen, cDNA hoặc tổng hợp protein, enzyme, hormone, ...
B1: Các bước thực hiện chủ yếu: tách chiết DNA bộ gen, nhân gen bằng PCR, sửdụng enzym giới hạn cắt thành các đoạn DNA nhỏ, điện di trên gel agar (hoặc gel polyacrylamid) với thang DNA chuẩn. Từkết quả điện di, dựa vào kích thước của gen cần tách dòng để lựa chọn được
đoạn DNA chứa gen cần tách dòng. Chọn vector tách dòng dựa vào mục đích và kích thước gen tách dòng.
Tách dòng in silico hay tách dòng ảo (cloning in silico) là sự tổng hợp, phân tích các kết quả tách dòng gen in vitro, trên cơ sở thông tin từ các ngân hàng dữ liệu (STS, EST…) để lựa chọn một đoạn DNA hoặc một gen cần thiết nào đó.
Kết quả tách dòng in silico cho phép lựa chọn phương án thiết kế vectơ tái tổ hợp có hiệu quả, dự toán trước kết quả tách dòng và hiệu quả biểu hiện gen cũng như mức độ thành công của thực nghiệm
Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ một số loài sâu hại câ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ
: https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
HOẶC
https://www.facebook.com/garmentspace/
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Tách dòng gen là tập hợp các kỹ thuật nhằm đưa một gen, một đoạn DNA cần thiết (DNA ensert) vào tế bào chủ (host cell), tạo điều kiện tích hợp để các tế bào chủ phân chia, tạo nên vô số các tế bào cùng mang một đoạn DNA insert giống nhau, tạo nên một dòng tế bào tái tổ hợp mang gen cần tách dòng.
DNA tái tổ hợp được chế tác với mục đích là để thực hiện một quá trình gọi là sự tách dòng. Tách dòng là sự tách lập và thu nhận nhiều bản sao đồng nhất của một gen hay của một mảnh đoạn DNA. Tách dòng có thể được đi kèm hoặc không được đi kèm với sự biểu hiện protein. Những áp dụng này của DNA tái tổ hợp dùng để thiết lập các ngân hàng bộ gen, cDNA hoặc tổng hợp protein, enzyme, hormone, ...
B1: Các bước thực hiện chủ yếu: tách chiết DNA bộ gen, nhân gen bằng PCR, sửdụng enzym giới hạn cắt thành các đoạn DNA nhỏ, điện di trên gel agar (hoặc gel polyacrylamid) với thang DNA chuẩn. Từkết quả điện di, dựa vào kích thước của gen cần tách dòng để lựa chọn được
đoạn DNA chứa gen cần tách dòng. Chọn vector tách dòng dựa vào mục đích và kích thước gen tách dòng.
Tách dòng in silico hay tách dòng ảo (cloning in silico) là sự tổng hợp, phân tích các kết quả tách dòng gen in vitro, trên cơ sở thông tin từ các ngân hàng dữ liệu (STS, EST…) để lựa chọn một đoạn DNA hoặc một gen cần thiết nào đó.
Kết quả tách dòng in silico cho phép lựa chọn phương án thiết kế vectơ tái tổ hợp có hiệu quả, dự toán trước kết quả tách dòng và hiệu quả biểu hiện gen cũng như mức độ thành công của thực nghiệm
Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620
Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://vietbaitotnghiep.com/dich-vu-viet-thue-luan-van
Tin sinh học là môn sinh học máy tính giúp nắm vững các kỹ năng về tìm kiếm trình tự gene, thiết kế mồi, so sánh độ tương đồng...Tài liệu này hoàn toàn miễn phí, mời các bạn ghé thăm!
Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620
Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://vietbaitotnghiep.com/dich-vu-viet-thue-luan-van
Tải "Giáo trình sinh học phân tử" hoàn toàn miễn phí cung cấp các kiến thức: cấu trúc và chức năng của gen, cấu trúc genome, điều hòa biểu hiện gen, sửa chữa và bảo vệ gen...
Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620
Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://vietbaitotnghiep.com/dich-vu-viet-thue-luan-van
Tải về hoàn toàn miễn phí tài liệu "Giáo trình công nghệ sinh học động vật" cho các bạn muốn tìm hiểu về mảng công nghệ sinh học động gồmhổ trợ sinh sản (IVF), tạo dòng vô tính...
Download luận văn đồ án tốt nghiệp ngành dược với đề tài: Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh viêm phổi ở trẻ em dưới 5 tuổi tại bệnh viện Đa khoa khu vực Hồng Ngự, cho các bạn tham khảo
Bài này mình sưu tầm được, một số phần bị lỗi font. Mình thấy nó khá hay, và có thể giúp ng đọc hiểu được về cơ bản PCR là gì, và cách chạy PCR ra sao.
( Rất cảm ơn người làm bài present này)
Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú, cho các bạn làm luận văn tham khảo
Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú, cho các bạn làm luận văn tham khảo
Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620
Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://baocaothuctap.net
Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620
Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://vietbaitotnghiep.com/dich-vu-viet-thue-luan-van
Tin sinh học là môn sinh học máy tính giúp nắm vững các kỹ năng về tìm kiếm trình tự gene, thiết kế mồi, so sánh độ tương đồng...Tài liệu này hoàn toàn miễn phí, mời các bạn ghé thăm!
Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620
Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://vietbaitotnghiep.com/dich-vu-viet-thue-luan-van
Tải "Giáo trình sinh học phân tử" hoàn toàn miễn phí cung cấp các kiến thức: cấu trúc và chức năng của gen, cấu trúc genome, điều hòa biểu hiện gen, sửa chữa và bảo vệ gen...
Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620
Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://vietbaitotnghiep.com/dich-vu-viet-thue-luan-van
Tải về hoàn toàn miễn phí tài liệu "Giáo trình công nghệ sinh học động vật" cho các bạn muốn tìm hiểu về mảng công nghệ sinh học động gồmhổ trợ sinh sản (IVF), tạo dòng vô tính...
Download luận văn đồ án tốt nghiệp ngành dược với đề tài: Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh viêm phổi ở trẻ em dưới 5 tuổi tại bệnh viện Đa khoa khu vực Hồng Ngự, cho các bạn tham khảo
Bài này mình sưu tầm được, một số phần bị lỗi font. Mình thấy nó khá hay, và có thể giúp ng đọc hiểu được về cơ bản PCR là gì, và cách chạy PCR ra sao.
( Rất cảm ơn người làm bài present này)
Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú, cho các bạn làm luận văn tham khảo
Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú, cho các bạn làm luận văn tham khảo
Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620
Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://baocaothuctap.net
Download luận án tiến sĩ ngành y học với đề tài: Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm, phân loại và kết quả điều trị tấn công lơxêmi cấp chuyển từ lơxêmi kinh dòng hạt, cho các bạn làm luận văn tham khảo
Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620
Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://vietbaitotnghiep.com/dich-vu-viet-thue-luan-van
Download luận án tiến sĩ ngành y học với đề tài: Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm, phân loại và kết quả điều trị tấn công lơxêmi cấp chuyển từ lơxêmi kinh dòng hạt, cho các bạn tham khảo
Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620
Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://vietbaitotnghiep.com/dich-vu-viet-thue-luan-van
Download luận án tiến sĩ ngành y học với đề tài: Nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tuyến tiền liệt ứng dụng trong chẩn đoán, cho các bạn làm luận án tham khảo
Download luận án tiến sĩ ngành y học với đề tài: Nghiên cứu sản xuất các gam chuẩn cho RT-PCR, ứng dụng trong chẩn đoán cúm và kiểm định công hiệu vắc xin sởi, cho các bạn tham khảo
Download luận án tiến sĩ ngành y học với đề tài: Nghiên cứu sản xuất các gam chuẩn cho RT-PCR, ứng dụng trong chẩn đoán cúm và kiểm định công hiệu vắc xin sở, cho các bạn tham khảo
Download luận án tiến sĩ ngành sinh học với đề tài: Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pangasius hypophthalmus bằng kỹ thuật lamp (Loop-mediated isothermal amplification)
Download luận án tiến sĩ ngành vật liệu điện tử với đề tài: Nghiên cứu chế tạo, đặc trưng và khảo sát tiềm năng ứng dụng của hệ dẫn thuốc nano đa chức năng nền copolyme PLA-PEG có và không có hạt từ (Fe3O4)
Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620
Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://baocaothuctap.net
Luận văn Áp dụng kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán trước sinh hội chứng Down.Dị tật bẩm sinh đã và đang là một vấn đề quan trọng ngày càng thu hút sự quan tâm chú ý của toàn xã hội nói chung và ngành y tế nói riêng. Dị tật bẩm sinh không chỉ để lại những hậu quả nặng nề, những thiệt thòi lớn cho trẻ mà còn để lại những gánh nặng lớn, những ảnh hưởng tâm lý sâu sắc của người mẹ trong những lần mang thai tiếp theo.
Hội chứng Down (DS) là một bệnh lý có tần suất cao nhất trong các bệnh rối loạn NST. Theo Who (1972) tần số DS là 120 – 150/100000 trẻ sơ sinh đẻ sống, có những biểu hiện đặc trưng về hình thái và chậm phát triển về trí tuệ
Download luận văn đồ án tốt nghiệp ngành vi sinh sinh học phân tử với đề tài: Xây dựng chứng nội (internal amplification control) cho quy trình phát hiện thành phần có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm chay dựa trên gen rDNA
Download luận án tiến sĩ với đề tài: Nghiên cứu phát triển kỹ thuật phát hiện chủng vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu, cho các bạn làm luận án tham khảo
Luận Văn Nghiên Cứu Một Số Yếu Tố Liên Quan Với Lệch Bội Nhiễm Sắc Thể Của Ph...tcoco3199
Luận Văn Nghiên Cứu Một Số Yếu Tố Liên Quan Với Lệch Bội Nhiễm Sắc Thể Của Phôi Người Trước Làm Tổ, các bạn tham khảo thêm tại tài liệu, bài mẫu điểm cao tại luanvantot.com
Tài liệu này có tính phí xin vui lòng liên hệ facebook để được hỗ trợ Liên hệ page để nhận link download sách và tài liệu: https://www.facebook.com/garmentspace
https://www.facebook.com/garmentspace.blog
My Blog: http://garmentspace.blogspot.com/
Từ khóa tìm kiếm tài liệu : Wash jeans garment washing and dyeing, tài liệu ngành may, purpose of washing, definition of garment washing, tài liệu cắt may, sơ mi nam nữ, thiết kế áo sơ mi nam, thiết kế quần âu, thiết kế veston nam nữ, thiết kế áo dài, chân váy đầm liền thân, zipper, dây kéo trong ngành may, tài liệu ngành may, khóa kéo răng cưa, triển khai sản xuất, jacket nam, phân loại khóa kéo, tin học ngành may, bài giảng Accumark, Gerber Accumarkt, cad/cam ngành may, tài liệu ngành may, bộ tài liệu kỹ thuật ngành may dạng đầy đủ, vật liệu may, tài liệu ngành may, tài liệu về sợi, nguyên liệu dệt, kiểu dệt vải dệt thoi, kiểu dệt vải dệt kim, chỉ may, vật liệu dựng, bộ tài liệu kỹ thuật ngành may dạng đầy đủ, tiêu chuẩn kỹ thuật áo sơ mi nam, tài liệu kỹ thuật ngành may, tài liệu ngành may, nguồn gốc vải denim, lịch sử ra đời và phát triển quần jean, Levi's, Jeans, Levi Straus, Jacob Davis và Levis Strauss, CHẤT LIỆU DENIM, cắt may quần tây nam, quy trình may áo sơ mi căn bản, quần nam không ply, thiết kế áo sơ mi nam, thiết kế áo sơ mi nam theo tài liệu kỹ thuật, tài liệu cắt may,lịch sử ra đời và phát triển quần jean, vải denim, Levis strauss cha đẻ của quần jeans. Jeans skinny, street style áo sơ mi nam, tính vải may áo quần, sơ mi nam nữ, cắt may căn bản, thiết kế quần áo, tài liệu ngành may,máy 2 kim, máy may công nghiệp, two needle sewing machine, tài liệu ngành may, thiết bị ngành may, máy móc ngành may,Tiếng anh ngành may, english for gamrment technology, anh văn chuyên ngành may, may mặc thời trang, english, picture, Nhận biết và phân biệt các loại vải, cotton, chiffon, silk, woolCÁCH MAY – QUY CÁCH LẮP RÁP – QUY CÁCH ĐÁNH SỐTÀI LIỆU KỸ THUẬT NGÀNH MAY –TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT – QUY CÁCH ĐÁNH SỐ - QUY CÁCH LẮP RÁP – QUY CÁCH MAY – QUY TRÌNH MAY – GẤP XẾP ĐÓNG GÓI – GIÁC SƠ ĐỒ MÃ HÀNG - Công nghệ may,kỹ thuật may dây kéo đồ án công nghệ may, công
Tài liệu này có tính phí xin vui lòng liên hệ facebook để được hỗ trợ Liên hệ page để nhận link download sách và tài liệu: https://www.facebook.com/garmentspace
https://www.facebook.com/garmentspace.blog
My Blog: http://garmentspace.blogspot.com/
Từ khóa tìm kiếm tài liệu : Wash jeans garment washing and dyeing, tài liệu ngành may, purpose of washing, definition of garment washing, tài liệu cắt may, sơ mi nam nữ, thiết kế áo sơ mi nam, thiết kế quần âu, thiết kế veston nam nữ, thiết kế áo dài, chân váy đầm liền thân, zipper, dây kéo trong ngành may, tài liệu ngành may, khóa kéo răng cưa, triển khai sản xuất, jacket nam, phân loại khóa kéo, tin học ngành may, bài giảng Accumark, Gerber Accumarkt, cad/cam ngành may, tài liệu ngành may, bộ tài liệu kỹ thuật ngành may dạng đầy đủ, vật liệu may, tài liệu ngành may, tài liệu về sợi, nguyên liệu dệt, kiểu dệt vải dệt thoi, kiểu dệt vải dệt kim, chỉ may, vật liệu dựng, bộ tài liệu kỹ thuật ngành may dạng đầy đủ, tiêu chuẩn kỹ thuật áo sơ mi nam, tài liệu kỹ thuật ngành may, tài liệu ngành may, nguồn gốc vải denim, lịch sử ra đời và phát triển quần jean, Levi's, Jeans, Levi Straus, Jacob Davis và Levis Strauss, CHẤT LIỆU DENIM, cắt may quần tây nam, quy trình may áo sơ mi căn bản, quần nam không ply, thiết kế áo sơ mi nam, thiết kế áo sơ mi nam theo tài liệu kỹ thuật, tài liệu cắt may,lịch sử ra đời và phát triển quần jean, vải denim, Levis strauss cha đẻ của quần jeans. Jeans skinny, street style áo sơ mi nam, tính vải may áo quần, sơ mi nam nữ, cắt may căn bản, thiết kế quần áo, tài liệu ngành may,máy 2 kim, máy may công nghiệp, two needle sewing machine, tài liệu ngành may, thiết bị ngành may, máy móc ngành may,Tiếng anh ngành may, english for gamrment technology, anh văn chuyên ngành may, may mặc thời trang, english, picture, Nhận biết và phân biệt các loại vải, cotton, chiffon, silk, woolCÁCH MAY – QUY CÁCH LẮP RÁP – QUY CÁCH ĐÁNH SỐTÀI LIỆU KỸ THUẬT NGÀNH MAY –TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT – QUY CÁCH ĐÁNH SỐ - QUY CÁCH LẮP RÁP – QUY CÁCH MAY – QUY TRÌNH MAY – GẤP XẾP ĐÓNG GÓI – GIÁC SƠ ĐỒ MÃ HÀNG - Công nghệ may,kỹ thuật may dây kéo đồ án công nghệ may, công
Nhận viết luận văn Đại học , thạc sĩ - Zalo: 0917.193.864
Tham khảo bảng giá dịch vụ viết bài tại: vietbaocaothuctap.net
Download luận án tiến sĩ ngành y học với đề tài: Xác định đột biến gen EGFR quyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ, cho các bạn làm luận án tham khảo
Download luận án tiến sĩ ngành y học với đề tài: Xác định đột biến gen EGFR quyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ, cho các bạn làm luận văn tham khảo
ĐỀ CƯƠNG MÔN HỌC VẬT LIỆU DỆT MAY Bài giảng Vật liệu dệt may - ThS. Nguyễn Th...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ
:
https://www.facebook.com/garmentspace/
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
HOẶC
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Một số biện pháp góp phần hoàn thiện chi phí sản xuất và tính giá thành sản p...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Thực trạng áp dụng hệ thống quản lý chất lượng của các doanh nghiệp Việt Nam ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Tiểu luận Thương mại điện tử Nghiên cứu mô hình kinh doanh thương mại điện tử...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Tiểu luận Những tác động của hội nhập kinh tế quốc tế đối với kinh tế, thương...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Tiểu luận Thanh toán quốc tế Tỷ giá hối đoái chính sách tỷ giá hối đoái ở Việ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Thực trạng và giải pháp phát triển hoạt động trung tâm Đào tạo Logistics tiểu...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Nghiên cứu cơ chế quản lý và vận hành thị trường cước vận tải container đường...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Bảo vệ quyền sở hữu công nghiệp liên quan đến nhãn hiệu của doanh nghiệp tại ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Tình hình xuất nhập khẩu hàng dệt may Việt Nam qua các năm.docxTÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Pháp luật của các quốc gia ASEAN chịu ảnh hưởng của hệ thống pháp luật Civil ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Ô nhiễm môi trường tại các làng nghề sản xuất hương trên địa bàn xã Quốc Tuấn...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Trình bày các phương pháp và công cụ Quản lý Nhà nước (QLNN) về kinh tế. Lý l...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Xây dựng mô hình kinh doanh fast-food online an toàn và tiện lợi tại thành ph...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Khóa luận tốt nghiệp Luật học Luật áp dụng cho thỏa thuận trọng tài lý luận v...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Khóa luận tốt nghiệp Luật kinh doanh Pháp luật Việt Nam về cứu trợ xã hội.pdfTÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Pháp luật về bồi thường, hỗ trợ tái định cư khi Nhà nước thu hồi đất theo Luậ...TÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Pháp luật về góp vốn bằng quyền sở hữu trí tuệ ở Việt Nam hiện nay.pdfTÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Bảo vệ nạn nhân của tội phạm là trẻ em dưới góc độ pháp lý.pdfTÀI LIỆU NGÀNH MAY
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ : https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 https://www.facebook.com/thuvienluanvan01 tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
GIÁO TRÌNH 2-TÀI LIỆU SỬA CHỮA BOARD MONO TỦ LẠNH MÁY GIẶT ĐIỀU HÒA.pdf
https://dienlanhbachkhoa.net.vn
Hotline/Zalo: 0338580000
Địa chỉ: Số 108 Trần Phú, Hà Đông, Hà Nội
CÁC BIỆN PHÁP KỸ THUẬT AN TOÀN KHI XÃY RA HỎA HOẠN TRONG.pptxCNGTRC3
Cháy, nổ trong công nghiệp không chỉ gây ra thiệt hại về kinh tế, con người mà còn gây ra bất ổn, mất an ninh quốc gia và trật tự xã hội. Vì vậy phòng chông cháy nổ không chỉ là nhiệm vụ mà còn là trách nhiệm của cơ sở sản xuất, của mổi công dân và của toàn thể xã hội. Để hạn chế các vụ tai nạn do cháy, nổ xảy ra thì chúng ta cần phải đi tìm hiểu nguyên nhân gây ra các vụ cháy nố là như thế nào cũng như phải hiểu rõ các kiến thức cơ bản về nó từ đó chúng ta mới đi tìm ra được các biện pháp hữu hiệu nhất để phòng chống và sử lý sự cố cháy nổ.
Mục tiêu:
- Nêu rõ các nguy cơ xảy ra cháy, nổ trong công nghiệp và đời sống; nguyên nhân và các biện pháp đề phòng phòng;
- Sử dụng được vật liệu và phương tiện vào việc phòng cháy, chữa cháy;
- Thực hiện được việc cấp cứa khẩn cấp khi tai nạn xảy ra;
- Rèn luyện tính kỷ luật, kiên trì, cẩn thận, nghiêm túc, chủ động và tích cực sáng tạo trong học tập.
GIAO TRINH TRIET HOC MAC - LENIN (Quoc gia).pdfLngHu10
Chương 1
KHÁI LUẬN VỀ TRIẾT HỌC VÀ TRIẾT HỌC MÁC - LÊNIN
A. MỤC TIÊU
1. Về kiến thức: Trang bị cho sinh viên những tri thức cơ bản về triết học nói chung,
những điều kiện ra đời của triết học Mác - Lênin. Đồng thời, giúp sinh viên nhận thức được
thực chất cuộc cách mạng trong triết học do
C. Mác và Ph. Ăngghen thực hiện và các giai đoạn hình thành, phát triển triết học Mác - Lênin;
vai trò của triết học Mác - Lênin trong đời sống xã hội và trong thời đại ngày nay.
2. Về kỹ năng: Giúp sinh viên biết vận dụng tri thức đã học làm cơ sở cho việc nhận
thức những nguyên lý cơ bản của triết học Mác - Lênin; biết đấu tranh chống lại những luận
điểm sai trái phủ nhận sự hình thành, phát triển triết học Mác - Lênin.
3. Về tư tưởng: Giúp sinh viên củng cố niềm tin vào bản chất khoa học và cách mạng
của chủ nghĩa Mác - Lênin nói chung và triết học Mác - Lênin nói riêng.
B. NỘI DUNG
I- TRIẾT HỌC VÀ VẤN ĐỀ CƠ BẢN CỦA TRIẾT HỌC
1. Khái lược về triết học
a) Nguồn gốc của triết học
Là một loại hình nhận thức đặc thù của con người, triết học ra đời ở cả phương Đông và
phương Tây gần như cùng một thời gian (khoảng từ thế kỷ VIII đến thế kỷ VI trước Công
nguyên) tại các trung tâm văn minh lớn của nhân loại thời cổ đại. Ý thức triết học xuất hiện
không ngẫu nhiên, mà có nguồn gốc thực tế từ tồn tại xã hội với một trình độ nhất định của
sự phát triển văn minh, văn hóa và khoa học. Con người, với kỳ vọng được đáp ứng nhu
cầu về nhận thức và hoạt động thực tiễn của mình đã sáng tạo ra những luận thuyết chung
nhất, có tính hệ thống, phản ánh thế giới xung quanh và thế giới của chính con người. Triết
học là dạng tri thức lý luận xuất hiện sớm nhất trong lịch sử các loại hình lý luận của nhân
loại.
Với tư cách là một hình thái ý thức xã hội, triết học có nguồn gốc nhận thức và nguồn
gốc xã hội.
* Nguồn gốc nhận thức
Nhận thức thế giới là một nhu cầu tự nhiên, khách quan của con người. Về mặt lịch
sử, tư duy huyền thoại và tín ngưỡng nguyên thủy là loại hình triết lý đầu tiên mà con
người dùng để giải thích thế giới bí ẩn xung quanh. Người nguyên thủy kết nối những hiểu
biết rời rạc, mơ hồ, phi lôgích... của mình trong các quan niệm đầy xúc cảm và hoang
tưởng thành những huyền thoại để giải thích mọi hiện tượng. Đỉnh cao của tư duy huyền
thoại và tín ngưỡng nguyên thủy là kho tàng những câu chuyện thần thoại và những tôn
9
giáo sơ khai như Tô tem giáo, Bái vật giáo, Saman giáo. Thời kỳ triết học ra đời cũng là
thời kỳ suy giảm và thu hẹp phạm vi của các loại hình tư duy huyền thoại và tôn giáo
nguyên thủy. Triết học chính là hình thức tư duy lý luận đầu tiên trong lịch sử tư tưởng
nhân loại thay thế được cho tư duy huyền thoại và tôn giáo.
Trong quá trình sống và cải biến thế giới, từng bước con người có kinh nghiệm và có
tri thức về thế giới. Ban đầu là những tri thức cụ thể, riêng lẻ, cảm tính. Cùng với sự tiến
bộ của sản xuất và đời sống, nhận thức của con người dần dần đạt đến trình độ cao hơn
trong việc giải thích thế giới một cách hệ thống
Để xem full tài liệu Xin vui long liên hệ page để được hỗ trợ
:
https://www.facebook.com/garmentspace/
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
HOẶC
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
https://www.facebook.com/thuvienluanvan01
tai lieu tong hop, thu vien luan van, luan van tong hop, do an chuyen nganh
Khoá luận tốt nghiệp ngành Truyền thông đa phương tiện Xây dựng kế hoạch truy...
Khảo sát đột biến gen ret trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình
1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN RET TRÊN CA LÂM SÀNG
U SẮC BÀO TUYẾN THƯỢNG THẬN
MANG TÍNH GIA ĐÌNH
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn: TS.BS Đỗ Đức Minh
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Mỹ Hiền
MSSV: 1515100017 Lớp: 15HSH01
TP. Hồ Chí Minh, 2017
2. LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan nội dung trình bày trong đồ án tốt nghiệp với đề tài “Khảo sát
đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia
đình” là thành quả nghiên cứu trên cơ sở số liệu thực tế và được thực hiện dưới sự
hướng dẫn trực tiếp của giáo viên hướng dẫn.
Mọi tham khảo trong đồ án này đều được trích dẫn rõ ràng nguồn gốc.
Mọi sao chép vi phạm quy chế của nhà trường em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Tp.Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 07 năm 2017
Sinh viên
Nguyễn Thị Mỹ Hiền
3. LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm
– Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp.HCM đã tận tình giảng dạy và truyền
đạt những kiến thức, lòng nhiệt huyết cũng như niềm đam mê nghiên cứu cho em
trong suốt thời gian học tập tại trường.
Em xin gửi lời cảm ơn đến TS.BS. Đỗ Đức Minh, người thầy, người anh đã tận
tình hướng dẫn em các thông tin về lâm sàng, về kiến thức sinh học phân tử trong
suốt thời gian làm đồ án.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các anh chị ở Trung tâm Y sinh
học phân tử - Đại học Y Dược Tp. HCM đã luôn quan tâm, tạo mọi điều kiện thuận
lợi để em hoàn thành khóa luận này. Thời gian học hỏi và làm việc trong môi trường
thân thiện, luôn nhận được sự giúp đỡ cũng như góp ý nhiệt tình của anh chị ở Trung
tâm là khoảng thời gian quý báu, mang lại cho em thêm nhiều kiến thức và kinh
nghiệm trong quá trình làm việc.
Và trên hết, con xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới gia đình. Cảm ơn
cha, mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng con khôn lớn, luôn bên cạnh động viên, ủng hộ,
dõi theo bước đường con đi.
Tp.Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 07 năm 2017
Sinh viên
Nguyễn Thị Mỹ Hiền
4. Đồ án tốt nghiệp
i
MỤC LỤC
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG v
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. U sắc bào tuyến thượng thận 2
1.1.1. Giới thiệu 2
1.1.2. Nguyên nhân 3
1.1.3. Biểu hiện 4
1.1.4. Xét nghiệm chẩn đoán 4
1.1.5. Điều trị 4
1.2. Bất thường di truyền 5
1.3. Các bệnh và hội chứng liên quan 8
1.3.1. Hội chứng NF1 8
1.3.2. Hội chứng VHL 8
1.3.3. Hội chứng MEN 9
1.4. Cấu trúc, đột biến, chức năng của gen RET 10
1.5. Các phương pháp giải trình tự 13
1.5.1. Phương pháp hóa học 13
1.5.2. Phương pháp enzyme 13
1.5.3. Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer) 14
1.5.4. Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới-454 Pyrosequencing 15
1.6. Cơ sở dữ liệu và phần mềm phân tích trình tự nucleotide 16
1.6.1. Cơ sở dữ liệu 16
1.6.2. Phần mềm phân tích trình tự nucleotide 16
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
2.1. Thiết kế nghiên cứu 17
2.2. Đối tượng nghiên cứu 17
5. Đồ án tốt nghiệp
ii
2.3. Vật liệu 19
2.3.1. Dụng cụ và thiết bị 19
2.3.2. Hóa chất 20
2.4. Sơ đồ quy trình thực hiện 23
2.5. Thuyết minh quy trình 24
2.5.1. Quy trình tách chiết DNA 24
2.5.1.1. Nguyên tắc: 24
2.5.1.2. Các bước thực hiện: 24
2.5.2. Quy trình PCR gen RET 25
2.5.2.1. Nguyên tắc: 25
2.5.2.2. Các bước thực hiện: 27
2.5.3. Điện di sản phẩm PCR 27
2.5.3.1. Nguyên tắc: 27
2.5.3.2. Các bước thực hiện: 29
2.5.4. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR 30
2.5.4.1. Nguyên tắc: 30
2.5.4.2. Các bước thực hiện: 30
2.5.5. Quy trình cycle sequencing 31
2.5.5.1. Mục đích: 31
2.5.5.2. Các bước thực hiện: 31
2.5.6. Quy trình tủa sản phẩm cycle 32
2.5.6.1. Nguyên tắc: 32
2.5.6.2. Các bước thực hiện: 32
2.5.7. Giải trình tự bằng máy ABI 3500 33
2.5.7.1. Nguyên tắc: 33
2.5.7.2. Đọc trình tự chuỗi DNA: 33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
3.1. Kết quả, bàn luận tách chiết 35
3.2. Kết quả, bàn luận PCR với cặp mồi đặc hiệu 35
6. Đồ án tốt nghiệp
iii
3.3. Kết quả, bàn luận tinh sạch sản phẩm PCR 37
3.4. Phản ứng cycle sequencing và đọc kết quả giải trình tự 38
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận 44
4.2. Kiến nghị 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
7. Đồ án tốt nghiệp
iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt Viết đầy đủ
Aa Amino acid
Bp Base pair
CATE Catecholamines
CT Computed tomography
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTPs Deoxynucleotide triphosphate
ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate
GDNF Glial cell line Derived Neurotrophic Factor
GFLs Family Ligands
MEN2 Đa u tuyến nội tiết loại 2
MRI Chụp cộng hưởng từ (Magnetic resonance imaging)
NCBI National Center For Biotechnology Information
NF1 Neurofibromatosis loại 1
PCCs Pheochromocytomas
PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi gen invitro)
PGLs Paragangliomas
PPGLs Pheochromocytomas và Paragangliomas
RNA Ribonucleic acid
SNP Điểm đa hình nucleotide đơn (Single Nucleotide Polymorphisms)
VHL Hội chứng Von Hippel-Lindau
8. Đồ án tốt nghiệp
v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Trình tự mồi xuôi và mồi ngược dùng cho phản ứng PCR ......................21
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR........................................................................27
Bảng 2.3: Các thông số điê ̣n di DNA bằng gel agarose ............................................28
Bảng 2.4: Thành phần trong một phản ứng cycle sequencing .................................32
Bảng 2.5: Thành phần hỗn hợp tủa DNA ..................................................................33
Bảng 3.1: Kết quả đo nồng độ nucleic acid trong mẫu..............................................35
Bảng 4.1: Kết quả giải trình tự phát hiện SNP tại exon 11, 13 [1] ...........................44
9. Đồ án tốt nghiệp
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Mô tả cách tiếp cận xét nghiệm gen theo hướng dẫn của Hội Nội tiết.......5
Hình 1.2: Bé trai 4 tuổi có biểu hiện điểm hạt cà phê và tàn nhang............................8
Hình 1.3: Vị trí gen RET trên nhiễm sắc thể số 10....................................................10
Hình 1.4: Cơ chế phân tử của đột biến gen RET.......................................................12
Hình 1.5: Hình kí xạ tự ghi kết quả giải trình tự DNA trên gel polyacrylamide ......14
Hình 1.6: Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tự dùng bản gel polyarylamide...15
Hình 2.1: Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân...............................................................18
Hình 2.2: Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase.............................................................26
Hình 2.3: Các chu kỳ của PCR...................................................................................26
Hình 2.4: Mô tả quá trình tinh sạch sản phẩm PCR ..................................................30
Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm các exon 10, 11,13, 14 - 15,16..........36
Hình 3.2: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 11) với trình tự chuẩn.........................39
Hình 3.3: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 13) với trình tự chuẩn.........................39
Hình 3.4: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 11) với trình tự chuẩn.........................40
Hình 3.5: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 13) với trình tự chuẩn.........................40
Hình 3.6: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 11) với trình tự chuẩn.........................41
Hình 3.7: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 13) với trình tự chuẩn.........................41
Hình 3.8: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 11) với trình tự chuẩn.........................42
Hình 3.9: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 13) với trình tự chuẩn.........................42
Hình 3.10: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 11) với trình tự chuẩn.......................43
Hình 3.11: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 13) với trình tự chuẩn.......................43
10. Đồ án tốt nghiệp
1
MỞ ĐẦU
U sắc bào tuyến thượng thận (PPGLs) là bệnh nội tiết hiếm tại Việt Nam. Tìm
hiểu về căn bệnh này giúp chúng ta có những biện pháp phòng ngừa, giảm nguy cơ
mắc bệnh cũng như kịp thời thăm khám nếu gặp các triệu chứng bất thường.
Paragangliomas (PGLs) là khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh nằm ở các hạch
thần kinh giao cảm hoặc phó giao cảm khắp cơ thể, khi khối u nằm ở tủy thượng
thận thì gọi là pheochromocytomas (PCCs), với các triệu chứng lâm sàng là đánh
trống ngực, nhức đầu và ra nhiều mồ hôi, kèm theo tăng huyết áp, tiết các chất
catecholamines (CATE) [9]. Theo dõi lâm sàng là điều cần thiết để chẩn đoán và
điều trị PPGLs, hầu hết các khối u tiết CATE nếu không được điều trị thì tỷ lệ tử
vong do tim mạch cũng như di căn sang các mô, cơ quan lân cận rất cao. Việc xác
định bất thường di truyền là quan trọng vì ít nhất 1/3 bệnh nhân bị PPGLs có đột
biến dòng mầm gây bệnh ở 1 trong số 14 gen gây bệnh gồm: NF1, RET, VHL,
SDHD, SDHC, SDHB, EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127,
SDHA, MAX và HIF2A [5,9,11]. Theo hướng dẫn thực hành của Hội Nội tiết lâm
sàng, bệnh nhân PPGLs cần được thăm khám và kiểm tra di truyền cho người thân
để sàng lọc di truyền gây bệnh. Xuất phát từ thực tiễn trên nhóm tiến hành đề tài
“Khảo sát đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận
mang tính gia đình” bằng cách sử dụng phương pháp mô tả hàng loạt ca, với mục
tiêu cụ thể:
- Giải trình tự 6 exon gen RET (exon 10,11,13,14,15,16)
- Phân tích kết quả giải trình tự gen dựa trên dữ liệu ngân hàng gen National
Center For Biotechnology Information (NCBI)
Đồ án tốt nghiệp gồm có 4 chương:
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Đối tượng – Vật liệu – Phương pháp
Chương 3: Kết quả – Bàn luận
Chương 4: Kết luận – Kiến nghị
12. Đồ án tốt nghiệp
2
1.1. U sắc bào tuyến thượng thận
1.1.1. Giới thiệu
Paragangliomas (PGLs) là khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh nằm ở các
hạch thần kinh giao cảm hoặc phó giao cảm khắp cơ thể, khi khối u nằm ở tủy
thượng thận thì gọi là pheochromocytomas (PCCs) và thường tiết các chất
catecholamines (CATE): epinephrine, norepinephrine, dopamine. Khoảng 80-85%
các khối u là PCCs và 15-20% là PGLs [9].
Tủy thượng thận nằm ở trung tâm của mỗi tuyến thượng thận bao gồm các tế bào
thần kinh nội tiết (chromaffin) sản xuất và giải phóng epinephrine (adrenaline) vào
máu để đáp ứng với kích hoạt của hệ thống thần kinh giao cảm. Neuroblastoma (u
nguyên bào thần kinh) và pheochromocytomas (PCCs) là hai loại u quan trọng nhất
phát sinh từ tủy thượng thận. Cả hai loại u này cũng có thể phát sinh từ các vị trí
ngoài tuyến thượng thận, cụ thể trong vùng cận hạch của chuỗi giao cảm [17].
U sắc bào tuyến thượng thận bao gồm u lành tính hoặc ác tính của thượng thận.
Một trong số đó được chú ý đến do sản xuất thừa hormones nội tiết. Ung thư thượng
thận là sự hiện diện của các khối u ác tính ở tuyến thượng thận, bao gồm u nguyên
bào thần kinh, ung thư biểu mô vỏ thượng thận (adrenocortical carcinoma) và một
số u tế bào ưa crôm thượng thận (PGLs) [1]. Hầu hết u tế bào ưa crôm và tất cả các
u tuyến thượng thận là những khối u lành tính, không di căn hoặc xâm lấn các mô
lân cận, nhưng có thể gây ra vấn đề sức khỏe đáng kể bởi sự mất cân bằng
hormones.
Sự phổ biến của PPGLs ở bệnh nhân tăng huyết áp trong phòng khám ngoại trú
nói chung dao động từ 0,2 - 0,6%. Ở trẻ em bị tăng huyết áp, sự phổ biến của
PPGLs là khoảng 1,7%. Gần 5% bệnh nhân PCCs có khối u thượng thận tình cờ
được phát hiện trên hình ảnh giải phẫu. Nghiên cứu khám nghiệm tử thi cho thấy
khối u không được chẩn đoán trong 0,05 - 0,1% bệnh nhân [9].
PCCs sản xuất, tích trữ và tiết CATE. Hầu hết PCCs tiết cả epinephrine và
norepinephrine và sự tiết này không liên quan đến kích thích thần kinh. Ngoài ra,
PCCs còn tiết các hormones khác như adrenocorticotropic hormone, somatostatin,
13. Đồ án tốt nghiệp
3
calcitonin, oxytocin và vasopressin. Nhiều công trình nghiên cứu về PPGLs đã đúc
kết quy luật số 10 của bệnh lý này, đó là: 10% xảy ra ở trẻ em, 10% ác tính, 10%
ngoài thượng thận và 10% không chức năng [11].
PCCs có ở mọi lứa tuổi, có thể độc lập hoặc liên kết với một hội chứng ung thư
di truyền, chẳng hạn như đa u thần kinh nội tiết (Multiple endocrine neoplasma-
MEN) loại 2A và 2B, u xơ thần kinh (neurofibromatosis) loại 1 (NF1), hoặc hội
chứng Von Hippel-Lindau (VHL). Chỉ có 10% PCCs thượng thận ác tính, phần còn
lại là lành tính [21]. Chẩn đoán xác định bằng đo nồng độ của các chất chuyển hóa
CATE trong nước tiểu. Hầu hết PCCs được điều trị ban đầu với các thuốc kháng
adrenergic, phẫu thuật được sử dụng để loại bỏ khối u khi bệnh nhân ổn định.
1.1.2. Nguyên nhân
U sắc bào tuyến thượng thận có thể xuất hiện đơn lẻ (các khối u đặc, một bên và
u ở trong vùng thượng thận) hoặc có tính chất gia đình (điển hình cũng ở tủy thượng
thận nhưng thường nhiều ổ và ở cả 2 bên), ở hai nghiên cứu lớn, tần suất u tủy
thượng thận có tính chất gia đình chiếm khoảng 30% và thường nằm trong bệnh
cảnh của hội chứng di truyền trội nhiễm sắc thể thường. Những bất thường di truyền
phối hợp với u tủy thượng thận có thể là nguyên nhân do đột biến gen sinh ung thư
như RET hoặc gen ức chế u như VHL hoặc NF1. Khuyến cáo sàng lọc di truyền cho
những bệnh nhân được chẩn đoán u tủy thượng thận trước 20 tuổi, u thượng thận 2
bên, đa u cận hạch, hay cho những bệnh nhân có tiền sử gia đình có người mắc u
tủy thượng thận hay u cận hạch [22].
Vì PCCs xuất phát từ vùng tủy thượng thận, các khối u này giải phóng không liên
tục một lượng các CATE có tác dụng sinh học gây ra các triệu chứng co mạch với
tăng cả huyết áp tâm thu, tâm trương và tăng nhịp tim. Trong tế bào ưa crôm,
norepinephrine và epinephrine được chuyển hóa bởi enzyme O-methyl transferase
thành các dẫn xuất O-methyl tương ứng lần lượt là normetanephrine và
metanephrine. Vì chuyển hóa CATE trong khối u độc lập với sự tình trạng giải
phóng CATE (CATE có thể được giải phóng từng lúc hoặc với tỷ lệ thấp), định
lượng các chất chuyển hóa của CATE ở huyết tương và ở nước tiểu có độ nhạy cao
14. Đồ án tốt nghiệp
4
hơn và đóng vai trò căn bản trong chẩn đoán u tủy thượng thận [22].
Ngoài ra, môi trường ô nhiễm, chế độ ăn uống không khoa học, hút thuốc lá, sử dụng
rượu bia trong thời gian dài,… cũng làm tăng nguy cơ ung thư tuyến thượng thận.
1.1.3. Biểu hiện
- Triệu chứng lâm sàng thường có: đánh trống ngực, nhức đầu, ra nhiều mồ hôi,
kèm theo tăng huyết áp (lúc này triệu chứng trên sẽ có độ nhạy 91%, độ đặc hiệu
94%).
- Tiết nhiều CATE có thể dẫn đến suy tim, phù phổi, loạn nhịp và xuất huyết nội sọ.
Tuy nhiên triệu chứng nổi trội nhất vẫn là tăng huyết áp. Tăng tiết CATE làm
cho bệnh nhân loạn nhịp tim. Các cơn kịch phát thường kéo dài dưới 1 giờ và có thể
bị thúc đẩy bởi phẫu thuật, thay đổi tư thế, tập thể dục, mang thai [22].
1.1.4. Xét nghiệm chẩn đoán
Theo hướng dẫn thực hành của Hội Nội tiết lâm sàng khuyến cáo:
- Xét nghiệm sinh hóa ban đầu: đo huyết tương metanephrines tự do hoặc
metanephrines phân đoạn niệu, lấy mẫu máu bệnh nhân theo hướng dẫn của tài liệu
tham khảo, sử dụng phương pháp sắc ký lỏng: phổ khối lượng hoặc phát hiện điện
hóa. Đề nghị những bệnh nhân có kết quả xét nghiệm là dương tính cần được theo
dõi mức độ tăng giá trị và biểu hiện lâm sàng [9].
- Hình ảnh học: chụp cắt lớp vi tính (CT), chụp MRI ở bệnh nhân có di căn, sử
dụng 123 I-metaiodobenzylguanidine (MIBG) ghi xạ hình, sử dụng 18 F-
fluorodeoxyglucose (18 FFDG) chụp cắt lớp phát xạ [9].
- Kiểm tra di truyền: thử nghiệm di truyền tại các phòng thí nghiệm uy tín với
những bệnh nhân nghi ngờ đột biến dòng mầm và được tư vấn sau khi có kết quả
[9].
1.1.5. Điều trị
- Cắt bỏ hoàn toàn khối u.
- Điều chỉnh chế độ ăn uống có nhiều natri và chất lỏng để điều hòa việc tiết
CATE gây ra co huyết khối để ngăn chặn hạ huyết áp nghiêm trọng sau khi loại bỏ
khối u.
15. Đồ án tốt nghiệp
5
1.2. Bất thường di truyền
Cứ 3 ca PPGLs thì có 1 ca là do nguyên nhân di truyền và chủ yếu là do đột biến
dòng mầm tại 1 trong số 14 gen gồm: NF1, RET, VHL, SDHD, SDHC, SDHB,
EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127, SDHA, MAX và HIF2A [9]
Hình 1.1: Mô tả cách tiếp cận xét nghiệm gen theo hướng dẫn của Hội Nội tiết
Có thể nghi ngờ 6 bệnh khác nhau về gia đình có biểu hiện lâm sàng: bệnh NF1,
MEN2, VHL, ung thư biểu mô tế bào thận với đột biến SDHB [13], khối u car-ney
(u tuyến thượng thận, khối u hạch dạ dày, chondroma phổi) và hội chứng Carney-
Stratakis (u tuyến tụy và sarcomas dạ dày) [14].
Các hội chứng MEN2 và VHL thường được đặc trưng bởi các dấu hiệu lâm sàng
riêng biệt hướng tới việc kiểm tra các gen RET và VHL. Phát hiện đột biến gen NF1 rất
phức tạp mặc dù xét nghiệm có sẵn trong các phòng xét nghiệm trực tuyến, việc chẩn
đoán xác định hội chứng chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng [12].
Tuy nhiên, một số bệnh nhân có đột biến gen NF1 và một số báo cáo về PPGLs đều
có đặc điểm tương đồng [4, 6]. Những phát hiện này cho thấy tầm quan trọng của việc
16. Đồ án tốt nghiệp
6
điều tra về dấu hiệu lâm sàng có thể xảy ra của một đột biến cơ bản ở tất cả các bệnh
nhân PPGL.
Với bệnh gia đình (di truyền) việc phát hiện nguyên nhân gây bệnh giúp tư vấn di
truyền chẩn đoán, điều trị sớm các thành viên khác trong gia đình.
*Theo tờ báo của Hiệp hội Mỹ về việc quản lý bệnh Ung thư tuyến giáp dạng tuỷ
[16]
Nhóm bệnh MEN2A có đến 95% bệnh nhân đột biến gen RET ở codon 609, 611,
618 và 620 ở vị trí exon 10 hoặc codon 630, 634 của exon 11.
Hầu như tất cả bệnh nhân có biểu hiện u tuyến giáp dạng tuỷ và một số ít bệnh
nhân mắc bệnh PCCs hoặc u tuyến cận giáp, thường phụ thuộc vào đột biến đặc
trưng của RET.
Ví dụ như đột biến RET ở codon 634 khiến nguy cơ mắc PCCs cao và tăng theo
độ tuổi.
· 30 tuổi – 25%.
· 50 tuổi – 52%.
· 77 tuổi – 82%.
Song, bệnh nhân mắc bệnh PCCs lại chiểm tỷ lệ thấp hơn khi bị đột biến exon
10. Tỷ lệ như sau:
· Codon 609 – 4 → 26%.
· Codon 611 – 10 → 25%.
· Codon 618 – 12 → 23%.
· Codon 620 – 13 → 24%.
Nhóm bệnh MEN2B
Khoảng 75% trường hợp MEN2B riêng lẻ và bệnh nhân bị ảnh hưởng bởi đột
biến ở gen RET, 25% trường hợp xảy ra có liên quan đến di truyền trong gia đình.
Với những bệnh nhân đột biến ở gen RET, có đến 95% bệnh nhân bị đột biến ở
exon 16 (codon M918T) và 5% ở exon 15 (codon A883F).
Tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh MEN2B phổ biến ở độ tuổi 20 cho đến 30.
Tại Bệnh viện Chợ Rẫy (2005 – 2010), theo khảo sát ở 74 bệnh nhân về đặc điểm
17. Đồ án tốt nghiệp
7
lâm sàng và cận lâm sàng các trường hợp u sắc bào tuỷ thượng thận, chúng tôi nhận
thấy rằng độ tuổi mắc bệnh trung bình từ 40 – 49 tuổi (chiếm 39,2%). Đặc điểm
thường gặp ở các khối u được thống kê như sau:
· U có ở 2 tuyến: 4,1%
· U ở 1 tuyến phải: 70,3%
· U ở 1 tuyến trái: 25,6%
Kích thước trung bình của khối u: 5,86 ± 4,14 cm
· Kích thước thường gặp: 3 → 5 cm (37,3%)
· U bên trái: 7,79 → 5,11 cm
· U bên phải: thường nhỏ hơn u bên trái và có kích thước khoảng 5,38 ± 3,65 cm
· U ở cả 2 bên: 3 ± 0,82 cm và nhỏ hơn so với những trường hợp chỉ có 1 u (6,02
± 4,19 cm)
Một công trình khảo sát các yếu tố di truyền liên quan PCCs cho thấy:
- Khảo sát trên 2499 đối tượng trong khoảng thời gian 10 năm (2001 – 2010), có
1620 trường hợp riêng lẻ và 879 trường hợp liên quan đến di truyền gia đình [5].
- Trong 363 trường hợp riêng lẻ (22,4%) có 269 đột biến ở hệ gen SDHx (137 –
SHDB, 100 – SDHD, 30 – SHDC, 2 – SHDA), 64 đột biến xảy ra ở gen VHL, 23 –
RET và 7 – TMEM127 [5].
- Xét theo tỷ lệ 363/1620 trường hợp đột biến riêng lẻ (22,4%; 23,5% là các bệnh
nhận bị hội chứng NF1). Các gen SDHB, SDHD và gen VHL là những gen đột biến
xảy ra ở phần lớn các bệnh nhân, mà trong đó đột biến SDHB chiếm 37,7%; 27,5%
ở SDHD; 17,6% ở VHL; 8,26% ở SDHC; 6,3% ở RET; 1,93% ở TMEM127 và
0,55% ở SDHA. Không phát hiện đột biến ở gen SDHAF2 [5].
- 137 bệnh nhân đột biến gen SDHB (119 đột biến điểm, bao gồm: đột biến thay
thế, nhân đôi, cắt hoặc chèn 1 điểm nhỏ và 18 trường hợp đột biến vùng) [5].
- Ở gen VHL có 64 bệnh nhân (63 trường hợp đột biến điểm và 1 đột biến vùng).
- Bệnh nhân mang gen đột biến SDHD có 100 người (95 trường hợp đột biến
điểm và 5 trường hợp đột biến vùng).
- Đột biến SDHC có 30 bệnh nhân (25 trường hợp đột biến điểm và 5 trường hợp
18. Đồ án tốt nghiệp
8
đột biến vùng) [5].
- Theo tỷ lệ đột biến gen riêng lẻ
· Đột biến gen SDHB – 8,46%
· Đột biến gen SDHD – 6,2%
· Đột biến gen VHL – 3,95%
· Đột biến gen SDHC – 1,85%
· Đột biến gen RET – 1,42%
· Đột biến gen TMEM127 – 0,43%
· Đột biến gen SDHA – 0,12%
1.3. Các bệnh và hội chứng liên quan
1.3.1. Hội chứng NF1
NF1 là một rối loạn di truyền đa chức năng được đặc trưng bởi các phát hiện về
da, đặc biệt là các điểm hạt cà phê và tàn nhang, do loạn sản xương và do sự phát
triển của hệ thống khối u thần kinh lành tính và ác tính, đáng chú ý nhất là các mô
thần kinh lành tính [17].
Hình 1.2: Bé trai 4 tuổi có biểu hiện điểm hạt cà phê và tàn nhang
1.3.2. Hội chứng VHL
Hội chứng VHL có liên quan đến PCCs. PCCs thường không gây ung thư, chúng
có thể không gây triệu chứng, nhưng trong một số trường hợp, chúng có liên quan
đến nhức đầu, các cơn hoảng loạn, đổ mồ hôi quá nhiều hoặc huyết áp cao nguy
19. Đồ án tốt nghiệp
9
hiểm và có thể không đáp ứng với thuốc. PCCs đặc biệt nguy hiểm nếu chúng phát
triển trong thai kỳ [18].
1.3.3. Hội chứng MEN
Đa u tuyến nội tiết là một nhóm rối loạn ảnh hưởng đến mạng lưới sản sinh
hormones của cơ thể được gọi là hệ thống nội tiết. Hormones là những chất hoá học
được phóng thích vào máu, điều chỉnh chức năng của tế bào và các mô khắp cơ thể.
Đa u tuyến nội tiết thường liên quan đến khối u ở ít nhất hai tuyến nội tiết, khối u
cũng có thể phát triển ở các cơ quan và mô khác. Những sự tăng trưởng này có thể
không ung thư (lành tính) hoặc ung thư (ác tính). Nếu khối u trở thành ung thư, tình
trạng có thể đe dọa tính mạng [19].
Các đột biến gen MEN1 gây ra nhiều loại đa u tuyến nội tiết loại 1. Gen này mã
hóa cho việc sản xuất một protein gọi là menin. Menin hoạt động như một chất ức
chế khối u, có nghĩa là nó giữ cho tế bào không tăng trưởng và phân chia quá nhanh
hoặc phân chia không kiểm soát được. Mặc dù chức năng của menin không rõ ràng,
nhưng nó có thể tham gia vào chức năng khác của tế bào như sao chép và sửa chữa
DNA và điều chỉnh hoạt động của các gen khác. Khi đột biến làm vô hiệu hóa cả
hai bản sao của gen MEN1, menin không còn khả dụng để kiểm soát sự tăng trưởng
và phân chia tế bào, sự mất mát của protein này làm cho các tế bào phân chia quá
nhiều, dẫn đến sự hình thành các khối u đặc trưng của đa u tuyến nội tiết loại 1 [19,
23].
Dấu hiệu phổ biến nhất của đa u tuyến nội tiết loại 2 là một dạng ung thư tuyến
giáp được gọi là ung thư tuyến giáp dạng tủy. Một số người bị rối loạn này cũng
đồng mắc PCCs dẫn đến cao huyết áp. Đa u tuyến nội tiết loại 2 được chia thành ba
phân típ: loại 2A, loại 2B và ung thư tuyến giáp dạng tủy mang tính gia đình
(FMTC). Những phân nhóm này khác nhau về dấu hiệu, triệu chứng đặc trưng và
nguy cơ của các khối u cụ thể. Ví dụ, cường giáp xảy ra chỉ ở loại 2A và ung thư
tuyến giáp là đặc điểm duy nhất của FMTC. Các dấu hiệu và triệu chứng của đa u
tuyến nội tiết loại 2 là tương đối phù hợp trong bất kỳ một gia đình nào [19, 23].
Các đột biến trong gen RET gây ra đa u tuyến nội tiết loại 2. Gen này mã hóa cho
20. Đồ án tốt nghiệp
10
việc sản xuất một protein liên quan đến tín hiệu trong tế bào. Protein RET kích hoạt
các phản ứng hóa học hướng dẫn tế bào phản ứng với môi trường của chúng, ví dụ
bằng cách phân chia hoặc sinh trưởng. Các đột biến trong gen RET kích hoạt chức
năng báo hiệu của protein, có thể kích hoạt sự tăng trưởng và phân chia tế bào khi
không có các tín hiệu từ bên ngoài tế bào. Sự phân chia tế bào không kiểm soát này
có thể dẫn đến sự hình thành các khối u ở các tuyến nội tiết và các mô khác [19, 23].
1.4. Cấu trúc, đột biến, chức năng của gen RET
Gen RET được tìm thấy sau khi gây nhiễm dòng tế bào nguyên bào sợi 3T3 với
DNA lấy từ các tế bào lymphoma của người. Gen RET nằm trên nhiễm sắc thể số
10, nhánh dài, vùng 1, băng 1, băng phụ 2 (10q11.2) và gồm 20 exon [10, 20].
Hình 1.3: Vị trí gen RET trên nhiễm sắc thể số 10
Sự nối ghép tự nhiên của gen RET tạo ra 3 dạng đồng phân khác nhau của
protein RET: RET51, RET43 và RET9 chứa 51, 43 và 9 Aa trong đuôi C cuối
cùng của chúng [10].
RET là protein xuyên màng. Mỗi protein được chia thành ba miền: một miền ngoại
bào N với bốn lần lặp đi lặp lại giống như cadherin (là một protein 2 thành phần,
phần bên trong tế bào gắn với khung xương của tế bào và phần bên ngoài tế bào là
polypeptide có 5 đồng phân gắn kết với nhau) và một vùng giàu Cystein, một miền
màng xốp kẽm và một miền tyrosine kinase nội bào, được chia ra bởi sự chèn thêm
27 Aa. Trong miền tyrosine kinase nội bào, có 16 Tyrosines (Tyrs) trong RET9 và 18
trong RET51. Tyr1090 và Tyr1096 chỉ có ở dạng đồng vị RET51 [10, 15].
Miền ngoại bào của RET chứa chín vị trí N-glycosyl hóa. Protein RET được
21. Đồ án tốt nghiệp
11
glycosyl hóa hoàn toàn được báo cáo có trọng lượng phân tử là 170 kDa mặc dù
không rõ ràng là nó có cấu tạo nên trọng lượng phân tử này liên quan [10].
Gen RET mã hóa sản xuất một protein liên quan đến tín hiệu trong tế bào. Protein
này dường như rất cần thiết cho sự phát triển bình thường của một số loại tế bào
thần kinh, bao gồm hệ thống thần kinh tự trị, thần kinh ruột non. Protein RET cũng
cần thiết cho sự phát triển bình thường của thận và sản sinh ra tinh trùng (sự hình
thành tinh trùng).
Protein RET có một đầu của protein nằm trong màng tế bào và đầu còn lại nằm
ngoài màng tế bào. Chính vị trí này của protein cho phép nó tương tác với các yếu
tố cụ thể bên ngoài tế bào và nhận các tín hiệu giúp tế bào phản ứng với môi trường
của nó. Khi các phân tử kích thích sự phát triển và tăng trưởng (các yếu tố tăng
trưởng) gắn với protein RET, một chuỗi các phản ứng hóa học phức tạp bên trong tế
bào được kích hoạt. Những phản ứng này chỉ dẫn cho tế bào trải qua những thay đổi
nhất định, chẳng hạn như phân chia hoặc trưởng thành để có các chức năng đặc biệt.
Đột biến gen RET được biết là gây ra một dạng đa u tuyến nội tiết loại 2. Đa u
tuyến nội tiết thường liên quan đến sự phát triển của các khối u ở hai hoặc nhiều
tuyến sản sinh hormones của cơ thể, được gọi là tuyến nội tiết. Những khối u này có
thể không ung thư hoặc ung thư. Đa u tuyến nội tiết loại 2 được chia thành ba phân
típ: loại 2A, loại 2B, và carcinoma tuyến giáp dạng tủy mang tính chất gia đình.
Những phân típ này được phân biệt bằng các dấu hiệu và triệu chứng đặc trưng và
nguy cơ của các khối u đặc biệt [18].
Hầu hết các đột biến gen RET gây ra đa u tuyến nội tiết loại 2 làm thay đổi
protein RET (thông qua thay đổi trình tự amino acid (Aa)). Loại 2A thường xuất
phát từ đột biến thay thế Aa Cysteine bằng Arginine ở codon 634 (Cys634Arg hoặc
C634R). Hơn 90% các trường hợp loại 2B là do đột biến thay thế Aa Methionine
bằng Threonine ở codon 918 (Met918Thr hoặc M918T). Một số thay thế Aa có thể
gây ra carcinoma tuyến giáp dạng tủy mang tính chất gia đình [5,9].
Thụ thể tyrosine kinase là một protein xuyên màng, trong điền kiện tự nhiên các
thụ thể này được kích hoạt khi có sự phối hợp của các đồng thụ thể (co-receptor) để
22. Đồ án tốt nghiệp
12
tiến hành chuyển nhóm phosphate của phân tử Aa Tyrosine cao năng thành các
phân tử đặc hiệu phục vụ chuyển hóa năng lượng cho hoạt động sống bình thường.
Khi bị đột biến gen, các thụ thể này hoạt động không kiểm soát, sinh ra các bệnh và
có thể là ung thư [10].
Hình 1.4: Cơ chế phân tử của đột biến gen RET
Gen RET mã hóa cho thụ thể tyrosine kinase là thành phần của yếu tố dẫn xuất
dòng tế bào thần kinh (GDNF) có nguồn gốc tín hiệu ngoại bào, đột biến gen RET
có liên quan đến sự phát triển của nhiều loại ung thư ở người, bao gồm phình đại
tràng bẩm sinh (Hirschsprung disease), ung thư phổi, ung thư tuyến giáp, đa u
tuyến nội tiết loại 2A và 2B, tăng hồng cầu và tăng sản cận tử cung và một số ung
thư khác [10].
Kích hoạt Kinase
RET là thụ thể cho các phối tử nhóm Glial cell line Derived Neurotrophic Factor
- GDNF (GFLs).
Để kích hoạt RET, GFL đầu tiên cần phải tạo thành một phức hợp với đồng thụ
thể glycosyl phosphatidyl inositol (GPI). Các đồng thụ thể được phân loại là các
thành viên của họ protein receptor-α (GFRα) của receptor GDNF. Các thành viên
23. Đồ án tốt nghiệp
13
khác nhau trong họ GFRα (GFRα1, GFRα2, GFRα3, GFRα4) có hoạt động ràng
buộc cụ thể đối với một GFL cụ thể. Khi tạo phức GFL-GFRα, phức hợp sau đó sẽ
kết hợp hai phân tử của RET, gây ra trans-autophosphorylation các dư lượng
Tyrosine cụ thể trong miền tyrosine kinase của mỗi phân tử RET. Tyr900 và Tyr905
trong vòng lặp kích hoạt (vòng lặp A) của miền kinase đã được chứng minh là các
vị trí tự quang phổ bằng quang phổ khối. Phosphoryl hóa Tyr905 ổn định cấu hình
hoạt tính của kinase, do đó dẫn đến sự tự phospho hóa các dư lượng Tyrosine khác,
chủ yếu nằm trong vùng đuôi C của phân tử [3, 15].
1.5. Các phương pháp giải trình tự
1.5.1. Phương pháp hóa học
Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh ra phương pháp hóa học để giải
trình tự một đoạn DNA. Tuy nhiên, phương pháp giải trình tự của Maxam và Gilbert
khó thực hiện vì phải xác định nhiều thông số cho thí nghiệm. Vì vậy, hiện nay người
ta sử dụng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội [21].
1.5.2. Phương pháp enzyme
Phương pháp enzyme được Sanger và cộng sự phát minh vào năm 1977. Nguyên
tắc chung của phương pháp này là:
- Trước hết chèn các đoạn DNA cần xác định trình tự vào một vector là phage
hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được xác định rõ.
- Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí
chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng DNA polymerase, bốn loại nucleotide tự
do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và các nucleotide tận cùng
(terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP, có bốn loại
ddNTP tương ứng với bốn base A, T, C, G). Phản ứng được thực hiện trong bốn
ống và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. Bắt đầu từ đoạn mồi, DNA
polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA
chèn trên vector và sự tổng hợp bị dừng lại là vì ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất
đi gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí này
chính là nơi để dNTP kế tiếp được gắn vào. Nhờ vậy trong ống phản ứng có các
24. Đồ án tốt nghiệp
14
mạch đơn DNA có các chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các
nucleotide trên đoạn DNA gốc.
- Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide
biến tính (hình 1.5). Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng đồng vị
phóng xạ 32P hay 35S thì sau khi điện di, cũng giống như phương pháp của Maxam
và Gilbert, người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi và từ các
vạch này giải trình tự của đoạn DNA [21].
Hình 1.5: Hình kí xạ tự ghi kết quả giải trình tự DNA trên gel polyacrylamide
1.5.3. Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer)
Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sản
sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch
điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Cấu tạo
của một máy tự động giải trình tự gồm hai phần chủ yếu, đó là: Phần điện di với gel
polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện di polyacrylamide có
thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là
những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó. Nguyên tắc hoạt
động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua
chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt
cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ [21]. Từ
biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng
với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA (hình 1.6).
25. Đồ án tốt nghiệp
15
Hình 1.6: Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tự dùng bản gel polyarylamide
Với các máy thế hệ mới sau này, người ta có thể dùng bốn màu huỳnh quang
khác nhau để đánh dấu bốn loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực
hiện được chi trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một
hàng mà không cần phải trên bốn hàng khác nhau như trước đây. Nếu dùng điện di
mao quản thì tùy thuộc vào số mao quản có thể chạy một lần mà người làm thí
nghiệm có thể có số mẫu cho mỗi lần chạy nhiều hay ít [21].
1.5.4. Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới-454 Pyrosequencing
Kỹ thuật pyrosequencing 454 được sáng tạo đầu tiên bởi Pål Nyrén và Mostafa
Ronaghi của Viện Kỹ thuật Stockholm, Thụy Điển năm 1996.
Kỹ thuật này được phát triển bởi công ty 454 Life Science, là một hệ thống giải
trình tự DNA hai bước có độ tương đồng cao với dung lượng lớn hơn rất nhiều so
với hệ thống giải trình tự Sanger. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý “giải trình tự
bằng tổng hợp” bao gồm khởi động một sợi DNA được giải trình tự, và giải trình
sợi DNA bổ sung bằng phản ứng của enzyme. Đây là một hệ thống được kết hợp
với việc khuếch đại số lượng lớn các đoạn DNA kèm cùng pyrosequencing dung
26. Đồ án tốt nghiệp
16
khối lớn trong các giếng picotiter. Nguyên lý “giải trình tự bằng việc tổng hợp”
cũng dựa trên việc nhận biết các pyrophosphate (PPi) được giải phóng trong quá
trình gắn nucleotide, tạo ra một tín hiệu ánh sáng, hiệu quả hơn kỹ thuật kết thúc
chuỗi bằng dideoxynucleotide [7].
1.6. Cơ sở dữ liệu và phần mềm phân tích trình tự nucleotide
1.6.1. Cơ sở dữ liệu
Cơ sở dữ liệu là nơi tập hợp và lưu trữ một cách có tổ chức những thông tin
nghiên cứu về tính chất, cấu trúc của các phân tử sinh học, các dữ liệu về bộ gen và
vô số những dữ liệu hữu ích khác. Sau quá trình giải trình tự mẫu bệnh phẩm, ta tiến
hành phân tích kết quả bằng cách so sánh trình tự thu nhận với cơ sở dữ liệu. Có
nhiều nguồn dữ liệu cho việc phân tích: trình tự của những gen đã được công bố, cơ
sở dữ liệu gen của tổ chức National Center For Biotechnology Information (NCBI).
Trong đó, NCBI là cơ sở dữ liệu thường được lựa chọn vì quy mô lớn và phổ biến
rộng rãi. NCBI có giao diện liên kết đơn giản, dễ sử dụng với khả năng lưu trữ, tìm
kiếm, so sánh và tính toán nhanh chóng.
1.6.2. Phần mềm phân tích trình tự nucleotide
Công cụ CLC Sequence Viewer: Được thiết kế vào năm 2005 với tên gọi ban đầu
là CLC Free WorkBench bởi các nhà khoa học của CLC Bio. Năm 2008, phần mềm
này được đổi tên lại thành CLC Sequence Viewer. Đây là phần mềm hỗ trợ cho
phép người sử dụng dễ dàng thực hiện những phân tích dữ liệu trình tự DNA,
ribonucleic acid (RNA) và protein như: sắp gióng cột các trình tự, nhận biết vị trí
cắt giới hạn của các enzyme, phân tích biểu hiện gen, thiết kế mồi, sao chép phân
tử, phân tích phát sinh loài, kết hợp với quản lý dữ liệu theo thứ tự [8].
27. Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
28. Đồ án tốt nghiệp
17
2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả hàng loạt ca được thực hiện trong thời gian từ 02/2017 đến
tháng 05/2017 tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là bệnh nhân đã được chẩn đoán u sắc bào tuyến thượng
thận, những bệnh nhân này đồng ý tham gia nghiên cứu khảo sát đột biến gen RET.
Mẫu thí nghiệm là 2 ml máu EDTA của người trong một gia đình gồm: 2 chị em
gái và 2 người con gái của họ và một mẫu không phải là người trong gia đình này.
*Mô tả ca lâm sàng:
Theo bài báo đã được công bố từ nghiên cứu trước của nhóm, ca lâm sàng này là
bệnh nhân nữ, nhập viện vì biết có khối u tuyến thượng thận phải.
Trước thời điểm nghiên cứu 2 năm bệnh nhân đã được phẫu thuật cắt bỏ khối u
thượng thận trái do được chẩn đoán u thượng thận 2 bên
Cha bệnh nhân có 2 người vợ:
Người vợ thứ 1: có 8 con chung, trong số này có 1 người con trai đột tử ở tuổi
30 (không rõ nguyên nhân), 1 người con trai đã phẫu thuật cắt khối u thượng thận 2
bên (không rõ chẩn đoán) và 1 người con gái có khối u thượng thận trái đã được
phẫu thuật nhưng đã qua đời do đột quỵ.
Người vợ thứ 2: Có 2 người con gái bao gồm bệnh nhân và chị gái. Người chị
gái đã phẫu thuật khối u thượng thận hai bên và bị đột quỵ sau khi phẫu thuật.
29. Đồ án tốt nghiệp
18
Hình 2.1: Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân
Chú thích:
Nam bình thường
Nữ bình thường
Nam bị bệnh u thượng thận
Nữ bị bệnh u thượng thận
Về lâm sàng:
Không có biểu hiện lâm sàng các hội chứng MEN2A, VHL, NF1.
Huyết áp: 100/60 mmHg, trong cơn: 150/100 mmHg.
Không có các sang thương da.
Về cận lâm sàng:
- Xét nghiệm sinh hóa:
Catecholamin niệu/24h: (thể tích nước tiểu 2300 ml/24 h)
Adrenalin: 7,6 µg (bình thường <20 µg)
Noradrenalin: 199 µg (bình thường <90 µg)
Dopamin: 278,3 µg (bình thường <600 µg)
Metanephrine máu: 758 pg/ml (bình thường <90 µg/ml)
Cortisol máu (sau test Dexa liều thấp 1 mg qua đêm): 87,25 nmol/l
30. Đồ án tốt nghiệp
19
Calcitonin: 4,25 pg/ml (bình thường <14 pg/ml)
PRL: 9,28 ng/ml Calcium: 4,5 mEq/L
fT4, TSH: trong giới hạn bình thường
Siêu âm tuyến giáp: nhân giáp 18x9 mm. FNA: lành tính.
- Hình ảnh học:
CT scan: kết quả cho thấy khối u thượng thận phải 5x5cm
Sau mổ, kết quả giải phẫu bệnh: pheochromocytomas
Chẩn đoán sau phẫu thuật: U sắc bào tuyến thượng thận phải
(pheochromocytomas)
- Xét nghiệm di truyền:
Bệnh nhân không có biểu hiện lâm sàng các hội chứng MEN2A, NF1 và VHL
nên chúng tôi tiếp cận theo sơ đồ khuyến cáo của Hội Nội tiết Hoa Kỳ. Theo
khuyến cáo này, bệnh nhân có tăng tiết noradrenalin và khối u ở thượng thận nên
sẽ ưu tiên gen VHL.
Tuy nhiên, được sự hỗ trợ tư vấn, nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát gen
RET đầu tiên ở exon 10, 11, 13, 14, 15, 16 của gen và đã phát hiện bệnh nhân bị đột
biến c.1900T>C (p.Cys634Arg), một đột biến thường gặp gây ra hội chứng
MEN2A.
Bệnh nhân có tiền căn gia đình có tính chất nghi ngờ cao nên đã được tư vấn và
chỉ định xét nghiệm di truyền cho những người thân trực hệ.
2.3. Vật liệu
2.3.1. Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ:
- Micropipet, đầu típ: 10 µl, 20 µl, 200 µl, 1000 µl
- Eppendorf 0,2 ml, 1,5 ml
- Thiết bị điện di (khay, lược)
- Bình tam giác thủy tinh
- Ống đong
Thiết bị:
31. Đồ án tốt nghiệp
20
- Máy lắc rung (vortex) - Micro ONE, Milipore
- Máy ly tâm eppendorf 5415 R (Eppendorf, Mỹ)
- Cân kỹ thuật
- Lò vi sóng
- Máy điện di Mupid – EXU (Advance, Nhật Bản)
- Máy soi gel Pringraph (Atto, Nhật Bản)
- Máy PCR Mastercycler Pro AG 6325 (Đức)
- Máy giải trình tự ABI 3500 Genetic analyzer (Appied Biosystems, Mỹ)
- Tủ mát (Sanyo, Nhật Bản)
- Tủ âm sâu 300
- Máy đo nồng độ DNA Nano Drop 2000/2000c (Mỹ)
2.3.2. Hóa chất
Hóa chất tách chiết: sử dụng bộ kit tách máu QIAGEN DNA Mini Kit
Thành phần bộ kit: QIAamp Mini Spin Columns, Collection tubes (2ml),
QIAGEN Protease (proteinase K), Ethanol (96 – 100%) và Buffers: AL, AW1,
AW2, AE.
Bảo quản: hóa chất được bảo quản ở nhiệt độ phòng (15 – 250C) và nơi khô ráo.
Hóa chất PCR:
- Nước cất khử ion
- Takara TaqTM Hot Start Version (Takara, Nhật) (5units)
- dNTPs (mỗi loại 2,5 mM). Hòa tan trong nước có pH 7 - 9
- Mồi xuôi, mồi ngược
- Buffer 10 X
100 mM Tris-HCl (pH 8,3)
500 mM KCl
15 mM MgCl2
Hóa chất điện di:
- Agarose dạng bột
- Ethidium bromide (10 mg/ml)
32. Đồ án tốt nghiệp
21
- Dung dịch 5X TBE 1000 ml
Tris (Merck, Mỹ) 54 g
Boric acid (Merck, Mỹ) 27,5 g
0,5M EDTA pH8 (Merck, Mỹ) 20 ml
H2O thêm cho đủ 1000 ml
Từ dung dịch 5 X pha thành 0,5 X
- Ethdium bromide
- Loading dye
- GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder (5x50 ng)
Hóa chất tinh sạch:
- Nước cất khử ion
- ExoSap-it 500 rcn (enzyme tinh sạch)
Hóa chất cycle sequencing:
- BigDye terminator (Applied Biosystems, Mỹ)
Hóa chất tủa sản phẩm cycle sequencing:
- NH4OAC (muối amoni)
- Ethanol tuyệt đối (Merck, Đức)
- Ethanol 70%
- Hidi formamide (Applied biosystems, Mỹ)
Bảng 2.1: Trình tự mồi xuôi và mồi ngược dùng cho phản ứng PCR
Kí hiệu mồi
Độ dài khuếch
đại
Tm (o
C) Trình tự mồi 5’ - 3’
RET – 10F
452 bp 56
TATGCTTGCGACACCAGTTG
RET – 10R TTCTGGCCTGTCCATCATAG
RET – 11F
699 bp 56
TGAGCCTCTGTCTCCATCTG
RET – 11R CCGTTCCCATCTAGGTGAGA
33. Đồ án tốt nghiệp
22
RET – 13F
420 bp 56
GGCCTCTCTGTCTGAACTTG
RET – 13R GATGGAAAGTGACCACTCAG
RET – 14F
948 bp 56
GAGAAAGCTGAGGCTTCAAG
RET – 15R CTTTCCTAGGCTTCCCAAGG
RET – 16F
324 bp 56
GATGTGTGTGGCCAGTTCTG
RET – 16R AGTGCAATTCCCTGGCCAAG
34. Đồ án tốt nghiệp
23
2.4. Sơ đồ quy trình thực hiện
Mẫu máu bệnh nhân được chẩn đoán mắc
bệnh u sắc bào tuyến thượng thận
Tách chiết DNA bộ gen từ máu bằng bộ kít
QIAGEN Mini Kit
Giải trình tự 6 exon bằng máy ABI 3500
PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho exon 10,
11, 13, 14, 15, 16
Tinh sạch sản phẩm PCR bằng ExoSap-it
(500 rcn) glycerol solution
Thực hiện phản ứng cycle sequencing
Tủa sản phẩm cycle sequencing
Đọc và phân tích kết quả
Điện di sản phẩm PCR
35. Đồ án tốt nghiệp
24
2.5. Thuyết minh quy trình
2.5.1. Quy trình tách chiết DNA
2.5.1.1. Nguyên tắc:
- Tách chiết DNA cần đảm bảo độ tinh khiết và nguyên vẹn cấu trúc DNA
- Có nhiều phương pháp tách chiết khác nhau, tùy vào mục đích nghiên cứu mà
chọn phương pháp thích hợp, tuy nhiên vẫn tuân thủ các nguyên tắc sau:
+ Phá vỡ tế bào để giải phóng vật liệu di truyền
+ Bổ sung các chất ức chế enzyme phân giải DNA
+ Tách DNA ra khỏi các tạp chất
+ Kết tủa, rửa và hòa tan DNA
2.5.1.2. Các bước thực hiện:
Thực hiện các bước theo sách hướng dẫn kèm theo bộ kit
- Bổ sung vào tube 1,5 ml: 20 µl Protease (proteinase K), 200 µl mẫu máu
(vortex mẫu đều), 200 µl Buffer AL. Vortex 15 giây
- Ủ tube ở 56oC/10 phút. Spin down
- Bổ sung 200 µl Ethanol (96 - 100%) vào tube. Vortex 15 giây. Spin down
- Chuyển hỗn hợp sang cột lọc chứa trong tube 2 ml. Ly tâm 8000 vòng/phút
trong 1 phút. Loại dịch chảy qua cột, thay ống thu (được cấp bởi kit)
- Chuyển cột sang tube 2 ml mới, cho 500 µl Buffer AW1 vào cột lọc. Ly tâm
8000 vòng/phút trong 1 phút. Loại dịch chảy qua cột, thay ống thu (được cấp bởi
kit)
- Chuyển cột sang tube 2 ml mới, cho 500 µl Buffer AW2 vào cột lọc. Ly tâm
14000 vòng/ phút trong 3 phút
- Chuyển cột sang tube 2 ml mới. Ly tâm khan 14000 vòng/phút trong 1 phút
- Chuyển sang cột thu 1,5 ml. Thêm 200 µl Buffer AE, ủ ở nhiệt độ phòng 1
phút. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút
- Thu DNA và bảo quản ở nhiệt độ - 200C
* Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA bằng máy Nanodrop:
Phương pháp này dựa vào sự hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của
36. Đồ án tốt nghiệp
25
các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm của các
mẫu cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu đo.
Độ tinh sạch của dung dịch dựa vào tỷ số OD= 260/280 nm. Một dung dịch
nucleic acid được coi là sạch khi tỷ số OD là 1,7 - 2,0.
Cách tiến hành:
+ Nạp 1 µl nuclease free water vào giếng đo của máy Nanodrop, chứng Blank
+ Nạp 1 µl mẫu vào giếng đo của máy
+ Đo mật độ quang trên 2 bước sóng 260 nm và 280 nm.
+ Đọc kết quả trên màn hình hiển thị nồng độ DNA tính bằng ng/µl và OD.
2.5.2. Quy trình PCR gen RET
2.5.2.1. Nguyên tắc:
- Dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài primers nhờ enzyme Taq polymerase để
khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc hiệu trong thiết bị luân nhiệt (thermocycler)
còn gọi là máy PCR. PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần
các đoạn DNA có chiều dài từ 200 - 3000 bp. Đoạn DNA được khuếch đại (DNA
đích) được nhận dạng nhờ cặp mồi đặc hiệu (oligonucleotide) thường có chiều dài
khoảng 20 nucleotide.
- PCR thường tiến hành khoảng 25 - 35 chu kỳ qua đó từ 10-6 mg ban đầu có thể
khuếch đại (amplification) lên tới 1 mg (khoảng 2 kb). Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba
giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:
Gây biến tính (denaturation) ở 90 - 98oC: Trong giai đoạn biến tính, phân tử
DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strands). Tất
cả các phản ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng
hợp DNA từ chu kỳ trước đó)
Gắn mồi (annealing) ở 40 - 65oC: Trong giai đoạn này các mồi gắn vào vị trí có
trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu. Các mồi bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển
động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành và bị đứt gãy liên tục giữa primer
sợi đơn và DNA khuôn mẫu sợi đơn. Các liên kết ion ổn định hơn tạo thành một
đoạn nhỏ (các mồi đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó
37. Đồ án tốt nghiệp
26
(khuôn mẫu và primer) Taq polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn
mẫu. Ở giai đoạn này phạm vi nhiệt độ được sử dụng có thể rất rộng tùy thuộc vào
trình tự nucleotide của primer, thông thường khoảng 55oC, nhưng có khi chỉ 35oC
hoặc đôi lúc lên tới 68oC (long PCR).
Kéo dài phân tử (extension) ở nhiệt độ 70 - 72oC: Đây là khoảng nhiệt độ thích
hợp nhất cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bằng cách bổ sung các
dNTP bắt đầu từ các vị trí có primer theo chiều 5’ - 3’. Các primer có một vài base
gắn vào khuôn mẫu có mối liên kết ion mạnh hơn lực phá vỡ các liên kết này sẽ
không đứt gãy. Các primer ở các vị trí không bắt cặp chính xác bị rời ra (do nhiệt độ
cao) khỏi khuôn mẫu đã không tổng hợp được DNA.
Hình 2.2: Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase
Hình 2.3: Các chu kỳ của PCR
38. Đồ án tốt nghiệp
27
2.5.2.2. Các bước thực hiện:
- Rã đông dNTP, buffer, mồi
- Đánh số thứ tự lên các tube 0,2 ml từ một cho tới mẫu chứng âm
- Sử dụng các cặp mồi ở bảng 2.1 để khuếch đại gen RET với 6 exon từ DNA bộ
gen của mẫu đã ly trích
Bước 1: Bổ sung 8,9 µl nước, 1,5 µl Buffer, 1,5 µl dNTP, 0,1 µl Taq polymerase,
0,75 µl mồi xuôi và mồi ngược (primer-R, primer-F), 1,5 µl gDNA vào tube 1,5ml
Bước 2: Bổ sung 8,9 µl nước, 1,5 µl Buffer, 1,5 µl dNTP, 0,1 µl Taq polymerase,
0,75 µl mồi xuôi và mồi ngược, 1,5 µl nước vào tube 1,5ml
Bước 3: Cài đặt chương trình chạy PCR 35 chu kỳ
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Buffer 10X 1,5 98oC x 3 phút
2,5 µM dNTP 1,5
98oC x 10 giây
56oC x 20 giây
72oC x 40 giây
35 chu kỳ
Primer-F (10 µM) 0,75 72oC x 2 phút
Primer-R (10 µM) 0,75 4oC
Takara TaqTM Hot Start
Polymerase (1,25 U/µl)
0,1
H2O 8,9
Genomic DNA 1,5
Tổng 15
2.5.3. Điện di sản phẩm PCR
2.5.3.1. Nguyên tắc:
- Là hiện tượng dịch chuyển các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện
trường. Sự dịch chuyển này do phần lực điện trong lực Lorentz. Điện di trên gel
(gelelectrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử DNA, RNA, protein dựa trên
Chu trình nhiệt
39. Đồ án tốt nghiệp
28
các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng tích
(isoelectic point). Kỹ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và
tạo điện trường đều. Một bản gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử và
các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, xanh coomassie, bạc…) để phát hiện
vị trí các phân tử gel sau khi điện di.
- Điê ̣n di là kỹ thuâ ̣t được dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại phân
tử đặc biệt là các protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thước khối lượng, điê ̣n
tích và cấu hình của chúng.
- Dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid tích điện âm đồng đều trên khắp
bề mặt phân tử nên khi chịu tác động của điện trường chúng sẽ di chuyển từ cực âm
về cực dương của điện trường, các nucleic acid trong gel agarose sẽ phát quang
dưới tia tử ngoại khi liên kết với các phân tử trong ethidium bromide.
- Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ
(support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc
polyacrylamide gel. Trong đó gel của agarose và polyacrylamide được sử dụng phổ
biến nhất. Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có các giếng để
nạp (loading) mẫu. Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn
truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi tương
đối.
Các kiểu điện di:
•Điện di trên gel agarose: khả năng phân tách gel 50 bp – 20 kb
•Điện di trên gel polyacrylamide: khả năng phân tách gel 5 bp – 1 kb
Bảng 2.3: Các thông số điê ̣n di DNA bằng gel agarose
Hàm lượng agarose
trong gel (%)
Kích thước DNA (kb)
0,3 60 - 5
0,6 20 - 1
40. Đồ án tốt nghiệp
29
0,7 10 - 0,8
0,9 7 - 0,5
1,2 6 - 0,4
1,5 4 - 0,2
2,0 3 - 0,1
- Khuôn gel: Nơi đổ gel
- Máy điện di
2.5.3.2. Các bước thực hiện:
- Quy trình đổ gel
Pha 500 ml dung dịch TBE 0,5 X từ dung dịch TBE 5 X
TBE 5X 50 ml
Nước cất 450 ml
Pha 100ml dung dịch gel agarose 2%
Agarose 2 g
TBE 0,5X 100 ml
Lắc đều, cho bình tam giác chứa dung dịch vào lò vi sóng, đun sôi để agarose hòa
tan hết trong dung dịch đệm TBE 0,5 X.
Chuẩn bị khay, lược, khuôn sạch trên bề mặt phẳng.
Để dung dịch agarose 2% nguội khoảng 50 - 55oC
Đổ toàn bộ dung dịch agarose vào khuôn đựng gel. Để yên trong 45 phút cho gel
đông hoàn toàn.
- Sản phẩm sau khi khuếch đại được nạp vào giếng trên gel agarose 2% với thang
chuẩn 1kp plus:
Cho gel vào bồn điện di. Bổ sung dung dịch điện di TBE 0,5X vào bồn điện di, lưu
ý dung dịch cần ngập mặt bản gel.
Lấy 2 µl thang chuẩn và 2 µl loading dye trộn đều lần lượt nạp mẫu vào các giếng
41. Đồ án tốt nghiệp
30
1, 3, 5, 7, 9, các giếng 2, 4, 6, 8, 10 là các giếng chứng âm. Lấy 2 µl ladder và 2 µl
loading dye trộn đều, bơm vào giếng số 11.
- Điện di với hiệu điện thế 100 vôn trong 30 phút
Sau khi chạy diện di xong, tiến hành nhuộm ethidium bromide bằng cách nhúng
toàn bộ bảng gel vào trong dung dịch có chứa ethidium bromide (10 mg/ml), ngâm
trong 5 phút
Đọc kết quả điện di: Xem kết quả trên máy soi gel, đối chiếu với thang chuẩn để
xác định kích thước của sản phẩm chụp và lưu hình chụp gel.
2.5.4. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR
2.5.4.1. Nguyên tắc:
Sản phẩm DNA sau khi khuếch đại sẽ còn một số sản phẩm phụ dư thừa, việc
tinh sạch giúp bất hoạt mồi và các dNTPs dư thừa trong sản phẩm.
Xử lý bằng enzyme là một phương pháp rất hiệu quả để làm sạch PCR. ExoSap-
it (500 rcn) glycerol solution giúp loại bỏ mồi và các dNTPs dư thừa, bảo tồn các
amplification PCR. Việc ủ đầu tiên giúp bất hoạt các mồi thừa và các dNTPs. Nhiệt
độ thứ hai, ủ ở nhiệt độ cao kích hoạt các enzyme.
Hình 2.4: Mô tả quá trình tinh sạch sản phẩm PCR
2.5.4.2. Các bước thực hiện:
Cho 1 µl nước, 1 µl ExoSap và 3 µl sản phẩm PCR vào tube 0,2 trộn đều bằng
42. Đồ án tốt nghiệp
31
máy vortex, spin down.
Chạy thời gian 30 phút ở hai nhiệt độ (370C 15 phút, 800C 15 phút)
2.5.5. Quy trình cycle sequencing
2.5.5.1. Mục đích:
Nhằm tạo ra các picth dữ liệu với độ cao đồng đều và cân bằng tín hiệu, tối ưu
hóa việc đọc được dài hơn, chất lượng cao hơn và chính xác hơn cho việc phát hiện
đột biến chúng tôi tiến hành thêm bước chạy cycle sequencing.
Với tính năng hóa học vượt trội, BigDye được chọn có các ưu điểm [2]:
• Nâng cao chất lượng kết quả giải trình tự
• Được tối ưu hóa cho độ dài đọc
• Đặc điểm di động nhuộm tốt hơn
• Cải thiện hiệu suất đọc qua các vùng giàu G, T
• Đọc được lâu hơn, chất lượng cao hơn với độ cao đỉnh cao nhất và cân bằng tín
hiệu tối ưu
• Nâng cao năng suất và giảm chi phí
2.5.5.2. Các bước thực hiện:
- Pha mồi 1,6 µM từ mồi 10 µM: Hút 21 µl nước và 4 µl mồi 10 µM vào tube
0,2ml trộn đều bằng máy vortex, spin down.
- Hút 4,5 µl nước, 1,5 µl buffer, 0,5 µl BigDye, 1 µl sản phẩm cycle, 1 µl mồi ở
bước trên vào tube 0,2 ml trộn đều bằng máy vortex, spin down. Chạy cycle
sequencing 120 phút.
43. Đồ án tốt nghiệp
32
Bảng 2.4: Thành phần trong một phản ứng cycle sequencing
Thành phần Thể tích (µl)
BigDye 0,5 96oC x 1 phút
Sản phẩm DNA tinh
sạch
1 96oC x 10 giây
50oC x 5 giây
60oC x 4 phút
25 chu kỳ
Mồi (1,6 µM) 1 4oC
1X sequencing buffer 1,5
Nước 4,5
Tổng thể tích 8,5
2.5.6. Quy trình tủa sản phẩm cycle
2.5.6.1. Nguyên tắc:
DNA dễ dàng hòa tan trong các dung môi ưa nước vì có ái lực với các phân tử
của dung môi. Khi tủa DNA, kết hợp bổ sung muối, do ethanol có ái lực với nước
mạnh hơn DNA nên kéo nước về phía mình, phá bỏ liên kết giữa DNA và nước. Kết
quả là các phân tử DNA tập trung lại và bị tủa xuống đáy theo lực ly tâm.
Mục đích: Loại bỏ các thành phần dư thừa còn sót lại của BigDye từ hỗn hợp của
phản ứng cycle sequencing trước khi tiến hành đưa vào máy giải trình tự.
2.5.6.2. Các bước thực hiện:
- Cho hỗn hợp (bảng 2.5) vào tube 1,5 ml
- Lắc rung hỗn hợp 15 giây, ly tâm lạnh 13200 vòng/phút ở 4oC, 20 phút
- Đổ bỏ dịch, thu tủa
- Thêm 300 µl ethanol 70% vào tube, ly tâm lạnh 13200 vòng/phút, 15 phút
- Làm khô ở 48oC, 10 - 15 phút
- Cho 17 µl hidi formamide, votex kỹ
Chu trình nhiệt
44. Đồ án tốt nghiệp
33
- Để ở 96oC, 2 phút sau đó chuyển nhanh sang thùng đá, để trong 5 phút.
- Lấy 17 µl dung dịch trên cho vào đĩa 96 giếng để chạy phản ứng giải trình tự
Bảng 2.5: Thành phần hỗn hợp tủa DNA
Thành phần Thể tích (µl)
Sản phẩm cycle sequencing 20
5M NH4OAC 12
Ethanol 100% 60
Tổng thể tích 92
2.5.7. Giải trình tự bằng máy ABI 3500
2.5.7.1. Nguyên tắc:
Sợi DNA mang điện tích âm khi điện di chạy về cực dương, các đoạn DNA có
kích thước khác nhau sẽ phân tách thành các băng vạch khác nhau. Điện di mao
quản cho phép phân tích các băng vạch có sự sai khác nhau chỉ 1 nucleotide.
2.5.7.2. Đọc trình tự chuỗi DNA:
Exon 10, 11, 13, 14, 15, 16 của gen RET được giải trình tự với các mồi đặc hiệu
ghi ở bảng 2.1 trên máy ABI 3500 Genetic Analyzer, dùng POP-7 polymer và
Capillary 80cm (Applied Biosystem, Mỹ).
Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm Genetic Analyzer Collection
Software v3.0. Mỗi loại nucleotide được quy ước bằng 1 sóng với màu khác nhau.
- Adenine: màu xanh lá cây
- Thymine: màu đỏ
- Cytosine: màu xanh da trời
- Guanine: màu đen
Thông thường, mỗi vị trí chỉ xuất hiện 1 sóng. Khi có sự biến đổi nucleotide sẽ
xuất hiện 2 sóng khác nhau trên cùng 1 vị trí hoặc màu của sóng tại ví trí nucleotide
thay đổi khác với màu quy ước. Sau đó, dùng công cụ CLC cycle sequence để so
với trình tự chuẩn trên GenBank, xác định sự biến đổi nucleotide là SNP hay đột
45. Đồ án tốt nghiệp
34
biến và đột biến loại nào.
Các dữ liệu về SNP của gen RET được tra cứu trên hệ thống dữ liệu của NCBI
(Nation Central For Biotechnology Information), dữ liệu đột biến tra cứu theo cơ sở
dữ liệu trực tuyến.
47. Đồ án tốt nghiệp
35
3.1. Kết quả, bàn luận tách chiết
Mẫu máu ngoại vi thu được từ đối tượng nghiên cứu được tiến hành ly trích
DNA sử dụng bộ kít tách chiết của QIAGEN để thu nhận DNA bộ gen. Sau đó,
nồng độ DNA được đo bằng máy quang phổ Nanodrop 2000c.
Bảng 3.1: Kết quả đo nồng độ nucleic acid trong mẫu
Tên mẫu OD260nm/OD280nm Nồng độ ng/µl
RET1 1,94 40,8
RET2 1,98 14,7
RET3 1,92 21,0
RET4 1,88 24,7
RET5 1,98 19,8
Qua kết quả đo ta thấy nồng độ DNA thu được nằm trong khoảng 1,7 - 2,0 chứng
tỏ mẫu DNA này là không bị tạp nhiễm protein.
Mẫu DNA được bảo quản ở -20oC, dùng mẫu DNA này để tiến hành PCR
khuếch đại gen RET với 6 exon.
3.2. Kết quả, bàn luận PCR với cặp mồi đặc hiệu
Sử dụng DNA làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR khuếch đại 6 exon của gen
RET với các cặp mồi đặc hiệu trong bảng 2.1. Mồi của phản ứng PCR được thiết kế
dựa trên trình tự chuẩn của gen RET (NG_007489) trong ngân hàng gen đồng thời
dựa trên một số nguyên tắc:
· Kích thước mồi được thiết kế thường là 20 bp
· Đầu 3’ của mồi thường là A hoặc G, không được quá 3G
· A+T=10; G+C=10 (mức biến thiên cao nhất của tỷ lệ A+T và G+C là
8:12)
· Tỷ lệ A+T/G+C ở mồi xuôi và mồi ngược phải tương đương nhau để có
48. Đồ án tốt nghiệp
36
cùng nhiệt độ bắt cặp
· Mồi xuôi, mồi ngược được thiết kế lần lượt trước và sau exon cần khuếch
đại là 100bp
Kết quả khuếch đại 6 exon (10, 11, 13, 14 - 15, 16) trong phản ứng PCR với 5
cặp mồi được phát hiện nhờ điện di DNA trên gel agarose 2% với thang chuẩn 1kp
plus
Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm các exon 10, 11,13, 14 - 15,16
Chú thích :
Giếng 1: Sản phẩm PCR exon 10 với mồi 10F/R
Giếng 3: Sản phẩm PCR exon 11 với mồi 11F/R
Giếng 5: Sản phẩm PCR exon 13 với mồi 13F/R
Giếng 7: Sản phẩm PCR exon 14 - 15 với mồi 14F/15R
Giếng 9: Sản phẩm PCR exon 16 với mồi 16F/R
Giếng 2, 4, 6, 8, 10: Chứng âm là nước
L: Thang chuẩn 1 kb plus
Theo kết quả điện di ở hình 3.1:
Giếng 1: Sản phẩm PCR có kích thước ở khoảng giữa 400 và 500. Kích
thước này cho thấy phù hợp với lý thuyết của đoạn chứa exon 10 là 452 bp
Giếng 3: Sản phẩm PCR có kích thước gần vạch 700. Kích thước này cho
thấy phù hợp với lý thuyết của đoạn chứa exon 11 là 699 bp
Giếng 5: Sản phẩm PCR có kích thước ở khoảng giữa 400 và 450. Kích
thước này cho thấy phù hợp với lý thuyết của đoạn chứa exon 13 là 420 bp
452bp
324bp
948 bp
699 bp
420 bp
300bp
700bp
75 bp
400 bp
1000 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 L
49. Đồ án tốt nghiệp
37
Giếng 7: Sản phẩm PCR có kích thước ở khoảng giữa 900 và 1000. Kích
thước này cho thấy phù hợp với lý thuyết của đoạn chứa exon 14 và 15 là 948 bp
Giếng 9: Sản phẩm PCR có kích thước ở khoảng 300 và 400. Kích thước
này cho thấy phù hợp với lý thuyết của đoạn chứa exon 16 là 324 bp
Tất cả phản ứng đều có 1 băng rõ nét và không có băng phụ khác.
Mẫu chứng âm: không nhiễm (không xuất hiện vạch), cho thấy sinh phẩm hóa
chất sử dụng cho phản ứng không bị nhiễm DNA lạ.
Như vậy, phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại 6 exon của gen
RET đã thực hiện cho kết quả tốt.
Hiện nay, enzyme polymerase sử dụng cho phản ứng PCR có rất nhiều loại với
hiệu quả cao như: Takara TaqTM Hot Start Polymerase (Takara Bio), iTaq DNA
polymarase (Bio-Rad), FastStart Taq polymerase (Roche), Go Taq® Flexi DNA
polymerase (Applied Biosystems)…
Trong luận này, tôi chọn Takara TaqTM Hot Start polymarase để khuếch đại gen
RET với 6 exon. Enzyme này có hoạt tính 5’ - 3’ exonuclease, 5’ - 3’ polymerase và
có thể khuếch đại sử dụng trong giải trình tự lên đến vài kb. Ngoài ra, sản phẩm
PCR do enzyme này khuếch đại sử dụng trong giải trình tự cho tín hiệu tốt và ổn
định.
3.3. Kết quả, bàn luận tinh sạch sản phẩm PCR
Thể tích sản phẩm PCR còn lại sau khi điện di được tinh sạch bằng ExoSap-it
500 rcn. Quá trình tinh sạch sản phẩm PCR nhằm bất hoạt các thành phần còn lại
sau phản ứng PCR thư Taq polymerase, dNTPs, mồi dư, các ion muối,… thu nhận
dung dịch chứa các đoạn exon chuẩn bị cho phản ứng giải trình tự.
Nồng độ DNA chủ yếu được ước lượng dựa vào độ đậm của các vạch điện di sau
khi PCR. Nồng độ DNA được điều chỉnh để sử dụng trong phản ứng cycle
sequencing. Tùy theo độ đậm của vạch điện di mà thay đổi lượng nước thêm vào
hòa tan DNA ở bước cuối của giai đoạn tinh sạch sản phẩm
Phương pháp xác định nồng độ DNA tương đối dựa vào độ đậm của vạch điện di
so với thang chuẩn 1 kb. Phương pháp này thực hiện nhanh, tiện lợi, có thể kiểm tra
50. Đồ án tốt nghiệp
38
chất lượng và nồng độ DNA của sản phẩm PCR. Do đó, thời gian thực hiện quy
trình cũng sẽ được rút ngắn.
3.4. Phản ứng cycle sequencing và đọc kết quả giải trình tự
3.4.1. Phản ứng cycle sequencing
Mỗi sản phẩm PCR được thực hiện với ít nhất 2 phản ứng cycle sequencing (mỗi
phản ứng sử dụng với mồi xuôi hoặc mồi ngược).
Phản ứng cycle sequencing bằng mồi xuôi hoặc mồi ngược nhằm tạo ra tổ hợp
các đoạn DNA chồng lắp lên nhau 1 nucleotide và kết thúc bằng 1 loại ddNTP có
gắn chất bắt màu đặc hiệu phát huỳnh quang dưới tia laser. Sau đó, sử dụng phương
pháp tủa bằng ethanol để thu lại lượng DNA có gắn chất bắt màu. Tủa DNA được
hòa tan trong dung dịch Hidi Formamide, biến tính ở 96oC trong 2 phút trước khi
làm giảm nhiệt độ nóng chảy của DNA. Quá trình này giúp DNA duỗi thẳng mạch
khi biến tính và cố định DNA ở dạng mạch thẳng, hỗ trợ cho quá trình giải trình tự
bằng điện di mao quản.
Sau khi thực hiện phản ứng cycle sequencing thì sản phẩm được tủa bằng ethanol
để loại bỏ các thành phần của dung dịch đệm, mồi, các nucleotide, các sản phẩm
không đặc hiệu,…đồng thời có tác dụng cô đặc DNA. Ở bước rửa bằng ethanol
70% sau khi ly tâm hút bỏ dịch nổi ở trên để giữ tủa dưới đáy tube. Lượng DNA tủa
thường rất ít nên cần thao tác cẩn thận. Do đó, khi hút bỏ dịch phía trên cần phải
thật nhẹ nhàng, hút đến đáy tube chứa tủa không nên cố gắng hút cho khô, tủa được
làm khô tự nhiên hay làm nóng ở 50 - 70oC trong 1 - 2 phút. Tủa khô hoàn toàn sẽ
làm cho tín hiệu giải trình tự được rõ ràng. Ngoài ra, khi đặt tube vào máy ly tâm
chúng ta phải chú ý đặt vai tube hướng ra ngoài, để khi hút dịch nổi tránh hút phải
tủa chứa DNA.
3.4.2. Đọc kết quả giải trình tự
Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench 5, so
sánh mẫu bệnh phẩm với trình tự DNA bộ gen và trình tự các exon chuẩn. Số thứ tự
của nucleotide được tính theo chuỗi cDNA của gen RET bình thường với mã số truy
cập là NG_007489 trong ngân hàng gen.
51. Đồ án tốt nghiệp
39
Do các điều kiện của phản ứng PCR cycle sequence như: hoạt tính enzyme, nồng
độ hóa chất cho phản ứng (ddNTPs, dNTPs...) tín hiệu của một số nucleotide đầu và
nucleotide cuối của mỗi trình tự thường bị nhiễu (các đỉnh tín hiệu không rõ ràng)
do đó khó xác định chính xác tên nucleotide.
Hình 3.2: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 11) với trình tự chuẩn
Phân tích dữ liệu hình 3.2 cho thấy vị trí c.1900 có phát hiện sự thay đổi trình tự
tại codon 634 làm thay đổi amino acid Cystein (TGC) thành amino acid Arginine
(CGC), 2 chân sóng tại điểm conflict gần trùng nhau và 2 màu nucleotide khác nhau
(T>C), tra dữ liệu NCBI cho kết luận đột biến này gây ra hội chứng MEN2A
Hình 3.3: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 13) với trình tự chuẩn
Phân tích dữ liệu hình 3.3 cho thấy vị trí c.2307 có phát hiện sự thay đổi trình tự
tại codon 769 (CTT thành CTG), 2 sóng tại điểm conflict chênh lệch nhau và 2 màu
52. Đồ án tốt nghiệp
40
nucleotide khác nhau (T>G), tuy nhiên không làm thay đổi amino acid vẫn là
Leucine, tra dữ liệu NCBI cho kết luận lành tính SNP
Hình 3.4: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 11) với trình tự chuẩn
Phân tích dữ liệu hình 3.4 cho thấy vị trí c.1900 có phát hiện sự thay đổi trình tự
tại codon 634 làm thay đổi amino acid Cystein (TGC) thành amino acid Arginine
(CGC), 2 chân sóng tại điểm conflict gần trùng nhau và 2 màu nucleotide khác nhau
(T>C), tra dữ liệu NCBI cho kết luận đột biến này gây ra hội chứng MEN2A
Hình 3.5: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 13) với trình tự chuẩn
Phân tích dữ liệu hình 3.5 cho thấy vị trí c.2307 có phát hiện sự thay đổi trình tự
tại codon 769 (CTT thành CTG), màu sóng tại điểm conflict khác với màu quy ước
(T>G), tuy nhiên không làm thay đổi amino acid vẫn là Leucine, tra dữ liệu NCBI
cho kết luận lành tính SNP
53. Đồ án tốt nghiệp
41
Hình 3.6: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 11) với trình tự chuẩn
Phân tích dữ liệu hình 3.6 cho thấy vị trí c.1900 có phát hiện sự thay đổi trình tự
tại codon 634 làm thay đổi amino acid Cystein (TGC) thành amino acid Arginine
(CGC), 2 sóng tại điểm conflict gần trùng nhau và 2 màu nucleotide khác nhau
(T>C), tra dữ liệu NCBI cho kết luận đột biến này gây ra hội chứng MEN2A
Hình 3.7: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 13) với trình tự chuẩn
Phân tích dữ liệu hình 3.7 cho thấy vị trí c.2307 có phát hiện sự thay đổi trình tự
tại codon 769 (CTT thành CTG), 2 sóng tại điểm conflict chênh lệch nhau và 2 màu
nucleotide khác nhau (T>G), tuy nhiên không làm thay đổi amino acid vẫn là
Leucine, tra dữ liệu NCBI cho kết luận lành tính SNP
54. Đồ án tốt nghiệp
42
Hình 3.8: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 11) với trình tự chuẩn
Phân tích dữ liệu hình 3.8 cho thấy vị trí c.1900 có phát hiện sự thay đổi trình tự
tại codon 634 làm thay đổi amino acid Cystein (TGC) thành amino acid Arginine
(CGC), 2 sóng tại điểm conflict gần trùng nhau và 2 màu nucleotide khác nhau
(T>C), tra dữ liệu NCBI cho kết luận đột biến này gây ra hội chứng MEN2A
Hình 3.9: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 13) với trình tự chuẩn
Phân tích dữ liệu hình 3.9 cho thấy vị trí c.2307 có phát hiện sự thay đổi trình tự
tại codon 769 (CTT thành CTG), màu sóng tại điểm conflict khác với màu quy ước
(T>G), tuy nhiên không làm thay đổi amino acid vẫn là Leucine, tra dữ liệu NCBI
cho kết luận lành tính SNP
55. Đồ án tốt nghiệp
43
Hình 3.10: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 11) với trình tự chuẩn
Phân tích dữ liệu hình 3.10 cho thấy vị trí c.2071 có phát hiện sự thay đổi trình tự
tại codon 691 (G>A) làm thay đổi amino acid Glycine (GGT) thành amino acid
Serine (AGT), 2 sóng tại điểm conflict chênh lệch nhau và 2 màu nucleotide khác
nhau, tra dữ liệu NCBI cho kết luận nghi ngờ có thể gây ra hội chứng phình đại
tràng bẩm sinh
Hình 3.11: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 13) với trình tự chuẩn
Phân tích dữ liệu hình 3.11 cho thấy vị trí c.2307 có phát hiện sự thay đổi trình tự
tại codon 769 (CTT thành CTG), 2 sóng tại điểm conflict chênh lệch nhau và 2 màu
nucleic khác nhau (T>G), tuy nhiên không làm thay đổi amino acid vẫn là Leucine,
tra dữ liệu NCBI cho kết luận lành tính SNP
56. Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
57. Đồ án tốt nghiệp
44
4.1. Kết luận
Sau khi tiến hành đề tài, qua kết quả thu nhận và các phân tích đã trình bày trong
phần III, chúng tôi kết luận:
- Tối ưu hóa thành công phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế
- Phân tích được trình tự DNA 6 exon (10, 11, 13, 14, 15, 16) của RET
- Phát hiện đột biến trên exon 11 và 13 của gen RET (bao gồm 4 bệnh nhân trong
một gia đình và một bệnh nhân không thuộc gia đình này)
Bảng 4.1: Kết quả giải trình tự phát hiện SNP tại exon 11, 13 [1]
Mẫu Exon 11 Exon 13
RET1 c.1900 T>C (p.Cys634Arg) c.2307 T>G (p.Leu769Leu)
RET2 c.1900 T>C (p.Cys634Arg) c.2307 T>G (p.Leu769Leu)
RET3 c.1900 T>C (p.Cys634Arg) c.2307 T>G (p.Leu769Leu)
RET4 c.1900 T>C (p.Cys634Arg) c.2307 T>G (p.Leu769Leu)
RET5 c.2071 G>A (p.Gly691Ser) c.2307 T>G (p.Leu769Leu)
Kết luận: Ở exon 11 của các mẫu RET1, RET2, RET3, RET4, có phát hiện đột
biến tại vị trí c.1900T>C (p.Cys634Arg) làm thay đổi Aa Cystein thành Arginine tại
codon 634, đây là một đột biến thường gặp gây ra hội chứng MEN2A đã được báo
cáo trước đây. Riêng mẫu RET5 có phát hiện sự thay đổi SNP ở vị trí c.2071G>A
(p.Gly691Ser) và nghi ngờ hội chứng phình đại tràng bẩm sinh (Hirschsprung)
Tại exon 13 của các mẫu RET1, RET2, RET3, RET4, RET5 có phát hiện SNP tại vị
trí c.2307T>G (p.Leu769Leu) không làm thay đổi Aa, kết luận lành tính.
4.2. Kiến nghị
Chúng ta cần tiến hành tầm soát các bất thường di truyền trên các bệnh nhân u
58. Đồ án tốt nghiệp
45
sắc bào tuyến thượng thận để có thể có kế hoạch theo dõi và điều trị.
Tiến hành nghiên cứu phát hiện đột biến gây bệnh u sắc bào tuyến thượng thận
trên nhiều gen khác.
60. Đồ án tốt nghiệp
46
Tài liệu là bài báo trong tạp chí Tiếng Anh:
1. "MEN2 Database". University of Utah.
2. Applied Biosystems, (2002). “BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
Protocol”.
3. Arighi E, Borrello MG, Sariola H (2005). "RET tyrosine kinase signaling in
development and cancer". Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4–5): 441–
67. doi:10.1016/j.cytogfr.2005.05.010. PMID 15982921.
4. Bausch B, Koschker AC, Fassnacht M, et al, (2006). “Comprehensive mutation
scanning of NF1 in apparently sporadic cases of pheochromocytoma”. J
ClinEndocrinolMetab, 91:3478–3481.
5. Buffet A, Venisse A, Nau V, et al, (2012). "A decade (2001-2010) of genetic testing
for pheochromocytoma and paraganglioma". Horm Metab Res Horm
Stoffwechselforschung Horm Metab, 44(5):359–366
6. Burnichon N, Buffet A, Parfait B, et al (2012). “Somatic NF1 inactivation is a
frequent event in sporadic pheochromocytoma”. Hum Mol Genet, 21:5397-5405.
7. Hall. N, (2007). “Advanced sequencing technologies and their wider impact in
microbiology”, The Journal of Experimental Biology 209, pp. 1518-1525, UK
8. Knudsen B. et al, (2008): CLC Sequence Viewer
9. Lenders JWM, Duh Q-Y, Eisenhofer G, Gimenez-Roqueplo A-P, Grebe SKG,
Murad MH, Naruse M, Pacak K, Young WF, (2014). Endocrine Society.
"Pheochromocytoma and paraganglioma: an endocrine society clinical practice
guideline". J Clin Endocrinol Metab, 99(6):1915–1942
10.Lois M. Mulligan, (2014). “RET revisited: expanding the oncogenic portfolio”
Nature Reviews Cancer 14, 173–186
11.Moonim MT, (2012). "Tumours of chromaffin cell origin: phaeochromocytoma and
paraganglioma". Diagn Histopathol, 18(6):234–244
12.Pasmant E, Sabbagh A, Masliah-Planchon J, et al, (2011). Role of non-coding RNA
ANRIL in genesis of plexiform neurofibromas in neurofibromatosis type 1. J Natl
Cancer Inst, 103:1713–1722.
61. Đồ án tốt nghiệp
47
13.Ricketts C, Woodward ER, Killick P, et al, (2008). “Germline SDHB mutations and
familial renal cell carcinoma”. J Natl Cancer Inst, 100:1260–1262.
14.StratakisCA, Carney JA, (2006).” The triadof paragangliomas, gastric stromal
tumours and pulmonary chondromas (Carney triad) and the dyad of paragangliomas
and gastric stromal sarcomas (CarneyStratakis syndroe): molecular genetics and
clinical implications”. Endocrinol Metab. 91:827–836.
15.Takahashi M, Asai N, Iwashita T, et al, (1993). "Characterization of the ret proto-
oncogene products expressed in mouse L cells". Oncogene. 8 (11): 2925–
2929. PMID 8414495.
16.Wells SA, Asa SL, Dralle H, et al (2015). "Revised American Thyroid Association
guidelines for the management of medullary thyroid carcinoma". Thyroid Off J Am
Thyroid Assoc 25(6):567–610
Tài liệu trích dẫn từ Internet:
17.http://emedicine.medscape.com/article/1177266-overview
18.https://ghr.nlm.nih.gov/condition/von-hippel-lindau-syndrome#
19.https://ghr.nlm.nih.gov/condition/multiple-endocrine-neoplasia#genes
20.https://en.wikipedia.org/wiki/RET_proto-oncogene#Structure
21.www.vsmmb.com/data/upload_file/File/.../PCR_sequencing.pdf
22.https://thuocchuabenh.vn/benh-noi-tiet/u-tuy-thuong.html
23.http://cubocube.com/dashboard.php?a=348&b=1601&c=1
62. Đồ án tốt nghiệp
1
PHỤ LỤC
Pipetman P10 - P1000 Tủ an toàn sinh học cấp II Máy PCR
Bồn điện di Máy soi gel Máy ủ
Máy giải trình tự 3500 Thiết bị luân nhiệt Máy đo OD