Downloaded 44 times
![12
III. MÔI TRƯ NG NUÔI C Y T BÀO NG V T
Thành ph n môi trư ng nuôi c y t bào ng v t ph c t p hơn r t nhi u so v i môi trư ng
nuôi c y vi sinh hay t bào th c v t, thư ng ch a các thành ph n không xác nh. Do thành ph n
ph c t p, khó n nh nên ngư i ta quan tâm d n n nghiên c u, t o các môi trư ng t ng h p
có th ch ng b o qu n, s d ng, i u ch nh và n nh thành ph n trong nh ng l n nuôi c y
khác nhau.
Môi trư ng nuôi c y ch a ph n l n là nư c. N u ngu n nư c không n nh có th t o nên
s khác bi t quan tr ng trong ch t lư ng s d ng. i u này c bi t quan tr ng i v i các môi
trư ng không có huy t thanh, vì các h p ch t h u cơ và kim lo i hi n di n trong nư c c t vô trùng
kh ion có th gây c nghiêm tr ng i v i m t s ki u t bào.
III.1. Vai trò c a môi trư ng
Môi trư ng nuôi c y cung c p các ch t dinh dư ng c n thi t cho s phát tri n c a t bào in
vitro. Các ch t dinh dư ng thi t y u giúp t bào phân chia như amiono acid, acid béo, ư ng, các
ion, các vitamine, cofactor và các phân t c n thi t duy trì môi trư ng hóa h c cho t bào. M t
s thành ph n có th gi nhi u vai trò hơn, VD: sodium bicarbonat duy trì pH thích h p và t o áp
su t th m th u cho môi trư ng.
III.2. Thành ph n c a môi trư ng
a. Mu i vô cơ
Các mu i vô cơ trong môi trư ng gi vai trò quan tr ng i v i s phát tri n t bào in vitro,
như: cân b ng áp su t th m th u, duy trì cơ ch v n chuy n ch t qua màng, giúp i u hòa i n th
màng, bám g n t bào, ho t ng như các cofactor...
b. H m
H m có vai trò i u hòa pH c a môi trư ng nuôi c y. H u h t các môi trư ng s d ng h
m bicarbonate v i CO2 là thành ph n chính. Ngoài ra, còn có h th ng m phosphat và các m
h u cơ ph c t p khác. Cũng có th s d ng h m h u cơ hay huy t thanh trong môi trư ng cơ
b n.
Khi s d ng bicarbonate làm h th ng m chính trong môi trư ng thì s tương tác c a CO2
thu nh n t các t bào (hay t không khí) v i nư c, s d n n s i u ch nh pH môi trư ng theo
cân b ng c a phương trình:
H2O + CO2 = H2CO3 = H+
+ HCO-
3
S d ng h m bicarbonate/CO2 c n duy trì không khí v i 5–10% CO2 trong t .
Bicarbonate, CO2 r , không c i v i t bào nên ư c dùng ph bi n.
H m h u cơ ư c s d ng nhi u nh t là HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-
ethane sulfonic acid). Các h m h u cơ không nh y c m v i CO2, chúng cung c p m t h th ng
t t các t bào chuy n hóa m nh (s n xu t nhi u CO2) có th n nh pH.
M t s dung d ch m như Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethane] thư ng s d ng
trong sinh hóa có th gây c i v i t bào in vitro.
c. Carbohydrate
ư ng trong môi trư ng là ngu n cung c p C và năng lư ng cho s phát tri n t bào in
vitro. Các ư ng chính ư c s d ng là glucose và galactose, m t s môi trư ng còn s d ng](https://image.slidesharecdn.com/congnghesinhhocdongvat-170801125931/85/Giao-trinh-cong-ngh-sinh-h-c-d-ng-v-t-12-320.jpg)
Uploaded byDịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
Giáo trình công nghệ sinh học động vật
Công nghệ sinh học (CNSH) là lĩnh vực nghiên cứu sử dụng các nguyên lý khoa học để tạo ra hàng hóa và dịch vụ phục vụ con người, bao gồm cả công nghệ trên người và động vật. Genomics và proteomics là hai nhánh quan trọng trong CNSH, với genomics tập trung vào nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gen, trong khi proteomics nghiên cứu toàn bộ protein biểu hiện trong cơ thể. Công nghệ tế bào và nuôi cấy tế bào động vật cũng đang phát triển nhanh chóng, góp phần vào sản xuất vaccine và các sản phẩm sinh học khác.
More Related Content
Similar to Giáo trình công nghệ sinh học động vật
![1 . Lịch sử phát triển. [Autosaved].pptx](https://cdn.slidesharecdn.com/ss_thumbnails/1-250709100327-8801a031-thumbnail.jpg?width=640&height=640&fit=bounds)
More from Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
Giáo trình công nghệ sinh học động vật
- 1. 1 M U I. KHÁINI M Công ngh Sinh h c (CNSH) (Biotechnology) òi h i s t p h p c a trí tu , k thu t d a trên n n t ng cơ b n c a khoa h c s s ng. ó là k t qu c a vi c ng d ng nh ng nguyên lý khoa h c và công ngh ch t o, s n xu t nguyên v t li u b ng nh ng tác nhân sinh h c, nh m t o ra hàng hóa và d ch v ph c v con ngư i. Công ngh Sinh h c trên ngư i và ng v t (CNSH N& V) là nh ng k thu t CNSH ti n hành ho c ng d ng trên i tư ng ngư i và ng v t. nư c ta, CNSH trên ngư i chưa th c s phát tri n thành m t lĩnh v c c l p, nên thư ng ư c g i chung là Công ngh Sinh h c ng v t (CNSH V). CNSH V có l ch s ti m tàng lâu dài, các ki n th c và s ng d ng sơ khai ã di n ra cách ây 8.000 năm khu v c Tây B c Á, khi con ngư i l n u tiên bi t săn b t các loài ng v t hoang d i v nuôi l y th t, lông, s a…và sau ó thu n hóa chúng làm phương ti n v n chuy n. Cách ây nhi u th p niên, con ngư i ã có nhi u c i ti n m nh m trong chăn nuôi ng v t, bi t ch n l c nh ng cá th kh e m nh, tiêm ch ng phòng ng a b nh, th c hi n nhi u k thu t khác tăng cư ng kh năng sinh s n c a chúng. Tuy nhiên, CNSH V hi n i (d a trên thành t u t bào h c và di truy n h c) ch th t s b t u vào nh ng năm 60 c a th k XX và bùng n trong hai th p k g n ây. II. N N T NG KHOA H C VÀ K THU T II.1. GENOMICS VÀ B GEN NGƯ I II.1.1. Genomics Genomics là lĩnh v c nghiên c u v thành ph n, t ch c, ch c năng và ti n hóa c a thông tin di truy n ch a trong b gen. Ba lĩnh v c chính c a genomics: h gen c u trúc (structure genomics), h gen ch c năng (functional genomics), h gen so sánh (comparative genomics). Genomics ư c xem là tâm i m c a sinh h c, b i m i k t qu t nghiên c u genomics ã, và ang óng góp tích c c vào các lĩnh v c ng d ng như chăm sóc s c kh e con ngư i, nông nghi p, lâm nghi p và nhi u lĩnh v c khác. S phát tri n nhanh chóng c a genomics có s tr giúp c a các ngành khoa h c k thu t khác, ch ng h n các thi t b gi i trình t … Ngoài ra, s “ ua nhau” gi i mã b gen các sinh v t t nh ng năm 1990 v i nhi u quy mô, nhi u m c khi n công vi c này tr nên sôi ng. n nay, có trên dư i 100 loài ư c gi i mã b gen. II.1.2. B gen ngư i Ý tư ng gi i trình t c b gen ngư i ư c ưa ra t các cu c h p ư c t ch c vào nh ng năm 1984-1986 b i Cơ quan Năng lư ng M (U.S. Department of Energy). Chương trình ư c khai trương khi Cơ quan Năng lư ng và Vi n s c kh e M k t h p. Vào cùng th i i m này, vi c gi i trình b gen ngư i cũng ư c b t u Pháp, Anh và Nh t b n. V i xu hư ng này, vi c thành l p T ch c B gen Ngư i (Human Genome Organisation_HUGO) vào mùa xuân năm 1988, ã kéo theo m t s qu c gia khác cùng tham gia chương trình và có óng góp vào k ho ch này, c bi t là c và Trung Qu c.
- 2. 2 Tháng 6-1988, cuc h p quan tr ng v vi c gi i trình t và l p b n b gen (Genome Mapping và Sequencing Meeting) u tiên ư c t ch c t i Cold Spring Harbor ã ch ng ki n n l c c a k ho ch gi i trình t b gen ngư i c a Celera Genomics (nhóm th hai gi i trình t b gen ngư i do Craig Venter ch trì). Cu c h p ư c xem như là m t i m nh n ban u cho HGP. Nh s phát tri n, h p tác qu c t , nh ti n b c a genomics, cũng như k thu t máy tính, b n phác th o hành ng (working draft) b gen ngư i ã ư c hoàn thành vào 26/6/2000. Tháng 2/2001, các phân tích c a b n phác th o hành ng ư c công b . D án b gen ngư i hoàn thành và tuyên b k t thúc vào ngày 14/4/2003, s m hơn 2 năm H i ngh khoa h c c a NIH k ni m 50 năm chu i xo n kép DNA. Tháng 5-2006, trình t c a NST ngư i cu i cùng ư c công b trên t p chí Nature. M c dù h u h t các bài báo u cho r ng b gen ngư i ã hoàn thành, th t ra n năm 2006, nó v n còn chưa hoàn t t và s m t nhi u năm n a m i có th hoàn thành tr n v n, b i các vùng trung tâm c a m i NST (như centromere) luôn bao g m các trình t DNA l p l i cao, r t khó có th gi i trình t chúng v i k thu t hi n nay. * ng d ng và tri n v ng c a vi c nghiên c u b gen ngư i Các k thu t và công ngh m i, các ti n ư c t o ra t HGP, và nh ng nghiên c u genomics khác, ang có nhi u tác ng m nh lên kh p các ngành c a khoa h c s s ng. M t s ng d ng hi n t i và ti m năng c a vi c nghiên c u b gen: - Thu c phân t (Molecular medicine). - Các ngu n năng lư ng và các ng d ng môi trư ng. - ánh giá r i ro. - Sinh kh o c , nhân lo i h c, ti n hóa và s di cư ngư i. - DNA pháp y (DNA forensic). - Nông nghi p, sinh s n v t nuôi và ch bi n sinh h c. II.2. PROTEOMICS II.2.1. Khái ni m Proteomics là khoa h c nghiên c u proteome. Proteome là toàn b các protein ư c bi u hi n b i c genome. Vì m t s gen mã hóa cho nhi u protein khác nhau, nên kích thư c c a proteome thư ng l n hơn so v i s lư ng gen. Th nh tho ng khái ni m này còn s d ng nh m mô t toàn b protein ư c bi u hi n m t t bào, hay m t mô c bi t nào ó. II.2.2. Các công c c a proteomics Công c u tiên c a proteomics là d li u. Các d li u protein, EST và trình t b gen ư c thu th p t o ra m c l c các protein ư c bi u hi n trong sinh v t. Ch ng h n, d a vào các phân tích t t c trình t mã hóa c a Drosophila, ngư i ta th y có n 110 gen Drosophila mã hóa cho các domain gi ng EGF, và 87 gen mã hóa cho các protein v i các domain xúc tác tyrosine kinase. Theo ó, khi ti n hành proteomics loài này, c n có m t b n li t kê các protein ã bi t, n u nghiên c u g p ph i các thông tin gi i h n, hay các d li u t phương pháp kh i ph không rõ ràng, ngư i ta có th xác nh thành ph n protein t s trùng kh p v i d li u ã có s n này.
- 3. 3 Công c thhai là kh i ph (Mass spectrometry_MS). Các thi t b MS có nhi u thay i trong th p niên qua, c bi t là nh y. MS có th th c hi n ba ki u phân tích r t c n thi t cho proteomics. Th nh t là, MS cung c p s o lư ng chính xác kh i lư ng phân t c a m t protein nguyên v n như 100 kDa hay hơn. Do ó, phân tích MS có th là cách t t nh t xác nh kh i lư ng phân t (hơn c phương pháp i n di protein trên gel polyacrylamide). MS cũng cung c p s o kh i lư ng chính xác các peptide t quá trình protolytic. D li u t các peptide này ư c tìm ki m tr c ti p, nh m xác nh chính xác protein m c tiêu. Cu i cùng, phân tích MS cũng cung c p các trình t c a peptide t quá trình th y gi i. Các d li u t MS s cung c p chi n lư c rõ ràng (và m nh nh t) trong vi c xác nh protein. Công c th ba là các ph n thu gom, k t h p các d li u MS v i các trình t protein c bi t có s n trong cơ s d li u. Các ph n m m này s l y các d li u MS không ư c gi i thích rõ ràng và k t h p nó v i nh ng trình t cơ s d li u protein, hay EST và trình t b gen v i các thu t toán c bi t. Khía c nh m nh nh t c a nh ng công c này, là chúng cho phép t ng hóa ư c m t lư ng l n các d li u MS, cho các k t h p trình t protein khác nhau. Công c c n thi t th tư là k thu t phân tách protein. S phân tách các protein có hai m c ích trong proteomics. Th nh t, chúng làm ơn gi n các h n h p protein thành các protein ơn l hay các nhóm nh . Th hai, b i chúng cho phép phát hi n các khác bi t trong các m c protein so sánh gi a hai m u, nên k thu t phân tách, nh m phân tích protein s cho phép ngư i ti n hành xác nh ư c các protein c bi t. Thông thư ng, phương pháp i n di protein hai chi u (2D-SDS- PAGE) ư c s d ng trong proteomics. M t s k thu t khác cũng ư c s d ng là 1D-SDS- PAGE, hay s c ký l ng hi u năng cao (high-performance liquid chromatograph_HPLC), các k thu t ch y i n di mao qu n (Capillary electrophoresis_CE), s c ký ái l c… II.2.3. Các ng d ng c a proteomics K thu t proteomics th t s có tác ng l n v i b n ng d ng chính. Khai thác (Mining): xác nh các protein có trong m t m u t cơ s d li u gen. Ghi nh n s bi u hi n c bi t (Protein-expression profiling): xác nh các protein trong m t m u c bi t, cũng như ch c năng c a m t tr ng thái c bi t c a t bào hay cơ th (tr ng thái bi t hóa, tr ng thái phát tri n, tr ng thái b nh…), hay ch c năng c a s ti p xúc v i thu c, các kích thích hóa lý. L p các sơ m ng lư i protein (Protein-network mapping): xác nh phương th c các protein tương tác v i nhau trong các h th ng s ng. L p b n các bi n i protein (Mapping of protein modification): xác nh phương th c và v trí các protein b bi n i. II.3. CYTOMICS Cytomics là nghiên c u các quá trình sinh hóa, nh m k t h p các cơ ch m c th p hơn vào các quá trình m c t bào và cu i cùng là cơ th . Cytomics giúp hi u và tái thi t l p các quá trình chuy n hóa (genome, proteome, metabolome), mô ph ng t bào và các cơ th nh . Phân tích các quá trình chuy n hóa n i bào, metabolome, giúp hi u ư c m ng lư i protein, và s hi n di n các gen im l ng (silent gene).
- 4. 4 II.4. CÔNG NGHNANO VÀ MICRO Công ngh nano liên quan n kh năng s p x p các phân t và các nguyên t thành các c u trúc phân t . Nó có tác ng chính lên máy tính, các v t li u và s s n xu t các công c , thi t b , kh năng can thi p vào các c p i u tr b nh. Các k thu t thi t k máy micro ang phát tri n nhanh chóng và có nhi u ng d ng trong các vi dòng (microfluidic), các trong sensor, s i quang h c... Các microrobot và nanorobot ho t ng như các robot di ng nh trong d ch cơ th là công c tuy t v i cho các thao tác t bào. S ra i c a biochip là m t ti n b vư t b c c a công ngh sinh h c nano, chúng ch a ng m t ph m vi r ng các v n nghiên c u như genomics, proteomics, sinh h c máy tính và dư c h c, cũng như m t s ho t ng khác. Nh ng ti n b trong lĩnh v c này t o ra nh ng phương pháp m i, g r i cho nh ng quá trình sinh hóa x y ra trong t bào, v i m c ích là tìm hi u và ch a tr các căn b nh cho ngư i. Các biochip ư c xem là các phòng thí nghi m thu nh , b i l trên nó có th ti n hành hàng trăm n hàng ngàn ph n ng sinh hóa. Biochip giúp các nhà nghiên c u có th sàng l c nhanh m t lư ng l n các ch t sinh h c v i nhi u m c ích khác nhau, t ch n oán b nh n phát hi n các tác nhân nguy h i sinh h c. II.5. K THU T T BÀO NG V T IN VITRO Vi c các t bào ng v t có th nuôi c y, duy trì và tăng sinh trong các chai, l ngày càng d dàng hơn trong phòng thí nghi m, ã m ra hư ng m i quan tr ng trong nghiên c u CNSH N& V- ó là công ngh t bào ng v t. Các dòng t bào cũng ư c thi t l p, ây là mô hình in vitro lý tư ng cho các nghiên c u nói chung. Nuôi c y các t bào ng v t lư ng l n là n n t ng c a s n xu t vaccine virus và nhi u s n ph m công ngh sinh h c khác. Các ch t sinh h c ư c s n xu t b ng k thu t DNA tái t h p trong nuôi c y t bào ng v t như enzyme, hormone, các kháng th ơn dòng, interleukin…hay các nhân t kháng ung thư. M c dù nhi u protein ơn gi n hơn có th ư c s n xu t vi khu n, nhưng nhi u dư c ch t c n s glycosyl hóa, i u này h u như ph i ư c ti n hành trong t bào ng v t. Thu nh n, nuôi c y và bi t hóa t bào là m t thành công m i trong lĩnh v c nuôi c y t bào ng v t. Tuy m i phát tri n, nhưng các t bào g c (stem cell) ã h a h n nhi u ng d ng to l n trong y sinh h c.
- 5. 5 CHƯƠNG 1 NUÔI CY MÔ – T BÀO NG V T I. GI I THI U I.1. LƯ C S PHÁT TRI N K thu t nuôi c y mô – t bào ng v t là k thu t nuôi c y in vitro các t bào, mô và cơ quan c a ng v t nh m duy trì và/hay tăng sinh các t bào, mô, cơ quan ó m t cách c l p, tách kh i nh ng bi n i c a h th ng in vivo i u ki n bình thư ng ho c stress. K thu t này u tiên ư c th c hi n v i các m u mô, và t c tăng sinh c a chúng r t ch m. Vi c nuôi c y mô và t bào ng v t ã ư c ti n hành hơn 100 năm nay, thông qua nh ng nghiên c u u tiên nh m tìm hi u m t s v n trong lĩnh v c sinh h c phát tri n. Ch ng h n Ross Harrison (1907) ã thành công trong vi c nuôi t bào th n kinh b ng d ch huy t ch trư ng thành. Alexis Carrel cũng ã nuôi phôi gà trong môi trư ng b sung các ch t dinh dư ng và gi ư c tim phôi gà ho t ng n tháng th ba (1912). Năm 1955, Harry Eagle’s kh ng nh d ch chi t mô ph c t p, d ch huy t và nh ng ch t ang dùng nuôi t bào có th ư c thay b i “m t h n h p các amino acid, vitamin, các co-factor, carbohydrate và mu i, b sung v i m t lư ng nh protein huy t thanh…”, i u này ã m ra m t th i kỳ m i trong nuôi c y t bào ng v t in vitro. Sau ó, hàng lo t các k thu t nh m khai thác, bi n i và ng d ng các t bào ng v t nuôi c y in vitro ư c ti n hành như t o các t bào bi n i di truy n, nghiên c u s chuy n hóa và sinh lý t bào, thu nh n và t o dòng in vitro các dòng t bào bình thư ng (t bào sinh dư ng, sinh d c), và b t thư ng (t bào ung thư) c a ngư i, cũng như c a nhi u ng v t khác. T m t th c t là nh ng kh i u c a ngư i có th t o nên dòng t bào liên t c (như dòng t bào Hela ư c Gey và cs thi t l p năm 1952), nuôi c y mô c a ngư i ã ư c u tư nghiên c u. Sau ó, vào năm 1961 Hayflick và Moorhead kh o c u v các t bào bình thư ng có i s ng xác nh. Các dòng t bào u tiên ã ư c thi t l p thành công, chúng duy trì ít nh t m t ph n c i m, ch c năng ban u như các t bào tuy n thư ng th n, t bào tuy n yên, t bào th n kinh, t bào cơ... S phát tri n c a k thu t nuôi c y mô ngày càng tinh vi, hi n i do nhu c u b c thi t c a hai hư ng nghiên c u chính: t o vaccine kháng virus và nghiên c u v ung thư. Hi n nay, các nhà nghiên c u ang ti n t i s d ng d ng t bào lai (hybridoma) gi a t bào ng v t và t bào ung thư, như là m t h th ng s n xu t các protein tái t h p, ví d kháng th ơn dòng, vaccine, interferon… G n ây, nuôi c y t bào g c (stem cell) tr thành mũi nh n m i trong công ngh t bào, v i nhi u hy v ng ng d ng y sinh. I.2. SƠ LƯ C V T BÀO NG V T Các t bào ng v t có vú là t bào eukaryote, chúng ư c liên k t v i nhau b i các nguyên li u gian bào t o thành mô. Mô ng v t thư ng ư c phân chia theo b n nhóm: bi u mô (epithelium), mô liên k t (connective tissue), mô cơ (muscle) và mô th n kinh (nerve). Trong nuôi c y t bào ng v t, ngư i ta phân bi t hai nhóm: các t bào d ch huy n phù và các t bào dính bám.
- 6. 6 - Các tbào d ch huy n phù: là nh ng t bào không bám dính khi sinh trư ng trong môi trư ng nuôi c y in vitro, ví d các t bào máu và t bào lympho; nh ng t bào này không òi h i b m t sinh trư ng. - Các t bào dính bám: H u h t các t bào ng v t bình thư ng là các t bào dính bám, vì th chúng c n có b m t g n vào và sinh trư ng (th y tinh, plastic), ư c s d ng ph bi n trong các ng d ng là các t bào bi u mô và nguyên bào s i (fibroblast). Ngư i ta thư ng s d ng ĩa petri ho c các chai tr c lăn nuôi c y các t bào dính bám. Các giá th là polymer b t bi n (spongy), th g m (ceramic), các s i r ng, microcapsule ho c các th mang có kích thư c hi n vi (microcarrier) cũng ư c s d ng r ng rãi tăng t l di n tích/th tích trong nuôi c y. Có m t m i quan h quan tr ng gi a hình d ng t bào và tính ch t bám dính c a chúng. N u t bào bám dính vào b m t nuôi c y, chúng s có hình dài, tr i r ng trên m t áy h p nuôi, ngư c l i, n u không bám dính, t bào s có hình kh i c u u. * c i m c a các t bào ng v t - T bào ng v t không có vách, nhưng kích thư c khá l n (kho ng 10 µm), nên tính b n cơ h c y u. Do ó, t bào ng v t trong nuôi c y in vitro r t d v b i các l c tác ng khi khu y tr n tách t bào, thao tác… Vì v y, khi thao tác v i t bào ng v t, c n c g ng thao tác nh nhàng và trong th i gian ng n nh t. - T bào ng v t có tăng trư ng và phân chia ch m, nên hi u su t s n sinh các ch t có ho t tính sinh h c r t th p, ch m. Do ó, s n xu t các ch t có ho t tính t t bào ng v t, c n ph i có th i gian dài và kh i lư ng t bào l n. - t bào ng v t, có cơ ch kìm hãm ngư c (negative feed-back), có nghĩa là s gia tăng n ng c a m t ch t nào ó trong môi trư ng s d n n c ch t bào t ng h p và ti t ch t ó ra môi trư ng. i u này có th gây t n thương t bào, th m chí còn có th làm ch t hàng lo t. Vì v y, khi nuôi c y mô – t bào ng v t, sau m i kho ng th i gian nuôi c y nh t nh, c n thi t ph i thay m i môi trư ng nuôi. - Tr t bào máu và m t s giai o n c a t bào sinh d c, h u h t các mô và t bào ng v t c n bám vào giá có th s ng và phân chia. Thông thư ng t bào tăng trư ng t t khi g n vào b m t r n. T bào s ng ng phân chia khi ã hình thành l p ơn liên t c trên b m t c a d ng c nuôi. Tuy v y, m t s dòng t bào như t bào ung thư, ho c dòng t bào liên t c t mô bình thư ng, sau khi ư c thu n hóa, có th sinh trư ng và phân chia trong tr ng thái lơ l ng mà không c n bám vào n n. - Các t bào ng v t có th thay i ki u gen và ki u hình, thông qua quá trình dung h p hai t bào có nhân khác nhau t o thành t bào lai (hybridoma) ho c quá trình bi n n p. VD: ch ng t bào bình thư ng có th c m ng thành t bào có các tính ch t c a t bào ung thư, thông qua quá trình bi n n p ư c th c hi n b i m t virus c m ng ung thư ho c b ng hóa ch t. - Các dòng t bào ng v t có th ư c b o qu n l nh sâu trong nitơ l ng (-197o C) su t nhi u năm. Khi ư c gi i ông và ho t hóa, t bào ph c h i kh năng tăng trư ng và phân chia như ban u. Ngoài các c tính trên, t bào ng v t còn có các c i m khác như kém thích nghi v i môi trư ng, nh y c m v i ion kim lo i, và a s t bào ng v t c n huy t thanh, hormone… tăng trư ng và phân chia. T t c nh ng c i m trên c n ư c lưu ý trong quá trình nuôi c y in vitro.
- 7. 7 I.3. ƯU IM VÀ H N CH C A NUÔI C Y MÔ – T BÀO NG V T * Ưu i m - H th ng t bào ng v t là các “nhà máy t bào” thích h p cho vi c s n xu t các phân t ph c t p và các kháng th dùng làm thu c phòng b nh, i u tr ho c ch n oán: như các enzyme, hormone, vaccine, kháng th ơn dòng, thu c tr sâu sinh h c, interferon và interleukin, các t bào nguyên v n th nghi m ch t c hóa h c… - Các t bào ng v t có quá trình bi n i h u d ch mã chính xác (post translational modifications) i v i các s n ph m protein sinh-dư c (biopharmaceutical protein) như phân gi i protein, liên k t ti u ơn v (subunit), ho c nhi u ph n ng k t h p khác như glycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành các c u n i disulfide ho c phoshorylation các g c amino acid. Nh ng s a i này r t quan tr ng nh hư ng n ho t tính sinh h c c a s n ph m. Ví d quá trình glycosylation có th giúp b o v protein ch ng l i s phân gi i chúng, duy trì kh năng n nh c u trúc và bi n i kháng nguyên. - S n xu t các viral vector dùng trong li u pháp gen nh m ch a tr nhi u b nh như ung thư, HIV, viêm kh p, các b nh tim m ch và xơ hóa u nang. - S n xu t các t bào ng v t dùng như m t cơ ch t in vitro trong nghiên c u c ch t h c và dư c h c. - Phát tri n công ngh mô ho c phát sinh cơ quan s n xu t các cơ quan thay th nhân t o- sinh h c hay các d ng c tr giúp, như: da nhân t o ch a b ng, mô gan ch a viêm gan, o Langerhans ch a ti u ư ng… * H n ch M c dù ti m năng ng d ng c a nuôi c y t bào ng v t là r t l n, nhưng vi c nuôi c y m t s lư ng l n t bào ng v t thư ng g p các khó khăn sau: - T bào ng v t có kích thư c l n hơn và c u trúc ph c t p hơn t bào vi sinh v t. - T c sinh trư ng c a t bào ng v t r t ch m so v i t bào vi sinh v t. Vì th , s n lư ng c a chúng khá th p và vi c duy trì i u ki n nuôi c y vô trùng trong m t th i gian dài thư ng g p nhi u khó khăn hơn. - Các t bào ng v t ư c bao b c b i màng huy t tương, m ng hơn nhi u so v i thành t bào dày ch c thư ng th y vi sinh v t ho c t bào th c v t, và k t qu là chúng r t d b v . - Nhu c u dinh dư ng c a t bào ng v t chưa ư c xác nh m t cách y , và môi trư ng nuôi c y thư ng òi h i b sung huy t thanh máu r t t ti n. - T bào ng v t là m t ph n c a mô ã ư c t ch c (phân hóa) hơn là m t cơ th ơn vào riêng bi t như vi sinh v t. - H u h t các t bào ng v t ch sinh trư ng khi ư c g n trên m t b m t. I.4. M T S KHÁI NI M DÒNG T BÀO - Dòng t bào (cell line): là thu t ng dùng ch m t qu n th t bào gi ng h t nhau b t ngu n t m t t bào ban u. - Dòng t bào liên t c (continued cell line; established cell line): là dòng t bào nuôi c y trong i u ki n in vitro qua nhi u th h , và có th duy trì kh năng phân bào trong m t th i gian r t dài, có khi là vĩnh vi n mà không thay i c tính. Ví d : CHO (chinese hamster ovary: t bào
- 8. 8 bu ng trng chu t Trung qu c), Schneider-2 (t bào phôi ru i gi m), COS1 (t bào th n kh xanh Châu Phi), Hela (t bào ung thư c t cung ngư i), Vero (t bào th n kh xanh Châu Phi)... - Dòng t bào t m th i (temporary cell line): là dòng t bào ch s ng trong i u ki n nuôi c y m t th i gian gi i h n. ây thư ng là các dòng t bào thư ng (không ph i ung thư). - T bào sơ c p (primary cell): là các t bào ư c nuôi c y trong i u ki n in vitro l n u tiên (nuôi c y sơ c p) sau khi ư c tách ra t kh i mô. - T bào th c p (secondary cell): là các t bào ã qua vài l n c y truy n (nuôi c y th c p) sau khi ư c tách t kh i mô. I.5. CÁC C P NUÔI C Y MÔ VÀ T BÀO NG V T Nhìn chung, trong phòng thí nghi m thư ng có ba c p chính: nuôi c y cơ quan, nuôi c y mô phát tri n sơ c p và nuôi c y t bào. I.5.1. Nuôi c y t bào T bào trong i u ki n in vitro có nh ng i m khác bi t so v i in vivo. Th nh t là t bào nuôi c y in vitro không có c tính tương tác t bào chuyên bi t (tương tác a chi u) như mô c a t bào in vivo. Th hai là môi trư ng in vitro thi u vài thành ph n liên quan n s i u hòa in vivo, do ó chuy n hóa c a t bào in vitro n nh và d ki m soát hơn trong in vivo, nhưng có th không th c s i di n cho mô. Tuy nhiên, dù th nào i n a thì nuôi c y mô – t bào ng v t cũng ã th hi n nhi u kh năng c bi t trong nghiên c u và ng d ng, nó ã và ang là công c r t h u ích. Có nhi u hình th c nuôi c y khác nhau tùy c tính t bào, hay tùy thu c vào phương pháp: nuôi c y sơ c p (Primary culture), nuôi c y th c p (Secondary culture), nuôi c y huy n phù (Suspension culture) và nuôi c y l p ơn (Monolayer culture). Nuôi c y sơ c p: là nuôi c y các t bào sau khi ư c tách ra t cách m nh mô và trư c l n c y chuy n u tiên. Nuôi c y sơ c p thư ng ư c s d ng khai thác các t bào ban u trong nh ng m nh mô, nh m t o ra các dòng t bào m i. Trong nuôi c y sơ c p, các t bào ban u thư ng là m t h n h p các dòng khác nhau, ho c ch a m t ki u t bào tr i nh t, trong ó có nh ng t bào quan tâm và nh ng t bào khác (t bào nhi m). Có th lo i b các t bào nhi m b ng cơ h c, hay enzyme khi tách mô, hay b ng cách duy trì các i u ki n ch n l c dương tính cho s s ng sót c a m t ki u t bào quan tâm c n thu nh n. Quy trình nuôi c y sơ c p: thu nh n các m nh sinh ph m, các m nh mô s ng x lý sơ b , lo i b vi khu n, n m và các thành ph n không mong mu n khác tách t o huy n phù t bào ơn ưa vào môi trư ng nuôi c y. Nuôi c y th c p ư c ti n hành sau khi t bào ư c t o dòng t nuôi sơ c p. Nhi u dòng t bào ã ư c thi t l p và thương m i hóa. Ph n l n các dòng này ư c thu nh n t kh i u (ví d t bào Hela, RD…) hay t các t bào b bi n i in vitro. Tuy nhiên, các dòng t bào này ư c nuôi c y trong các phòng thí nghi m khác nhau nên có th d n n s phát sinh các c tính m i khác nhau và khác v i các t bào sơ khai ban u. Các t bào nuôi c y th c p là i tư ng chính cho nghiên c u và ng d ng c a công ngh t bào ng v t. Quy trình nuôi c y th c p: gi i ông ( i v i các t bào ư c b o qu n l nh) ưa vào môi trư ng thích nuôi c y thích h p
- 9. 9 Nuôi c yhuy n phù thư ng ư c ti n hành v i các t bào thu nh n t máu (b ch c u…). Có th coi ây là phương pháp nuôi c y trong không gian ba chi u v i k thu t nhân sinh kh i b ng fermenter, thông qua h th ng bioreactor, nh m thu nh n lư ng l n các t bào mong mu n. Nuôi c y l p ơn ư c ng d ng v i nh ng dòng t bào khác thu nh n t các mô r n (ph i, th n, cơ, xương, m …) c n nuôi phát tri n thành l p ơn. Các dòng t bào bám dính có th ư c phân lo i như t bào n i mô: BAE-1; t bào bi u mô: Hela; mô th n kinh: SH-SY5y hay fibroblast: MRC-5. Thông thư ng, hình d ng in vitro c a các t bào s ng nói trên luôn ph n ánh ngu n g c c a mô. Ngoài ra, m t s dòng t bào khi nuôi s bi u hi n tr ng thái bán bám dính (semi-adheret) như B95-8. Khi ó, trong d ng c nuôi s xu t hi n h n h p hai qu n th t bào: các t bào bám và các t bào huy n phù. * Nh ng thu n l i c a nuôi c y t bào - Có th phát tri n m t dòng t bào qua nhi u th h . - Có th nuôi c y quy mô l n. * Nh ng b t l i c a nuôi c y t bào - T bào b m t i m t s c tính ã bi t hóa trong mô. I.5.2. Nuôi c y mô Nuôi c y mô phát tri n sơ c p ư c ti n hành b ng cách t các m nh mô lên trên b m t r n b ng nh a, hay th y tinh bao ph b i các ch t dinh dư ng d ng l ng. Trong i u ki n thích h p, các m nh mô s bám vào b m t r n, các t bào ph n rìa c a m nh mô s tăng sinh làm n i r ng m nh mô. K thu t này cung c p mô hình th nghi m thu n l i hơn so v i các th nghi m in vivo, c bi t khi ti n hành các nghiên c u v c t . Nuôi c y mô phát tri n sơ c p còn dùng thu nh n các qu n th t bào. * Nh ng thu n l i c a nuôi c y mô - Các y u t lý hóa c a môi trư ng (pH, nhi t , áp su t th m th u, O2, CO2) ư c ki m soát t t. Các y u t b sung có thành ph n không xác nh cũng ang d n ư c hi u rõ và ư c thay th b i nh ng thành ph n xác nh. - M u mô không ng nh t nhưng sau vài th h nuôi c y in vitro, nh ng dòng t bào này tr nên ng nh t hơn hay ít nh t là cùng d ng. - Nh ng t bào nuôi c y có th ti p xúc tr c ti p v i m t ch t n ng th p và xác nh, và ch t này có th xâm nh p tr c ti p vào t bào. - So v i nuôi c y cơ quan thì trong nuôi c y mô, m t s ch c năng bình thư ng c a mô v n ư c duy trì và có th nuôi c y trên quy mô l n (nhưng khó ti n hành). * Nh ng khó khăn c a nuôi c y mô - T ch c ban u c a mô b m t. - K thu t nuôi c y c n ư c th c hi n i u ki n vô trùng tuy t i. T bào ng v t òi h i ư c cung c p m t môi trư ng ph c h p, gi ng huy t tương máu hay d ch l ng k các t bào. Do ó, òi h i ngư i th c hi n ph i có k năng thành th o và hi u bi t t t v lĩnh v c này. - Tiêu hao nhi u công s c và ti n b c nhưng ch thu ư c m t lư ng nh . Giá thành vi c nuôi c y cao, do ó ch nên s d ng khi c n thi t.
- 10. 10 - Sau mt th i gian phân chia liên t c, có th t o thành các t bào v i b NST a b i không hoàn ch nh. Ngay c v i nuôi c y trong th i gian ng n, m c dù các t bào có th n nh v m t di truy n, nhưng s không ng nh t v t c tăng trư ng c a t ng t bào có th t o ra s thay i t th h này sang th h khác. I.5.3. Nuôi c y cơ quan K thu t nuôi c y cơ quan ư c phát tri n t các phương pháp nuôi c y mô nh m ph c v nghiên c u, ây có th là mô hình ch c năng trong nhi u th nghi m. ó là k thu t nuôi c y in vitro nh ng m nh c a m t cơ quan hay c cơ quan, duy trì c u trúc c a mô và hư ng nó phát tri n bình thư ng. Môi trư ng nuôi c y cơ quan có th d ng môi trư ng r n hay môi trư ng l ng. Vi c nuôi c y cơ quan thu nh n t phôi thai d dàng hơn các cơ quan t cơ th trư ng thành, b i nhu c u O2 c a nh ng mô trư ng thành l n hơn nhi u. Vì v y, nuôi ư c các cơ quan t cơ th trư ng thành ph i s d ng môi trư ng v i các thi t b c bi t. Nh ng thu n l i c a nuôi c y cơ quan: - Ch c năng sinh lý bình thư ng c a cơ quan ư c duy trì. - T bào gi tr ng thái bi t hóa hoàn toàn. Nh ng b t l i c a nuôi c y cơ quan: - Không th nuôi c y quy mô l n. - Cơ quan nuôi c y phát tri n ch m. - Thư ng xuyên ph i c y chuy n sang môi trư ng m i cho m i thí nghi m. II. I U KI N LÝ – HÓA TRONG K THU T NUÔI C Y MÔ – T BÀO NG V T II.1. Nhi t T bào c a các loài ng v t khác nhau có nhi t nuôi c y thích h p khác nhau. VD: t bào c a ng v t có vú và c a ngư i phát tri n t t 37 ± 10 C, nhi t t bào c a các loài chim phát tri n t t 38,50 C, còn t bào c a các loài côn trùng phát tri n t t nhi t 25 ± 20 C. M t s dòng t bào phát tri n nhi t th p hơn thân nhi t bình thư ng c a cơ th , VD: t bào bi u mô, t bào tinh trùng... Trong nuôi c y in vitro, t bào ng v t không ch u ư c nhi t cao hơn 20 C so v i nhi t phát tri n thích h p c a chúng, nhưng t bào l i có kh năng ch u ng ư c nhi t th p hơn nhi t phát tri n t i ưu c a chúng mà r t ít nh hư ng n s phát tri n c a chúng sau này. duy trì nhi t nuôi c y, thư ng ph i s d ng t m (incubator). Nhìn chung, các t m duy trì nhi t b ng cách làm m và tu n hoàn khí nóng áp ng v i nh ng thay i nhi t và s tr l i nhi t nhanh chóng sau khi m hay óng c a t . i v i các t m có b sung nư c khay bên dư i s duy trì m cao. II.2. pH pH không ch quan tr ng trong vi c duy trì s cân b ng ion thích h p mà còn duy trì ch c năng t i ưu c a các enzyme n i bào, cũng như s g n k t c a các hormone và nhân t tăng trư ng lên các receptor b m t. S bi n i pH có th làm thay i chuy n hóa t bào, d n t i s c m ng
- 11. 11 s n xut protein shock nhi t, m t quá trình d n n s ch t t bào (apoptosis). Do v y, ki m soát pH là c n thi t t i ưu hóa i u ki n nuôi c y. pH t i ưu cho s phát tri n c a t bào nuôi c y khác nhau tùy theo loài và tùy theo dòng t bào. H u h t các t bào s ng trong môi trư ng có ngư ng pH 6,5 – 7,8 nên môi trư ng nuôi c y thư ng ư c i u ch nh pH 7,0 – 7,4 (trung bình là 7,2). M t s dòng t bào thích h p v i pH cao hơn (VD: t bào fibroblast ngư i thích h p v i pH 7,4 – 7,7) hay th p hơn (VD: t bào côn trùng phát tri n t t pH 6,2±0,1). Môi trư ng có pH n nh ít thay i có th giúp t bào s ng t t hơn. H u h t các môi trư ng thương m i ch a phenol red như là m t ch t ch th pH. Môi trư ng chuy n màu vàng cho bi t pH gi m (acid) và màu h ng n u pH tăng (ki m). II.3. Áp su t th m th u Áp su t th m th u c a môi trư ng ư c xác nh b i chính công th c môi trư ng. Mu i và glucose là hai tác nhân chính hình thành nên áp su t th m th u, m c dù các amino acid cũng quan tr ng. Thay i áp su t th m th u c a t bào h u như luôn tác ng lên s tăng trư ng và ch c năng t bào. N u t bào n m trong môi trư ng có áp su t không thích h p, chúng s bi n d ng: t bào co l i trong môi trư ng có áp su t th m th u quá cao, còn trong môi trư ng có áp su t quá th p, chúng s căng ph ng lên. ki m tra áp su t th m th u c a môi trư ng, thư ng s d ng Osmom k (Osmometer). Các môi trư ng thương m i ư c thi t k áp su t th m th u là 300 mOsm (t bào phát tri n trong kho ng 290 - 310 mOsm). Có th i u ch nh áp su t th m th u b ng cách thêm NaCl, c 0,0292 g/lít NaCl s làm tăng 1 mOsm (s d ng 5M NaCl v i 1ml/lít s làm tăng áp su t th m th u lên 10 mM). Chú ý là trong môi trư ng còn có các thành ph n ư ng, ion, các amino acid…chúng cũng óng góp vào s t o áp su t th m th u. II.4. Các lo i khí Ba lo i khí c n quan tâm: CO2, O2 và N2. T l c a chúng ư c ph i tr n thích h p theo các chương trình thi t k s n c a t nuôi, nh ó các phân áp khí ư c t o ra thích ng v i c i m sinh lý c a t bào và mô s ng. O2 có vai trò quan tr ng trong sinh trư ng, tăng sinh và bi t hóa t bào. Tuy nhiên, nhu c u v O2 c a t bào nuôi c y th p hơn nhu c u O2 c a mô s ng. Áp su t O2 trong t nuôi c y t bào thư ng th p hơn áp su t O2 trong không khí. Trong quá trình nuôi c y tĩnh, các phân t oxy trong không khí luôn có xu hư ng khu ch tán vào môi trư ng nuôi, qua l p môi trư ng dày ch ng vài milimet. Do v y, n u s d ng quá nhi u môi trư ng trong m t th tích h p s kìm hãm s khu ch tán oxy. N ng O2 ph bi n dùng trong t nuôi t bào thư ng t 16 – 20%. Tác ng c a CO2 lên nuôi c y t bào khó ư c xác nh m t cách chính xác, b i nó liên quan n hàm lư ng CO2 hòa tan, pH, n ng HCO3 - . Áp su t CO2 trong không khí có th i u hòa tr c ti p n ng CO2 hòa tan, v i s tham gia c a y u t nhi t . Chính s bi n i thu n ngh ch CO2 thành HCO3 - có th s làm thay i pH c a môi trư ng nuôi, do v y, n ng CO2 trong t nuôi có tính quy t nh n pH c a môi trư ng nuôi c y. i u này ư c hi u là, có th dùng n ng CO2 n nh pH c a môi trư ng nuôi. Tùy vào m i lo i t bào ch n n ng CO2 tương ng.
- 12. 12 III. MÔI TRƯNG NUÔI C Y T BÀO NG V T Thành ph n môi trư ng nuôi c y t bào ng v t ph c t p hơn r t nhi u so v i môi trư ng nuôi c y vi sinh hay t bào th c v t, thư ng ch a các thành ph n không xác nh. Do thành ph n ph c t p, khó n nh nên ngư i ta quan tâm d n n nghiên c u, t o các môi trư ng t ng h p có th ch ng b o qu n, s d ng, i u ch nh và n nh thành ph n trong nh ng l n nuôi c y khác nhau. Môi trư ng nuôi c y ch a ph n l n là nư c. N u ngu n nư c không n nh có th t o nên s khác bi t quan tr ng trong ch t lư ng s d ng. i u này c bi t quan tr ng i v i các môi trư ng không có huy t thanh, vì các h p ch t h u cơ và kim lo i hi n di n trong nư c c t vô trùng kh ion có th gây c nghiêm tr ng i v i m t s ki u t bào. III.1. Vai trò c a môi trư ng Môi trư ng nuôi c y cung c p các ch t dinh dư ng c n thi t cho s phát tri n c a t bào in vitro. Các ch t dinh dư ng thi t y u giúp t bào phân chia như amiono acid, acid béo, ư ng, các ion, các vitamine, cofactor và các phân t c n thi t duy trì môi trư ng hóa h c cho t bào. M t s thành ph n có th gi nhi u vai trò hơn, VD: sodium bicarbonat duy trì pH thích h p và t o áp su t th m th u cho môi trư ng. III.2. Thành ph n c a môi trư ng a. Mu i vô cơ Các mu i vô cơ trong môi trư ng gi vai trò quan tr ng i v i s phát tri n t bào in vitro, như: cân b ng áp su t th m th u, duy trì cơ ch v n chuy n ch t qua màng, giúp i u hòa i n th màng, bám g n t bào, ho t ng như các cofactor... b. H m H m có vai trò i u hòa pH c a môi trư ng nuôi c y. H u h t các môi trư ng s d ng h m bicarbonate v i CO2 là thành ph n chính. Ngoài ra, còn có h th ng m phosphat và các m h u cơ ph c t p khác. Cũng có th s d ng h m h u cơ hay huy t thanh trong môi trư ng cơ b n. Khi s d ng bicarbonate làm h th ng m chính trong môi trư ng thì s tương tác c a CO2 thu nh n t các t bào (hay t không khí) v i nư c, s d n n s i u ch nh pH môi trư ng theo cân b ng c a phương trình: H2O + CO2 = H2CO3 = H+ + HCO- 3 S d ng h m bicarbonate/CO2 c n duy trì không khí v i 5–10% CO2 trong t . Bicarbonate, CO2 r , không c i v i t bào nên ư c dùng ph bi n. H m h u cơ ư c s d ng nhi u nh t là HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2- ethane sulfonic acid). Các h m h u cơ không nh y c m v i CO2, chúng cung c p m t h th ng t t các t bào chuy n hóa m nh (s n xu t nhi u CO2) có th n nh pH. M t s dung d ch m như Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethane] thư ng s d ng trong sinh hóa có th gây c i v i t bào in vitro. c. Carbohydrate ư ng trong môi trư ng là ngu n cung c p C và năng lư ng cho s phát tri n t bào in vitro. Các ư ng chính ư c s d ng là glucose và galactose, m t s môi trư ng còn s d ng
- 13. 13 maltose hay fructose.N ng ư ng khác nhau gi a các môi trư ng cơ b n t 1g/l– 4,5g/l. Môi trư ng ch a n ng ư ng cao s giúp phát tri n nhi u ki u t bào. d. Vitamine Vitamine là cơ ch t cho nhi u cofactor, chúng có nhi u trong thành ph n huy t thanh. Tuy nhiên, nhi u lo i môi trư ng c n ư c b sung vitamine thích h p b i chúng r t quan tr ng trong nuôi c y t bào. c bi t vitamine nhóm B c n thi t cho s phát tri n t bào, và i v i m t s t bào, vitamine B12 là thi t y u. M t s môi trư ng có nhi u vitamine A và E. Thông thư ng vitamine ư c s d ng trong môi trư ng là riboflavin, thiamine và biotin. e. Các protein và peptide Các thành ph n này gi vai trò quan tr ng trong nuôi c y h u h t các t bào, c bi t khi nuôi c y v i môi trư ng không huy t thanh. M t s protein, peptide r t c n thi t như albumin, transferring, fibronectin và fetuin thư ng có s n trong huy t thanh. f. Acid béo và lipid Gi ng v i protein và peptide, các ch t này r t c n thi t trong môi trư ng nuôi không huy t thanh và cho m t s t bào c bi t. Chúng hi n di n trong huy t thanh v i các d ng như cholesterol và steroid. g. Y u t vi lư ng Bao g m k m, ng, selenium… và các tricarboxylic acid trung gian, trong ó selenium là ch t giúp tách các g c oxy t do. Ngoài ra, tùy vào m c ích nghiên c u có th ưa vào môi trư ng m t s vi lư ng c n thi t khác. h. Huy t thanh Trong h u h t các lo i môi trư ng nuôi c y t bào ng v t u có m t huy t thanh b i nó có nh ng vai trò quan tr ng như sau: - Cung c p ch t dinh dư ng quan tr ng cho t bào như các amino acid thi t y u, ti n ch t c a nucleic acid, các nguyên t vi lư ng… - Cung c p các nhân t tăng trư ng, kích thích cho t bào tăng trư ng và phân chia. - Kích thích s ph c h i các t n thương c a t bào khi c y chuy n, và các protein trong huy t thanh làm b t ho t trypsin, tránh các enzym gây t n thương t bào. - C i thi n tính tan c a các ch t dinh dư ng. - Ch ng oxy hóa: huy t thanh kháng oxy hóa m nh, và c ch c tính c a oxy. - C i thi n tính dính c a t bào lên b m t bình nuôi nh các y u t làm tăng dính c a t bào lên giá . Huy t thanh r t c n cho vi c nuôi c y t bào ng v t. Tuy nhiên, bên c nh nh ng tác ng t t nêu trên, huy t thanh cũng có nh ng tác ng không t t: - Nuôi c y t bào v i môi trư ng b sung huy t thanh chi phí cao, nh t là huy t thanh bò (FBS) làm tăng giá thành lên áng k (huy t thanh chi m 90% giá thành c a môi trư ng nuôi c y). - Huy t thanh d b nhi m virus, mycoplasm và khó n nh ch t lư ng c a nh ng lô môi trư ng khác nhau.
- 14. 14 - Huy tthanh còn ch a nh ng thành ph n gây c ch s phân bào và c m ng s phân hóa (VD: TGF - có tác d ng c ch s phân chia c a t bào thư ng bì khí qu n, làm t bào bi n thành hình có góc c nh; TGF- còn có tác d ng kìm hãm s phân chia c a dòng t bào bi u bì ngư i và chu t), (do ó khi nuôi c y, c n ch n lo i huy t thanh phù h p không ch a y u t c ch i v i dòng t bào nuôi c y). - M t s t bào nuôi c y không (ho c kém) phát tri n trong huy t thanh, chúng thích ng v i các môi trư ng c c b chuyên bi t, có tính ch t khác bi t rõ r t v i huy t thanh. - Nhi u ch t trong huy t thanh (vitamin C, các lipoprotein...) thư ng không n nh khi ông l nh hay b o qu n lâu. Môi trư ng b sung huy t thanh s có n ng hormone hay các nhân t tăng trư ng không thích h p v i s phát tri n c a m t s t bào. - Huy t thanh không pha loãng s c v i nhi u lo i t bào (cũng có m t s lo i t bào có kh năng ch u ng ư c n ng huy t thanh cao hơn các t bào khác, VD: các t bào n i mô thành m ch vì chúng phát tri n trong môi trư ng tương t huy t thanh nhưng không hoàn toàn gi ng huy t thanh) - Khi m t n ng hormone thích h p, huy t thanh cũng có th ch a cơ ch t c ch s phát tri n, bi t hóa hay ch c năng. Huy t thanh cũng kích thích s bi t hóa c a các t bào vào tr ng thái không nguyên phân, làm chúng không th duy trì dòng t bào b t t . Vì v y, nhi u nhà nghiên c u hư ng n xây d ng các môi trư ng t ng h p không dùng huy t thanh (như M-199) hay dùng v i lư ng th p (CMRL 1066, NTCT 109). phát tri n t bào trong môi trư ng không huy t thanh, c1o nhi u cách ti p c n, t t c các chi n lư c này u nh m k t h p s thay i liên t c v i vi c làm giàu các thành ph n dinh dư ng trong môi trư ng nuôi: - T o s thích nghi c a các t bào v i môi trư ng không huy t thanh và không b sung hormone nào. - S d ng huy t thanh ã ư c làm gi m (hay lo i b hoàn toàn) các l p hormone không c n thi t. - B sung thư ng xuyên vào môi trư ng không huy t thanh các nhân t tăng trư ng, bám dính và các nhân t phù h p khác. III.3. Ch n l c môi trư ng thích h p N u m t dòng t bào m i ư c mang vào phòng thí nghi m, c n xác nh môi trư ng thích h p phát tri n. Các thông tin này có th ư c ưa ra b i nhà cung c p. Cũng có th t tìm ư c thông tin thông qua vi c sàng l c, th nghi m v i nhi u loài môi trư ng khác nhau trong cùng i u ki n nuôi xác nh môi trư ng thích h p cho nuôi c y nh ng t bào phát tri n sơ c p u tiên, nh ng dòng t bào còn thi u thông tin ho c mu n tìm môi trư ng m i thay th cho m t dòng t bào nào ó. Hi n nay, tr nh ng dòng t bào ã thi t l p ư c thu n hóa v i môi trư ng t ng h p hoàn toàn, a s các dòng t bào còn l i ư c nuôi c y trong môi trư ng t ng h p có b sung 5–10% huy t thanh (có dòng t bào c n b sung 20% huy t thanh). ư c s d ng ph bi n là huy t thanh bê, cũng có m t s lo i t bào òi h i b sung huy t thanh bào thai bò trong môi trư ng nuôi c y. Ngoài huy t thanh, m t s nh ng d ch chi t sinh h c ph c t p (s a, d ch chi t phôi, huy t tương...), các nhân t tăng trư ng, hormone... cũng thư ng ư c b sung vào môi trư ng.
- 15. 15 III.4. K thut pha môi trư ng - Thành ph n môi trư ng: khác nhau tùy vào lo i s d ng. Khi pha môi trư ng c n ph i m b o cung c p y các thành ph n theo úng công th c. - i u ki n nuôi c y: thông thư ng các t bào ng v t phát tri n t t nh t nhi t m kho ng 36-39o C. c bi t khi nuôi c y t bào ng v t, i u ki n v m và n ng CO2 trong không khí r t quan tr ng. Trong các t nuôi c y t bào ng v t thư ng t m t khay nư c t o m cao trong không khí, tránh b c hơi nư c t môi trư ng nuôi, d n n thay i áp su t th m th u c a môi trư ng. N ng CO2 trong t nuôi thư ng 5%, c bi t có khi n 95%. - S vô trùng: ây là y u t c c kỳ quan tr ng và ư c lưu ý c bi t trong nuôi c y t bào ng v t. Virus và các vi sinh v t ngo i nhi m là nh ng nguy cơ l n, có th làm ch t t bào nuôi c y. Tùy theo tính ch t hóa h c c a các thành ph n môi trư ng ch n cách kh trùng thích h p, có th là h p ư t ho c l c vô trùng b ng milipore. IV. K THU T NUÔI C Y T BÀO IV.1. NUÔI C Y SƠ C P Quy trình nuôi sơ c p g m: Hình 1.1. Sơ nuôi c y sơ c p THU NH N M U MÔ C t nh (Ch n l c m u mô quan tâm, c t b ph n mô ch t) C t nh (M nh nh nuôi) Tách t bào b ng cơ h c (nghi n, ép) Tách t bào b ng enzyme ( …) Nuôi m u mô sơ c p Trypsin l nh Trypsin m Collagenase NUÔI SƠ C P Ly tâm Tái huy n phù C y chuy n DÒNG T BÀO Thu nh n t bào m i Nuôi m nh mô th c p
- 16. 16 + Bư c1: thu nh n mô (tươi hay ông l nh) có ch a t bào s ng. + Bư c 2: ph u tích và/ hay tách r i t bào, xác nh n ng . + Bư c 3: nuôi c y. IV.1.1. Thu nh n m u và x lý sơ b M u thu nh n có th bao g m b t kỳ mô nào c a cơ th . T i nơi thu nh n, m u c n ư c làm s ch (r a và sát trùng b ng c n) r i ưa vào b o qu n trong dung d ch DPBS r i chuy n nhanh v phòng thí nghi m. Tùy lo i m u mô cũng như th i gian c n thi t ưa v phòng thí nghi m, có k ho ch v n chuy n chúng trong i u ki n nhi t m (370 C), nhi t l nh hay ông l nh t m th i. X lý sơ b m u mô: r a nhi u l n b ng dung d ch DPBS có b sung kháng sinh, kháng n m c t b các ph n mô ch t, ph n th a c t m nh nh ra thành t ng m nh 2-3 mm2 nuôi m u mô sơ c p ho c tách r i các t bào. VI.1.2. Tách r i các t bào Mô là t p h p các t bào ư c t ch c tinh vi và c trưng, chúng liên k t thành m t kh i th ng nh t, thông qua các c u n i gian bào. Tách các t bào ra kh i mô c n phá b nh ng c u n i liên bào này, nhưng không gây t n thương áng k cho t bào. Có hai bi n pháp chính tách r i các t bào: a. Tách b ng cơ h c - C t nhuy n mô: Dùng kéo c t nhuy n m nh mô, huy n phù trong dung d ch PBS (-), l ng và thu d ch trong (huy n phù thu nh n các t bào ơn). Phương pháp này cho kh năng s ng c a t bào cao nhưng s lư ng t bào ơn thu nh n ít nên thư ng ư c áp d ng cho nh ng m u mô có kích thư c l n và không khan hi m. Trên th c t , vi c c t nhuy n mô thư ng dùng làm tăng kh năng ti p xúc c a mô v i enzyme trong k thu t tách b ng enzyme ư c ti n hành sau ó. - Ép nhuy n mô s d ng hai phi n lame: thư ng ư c s d ng tách t bào nh ng mô có liên k t y u (như mô lách). Ngoài ra còn có th s d ng các pittong c a syringe ép mô trong ĩa petri nh m tách r i các t bào. - Ép b ng màng l c t bào (Cell strainer): t m u mô lên trên màng l c (có ư ng kính l 70 – 100µm), s d ng pittong c a syringe chà sát m nh m nh mô, khi ó, nh ng t bào s va ch m vào lư i l c và tách r i. Nh ng t bào ơn (có ư ng kính nh hơn l l c) s l t qua l l c. b. Tách b ng enzyme C u n i gian bào có b n ch t là protein (các t bào liên k t v i nhau và v i ECM), do v y các protease s d ng tách t bào là nh ng enzyme thu phân protein như: trypsin, collagenase, elastase, pronase, dispase hay nh ng t h p khác. Vi c s d ng enzyme có th riêng l , hay k t h p tùy thu c vào m c ích. Trypsin c t liên k t gi a nhóm carboxyl (-COOH) c a lysin ho c arginin và g c amin (- NH2) c a axid amin b t kì ng li n k v i nó trong polypeptid, ngo i tr liên k t gi a lysin và arginin. X lý trypsin d n n s cu n tròn t bào. Khi các t bào co l i, các liên k t tr nên l ng l o và t bào d dàng ư c tách ra b i tác ng cơ h c. Trypsin ho t ng trong môi trư ng pH 6 – 9, t i ưu pH 8 – 9, r t b n v ng trong môi trư ng acid y u.
- 17. 17 Canxi ư cxem như ch t b o v cho trypsin, ho t tính xúc tác c a trypsin b gi m 50% khi v ng m t Ca2+ vì trypsin tr nên trơ. M t s kim lo i như coban, mangan… có kh năng ho t hóa trypsin. Ho t tính c a trypsin s b kìm hãm b i huy t thanh bò có thai ho c DFP (di-isopropyl fluoro phosphate). N ng trypsin thư ng dùng tách t bào là 0,01–0,5% (thư ng là 0,25%), ôi khi là 1%. Có th s d ng quy trình trypsin m (370 C) hay trypsin l nh (40 C). Trypsin không tác ng c hi u cho lo i protein, vì v y có th phân c t các protein màng và gây v t bào khi dùng n ng cao, ho c cho tác ng trong th i gian dài. C n trung hòa trypsin b ng huy t thanh ngay sau khi thu u c t bào ơn. Collagenase là enzyme th y phân các liên k t peptid d ng poly-L prolin c trưng cho vùng xo n c a collagen. Collagenase thu nh n t ng v t h u nhũ thì c t chu i collagen t i nh ng i m riêng bi t, còn thu nh n t vi khu n thì c t t i nhi u v trí d c trên chu i collagen. a s các collagenase ho t ng pH trung tính ho c hơi ki m (pH 7- 8), nhi t thích h p dư i 400 C, và gi m ho t tính nhi t trên 450 C. Có 4 lo i collagenase: - Collagenase lo i I: ch a m t lư ng trung bình nh ng ho t ch t (collagenase, caseinase, clostripain, trypsin ho t ng). Chúng thư ng ư c dùng cho vi c tách t bào da, gan, ph i, m và nh ng t bào mô thư ng th n. - Collagenase lo i II: ch a h p ch t clostripain nhi u hơn, ư c s d ng tách t bào t tim, xương, cơ và s n. - Collagenase lo i III: có ho t tính phân gi i protein th p. - Collagenase lo i IV: có ho t tính trypsin th p, thư ng dùng phân tách t bào t y. Collagenase và dispase phân c t không hoàn toàn các c u n i nên ít làm hư h i t bào. Ngư i ta còn s d ng hyaluronidase k t h p v i collagenase phân h y các ch t d ch n i bào, DNase ư c s d ng phân h y các DNA thoát ra t các t bào b ly gi i. Chymotrypsin có tính c hi u kém hơn trypsin, nó phân gi i các liên k t peptide t o thành b i nhóm carboxyl c a acid amin thơm (như tyrosin, phenylalanin, tryptophan, methionin và leucin) v i m t nhóm amin c a m t acid amin khác. Chymotrypsin có pH thích h p t 8 – 9, và b c ch b i DFB (di-isopropyl fluoro phosphate) Papain th y phân protein thành các polypeptid và các acid amin. Papain ch u ư c nhi t tương i cao (d ng khô không b bi n tính 1000 C trong 3 gi ), ho t ng pH t 4,5 – 8,5 (tùy vào cơ ch t l a ch n pH thích h p nh t cho m i ph n ng). Papain b kìm hãm b i các ch t oxy hóa như oxy, ozone, hydroperoxyte, iod acetamid, th y ngân chlobenzoate, cystin và các h p ch t disulfur khác. Elastase th y phân m t s lư ng l n protein n n. Elastase là enzyme duy nh t có kh năng th y phân elastin, m t ch t n n không b tác ng b i trypsin, chymotrypsin hay pepsin. Elastase thư ng ư c s d ng có k t h p v i các enzyme khác như collagenase, trypsin và chymotrypsin. Elastase là enzyme ư c ch n tách t bào t phôi. c. Tách t bào b ng các phương pháp khác + Phương pháp ly tâm theo gradient t tr ng: ư c s d ng phân tách tinh trùng hay các t bào ơn nhân trong máu. Môi trư ng ly tâm thư ng s d ng là Percoll, Ficoll…
- 18. 18 VD: Quy trìnhFicoll dùng phân tách t bào máu ơn nhân: - Pha loãng máu (có ch t ch ng ông) 2 l n v i dung d ch m PBS - t 35 ml máu pha loãng lên 15ml Ficoll, ly tâm t c 400g trong 20 phút 240 C - Thu d ch n i, huy n phù trong cùng m t lư ng dung d ch m - Ly tâm l n n a t c 500g trong 20 phút 240 C - Thu c n, huy n phù trong cùng m t lư ng dung d ch m - B o qu n d ch huy n phù t bào 2 – 80 C + Phương pháp tách t bào d a vào marker b m t (là nh ng receptor b m t c a t bào): ư c s d ng ánh d u và phân l p t bào g c. Nh ng t bào g c hi m hoi ư c ch n t hàng tri u t bào khác. D ch t bào ư c ính m t phân t huỳnh quang vào receptor, dư i tác d ng c a l c y, d ch (có t bào) s i qua m t u kim r t nh , sao cho m i l n ch có m t t bào. u ra c a kim là m t ngu n ánh sáng, thư ng là tia laser và sau ó là m t i n trư ng. Nh ng t bào phát huỳnh quang s mang i n tích âm, còn nh ng t bào không phát huỳnh quang mang i n tích dương. S tích i n khác nhau như v y cho phép thu nh n t bào c n. M c dù m i lo i mô có nh ng yêu c u v i u ki n tách khác nhau, nhưng cho dù là mô nào, khi tách t bào nuôi c y u c n lưu ý m t s i m sau: - Các mô m , mô ch t, mô t p ph i ư c lo i b ra trong quá trình tách. - Mô nên ư c c t nhuy n b ng d ng c nh n, bén tránh hư h i t bào. - Enzyme s d ng trong quá trình tách t bào, trư c ó ph i ư c tách ra kh i dung d ch (b ng ly tâm), hay ph i b b t ho t (b ng huy t thanh). - N ng t bào thu nh n cho nuôi c y sơ c p ph i m b o, ng th i luôn cao hơn n ng t bào nuôi c y sau ó. - H i ph c t bào b ng cách nuôi trong môi trư ng dinh dư ng cao hay b sung huy t thanh v i n ng cao. - Phân tách t bào t mô non hay phôi nhanh hơn, hi u qu cao hơn, t bào thu ư c nhi u hơn, s ng và tăng sinh m nh hơn so v i các mô ã trư ng thành. IV.1.3 Nuôi c y thu nh n t bào a. Nuôi t bào sơ c p Ly tâm d ch tách t bào lo i b d ch n i, thu c n huy n phù t bào ưa d ch huy n phù t bào vào bình nuôi c y (bình Roux), b sung môi trư ng 37,50 C trong t nuôi, sau 24 gi thay môi trư ng m i và ti p t c . Sau l n nuôi c y sơ s c p thu ư c các t bào sơ c p. Thành ph n t bào sơ c p r t ph c t p, bao g m nhi u lo i t bào khác nhau cùng hi n di n trong bình nuôi. có dòng t bào thu n nh t, c n th c hi n bư c ti p là ch n dòng. b. Nuôi c y phát tri n m nh mô sơ c p i v i trư ng h p lư ng m u mô quá ít, c n nuôi c y nguyên m nh mô thu nh n t bào, tránh m t m u khi tách mô: t các m nh mô trong ĩa nuôi, s d ng cùng môi trư ng v i môi trư ng nuôi t bào t mô ó.
- 19. 19 Các m nhmô thư ng n i, hay lơ l ng trong môi trư ng nuôi c y, thư ng b ch t nhanh n u không bám vào b m t nuôi. Có th b sung ít môi trư ng tăng s bám dính c a m nh mô vào b m t d ng c nuôi ho c c nh m u mô b ng huy t tương/ huy t thanh. Khi các t bào ã phát tri n và lan r ng ra t các rìa c a m nh mô, ti n hành tách b m u mô và thu ư c t bào. c. C y chuy n C y chuy n r t c n cung c p ch t dinh dư ng và không gian cho các dòng t bào phát tri n liên t c. T n s và t l pha loãng, hay n ng t bào trong c y chuy n ph thu c vào các c tính c a m i dòng. N u dòng ư c c y chuy n quá thư ng xuyên hay n ng t bào quá th p, chúng có th b m t. C y chuy n bao g m các thao tác sau: - Tách b môi trư ng nuôi c y cũ. - R a b m t giá th nuôi (có t bào bám). - Tách các t bào bám kh i b m t d ng c nuôi. - Pha loãng các t bào b ng môi trư ng m i. C y chuy n các t bào bám dính: - Tách b môi trư ng kh i h p nuôi. N u các t bào bám ch t, có th b môi trư ng. N u nhi u t bào n i hay bám y u, nên l c nh và r a, sau ó làm l ng s bám dính các t bào b ng dung d ch trypsin. - R a d ng c nuôi v i PBS. - B sung dung d ch trypsin. - trong t m 370 C ch ng 2 – 3 phút (tùy ki u t bào và ki u nuôi) xem dư i kính hi n vi: n u các t bào có hình tròn có nghĩa là chúng ã tách ra kh i b m t giá th nuôi. - Huy n phù v i môi trư ng có b sung huy t thanh, và r a t bào b ng cách ly tâm 800 vòng/phút trong 5 – 10 phút tái huy n phù b ng môi trư ng nuôi (bư c này có th b n u t l pha loãng cao trong môi trư ng có ch a huy t thanh) C y chuy n các t bào huy n phù: Nuôi c y các t bào trong các flask hay các spinner có th ư c duy trì b ng vi c pha loãng m t lư ng tương ương c a huy n phù t bào b ng môi trư ng tươi: - Gi flask ng th ng, dùng pipette huy n phù vài l n tách r i các c m t bào. - Tách l y m t lư ng huy n phù m ho c pha loãng vào bình nuôi m i ly tâm thu c n, lo i b d ch n i tái huy n phù c n vón vào môi trư ng tươi l y m t th tích tương ương lư ng t bào mong mu n vào các bình nuôi và ti n hành nuôi. IV.2. T O DÒNG T BÀO Vi c t o dòng m b o t t c các t bào con cháu u xu t phát t m t t bào ơn và có cùng m t c tính di truy n. Ý nghĩa c a vi c t o dòng là ngăn c n nh ng thay i nhanh, và không oán trư c trong ki u hình nuôi c y. Hơn n a vi c t o dòng cho phép sàng l c s lư ng l n các dòng cũng như ch n l c các dòng t bào v i c tính mong mu n. Nói chung vi c t o dòng cho phép ch n l c m t ch ng t bào v i các c tính t i ưu cho nghiên c u.
- 20. 20 Tái t odòng (recloning) là công vi c thi t l p l i các c tính v n có c a dòng, m t khi chúng b bi n i (b i các dòng t bào ã thi t l p có th t o ra m t s bi n i nào ó v i các c tính phù h p hơn, trong môi trư ng nuôi nào ó). N u mu n thay i các c tính t bào thông qua t bi n hay chuy n nhi m, thì vi c t o dòng không c n thi t. Do ó, có th t o các bi n i quan tr ng trong các ki u hình c bi t, sau m t vài th h c y chuy n. Trong môi trư ng nuôi c y, m t t bào riêng r s nguyên phân t o nhi u t bào con. Các t bào này qu n t t i v trí c a t bào m ban u, hình thành nên m t t p oàn (colony). Như v y, các t bào c a m t t p oàn s có cùng c tính ki u gen và ki u hình, hay nói cách khác, chúng cùng m t dòng. IV.2.1. K thu t ch n dòng t bào Phương pháp ti n hành: - Dùng dung d ch trypsin tách r i các t bào t ĩa nuôi c y, t o huy n phù t bào. - C y t bào vào ĩa nuôi có môi trư ng m i v i m t th p ( các t bào cách xa nhau trong ĩa nuôi). Nuôi t bào cho n khi chúng phát tri n các colony riêng r . - Ch n m t colony t bào c n t o dòng, cô l p b ng m t m t ng kim lo i n ng có kích thư c phù h p. Hút b môi trư ng trong ng và tách các t bào t colony này b ng trypsin, c y sang ĩa môi trư ng m i. N u c n thi t có th th c hi n bư c ch n dòng này vài l n n a cho n khi m b o thu ư c dòng t bào t m t t bào u tiên. C y chuy n t bào - b môi trư ng cũ. - Cho PBS vào bình Roux (-), l c nh r a s ch t bào ch t và huy t thanh, b PBS (-), l p l i 2 l n. - Cho trypsin-EDTA cho vào bình Roux. - L c nh bình Roux. - b trypsin, v nh bình Roux t bào tách kh i vách bình Roux. - Cho 2ml E’MEM vào bình Roux, tráng u lên b m t bình Roux có t bào. - Hút vào m i bình Roux m i 5ml môi trư ng E’MEM. - Dùng pipette hút s c môi trư ng và phun u vào b m t bình Roux có t bào t o huy n phù. - Hút d ch huy n phù cho vào bình Roux m i, l c nh , 37,50 C trong t nuôi. - Sau 24 gi , b môi trư ng cũ, cho môi trư ng m i vào lo i b trypsin và các t bào ch t. M t bình Roux ch a y t bào có th c y chuy n sang 3 ho c 4 bình Roux m i.
- 21. 21 IV.2.2. Các phươngpháp t o dòng a. Phương pháp ng syringe: giúp thu nh n các t p oàn t bào quan tâm ư c nuôi c y trên môi trư ng th ch. Cách ti n hành: - Tách các t bào b ng trypsin. - Tái huy n phù trong môi trư ng phát tri n. - m m t th tích t bào. - Huy n phù t bào. - Thêm môi trư ng vào d ch huy n phù, hút–nh b ng pipette vài l n tách các t bào riêng r . - trong t m và quan sát b t u vào ngày th 5. - Khi t p oàn phát tri n ch ng 50 – 100 t bào, có th “nh t ra” các t p oàn ch n l c, c n ch c ch n r ng các t p oàn ch n l c xa kh i các “hàng xóm cũ” c a nó vòng nh n t o dòng s ch ch a m t t p oàn duy nh t. - Hút b môi trư ng và r a v i PBS. - Trét m t dư i m t ng syringe (b ng thép không g ) m t l p m silicone ã h p kh trùng. Dùng k p syringe vào ĩa, n xu ng ch c ch n nó ư c g n t t. M i syringe không nên ch a hai t p oàn. - Ti p t c n khi có 5 – 10 t p òan/ ĩa ư c ch n và bao ph u. - Cho trypsin vào syringe, n khi các t bào tr nên tròn và n i lên khi ki m tra dư i kính hi n vi. - Pha loãng trypsin v i môi trư ng phát tri n và c n th n hút o nh khi ki m tra dư i kính hi n vi. - Thêm môi trư ng tăng trư ng vào gi ng. - L p y các gi ng v i nư c c t vô trùng hay PBS. - 370 C và ki m tra s phát tri n hàng ngày. b. Phương pháp pha loãng t i h n các n ng pha loãng r t th p, trong m t th tích dung d ch nh t nh có th ch ch a m t t bào duy nh t. Các t bào ơn này ư c nuôi c y trong các vi gi ng, hình thành m t t p oàn. Dòng t bào quan tâm ư c ch n tr c ti p t nh ng t p oàn này. Phương pháp này có th ư c s d ng v i các t bào huy n phù hay t bào bám. Ti n hành: - X lý các ĩa nuôi b ng trypsin thu ư c d ch huy n phù t bào ơn. Quan sát, ki m tra dư i kính hi n vi. - R a các t bào hai l n b ng cách ly tâm t c th p.
- 22. 22 - i uch nh sao cho thu ư c n ng 10 – 100 t bào/ml trong môi trư ng phát tri n hòan ch nh. - Cho môi trư ng vào các gi ng nuôi c a ĩa 96 gi ng, n ng s d ng ph thu c vào hi u qu tr i c a các t bào s d ng. t i a cơ h i có các t bào ơn/gi ng, ch ng m t n a s gi ng có th s không có t bào nào. - T 12 – 14 gi ki m tra các dòng sau khi tr i, ánh d u các ĩa có t bào ơn. N u có gi ng có t hai t bào tr lên ph i b gi ng ó. - Các dòng có th ư c tr c ti p sàng l c t các gi ng nuôi c a ĩa. - Khi m t dòng ư c ch n, chúng ư c nh t ra và nuôi vào ĩa 24 gi ng, 35mm và cu i cùng là 100mm. Có th s d ng cùng lo i môi trư ng l n nuôi u tiên. c. Phương pháp dùng môi trư ng không huy t thanh T o dòng trong môi trư ng không huy t thanh tương t v i phương pháp t o dòng nêu trên, ngo i tr c n ph i trung hòa trypsin v i STI và r a b ng cách ly tâm. V. CÁC H TH NG NUÔI C Y T BÀO NG V T V.1 H TH NG NUÔI C Y T BÀO TRUY N TH NG (NUÔI C Y T BÀO 2D) Nuôi c y t bào truy n th ng là phương pháp nuôi c y trên ĩa Petri 2D, ĩa nhi u gi ng 2D hay b m t lam kính 2D. Tuy nhiên, c u trúc môi trư ng bình thư ng c a m t t bào trong cơ th s ng là 3D g m m t m ng lư i ph c t p các vi s i khuôn ngo i bào v i các vi l ; trong ó các t bào ư c các t bào khác bao quanh, v i các ligand ngo i bào, bao g m nhi u lo i colagen, laminin và các protein n n khác, không ch cho phép liên k t t bào – t bào, t bào – màng cơ b n mà còn d n oxy, hormone, dư ng ch t vào và lo i b các s n ph m th i. Vì v y, phương pháp nuôi c y truy n th ng th hi n m t s h n ch , ó là: - Không th thi t l p m t gradient 3D “ úng” trong nuôi c y 2D – i u này có nh hư ng nh t nh n s bi t hóa sinh h c, quy t nh s ph n c a t bào, s phát tri n cơ quan, truy n tín hi u, truy n thông tin th n kinh và vô s các quá trình sinh h c khác. - T bào ư c phân l p tr c ti p t cơ th thư ng xuyên thay i s chuy n hóa và các ki u bi u hi n gen hi ư c nuôi c y 2D vì s thích ng c a các t bào v i ĩa petri 2D òi h i s i u ch nh áng k c a qu n th t bào ang s ng không ch thay i oxy, dư ng ch t và các tương tác ECM mà còn lo i b ch t th i. - Các t bào tăng trư ng trong môi trư ng 2D có th thay i áng k kh năng x n xu t các protein ECM c a riêng chúng và thư ng xuyên ch u nh ng bi n i v hình thái (VD: gia tăng s tr i r ng). - Các t bào nuôi c y in vitro thi u các tác nhân tín hi u và hormone ch y u (như bình thư ng, chúng ư c cung c p y trong cơ th t h tu n hoàn). V.2 H TH NG NUÔI C Y T BÀO 3D K thu t nuôi c y t bào 3D ư c ng d ng nh m phát tri n các mô và cơ quan thay th . Trong k thu t này, ngư i ta ưa t bào và các nhân t tăng trư ng vào trong các scaffold t ng h p (ho t ng như ECM t m th i) giúp các t bào t ch c thành các mô khác nhau (da, s n, gan, th n kinh, m ch...) hay th m chí là c cơ quan. Scaffold là m t khuôn ngo i bào nhân t o có c u trúc l x p, giúp i u ti t t bào, hư ng d n tăng trư ng và tái t o mô ba chi u. Sau khi ư c ưa vào scaffold, các t bào s bám, sau ó
- 23. 23 sao chép, bit hóa và t ch c thành mô kh e m nh bình thư ng, cùng v i vi c ti t ra các thành ph n n n ng ai bào c n t o mô. Vì v y, vi c ch n l a scaffold là c t y u t o ra các mô và cơ quan có hình d ng và kích thư c mong mu n. Oxy và dư ng ch t ư c cung c p t môi trư ng l ng nuôi c y t bào. Các t bào b t u tăng sinh và di cư vào các l c a scaffold. Các polymer t ng h p (như PGA, PLA, PLGA, PCL) và các polymer t nhiên (alginate, agarose, gel collagen, polyglycosaminoglican...) xu t hi n trong nh ng th p k g n ây ư c l a ch n ph bi n ch t o scaffold vì s h p d n, linh ho t ng d ng cho s tăng trư ng c a ph n l n các mô. Phương pháp này cũng t n t i m t s h n ch : - S phân h y các polymer t ng h p (c trong i u ki n in vitro và in vivo), gi i phóng các s n ph m ph có tính acid, khi n vi môi trư ng scaffold không lí tư ng cho s tăng trư ng mô. - Các polymer t nhiên có th gây áp ng mi n d ch, do ó c n làm gi m tính kháng nguyên c a chúng b ng cách khâu m ch, ho c x lí pepsin lo i nh ng vùng telopeptid. - Các phương pháp ch t o scaffold không th ki m soát chính xác kích thư c và hình d ng l , cũng như s phân b không gian c a các l và c u trúc các kênh bên trong scaffold. Dung môi còn dư ng l i trong scaffold cũng là v n quan tr ng c n gi i quy t vì nguy cơ c t và gây ung thư cao. - Các t bào không th phân b ng nh t trong kh p scaffold – h u h t các t bào không th di cư vào bên trong sâu hơn 500µm. kh c ph c tình tr ng này, nên c y thêm t bào vào scaffold trong su t quá trình thi t k ki m soát t t hơn s phân b t bào. Tuy nhiên, i u này không th th c hi n ư c v i h u h t các quy trình thi t k scaffold vì có liên quan n các hóa ch t c và nhi t, làm t n thương các t bào s ng. - Các t bào l p y các l và b t u ti t ECM c a riêng chúng, l p t bào trên cùng tiêu th ph n l n oxy và dư ng ch t, làm h n ch s khu ch tán c a các thành ph n này, do ó làm gi m s t bào tiên phong di cư sâu vào bên trong scaffold. Cu i cùng, s di cư c a t bào b d ng l i do thi u oxy và dư ng ch t cung c p. - Ngay c khi t bào ã phân b kh p scaffold quy mô l n, v n c n cung c p m ch máu nuôi dư ng các t bào sâu bên trong scafflod. Các mô m ch xung quanh có th tăng trư ng vào trong m t scaffold c y ghép, nhưng ph i m t th i gian cho quá trình phát tri n m ch này, các t bào sâu bên trong có th ch t khi m ch phát tri n t i nơi. V.3. NUÔI C Y T BÀO NG V T TRONG BÌNH KHU Y H u h t vi c nuôi c y mô ti n hành trên quy mô nh , cung c p m t lư ng ít t bào ti n hành các thí nghi m. Vi c nuôi t bào ng v t v i quy mô l n ư c b t u th nghi m t u nh ng năm 1950 b ng cách dùng Jar Fermentor. Khi nuôi c y t bào ng v t quy mô l n, c n chú ý m t s c i m không có l i cho nuôi c y quy mô l n sau: - T bào ng v t khá l n, kho ng 10 µm. Tính b n cơ h c i v i s khu y y u. - Th i gian tăng sinh g p ôi ch m, kho ng 1 ngày. Nh y c m v i ion kim lo i. - Kém kh năng thích ng v i môi trư ng. C n huy t thanh và hormone. - a s t bào ng v t c n s ng và phân chia trên m t giá . Khi tăng lư ng t bào nuôi c y, c n ph i i u ch nh hàng lo t các thông s và thi t b c n thi t. Ch ng h n, m t s v n c n lưu ý như ch t dinh dư ng, s trao i khí ( c bi t là oxy) và
- 24. 24 vi c loi b các c t do chuy n hóa t o ra (ammonia, lactic acid...). t i ưu hóa quá trình, th tích nuôi ch ng 1 lít là t t nh t. Nuôi c y t bào ng v t trong bình khu y là bư c tăng quy mô u tiên trong vi c nuôi c y t bào huy n phù t nhiên, hay t bào sau khi ư c thu n hóa, ho c g n t bào v i các vi v t mang. T bào ư c nuôi c y huy n phù trong m t bình nuôi, có b ph n cánh khu y ho t ng nh t trư ng c a nam châm. Ngoài ra bình nuôi c y này còn có hai nhánh hai bên, thu n l i cho vi c thêm t bào, thay môi trư ng, hay cung c p khí O2, ho c không khí giàu CO2. V.4. NUÔI C Y T BÀO QUY MÔ PILOT VÀ S N XU T Vi c l a ch n h th ng và hình th c nuôi c y ph thu c vào t c phát tri n và c i m t o s n ph m c a các dòng t bào. * H th ng nuôi c y: thư ng s d ng là hollor-fibre (s i r ng) và ceramic matrix modules (các ơn v ch t n n ceramic), bioreacter khu y và fermentors. T bào có th ư c nuôi c y trong h th ng nuôi c y không ng nh t hay ng nh t: - H th ng nuôi c y không ng nh t: t bào ư c c nh trong phòng tăng sinh. H u h t các h th ng có phòng tăng sinh v i các hollow fibre, hay ch t n n ceramic x p. - H th ng nuôi c y ng nh t: t bào ư c nuôi trong bioreacter v i khu y cơ h c, hay s c khí gi chúng tr ng thái huy n phù. * Hình th c nuôi c y g m: batch (theo m ), fed-batch (theo m có cung c p thêm t bào), chemostat (nuôi c y liên t c) và perfusion (ch y tràn). Batch và fed-batch ư c dùng ph bi n nh t. Hình th c chemostat và perfusion thì òi h i thao tác, hóa ch t nhi u hơn vì nó cho phép t o MAbs liên t c. T t c các phương pháp nói trên u có th áp d ng ư c v i h th ng nuôi c y ng nh t và không ng nh t, tr chemostat. VI. M T S K THU T LIÊN QUAN VI.1. K THU T VÔ TRÙNG K thu t vô trùng ư c thi t l p di t (l p hàng rào vô trùng) m t ph r ng các vi sinh v t ( ng v t nguyên sinh, n m, vi khu n, mycoplasma, virus...). Tùy theo t ng i tư ng vi sinh v t, c bi t là kh năng kháng c a chúng, có phương pháp kh trùng t hi u qu t i a. Các phương pháp kh trùng thư ng ư c dùng là: - S d ng autoclave t o nư c nhi t 1210 C (d ng hơi nư c dư i i u ki n áp su t). - Chi u x : chi u tia UV (Ultraviolet light), tia Gamma (Gamma ray)... - Vô trùng b ng hóa ch t: alcohol (lo i 70%), khí formaldehyde... - Vô trùng b ng l c: s d ng các b l c vi khu n và n m, b l c virus, máy l c HEPA (High efficiency particulate air). VI.2. QUAN SÁT T BÀO - Quan sát tr c ti p b ng m t, trên các ĩa nuôi nh n bi t s thay i c a các y u t môi trư ng nuôi: pH (d a vào màu s c c a môi trư ng nh b sung ch t ch th màu pH), n ng CO2 (do t nuôi báo), c c a môi trư ng (gây nên b i vi sinh v t nhi m ho c các m nh v c a t bào ch t). - Quan sát dư i kính hi n vi ánh giá v hình d ng, s lư ng t bào.
- 25. 25 VI.3. KI MSOÁT NHI M Các vi sinh v t nhi m thư ng ư c nh n bi t khá d dàng vì thông qua nh ng quan sát b ng m t ho c quan sát dư i kính hi n vi. Nh ng ĩa nuôi có acid b t thư ng hay có v c hay có các qu c u, các dây... c n ư c quan sát dư i kính hi n vi phát hi n k p th i tác nhân nhi m. N u sau khi ki m tra kh ng nh m u b nhi m, c n cách li các ĩa nuôi ó và kh trùng, ng th i sát trùng kính hi n vi, v trí t ĩa nuôi, tay và các d ng c khác. S nhi m virus thư ng r t khó và t n kém phát hi n. Và khó phát hi n nh t là ki u nhi m dòng t bào này v i m t dòng t bào khác (g i là s nhi m chéo – cross contaminated cell lines)– chúng có th x y ra nhi u năm mà không ư c phát hi n. Ngăn ng a nhi m là i u c n thi t, òi h i s căn b ng gi a vi c duy trì môi trư ng vô trùng trong phòng nuôi c y và thi t b , th i gian và chi phí liên quan. Cách t t nh t lo i b s nhi m trong nuôi c y là b i các ĩa, v t d ng ã nhi m. Th m chí, khi c n thi t s n sàng h y b c các m u thí nghi m. VI.4. ÔNG L NH K thu t ông l nh nh m gi t bào trong nitơ l ng nhi u năm v i kh năng s ng sót cao là thu n l i c a các nghiên c u in vitro. Ngân hàng t bào ông l nh s cung c p thư ng kì các dòng t bào chu n, chúng ư c gi i ông và sau ó nuôi c y th c p. Khi thi t l p dòng t bào, chúng có th ư c b o qu n ông l nh sau 3 – 5 l n c y chuy n. i v i các t bào ngư i bình thư ng, th i gian s ng in vitro có gi i h n, do v y, ông l nh là cách duy nh t s d ng dòng t bào này trongnhi u thí nghi m khác nhau. V n t ra là khi các t bào qua ông l nh và gi i ông, n u h u h t b ch t, qu n th t bào không th ư c ông l nh tr l i như quy trình ã ti n hành. Quá trình 6ong l nh và gi i ông có th thay i ki u nhân t bào, c bi t là các t bào chu t. Do ó, ông l nh v n có th t o ra d h p trong t bào i v i m t s trư ng h p. N u các t bào ư c gi trong nitơ l ng, ph i c n th n b i ây là cơ h i nhi m, nh t là nhi m chéo, ho c s lan r ng các tác nhân nhi m như mycoplasma. Cu i cùng, ngư i ta nh n th y r ng các t bào lưu tr l i (-1800 C) thư ng gi m s c s ng. VII. NG D NG C A K THU T NUÔI C Y T BÀO NG V T - Nuôi c y t bào ng v t làm mô hình th nghi m và ch n oán b nh. - S n xu t các h p ch t sinh h c như interferon, vaccine virus, các protein (các nhân t ông máu và ho t hóa plasminogene…), enzyme (Rtase…)… - T o ngu n mô – t bào ng v t làm v t li u c y ghép: ghép t bào t y t ng t o ra insulin c a heo vào ngư i, ghép t bào th n kinh t thai giúp ph c h i ch c năng não hay ch c năng v n ng, t o m ch máu t nuôi c y t bào ng m ch ch c a bò… S phát tri n xa hơn c a k thu t này trong y h c là vi c t o ngu n t bào – mô th c hi n ghép t thân: l y t bào/mô t cơ th b nh nhân nuôi c y in vitro, cho bi t hóa thu ư c t bào/mô ghép l i cho chính b nh nhân ó, ph c h i các mô t n thương. Tri n v ng l n nh t trong lĩnh v c này là s d ng các t bào g c phôi thai. - S n xu t các virus di t côn trùng b ng cách nuôi c y các t bào côn trùng và cho nhi m virus, sau ó thu ch ph m.
- 26. 26 CHƯƠNG 2 CÔNG NGHH TR SINH S N I. GI I THI U Khái ni m: H tr sinh s n là m t quy trình nh m t o ra cá th m i v i nhi u k thu t h tr phù h p cho t ng giai o n trong ti n trình sinh s n. Công ngh này không ch là m t li u pháp i u tr vô sinh/hi m mu n ngư i mà còn là phương ti n h u ích, n n t ng ti n hành các nghiên c u khác ngư i và ng v t như chuy n gen, ch n oán s m, b o t n ng v t, nhân b n, thu t bào g c. Năm 1763, Jacobi ã th c hi n các k thu t th tinh nhân t o cho chó và cá. Năm 1780, bác sĩ thú ý ngư i Italia, Spallanzani, ã nghiên c u tinh d ch và nh n th y r ng khi tinh d ch nhi t th p, tinh trùng s ng lâu hơn. Cu i th k 19, nhi u tài li u trình bày phương pháp th tinh nhân t o cho chó, ng a và bò m t cách khá chi ti t. Tuy nhiên, ph m vi các nghiên c u nói trên còn h p, do s h n ch các ki n th c sinh h c th i b y gi . Th tinh nhân t o cho gia súc ư c nghiên c u có h th ng t u th k XX. Năm 1959, con th u tiên ư c ra i t phương pháp th tinh trong ng nghi m. Th tinh trong ng nghi m trên ngư i ư c Petrucci c p n năm 1961 nhưng b Tòa thánh Vatican ph n i k ch li t. Năm 1962, công trình này ư c ti p t c b i Edward và Steptoe. Vào năm 1971, Steptoe ã b t u th c hi n hút 149 tr ng (t nhi u ph n hi n t ng) qua n i soi b ng và nuôi ư c 112 t bào n giai o n phôi nang, tuy nhiên không th ti n hành c y truy n. Có m t trư ng h p báo cáo c y thành công, phôi có hi n tư ng làm t , nhưng r t ti c, thai l i n m ngoài t cung. Năm 1972, con chu t u tiên ra i t phôi ông l nh. Năm 1973, n lư t con bê u tiên ra i cũng b ng phôi ông l nh. Ngày 25 tháng 7 năm 1978, l n u tiên trong l ch s phát tri n c a nhân lo i, m t bé gái (Louise Brown) ra i b ng công ngh th tinh trong ng nghi m t i m t b nh vi n Anh. Năm 1982, bé gái th hai (Amadine) ra i b ng công ngh này Pháp. Trong nh ng năm 80 c a th k XX, k thu t th tinh trong ng nghi m phát tri n m nh. Singapore ư c ghi nh n là nơi th c hi n thành công th tinh trong ng nghi m u tiên Châu Á vào năm 1983 b i nhóm nghiên c u c a SC Ng và cs. Năm 1984, m t phôi ông l nh ư c rã ông c y vào t cung, phát tri n và cho ra i bé trai u tiên, t tên là Zoe. Năm 1993, trong khi nghiên c u m t ca lâm sàng B , Gianpiero D. Palermo ã ưa ra k thu t bơm tinh trùng vào bào tương tr ng (ICSI). Năm 2005, phác m i trong k thu t tr tr ng ã c i thi n áng k t l th tinh. Nhi u em bé u tiên t c tr ng và tinh trùng ông l nh ra i thành công t i Ý. N i dung c a các k thu t h tr sinh s n, v cơ b n có th ư c x p thành các nhóm sau: - K thu t thu nh n giao t . - K thu t h tr th tinh. - Nuôi phôi.
- 27. 27 - K thut chuy n phôi (c y truy n). Và m t s k thu t liên quan khác. II. K THU T CHU N B GIAO T II.1. CHU N B TR NG II.1.1. Cho tr ng (oocyte donation) ngư i, ngư i cho tr ng ư c kích thích bu ng tr ng b ng các hormone gây chín r ng nhi u tr ng ho c ư c ch t hút qua siêu âm u dò âm o. Ngư i cho tr ng thư ng không quá 35 tu i, có s c kh e t t, tâm sinh lý và quan h xã h i bình thư ng và nh t thi t ph i tr i qua các ki m tra y h c, n i ti t và s n khoa nghiêm ng t. N u ngư i cho tr ng ã t ng có ít nh t là m t con bình thư ng thì càng t t. ng v t, thu nh n ngu n tr ng (và tinh trùng) c a nh ng gi ng khác nhau cùng loài, nh m th tinh trong ng nghi m ư c xem là m t phương pháp lai t o hi u qu . Cho các giao t v t nuôi không mang ý nghĩa h tr sinh s n mà ơn thu n ch là tính ch t c i thi n gi ng, ph c v chăn nuôi hay b o t n loài. Nh ng năm g n ây, k thu t cho noãn tương (ooplasmic donation – ch l y d ch bào tương hay d ch túi m m thay vì thu nh n t bào tr ng) và chuy n túi m m ư c ti n hành như là m t phương th c nh m c i thi n hi u qu c a h tr sinh s n. ây, khi tiêm m t lư ng nh noãn tương c a t bào tr ng bình thư ng vào tr ng nh n thì có th s giúp h i ph c l i nh ng c tính mà tr ng nh n khi m khuy t. Ty th (t n t i trong noãn tương, gi ch c năng hô h p) là thành ph n cơ b n có nh hư ng quan tr ng t i ho t ng sinh lý bình thư ng c a tr ng. Tuy nhiên, s t n t i c a noãn tương ngo i lai trong t bào ch (d ty th ) có th gây ra nh ng i kháng v i b gen c a b và m n m trong nhân. S không tương thích gi a ty th và b gen có th s gây ra nh ng khi m khuy t trong s bi u hi n c a gen và s phát tri n, th m chí chúng có th ư c di truy n và bi u hi n nhi u th h ti p theo. II.1.2. Gây r ng tr ng nhi u (superovulation) Gây r ng tr ng nhi u (còn g i là gây siêu bào noãn) là phương pháp kích thích s chín và r ng tr ng hàng lo t b ng các hormone nh m thu ư c nhi u tr ng chín m t lúc. i u này có th nh m hai m c ích: thu ngu n tr ng và cho th tinh t nhiên thu nh n ngu n phôi (trong ng d n tr ng) sau ó. Nhi u thí nghi m cho th y nhóm hormone gonadotropin (PMSG_Pregnant mare’s serum gonatropin) (huy t thanh ng a ch a) có tác d ng gây chín tr ng nhanh, gi ng như FSH. Tương t , hCG (human chorionic gonatropin) cũng tác ng gây r ng tr ng như LH (Luteinizing hormone). Do v y, gây r ng tr ng nhi u, có th s d ng PMSG và FSH ( ư c tách chi t t tuy n yên c a c u, ho c heo) k t h p chung v i hormone hCG. FSH kích thích phát tri n m t lo t các nang noãn, i u này thích h p cho vi c th tinh in vitro. Trong m t s trư ng h p, ch c n t o ra m t vài hay m t nang noãn phát tri n gi ng t nhiên. Li u dùng c a các hormone nói trên tùy thu c vào t ng loài, tu i và tr ng lư ng con v t; cũng như ph thu c vào lo i thu c, th i gian tiêm. m t s loài như chu t, hi u qu kích thích r ng tr ng còn ph thu c vào chu kỳ sáng t i.
- 28. 28 B ng 2.1.Quy trình gây siêu bài noãn m t s v t nuôi (E. Hafez, 1987) ng v t Ngày c a chu kỳ ng d c Hormone r ng tr ng hCG (IU) Bò Dê C u Heo 15-16 16-17 12-14 15-16 1500-3000 1000-2000 1000-2000 750-1500 20-50 12-20 12-20 10-20 1500-2000 1000-1500 1000-1500 500-1000 Tác ng b t l i nh t c a vi c kích thích bu ng tr ng b ng hormone là có th xu t hi n h i ch ng quá m n c a bu ng tr ng (Ovarian hiperstimlation syndrome – OHSS) và trư ng h p ch a a thai. V m t lâm sàng, h i ch ng này n u nh , hay trung bình không quan tr ng, nhưng bi u hi n n ng có th e d a tính m ng. Tuy nguyên nhân chưa rõ ràng, nhưng h i ch ng có m t s bi u hi n: - Nh : tăng hàm lư ng estrogen, bu ng tr ng to lên ch a các nang nh . - Trung bình: ngoài các bi u hi n trên còn xu t hi n tiêu ch y, nôn ói. - N ng: kích thư c nang l n làm bu ng tr ng to, th m quanh mao m ch tăng làm thoát d ch gây tích nư c c trư ng trong b ng và tràn d ch màng ph i, gây khó th . II.1.3. Thu nh n tr ng Có th thu nh n tr ng ng v t b ng nhi u cách: - Thu tr ng t ng d n tr ng sau khi r ng: ph u thu t l ng d n tr ng, s d ng ng thông bơm dung d ch PBS g i r a lòng ng vài l n, tìm tr ng trong dung d ch r a và phân lo i. Phương pháp này thư ng s d ng cho ng v t thí nghi m vì thu ư c tr ng có t l chín cao. Tuy nhiên, vi c xác nh th i i m tr ng chín và r ng khó khăn, do v y, ch ng thư ng ph i gây r ng tr ng nhi u b ng kích d c t . - Thu tr ng t nang tr ng c a bu ng tr ng: b ng k thu t n i soi – siêu âm, s d ng m t kim dài xuyên qua thành âm o, tìm nang tr ng chín ch c hút cho phép thu nh n t bào tr ng. Phương pháp này cho phép khai thác tr ng nhi u l n, hi n ư c s d ng r ng rãi ngư i và các gia súc l n, nhưng ng v t quý hi m. Ngoài ra, cũng có th ti n hành n i soi qua thành b ng, cũng như gi i ph u l bu ng tr ng gi ng như cách thu tr ng ng d n tr ng. - Thu tr ng t nang tr ng c a bu ng tr ng nh ng ng v t ã b gi t m . Trong phương pháp này, bu ng tr ng ph i ư c thu ngay sau khi m , càng s m càng t t, sau ó ti n hành kh trùng, b o qu n trong môi trư ng thích h p và chuy n nhanh v phòng thí nghi m. Vi c thu nh n tr ng t bu ng tr ng liên quan t i m t s th pháp k thu t khác: - Phương pháp ch c-hút (follicle puncturing): s d ng kim tiêm 18 G và syringe 5 ml ch c vào nang tr ng r i hút tr ng. - Phương pháp r ch-múc (follicle dissection): dùng dao ph u thu t r ch nang tr ng múc d ch có ch a tr ng. - Phương pháp c t nghi n bu ng tr ng (ovary slicing): bu ng tr ng ư c c t nh b ng kéo và l c l y t bào tr ng. Hormone phát tri n tr ng PMSG (IU) FSH (mg)
- 29. các phương phápnêu trên, h u h t tr ng thu nh n ư c còn non, vì v y, chúng c n ph i ư c nuôi chín, m c dù các tr ng nuôi chín in vitro thư ng có hi u qu th tinh không cao. ngư i, sau khi kích thích gây r ng có th thu nh n tr ng b ng m t trong ba phương pháp (tùy tr ng thái b nh nhân, i u ki n b nh vi n): soi b ng (laparoscopic), siêu âm c c b bu ng tr ng (ultrasound) và g i r a nang tr ng (follicular flushing). II.1.4. Quan sát và phân lo i tr ng S d ng kính hi n vi soi n i v i phóng i x6-12 ki m tra d ch và x25-50 quan sát t bào tr ng. Tr ng chưa trư ng thành s t i và khó quan sát, nhưng v i tr ng trư ng thành, cũng khó nh n ra chúng vì l p t bào cumulus s làm tr ng tr nên m nh t. Tr ng thư ng ư c quan sát v i ch t lư ng khác nhau thông qua s hi n di n c a l p t bào cumulus. N u phát hi n m t ph c h p tr ng/cumulus (oocyte/cumulus –OCC) thì vi c ánh giá tr ng thái c a tr ng thư ng d a vào th tích, 6 m c và s hi n di n v s lư ng, hình thái c a toàn b kh i OCC. N u phát hi n tr ng có m t th c c có th cho r ng tr ng ang giai o n metaphase II (MII). Hi n có hai k thu t ánh giá s trư ng thành c a tr ng t ph c h p OCC. - K thu t ánh giá gián ti p thông qua các tr ng còn g n kh i cumulus cách ánh giá này ơn gi n nhưng thi u chính xác. - K thu t ánh giá tr c ti p: có hai cách: + Làm d t ph c h p OCC b ng cách gây xung ng m nh ĩa nuôi dư i kính hi n vi r i ánh giá tr ng d a vào s hi n di m c a túi m m hay th c c th nh t: n u quan sát th y túi m m (vùng ch a nhân), tr ng ư c cho là ang giai o n túi m m (GV); n u túi nhân không còn hi n di n trong tr ng, tr ng ư c cho là tr ng thái v túi m m (GVBD); khi th c c th nh t hi n di n, tr ng ã hoàn thành l n gi m phân u tiên và ang ngh metaphase – tr ng ang tr ng thái MII. + Phân tách kh i cumulus b ng enzym, r a tr ng và ánh giá gi ng như khi tr ng còn l p cumulus. Thu n l i c a k thu t này là tr ng ư c ánh giá c n th n hơn, và thư ng s d ng trong ICSI. Hình 2.1. Tr ng trư ng thành (ph c h p OCC) Kho ng không quanh bào tương L p t bào cumulus Th c c Zona pellucida Bào tương Màng t bào Vùng nhân
- 30. 30 II.1.5. Nuôi trng trư ng thành (in vitro maturation – IVM) M t tr ng ư c coi là chín khi ã trư ng thành c v nhân và t bào ch t. Ch nh ng tr ng chín m i s n sàng cho vi c th tinh. Các tr ng ư c l y tr c ti p t vi c ch c hút nang thư ng chưa trư ng thành, do ó, sau khi thu nh n, tr ng ph i ư c nuôi chín (trư ng thành) trong môi trư ng có m HEPES, huy t thanh và heparin. u tiên, tr ng sau khi thu nh n ư c r a b ng môi trư ng thu nh n ( ã ư c làm m 370 C), sau ó r a b ng môi trư ng nuôi chín và ưa vào các gi t môi trư ng nuôi nuôi chín. Môi trư ng nuôi chín tr ng khác nhau gi a các loài, ng th i khác nhau v m c ích s d ng và ôi khi tùy thu c vào các phòng thí nghi m, g m hai lo i: môi trư ng ơn gi n và môi trư ng ph c t p. Môi trư ng IVM thư ng ư c b sung hormone (FSH, LH/hCG, estradiol, prolactin…) nh m tác ng tr c ti p lên quá trình trư ng thành c a tr ng, c i thi n s phát tri n c a ph6oi giai o n trư c làm t . Nhân t tăng trư ng cũng ư c b sung g m IGF (vai trò g ng insulin–like growth factor), EGF (nhân t tăng trư ng bi u mô–epidermal growth factor) và TGF-L. Chúng tác ng lên s phân bào, kích thích t ng h p RNA và protein… Có nhi u y u t nh hư ng n IVM, ch ng h n nư c s d ng, th m th u, nhi t và khí, sáng c a môi trư ng, d ng c nuôi c y… Nhi t thích h p cho IVM tr ng bò và trâu là 38–390 C, n ng khí thích h p là 5%CO2, 5%O2 và 90% N2. II.2. CHU N B TINH TRÙNG II.2.1. Thu nh n tinh d ch ng v t, tinh trùng s d ng trong th tinh in vitro có th ư c khai thác t tinh hoàn, phó tinh hoàn thông qua con ư ng phóng tinh hay thu nh n t ph u thu t tr c ti p. M t s phương pháp thư ng dùng l y tinh t ng v t: - S d ng dòng i n nh kích thích. - Dùng tay xoa tuy n sinh d c qua tr c tràng. - Dùng âm o gi . - Dùng tay. Trong ó ph bi n nh t là dùng âm o gi và dùng tay. ngư i, trong trư ng h p tinh trùng bình thư ng, vi c thu nh n ư c ti n hành b ng cách dùng tay kích thích phóng tinh. II.2.2. ánh giá tinh d ch và tinh trùng o th tích tinh d ch thu ư c b ng syringe hay các pipette chia v ch, sau ó s d ng phòng m h ng c u (haemocytometer) ánh giá m t tinh trùng, di ng c a tinh trùng cũng như các ki u di ng c a tinh trùng. Qua ó, l a ch n phương pháp thích h p chu n b m u cho các k thu t h tr . Thao tác dư i kính hi n vi phóng i x20. Khi m c n lưu ý: (1) s hi n di n c a các m nh v t bào và nh ng t bào khác ngoài các t bào tinh trùng (t bào h ng c u, b ch c u), (2) s ngưng k t c a các t bào tinh trùng và ki u ngưng k t. H u h t m u tinh bình thư ng u có kh năng th tinh. Không s d ng các m u ch a lư ng tinh trùng b t thư ng (hình d ng) cao b i ti m năng th tinh c a chúng kém.
- 31. Ngoài ra, nhng hư h ng trên NST c a tinh trùng cũng có th ư c phát hi n b ng phương pháp nhu m chromomycin (CMA3) và nhu m aniline blue (AAB) Hình 2.2. M t s d ng tinh trùng b t thư ng ngư i (1: Quá to, 2: Quá nh , 3: Nhi u u, 4: Nhi u uôi, 5: D d ng, 6: uôi g y, 7: Thân dài) II.2.3. Chu n b tinh trùng cho k thu t th tinh Các phương pháp h tr th tinh, quy trình chu n b tinh trùng cơ b n gi ng nhau, tr trư ng h p th tinh vi thao tác. Tinh trùng ư c thu nh n b ng cách nào i n a cũng không có kh năng xâm nh p vào t bào tr ng n u không ư c ho t hóa. Trong s giao ph i t nhiên, tinh trùng ư c ho t hóa trong ng sinh d c c a con cái. Trong s giao ph i t nhiên, tinh d ch có ch c năng trung hòa và b o v tinh trùng kh i môi trư ng acid c a âm o, ng th i có m t ph n ch c năng n nh và nuôi dư ng tinh trùng. Tuy nhiên, tinh d ch cũng có th nh hư ng x u n tinh trùng sau khi phóng tinh vào âm như làm gi m s c s ng, gi m di ng và th m chí làm gi m kh năng th tinh c a tinh trùng. Do ó, vi c tách tinh trùng kh i tinh d ch s d ng vào m c ích i u tr là c n thi t. S l a ch n phương pháp chu n b tinh trùng (trong th c t có th ph i k t h p gi a nhi u phương pháp v i nhau) ph thu c vào s ánh giá v s lư ng t bào tinh trùng di ng, t l gi a s lư ng tinh trùng di ng so v i không di ng, th tích tinh d ch, s hi n di n c a các kháng th , s ngưng k t hay m nh v . * Thu nh n tinh trùng Hình 2.3. K thu t Swim up Bình thư ng (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 37–390 C 30– 60 phút Tinh trùng ch t/ b t ng Tinh trùng di ng t t
- 32. 32 Phương pháp swimup chu n: thư ng ư c dùng v i các m u tinh trùng có s lư ng cao (106 tinh trùng di ng/ml) v i kh năng di ng ti n t t. Nguyên t c c a phương pháp này là nh ng tinh trùng di ng t t s t bơi lên trên, thoát kh i l p tinh d ch phía dư i. Ly tâm v i gradient n ng không liên t c: ư c s d ng cho các m u có m t s bi u hi n v di ng th p, kh năng di ng ti n kém, lư ng m nh v và (hay) s lư ng t bào khác còn nhi u, có ch a n ng cao các kháng th kháng tinh trùng… Hình 2.4. K thu t ly tâm v i thang n ng Percoll Phương pháp l ng hay t trên paraffin l ng: thư ng ư c s d ng v i m u có s lư ng tinh trùng th p và di ng kém. Phương pháp này giúp tách các m nh v t bào hi u qu nhưng l i t n th i gian chu n b (vài gi ). Hình 2.5. K thu t t o gi t l ng sau ly tâm Ly tâm t c cao và r a: s d ng cho nh ng m u quá ít tinh trùng, m u có th pha loãng ho c không pha loãng. S di chuy n – l ng (migration-sendimantation): ây là m t s c i bi n k thu t swim-up k t h p v i m t bư c l ng. ây là m t k thu t nh nhàng nhưng hi u su t r t th p i v i tinh trùng kém di ng nên không ư c dùng r ng rãi trong IVF G n ây Zavos và cs. ã ngh s d ng ng tube nhi u ngăn (multi-chamber tube) thu nh n các tinh trùng nh m s d ng cho các k thu t h tr sinh s n b ng phương pháp swim-up và l ng. So sánh v i ly tâm theo gradient n ng , k thu t này cho th y m t k t qu t t hơn i v i tính di ng, hình thái tinh trùng bình thư ng, s óng xo n NST và cu i cùng, t l các tinh trùng ch t trong quá trình x lý cũng gi m. Percoll 90% Percoll 45% Tinh d ch Ly tâm Tinh trùng di ng Tinh trùng b t ng Tinh d ch ĩa Petri D u paraffin Huy n phù tinh trùng t o gi t tròn Các m nh v và t bào khác l ng xu ng Tinh trùng di ng
- 33. 33 Còn nhi ubi n pháp thu nh n tinh trùng khác, ch ng h n dùng các h t th y tinh (glass beads), l c b ng kh i s i th y tinh (Glass wool filtration), c t Sephadex, t o s di chuy n xuyên qua màng c a dòng tinh trùng (Transmembrance migration). Tuy nhiên, các phương pháp này ph c t p nên ít ư c s d ng. * Kích ho t tinh trùng Các ch t kích thích thư ng ư c s d ng là pentoxifylline và 2-Deoxuadenosine, chúng làm gia tăng cơ ch ho t hóa ATP n i bào, kích thích di ng c a các tinh trùng y u trong m u, làm tăng t l th tinh và mang thai i v i các m u tinh d ch không t t * L i ích c a vi c chu n b tinh trùng: Vi c ch n ư c các tinh trùng bình thư ng, di ng t t, ng th i cô c chúng trong m t th tích nh s t o nhi u thu n l i cho các phương pháp i u tr : - Lo i ư c các t bào ch t, h u h t các vi sinh v t và ph n l n các ch t c. - Lo i ư c ph n l n prostaglandins có trong tinh d ch, tránh s co th t t cung trong phương pháp IUI. - Kích thích s ho t hóa u tinh trùng, t o thu n l i cho quá trình th tinh. - Gi m ph n l n các nguy cơ nhi m khu n t tinh d ch, b i các phương pháp chu n b tinh trùng hi n nay có th phát hi n và lo i ư c h u h t vi sinh v t có trong tinh d ch. - Tránh nguy cơ s c ph n v ( ôi khi x y ra) khi cho tinh d ch vào bu ng t cung. - Gi m ư c nguy cơ t o kháng th kháng tinh trùng ngư i v khi cho quá nhi u tinh trùng ch t vào bu ng t cung. Chu n b tinh trùng cho các k thu t vi th tinh có m t s khác bi t i n hình. chu n b cho ICSI, ph i k t h p nhi u phương pháp, c bi t v i các m u tinh d ch quá ít tinh trùng, không th chu n b b ng cách ly tâm hay các k thu t swim-up thông thư ng. III. K THU T H TR S TH TINH III.1. D N TINH NHÂN T O (Artificial Insemination_AI) D n tinh nhân t o (còn g i gieo tinh; sinh s n nhân t o) là nh ng k thu t ưa tinh trùng ( ã ư c thu nh n, ch n l c) vào cơ quan sinh d c c a con cái ( ã ư c chu n b trư c cho vi c nh n tinh). D n tinh nhân t o ra i nh m tăng nhanh t c c i t o di truy n c a loài. Do v y, ư c phát tri n và ng d ng nhanh vào nông nghi p. ngư i, d n tinh nhân t o ư c s d ng i u tr các trư ng h p vô sinh liên quan n quá trình giao ph i không (hay khó) x y ra nam cũng như các b nh màng âm o, t cung làm cho tinh trùng gi m hay m t kh năng th tinh n . Ngòai ra, d n tinh nhân t o còn ư c s d ng làm tăng hi u qu th tinh và h n ch các b nh lây qua ư ng sinh d c. Tùy vào v trí ưa tinh trùng vào cơ quan sinh d c cái, AI ư c phân thành b n hình th c k thu t, bao g m: - ITI (IntraTubal Insemination): bơm tinh trùng vào ng d n tr ng. - IFI (IntraFollicular Insemination): bơm tinh trùng vào vòi tr ng. - ICI (IntraCervical Insemiantion): bơm tinh trùng vào c t cung. - IUI (IntraUterine Insemination): bơm tinh trùng vào t cung.
- 34. 34 Trong các kthu t d n tinh nhân t o, IUI ư c s d ng nhi u và ã ư c chu n hóa. ti n hành k thu t này, trư c h t tinh trùng ư c thu nh n, ki m tra s lư ng và ch t lư ng. ng th i, con cái s ư c theo dõi th i kỳ ng d c s n sàng nh n tinh. Nh m ch ng, các con cái nh n tinh ph i ư c gây r ng nhi u tr ng b ng hormone. D n tinh nhân t o trên i tư ng ng v t có m t s thu n l i: (1) c i t o ư c di truy n c a loài khi s d ng tinh trùng gi ng t t, (2) phát huy kh năng s d ng tinh trùng, (3) sau khi con c ch t, tinh trùng v n có th ư c thu nh n và s d ng, (4) gi m ư c các b nh lây lan qua ư ng giao ph i, (5) ti n l i và có hi u qu kinh t cao. Bên c nh ó, k thu t AI cũng g p ph i m t s khó khăn: (1) ph i phát hi n chính xác th i kỳ ng d c c a con cái, (2) ph i t p hu n cho ngư i thao tác (d n tinh viên), (3) c n m t s k thu t ph tr khác như ông l nh tinh, các k thu t ki m tra, ánh giá tinh trùng, ánh giá con v t nh n, theo dõi sau d n tinh... C n lưu ý: k thu t IUI th c hi n trên ngư i s d có nguy cơ a thai (do gây siêu bào noãn làm chín hơn m t tr ng) nên ngư i m có th sinh ôi, sinh ba... Nguy cơ nhi m trùng khi th c hi n IUI cao n u b nh vi n không ư c trang b hi n i. III.2. TH TINH IN VITRO (In vitro fertilization_IVF) Hình 2.6. Quy trình th tinh in vitro bò (I. Gordon, 2003) (Môi trư ng nuôi trư ng thành tr ng: TCM-199, Gonadotrophins, Oestradiol, 10% FCS. Tinh d ch sau khi gi i ông ư c ly tâm r a m t l n b ng dung d ch Percoll, 500 g, 10 phút. Sau khi r a, tinh trùng ư c sơ b 6 – 8 gi , ho t hóa i u ki n 390 , 5% CO2). Th tinh trong in vitro là quá trình k t h p gi a tinh trùng v i tr ng t o ra h p t , ư c th c hi n bên ngoài cơ th m , t i phòng thí nghi m (trong h p l ng, h p Petri, ng nghi m). Tuy Tinh trùng ho t hóa Nang tr ng Tinh d ch ông l nh/ gi i ông C n tinh trùng 30% Percoll 45% Percoll Tinh d ch sơ b trong 6 – 8 gi , 390 C, 5% CO2 (3 tri u tinh trùng/ml) Tr ng trư ng thành (10 – 15 tr ng) Nuôi c y 390 C, 28 gi , 5% CO2 Th tinh (10 tri u tinh trùng/ml)
- 35. 35 x y rangoài, nhưng các i u ki n cho quá trình IVF như môi trư ng, nhi t , m, nh t, y u t dinh dư ng... cùng các ch tiêu sinh h c khác ph i ư c m b o bình thư ng gi ng như trong cơ th m . Các tinh trùng dùng cho th tinh in vitro ư c chu n b theo các phương pháp ã ưa ra trên, tùy t ng i tư ng. Tuy trong quá trình th tinh ch có m t tinh trùng xâm nh p vào tr ng nhưng c n ph i có hàng ch c tinh trùng xung quanh. N ng tinh trùng có th ư c quy t nh do s lư ng tinh trùng và dung tích c a vi gi t môi trư ng th tinh. Thông thư ng, môi trư ng nuôi tr ng ( ôi khi có huy t thanh) ư c s d ng cho giai o n th tinh và th m chí c giai o n hình thành và phát tri n phôi sau này. Tuy nhiên, hi u qu c a vi c này không rõ ràng. Khi th tinh in vitro ho c nuôi phôi, c n thi t ph i ph lên trên b m t c a môi trư ng nuôi m t l p d u khoáng làm gi m quá trình t o h t ngưng t trong môi trư ng, cũng như làm thay i n ng c a các ch t. Ngoài ra, l p d u khoáng còn có tác d ng như là hàng rào ngăn c n các h t b i, vi sinh v t xâm nh p. M t b t l i c a vi c s d ng l p d u khoáng là ngăn c n s khu ch tán c a khí CO2 vào môi trư ng nuôi. Do v y, c n nhi u th i gian hơn t o s cân b ng c a c a khí trong pha khí c a t m và môi trư ng. * Các h th ng th tinh in vitro Ba y u t quan tr ng trong m t h th ng th tinh in vitro: (1) d ng c th tinh, (2) môi trư ng th tinh, (3) và các i u ki n khác (khí, nhi t và m môi trư ng…). D ng c thư ng dùng b ng nh a có ch t lư ng t t, ư c ki m tra ch t lư ng k càng v i nh ng th nghi m v ch t gây s c và gây c. Th tinh trong ng nghi m 5 ml: s d ng ng ly tâm nh a 5ml v i n p m ư c v n l ng, do ó giúp ki m soát t t pH và áp su t th m th u. N ng tinh trùng t i ưu là 50.000 tinh trùng di ng/1OCC. H n ch c a h th ng này ph i chuy n m u sang ĩa khác m i có th ki m tra s th tinh. Th tinh trong ĩa m t gi ng hay b n gi ng: thêm m t th tích huy n phù tinh trùng ã o tr ơc vào m i gi ng c a ĩa 4 gi ng (hay ĩa m t gi ng) v i n ng trung bình 100.000 tinh trùng di ng ti n/gi ng, qua êm r i r a tr ng lo i b các tinh trùng th a. H n ch c a h th ng này là khó th c hi n i v i các trư ng h p m u có s lư ng tinh trùng ít (vì không th cho nhi u hơn 0,5ml môi trư ng trong m i gi ng). Th tinh trong ng mao qu n và c ng r : s d ng m t c ng r hay ng mao qu n nh ng tinh trùng và tr ng. Sau khi th tinh, dùng pipette y h t dung d ch ch a trong ng mao qu n hay c ng ra vào trong ĩa 1 gi ng hay 4 gi ng ki m tra. Ưu i m c a phương pháp này là ti t ki m ư c tr ng và tinh trùng. Th tinh trong vi gi t: ưa m i OCC vào m t vi gi t ã ư c chuy n b s n t 20 – 50 µl huy n phù tinh trùng dư i l p d u, sau ó trong t m 5% CO2 và 370 C. Các vi gi t có th ư c chu n b trong ĩa petri nh , ĩa m t gi ng hay b n gi ng vô trùng. ây là phương pháp ph bi n nh t vì khá ơn gi n, an toàn mà v n em l i hi u qu cao, c bi t r t h u ích cho nh ng trư ng h p m u ít tinh trùng. Khó khăn chính là yêu c u ngư i thao tác ph i có kinh nghi m. Tùy theo thói quen ti n hành cũng như i u ki n c a các phòng thí nghi m thao tác cho tinh trùng vào trong môi trư ng có tr ng ã chu n b s n trong gi t th tinh hay ngư c l i. Vi c chuy n tinh trùng vào môi trư ng tr ng thư ng ư c ti n hành trên ng v t, ngư c l i, vi c chuy n tr ng vào tinh trùng thư ng ti n hành trên ngư i.
- 36. 36 * ánh giák t qu th tinh Ghi nh n k t qu , ánh giá s th tinh ngay ngày th nh t b ng quan sát hi n vi và có th ti n hành ph u tích phôi n u c n thi t. d dàng quan sát, các tr ng ã ư c th tinh nên ư c ph u tích sau 17 – 20 gi ánh giá. S th tinh thư ng ư c ánh giá b i s hi n di n c a hai ti n nhân và hai th c c trong tr ng. Ngoài ra, cũng có th quan sát th y nh ng bi u hi n hình d ng c thù như: màng zona pellucida y n; nguyên sinh ch t kh e m nh và s ch, có th bi u hi n t màu nâu n en; hình d ng có th khác (t hình c u n nh ng ki u hình không c trưng); có m t vành sáng rõ nguyên sinh ch t ngo i vi dày ch ng 5–10 µm. Các chi ti t v hình d ng và s th tinh nên ư c ghi nh n ti p t c vào ngày th 2 cho m i h p t quan tâm, khi mu n ch n chúng chuy n (c y phôi). Tách các h p t th tinh bình thư ng t i th i i m ghi nh n các gi t th tinh hay các gi ng ban u, chuy n vào các gi ng m i hay các ĩa m i ã ư c thay môi trư ng t t. Các b t thư ng khác cũng ã ư c quan sát: - Tr ng chưa trư ng thành v i túi m m hay không có túi m m ho c th c c (tr ng metaphase I) ư c th y xen l n gi a các tr ng sau khi thu nh n và th tinh. - Các tr ng xu t hi n v i ba ti n nhân thư ng phát tri n b t thư ng và có nh ng sai l ch nghiêm tr ng trong nhi m s c th b i vì hình thành t i ba thoi vô s c. - Các tr ng v i m t ti n nhân và hai th c c ư c ho t hóa và thư ng ch a u tinh trùng ang xo n ch t hay tháo xo n m t ph n. - Tr ng m t ti n nhân và m t th c c: n u không th y hình thành th c c th hai, tr ng này thư ng không có kh năng phát tri n, nên lo i b chúng. S tái th tinh: Các tr ng không xu t hi n (ho c không quan sát ư c) ti n nhân có th ư c tái th tinh. S th tinh hay s phân c t thư ng ư c xác nh n vào ngày th hai, nhưng i u này có th là k t qu c a quá trình th tinh c a l n u tiên. Cũng không lo i tr kh năng n y sinh s ch m tr th tinh do các khi m khuy t ch c năng tinh trùng ho c s trư ng thành tr c a tr ng. Nh ng phôi này nói chung c n ch n oán trư c khi cho làm t . III.3. GIFT (GAMTE INTRAFALLOPIAN TRANSFER) K thu t li u pháp giao t (GIFT) ư c gi i thi u l n u tiên năm 1984 b i Ricardo Asch (M ), trong ó, m t hay nhi u tr ng tr n v i tinh trùng ã ư c ho t hóa và l c s ch ư c tiêm vào trong vòi d n tr ng. Như v y, s th tinh x y ra t i ng d n tr ng c a cơ th m ch không ph i trong ng nghi m như trong k thu t IVF. GIFT ư c th c hi n qua ba bư c: - Kích thích r ng tr ng nhi u. - Tr ng và tinh trùng sau khi thu nh n ư c áng giá ch t lư ng và x p lo i, tinh s ch và ho t hóa, s d ng các t bào t t. - Chuy n giao t : m t khi tinh trùng và tr ng ã s n sàng cho th tinh, chúng ư c tr n chung l i chuy n vào ng d n tr ng. Thu n l i c a GIFT là tinh trùng và tr ng g p nhau trong ng d n tr ng, nơi x y ra s th tinh t nhiên. Tuy nhiên, do c n ph i ti n hành n i soi cũng như s h tr c a các k thu t khác
- 37. nên GIFT tn kém. M t khác không th tr c ti p theo dõi quá trình th tinh nên không bi t ư c n u s th thai không x y ra thì nguyên nhân do y u t nào. T l thành công c a GIFT cao hơn không áng k so v i IVF. Có th ch ơn gi n là s th tinh x y ra trong môi trư ng cơ th (t nhiên) t t hơn trong môi trư ng ng nghi m (nhân t o). III.4. VI TH TINH (MICROINSEMINATION) Hình 2.7. Các phương pháp vi th tinh III.4.1. Khoan màng zona (ZD_zona drilling) Khoan th ng m t l nh trên màng zona b ng acid tyrode v i m t micropipette nh n(acid làm hòa tan màng), rau ó r a tr ng vài l n b ng môi trư ng nuôi c y m i ( trung hòa acid) r i l y tr ng này th tinh in vitro. Ngoài ra, cũng có th dùng trypsin hay pronase phá màng zona. Phương pháp này cho t l th tinh cao hơn v i m t tinh trùng th p trong IVF chu t, tuy nhiên, ngư i, k t qu thu ư c không kh quan – s th tinh x y ra nhưng phôi có ch t lư ng kém nên khó phát tri n thành thai. III.4.2. Tách b m t ph n màng trong su t (PZD – Partial Zona Dissection) Dùng m t ng hút u nh n âm vào màng zona t i v trí 1 gi và xuyên ra ngoài t i v trí 11 gi . Dùng m t ng hút khác gi l y i ph n màng trong su t n m phía trên c a ng hút u nh n. Các noãn x lý theo cách này có th phát tri n bình thư ng sau khi th tinh, phôi cũng phát tri n thành thai bình thư ng. Phương pháp này không ư c coi là ti n b trong k thu t vi th tinh vì: - T o l tương i l n vùng màng trong su t khi n phôi ư c t o ra có ch t lư ng kém, làm t không t t. - Các tinh trùng y u và tinh trùng b t thư ng có m t trong các m u tinh d ch cũng s d dàng xâm nh p vào tr ng. - Có th nhi u tinh trùng cùng lúc chui vào tr ng. SUZI ICSI ZD PZD V trí 11 gi V trí 1 gi holding pipette injection pipette Khoang noãn Th c c T bào V trí 3 gi
- 38. 38 III.4.3. Tiêm tinhtrùng vào dư i màng trong su t (SUZI – Surzonal sperm injection) Dùng m t ng hút nh ưa th ng tinh trùng xuyên qua màng torng su t vào trong kho ng không quanh noãn tương. Các th nghi m u tiên thư ng tiêm ch m t tinh trùng, k t qu không kh quan. Sau ó, ngư i ta tiêm t 2 n 3 tinh trùng, k t qu th tinh tăng lên nhưng kèm theo là nguy cơ a th tinh cũng tăng. gi i quy t v n này, k thu t lo i b ti n nhân th a ư c th nghi m. III.4.4. Bơm tinh trùng vào bào tương tr ng (ICSI – Intracytoplasmic sperm injection) - Thu nh n m t tinh trùng di ng trong môi trư ng vào m t kim nh n ( uôi vào trư c), hút vào và y ra vài l n cho n khi tinh trùng b t ng, sau ó hút sâu tinh trùng vào bên trong pipette (h n ch t i a môi trư ng i theo). - Dùng pipette holding gi tr ng (sao cho vùng nhô lên c a tr ng v trí 12 gi hay 6 gi ). - Dùng mũi kim nh n (ch a tinh trùng) âm th ng màng zona t i v trí 3 gi . Khi pipette xuyên ch ng 1/3 n ½ ư ng kính tr ng thì y nhanh kim v phía trư c, cùng th i i m ó v tr ng ư c kéo v phía pipette gi . - y tinh trùng vào trong noãn tương r i c n th n rút pipette ra ngoài. - Nuôi tr ng trong t CO2. Sau 16 – 18 gi ki m tra th tinh. Ki m tra l n th hai vào ngày hôm sau ánh giá s phát tri n c a phôi. Hình 4.34. Quy trình ICSI Hình 2.8. Quy trình ICSI * H n ch c a ICSI Bên c nh nh ng l i ích do ICSI mang l i, nó cũng ch a ng nhi u nguy cơ. Th nh t, ó là s lan truy n nh ng b nh di truy n ti m n, b i vì b nh vô sinh nam thư ng do s b t thư ng v NST hay nh ng b t thư ng khác v m t di truy n. Th hai là s không nh t quán v tinh trùng. Th ba, s th tinh không hoàn ch nh. Th tư, sai l ch s bi u hi n gen, trư ng h p này thư ng x y ra khi s d ng tinh trùng chưa trư ng thành. III.4.5. ROSI (Round spermatid injection) ROSI là k thu t ICSI nhưng s d ng các tinh trùng hình tròn không có uôi (các t bào hình thành trong quá trình sinh tinh, mang b NST 1n
- 39. 39 III.4.6. ánh giás th tinh và phân c t 16 n 18 gi sau khi tiêm, ti n hành ánh giá s lư ng và hình d ng c a ti n nhân thông qua kính hi n vi o ngư c, b ng cách dùng m t mũi kim th y tinh xoay nh tr ng. Ti p t c ki m tra các phôi phân c t sau 24 gi nuôi c y. Chuy n phôi ư c ánh giá bình thư ng hay không vào kho ng 48 gi sau vi tiêm. Các phôi thích h p cho ông l nh ho c là vào ngày 1 (giai o n ti n nhân) ho c ngày 2 (giai o n phân c t s m). S th tinh ít khi th t b i i v i ICSI, h u h t các trư ng h p th t b i liên quan n tinh d ch ch a các tinh trùng không di ng hay tinh trùng u tròn. S th tinh th t b i có th ch t lư ng tr ng kém. Vi c s d ng các t bào tinh trùng t mào tinh hay tinh hoàn (nói chung các tinh trùng chưa trư ng thành) làm gi m t l th tinh và mang thai. ROSI cho th y t l th tinh trong kho ng 17– 27%, th p hơn so v i các t bào tinh trùng trư ng thành. IV. C Y TRUY N PHÔI Trong quá trình sinh s n in vivo, tr ng ư c th tinh và phát tri n thành phôi ngay trong ng d n tr ng. Phôi v a phát tri n v a chuy n v v t cung. Khi ã bám vào màng áy t cung, phôi ti n hành làm t và ti p t c phát tri n. Do v y, các phôi sau khi ư c t o ra t in vitro (hay in vivo) c n ư c ưa vào t cung c a cá th nh n thích h p. Vi c c y phôi vào t cung g i là chuy n phôi hay c y truy n phôi. Như v y, chuy n phôi là k thu t thu nh n phôi t b ph n sinh d c c a cá th cái (hay in vitro) c y vào t cung c a con cái nh n, nh m ti p t c hoàn thành quá trình mang thai và sinh con. B ng 2.2. C y truy n phôi thành công các ng v t Năm ng v t Tác gi Năm ng v t Tác gi 1890 Th Heape 1964 Chu t túi Blaha 1932 Dê Warwick và cs 1968 Ch n sương Chang 1933 Chu t rat Nicholas 1974 Ng a Oguri, Tsutsumi 1934 C u Warwick và cs 1975 Ch n vizon Adams 1942 Chu t nhà Fekete, Little 1976 Kh Kraemer và cs 1949 Dê Warwick, Berry 1978 Mèo Schriver, Kraemer 1951 Heo Kvansnickii 1978 Ngư i Steptoe, Edwards 1951 Bò Willett và cs 1979 Chó Kinney và cs Khi ưa vào cá th nh n, phôi v n s ng và phát tri n bình thư ng trên cơ s tr ng thái sinh lý, sinh d c c a cơ th nh n phôi phù h p v i tr ng thái sinh lý, sinh d c c a cơ th cho phôi ho c/ và phù h p v i tu i phôi (g i s phù h p này là ng pha). S ng pha ư c chu n b b ng các li u pháp hormone. Chuy n phôi tr i qua các bư c cơ b n sau: (1) Chu n b phôi; (2) Chu n b con nh n phôi; (3) C y truy n phôi vào con cái nh n. Ngư i nh n c y phôi t t nh t dư i 50 tu i, kho m nh không có các b nh lý thai s n. chu n b , ngư i nh n phôi ph i ư c khám t ng quát n i, ngo i khoa, khám ph khoa, kh o sát v n i ti t, c bi t là n i ti t sinh s n. Hơn n a, ngư i nh n c y phôi cũng ph i ư c ki m tra HbsAg, HIV, BW. T t nh t, ngư i m ã sinh thu n l i trư c ó.
- 40. * Ch nl c các phôi Nhìn chung có th tuy n ch n c y g m ba lo i phôi v i các tiêu chu n sau: - Lo i r t t t: Phôi có s phát tri n úng v i l ch trình sinh lý, hình thái quan sát chu n. Kh i phôi bào phân chia u, rõ và m màu. Màng zona pellucida tròn, p. Phôi bào liên k t ch t ch , không có t bào r i, không có k gian bào. - Lo i t t: Cơ b n phôi có s phát tri n úng v i l ch trình sinh lý, kích thư c và s lư ng. Có th các phôi bào không p, không u, có m t s t bào r i, m t ít m nh v n nhưng s liên k t t bào ph i tương i ch t ch . - Lo i trung bình: Các phôi bào liên k t thi u ch t ch , có nhi u t bào r i, nhi u m nh v n r i xen k ho c k t t . Kích thư c phôi bào không u, thư ng nh hơn bình thư ng. Màng trong su t không u, có th v , không tròn. * Chuy n phôi a. Chuy n h p t (Zygote Intrafallopian Transfer_ZIFT): Dùng m t ng dài ưa h p t vào o n cu i c a vòi tr ng dư i s h tr c a siêu âm. Thu n l i c a ZIFT là tr ng ư c th tinh bên ngoài cơ th trong th i gian ng n và nhanh chóng quay l i môi trư ng t nhiên. Tuy nhiên không ch c ư c r ng h p t có phát tri n thành phôi t t hay không. Phương pháp này ít ư c s d ng. Hình 2.9. Quy trình ZIFT (1) Thu nh n tinh trùng và tr ng, (2) Tinh trùng và tr ng ư c th tinh bên ngoài cơ th trong th i gian ng n sau ó nhanh chóng quay l i i u ki n môi trư ng t nhiên, (3) Chuy n h p t vào o n cu i c a vòi tr ng. b. Chuy n phôi giai o n 2 t bào n giai o n morula: Chuy n phôi 2–12 t bào: Th i i m thu n l i nh t chuy n phôi là khi phôi ch bên ngoài trong th i gian ng n (2 ngày) (phôi bên ngoài lâu s ch u nhi u nh hư ng c a các i u ki n bên ngoài và nguy cơ nhi m trùng cao). Nên ch n phôi có nhi u t bào vì các phôi phát tri n nhanh s d dàng làm t trong bu ng t cung. Vi c ch n các phôi chuy n vào giai o n 10 -12 t bào thông thư ng ơn gi n hơn, nhưng cũng có nhi u m t khó khăn so v i chuy n phôi 2 - 4 t bào. Chuy n phôi morula (phôi dâu ho c giai o n túi m m): g n gi ng v i i u ki n t nhiên. Tuy nhiên, chuy n phôi vào giai o n này v n không ư c ưu tiên vì th i gian phôi phân chia nén c t bào ang x y ra trong i u ki n nuôi c y nhân t o, ây là giai o n nh y c m. C y phôi lúc này thư ng không t t b ng giai o n blastocyst.
- 41. Hình 2.10. Chuyn phôi giai o n 6 t bào n morula (1) Thu nh n tinh trùng, tr ng, (2) Sau th tinh kho ng 18 gi ki m tra s th tinh và phát tri n c a phôi, (3) Ch n phôi và chuy n phôi vào bu ng t cung. c. Chuy n phôi giai o n blastocyst : Nh ng thu n l i c a c y chuy n phôi giai o n blastocyst: - Phôi chuy n vào t cung có s phù h p gi a t cung và giai o n phát tri n c a phôi, khi ó môi trư ng t cung s t o i u ki n t t nh t cho phôi làm t và phát tri n. - Cho phép phôi phát tri n trong phòng thí nghi m trong th i gian dài là phương pháp t t ch n l c phôi thích h p nh t cho c y chuy n. Theo lý thuy t, nh ng phôi ch t trư c khi phát tri n thành blastocyst (in vitro) cũng có th phát tri n th thai trong t cung. - B i vì phôi blastocyst ư c ch n l c nên h u như có th làm t và mang thai. T l phôi phát tri n cao khi chuy n phôi giai o n s m hơn (giai o n 2 t bào n morula). - Chuy n ít phôi nên làm gi m tình tr ng a thai. ây là nguyên nhân quan tr ng nh t ph i chuy n phôi giai o n blastocyst. Nh ng r i ro và b t l i khi chuy n phôi giai o n blastocyst: - M t s phôi blastocyst s d ch t trong phòng thí nghi m. - Không ai bi t r ng, các phôi ch t khi phát tri n thành blastocyst, n u ư c chuy n s m s phát tri n thành thai t t, bình thư ng hay không. - Có th phôi khó s ng sót khi ông l nh và gi i ông. ngư i, không nên chuy n m t lúc hơn hai phôi blastocyst vào t cung m nh n b i r i ro a thai cao. Tuy niên, t l th thai khi chuyên m t phôi th p hơn 2, 3 hay 4 phôi cùng lúc, do v y c n th a thu n gi a ngư i nh n và bác sĩ trư c khi chuy n phôi. IV. M T S K THU T LIÊN QUAN * B o qu n phôi và các giao t : Phôi và các giao t có th ư c tr l nh nhi t c c th p (-1960 C trong nitơ l ng) trong m t th i gian r t dài. * H tr s thoát nang (Assisted hatching – AH): s d ng m t pipette gi ch t phôi, sau ó dùng m t pipette khác làm phân rã m t ph n màng zona. Phôi ã b th ng màng ư c ti p t c nuôi c y và chuy n vào t cung m .
- 42. Hình 2.11. Phôiang thoát nang AH không ph i là khâu b t bu c trong công ngh h tr sinh s n mà ư c ch nh cho m t s trư ng h p tương i c bi t: (1) màng zona quá dày, (2) các trư ng h p làm t c a phôi th t b i, (3) cá th nh n mang phôi l n tu i, (4) ch t lư ng phôi kém... * Xác nh gi i tính phôi (Sex determination) Vi c xác nh gi i tính thông qua phôi có th ư c th c hi n qua vi c xác nh gi i tính tinh trùng ho c xác nh tr c ti p gi i tính c a phôi. Xác nh gi i tính tinh trùng d a vào tính tích i n hay tr ng lư ng riêng c a chúng khi mang NST X hay Y, thông qua ly tâm hay i n di tinh d ch. Hi n nay, còn có th d a vào ki u hình khác bi t gi a tinh trùng mang NST X và Y l a ch n b ng máy flowcytometer, v i hi u qu ch n l c ư c ghi nh n là 90%. G n ây, các nhà khoa h c Anh ưa ra k thu t m i tách tinh trùng mang NST X và Y d a trên cơ s giám nh s khác nhau v s lư ng DNA c a chúng. Có nhi u cách xác nh gi i tính phôi: - Phương pháp t bào h c: Xác nh gi i tính phôi b ng cách s d ng th Barr c a các t bào phôi giai o n blastocyst (phương pháp này ít hi u qu , có th nh m l n vì s hi n di n c a nhi u h t trong t bào ch t) ho c phân tích NST trong t bào phôi (thông qua s khác bi t v hình d ng c thù c a các NST gi i tính). Hình 2.12. Xác nh gi i tính qua th Barr (Steven M. Carr, 2000) - Phương pháp mi n d ch: S ho t ng c a gen trên NST Y t o nên kháng nguyên tương h p mô Y (Histocompatibility Y), do ó nuôi phôi trong môi trư ng có b sung kháng nguyên và b th ho c s d ng kháng nguyên th c p ư c ánh d u v i các ch t phát huỳnh quang có th giúp xác nh gi i tính c a phôi.
- 43. 43 - Phương phápphân t : Trên NST Y ch a m t trình t DNA chuyên bi t cho gi i tính c, có th ư c phát hi n. L y 2 – 4 t bào phôi, thu nh n DNA, s d ng c p m i c trưng cho o n DNA này khu ch i chúng b ng k thu t PCR. Phân tích k t qu PCR b ng i n di trên gel có th giúp xác nh ư c gi i tính c a phôi. Phương pháp này có nhi u ưu i m: nhanh, chính xác (có th g n 100%), lư ng t bào thu nh n ít nên phôi ít t n thương, có kh năng s ng cao hơn các phương pháp khác. Kh năng có thai t phôi ã sinh thi t l y t bào ch kém phôi nguyên ch ng 5–10%.
- 44. 44 CHƯƠNG 3 CÔNG NGHT O DÒNG VÔ TÍNH I. GI I THI U Thu t ng dòng (clone) có ngu n g c ti ng Hy L p (klon: nhánh con hay cành con), ư c dùng ch nh ng phân t DNA, nh ng t bào hay nh ng cơ th hoàn ch nh có cùng m t c u trúc di truy n. T o dòng (cloning) là khái ni m di n t nh ng thao tác k thu t nh m t o ra dòng, thư ng ư c dùng trong tr ng tr t, chăn nuôi. Trư c ây, ngư i ta quan ni m r ng thông tin di truy n c a t bào gi m b t khi chúng bi t hóa, nói cách khác, các t bào bi t hóa không th phát tri n thành cơ th hoàn ch nh. Gi thuy t này ã b bác b b i thí nghi m c a Hans Dreisch (1894): các t bào phôi t phôi 2 – 4 t bào c a nhím bi n khi b tách ra v n có kh năng phát tri n thành u trùng Hình 3.1. Thí nghi m c a Hans Spemnn (1914) Thí nghi m trên phôi sa giông c a Hans Spemann (1901) cũng cho k t qu tương t . Thí nghi m u tiên v chuy n nhân ư c Hans Spemann th c hi n năm 1914: dùng s i tóc bu c tr ng m i th tinh và si t l i, làm cho nhân và t bào ch t c a tr ng d n sang hai bên khác nhau. Khi nhân phân chia n giai o n 16 t bào, m t nhân trư t qua eo th t và l t sang ph n bên kia c a tr ng. Nhân phía t bào cũng cũng b t u phân chia. Nút th t c a s i tóc ư c si t ch t ngăn c n s di chuy n qua l i ti p theo gi a các nhân. Cu i cùng ông thu ư c hai u trùng: u trùng phía bên ph n nhân phát tri n s m hơn u trùng phía bên t bào ch t. i u này chúng t r ng m t nhân c a phôi giai o n 16 t bào có th tr c ti p phát tri n thành u trùng. 1952, Robert Briggs và Thomas J. King (Vi n Nghiên c u Ung thư Philadelphia) t o dòng m t con ch c (Rana pipiens) b ng cách c y nhân t bào giai o n mu n c a phôi vào tr ng chưa th tinh ã lo i nhân. Tr ng phân chia nhưng không phát tri n. Các nghiên c u t o dòng vô tính trên lư ng cư s m thành công, nhưng v i ng v t h u nhũ l i g p khó khăn v k thu t, tr ng c a chúng nh hơn 1000 l n so v i tr ng ch. Năm 1984, Steen Willadsen ( an M ch) t o dòng c u b ng cách chuy n m t t bào c a phôi tám t bào vào tr ng chưa th tinh ã lo i nhân. Ba trong s b n phôi ư c chuy n vào vòi tr ng c u cái và phát tri n thành nh ng chú c u con gi ng nhau v di truy n. Năm 1986, Willadsen ti p t c thành công t o dòng m t con bò b ng cách s d ng các t bào phôi ã bi t hóa m t tu n. Ian Wilmut và c ng s ã thành công trong vi c t o dòng ng v t có vú u tiên t nh ng t bào sinh dư ng (1995). S ra i c a c u Dolly ã m ra m t cu c cách m ng cho công ngh t o dòng vô tính ng v t. n nay, r t nhi u loài khác cũng ã ư c nhân dòng thành công theo phương th c này, th m chí là t nh ng t bào mà bình thư ng chúng không còn kh năng phân chia (t bào th n kinh). S i tóc
- 45. 45 II. M TS QUÁ TRÌNH SINH H C C A CÔNG NGH T O DÒNG II.1. S HO T HÓA TR NG (OOCYTE ACTIVATION) Tr ng ng v t h u nhũ sau khi chín r ng s ngh kì metaphase gi m phân l n II (MII), n u ư c th tinh tr ng s phát tri n thành phôi. Hi n tư ng tr ng thoát ra kh i kì ngh MII nh th tinh ư c g i là s ho t hóa tr ng. S ho t hóa tr ng bao g m m t chu i các thay i n i bào, ư c x p thành các s ki n s m (s thay i n ng ion canxi n i bào, t ó kh i ng các s ki n khác c a quá trình ho t hóa như ph n ng h t v ngăn c n hi n tư ng a tinh trùng xâm nh p tr ng, b sung nh ng mARN c a ngư i m và ti p t c quá trình gi m phân t o th c c th hai) và các s ki n mu n (hình thành ti n nhân c và cái, t ng h p DNA và b t u chu kì nguyên phân u tiên) II.2. S IN D U DI TRUY N (IMPRINTING) ây là m t hi n tư ng mà nh ó, m t nhóm gen trong b gen ng v t khi bi u hi n ph i ph thu c vào gen c a cha m chúng. th h con, m t s gen ư c in d u th a hư ng t cha có th bi u hi n và các gen in d u th a hư ng m có th im l ng hay ngư c l i. Do v y, các d u in (imprint) có th ho c là, ho t ng như m t nhân t gây im l ng (silencer) ho c là m t nhân t ho t hóa (activator) i v i các gen ư c in d u. Hình 3.2. Các d u in ư c thi t l p, truy n t trong quá trình sinh giao t và phát tri n ( ư ng k nét t: allele có ngu n g c t cha; ư ng k nét li n: allele có ngu n g c t m ; h p xanh: s methyl hóa chuyên bi t cha ư c thi t l p trong su t quá trình phát sinh giao t ; A: b gen có ki u in d u khác nhau sau khi th tinh; B: các d u in và s c d u in duy trì trong su t quá trình phát tri n; C: nh ng d u in b xóa các t bào sinh d c sơ khai; D: nh ng d u in thích h p tái thi t l p cho th h sau. (J. Greg Falls và cs, 1999) m t phôi phát tri n bình thư ng, c n m t nhóm NST ã ư c in d u t m và m t nhóm NST khác ư c in d u t cha. Nh ng gen ư c in d u thư ng có nh ng d u in bên trên hay g n ngay gen ó. S in d u này c trưng cho t ng cá th g i là ki u in d u (imprinting pattern). Do ó, nh ng b n sao c a gen mà th h con ư c th a hư ng t m s khác nhi u so v i gen ư c th a A B T bào ã bi t hóa c d u in C T bào sinh d c nguyên th y Xóa d u in D Giao t Thi t l p d u in
- 46. 46 hư ng tcha (Reik W và Walter J, 200). Trong phôi và th h con sau này, nh ng d u in ó s ki m soát s bi u hi n c a các gen. II.3. TÁI THI T L P CHƯƠNG TRÌNH (EPIGENETIC REPROGRAMMING) ng v t h u nhũ, tr ng chín r ng vào kì MII và ngh kì này n khi ư c th tinh, r i ti p t c quá trình gi m phân, y ra th c c th hai, hình thành ti n nhân c và cái. Sau ó, phôi i vào quá trình nguyên phân liên t c, bi t hóa thành các t bào chuyên bi t, k t qu là hình thành các mô, cơ quan. Chương trình phát tri n sinh h c luôn m b o s chuy n ti p thành công t tr ng n th h con. Nhìn chung, m t khi chương trình ã b t u thì không th ng ng hay quay ngư c tr l i, m c dù các t bào phôi giai o n s m là toàn th trong l n phân chia u tiên hay th hai. Sau tr ng thái này, nh ng t bào riêng l s không th phát tri n thành nh ng cá th m i, b i có nhi u bi n i x y ra trong DNA, kéo theo s bi u hi n gen trong quá trình phát tri n t nhiên. Tuy nhiên, khi chuy n nhân in vitro, nh ng t bào này vào ư c noãn tương thì chương trình phát tri n có th quay ngư c l i. Ngư i ta g i ây là quá trình tái thi t l p chương trình nhân (nuclear reprogramming). Nói cách khác, khi DNA ư c tái thi t l p chương trình, nó có kh năng phát tri n thành phôi. i u này cho th y noãn tương c a tr ng có th giúp khôi ph c l i tính toàn th hay tái thi t l p chương trình DNA, nhân c a m t t bào ã ư c chương trình hóa có th b t u l i và hoàn thành s phát tri n. Do ó, trái v i quan i m cũ, s tái thi t l p chương trình nhân có th x y ra khi ti n hành các k thu t chuy n nhân in vitro thích h p. II.4. TI M NĂNG (POTENCY) VÀ TOÀN NĂNG (TOTIPOTENT) Trong sinh h c t bào, ti m năng ư c nh nghĩa là kh năng phát tri n c a các t bào trong m t i u ki n môi trư ng nh t nh. T bào toàn năng có kh năng phát tri n không h n nh như h p t và các t bào c a phôi s m, m i t bào có kh năng t o ra m t cá th trư ng thành hoàn ch nh và t t c các mô và cơ quan c a nó, cũng như m t ph n khác c a bào thai (c th là nhau thai). Năm 1985, các nhà khoa h c ã ch ra r ng, t bào sinh dư ng c a các cơ th k c ng v t b c cao có kh năng phát tri n thành m t cơ th m i hoàn ch nh, nói cách khác, t bào có tính toàn năng và ch a y thông tin di truy n cho m t cá th hòan ch nh. n nay, trong các t bào ng v t h u nhũ, t bào h p t hay phôi giai o n t 2–8 t bào ư c bi t chính xác là có tính toàn năng. i u này có nghĩa là m i t bào phôi giai o n này u có kh năng t o ra m t cá th riêng r hoàn thi n. II.5. NHÂN T XÚC TI N NGUYÊN PHÂN, GI M PHÂN, TRƯ NG THÀNH (MPF) Sau khi có s xâm nh p c a tinh trùng, tr ng ti p t c quá trình gi m phân, hình thành th c c th hai, NST c và cái cùng tháo xo n hình thành hai ti n nhân. Sau khi DNA sao chép, h p t b t u phân c t hình thành hai t bào phôi u tiên. Tác ng làm “m i” cho hàng lo t s ki n trên là s ho t hóa c a nguyên sinh ch t t bào tr ng nh n ư c g i là nhân t xúc ti n nguyên phân/ gi m phân/ trư ng thành (matured/ meiosis/ mitosis factor –MPF) Trong su t quá trình trư ng thành c a tr ng, MPF ho t ng t i a t i metaphase c a c gi m phân I và II. Khi tr ng ngh kỳ MII, s ho t ng c a MPF v n m c cao. Khi tr ng ư c th tinh hay ho t hóa, s ho t ng c a MPF gi m i nhanh. Do ó, có s khác bi t trong nguyên sinh ch t khi s d ng tr ng MII hay h p t (giai o n ti n nhân) nh n nhân chuy n. Khi tr ng MII dùng nh n nhân chuy n, MPF ho t ng cao; trong khi ó, h p t (giai o n ti n nhân)
- 47. 47 MPF ho tng gi m. Tr ng MII hay h p t khi ã lo i b nhân (ch còn nguyên sinh ch t – cytoplasm) ư c g i là các cytoplast. II.6. S BI T HÓA T BÀO G C PHÔI Các t bào g c phôi ch m i ư c tìm hi u vào nh ng năm g n ây, nhưng chúng ã t ra có s h p d n c bi t i v i các nhà khoa h c b i tính toàn th và linh ng. Karin Hubner và cs (2003) ã nuôi c y các t bào g c phôi chu t trong th i gian dài và ã t o ra nh ng t bào gi ng tr ng (oocyte-like cell) t nh ng t bào g c phôi. (a) C u trúc gi ng nang tr ng sơ c p (b) C u trúc gi ngnang tr ng th c p Hình 3.3. Hình thái c m t bào g c phôi và tr ng (Hubner và cs, 2003) Các t bào gi ng tr ng ư c hình thành trong quá trình nuôi c y t bào g c phôi, bi u hi n nh ng marker gi ng v i các t bào tr ng bình thư ng ư c t o ra trong quá trình sinh tr ng in vivo. Do c tính toàn th c a các t bào g c phôi, vi c s d ng chúng trong công ngh t o dòng ng v t ang ư c quan tâm c bi t trong tr li u. Các cơ ch ho t ng gen c a t bào g c phôi cũng chưa ư c tìm hi u nhi u, song ây là m t chi n lư c y h a h n trong công ngh t o dòng tr li u. III. CÁC K THU T CƠ B N TRONG T O DÒNG IN VITRO V i nhi u quy trình k thu t, 75% s thành công c a các thí nghi m t o dòng là do d ng c thao tác t t. Có nhi u d ng c , thi t b ư c s d ng chung trong công ngh h tr th tinh ICSI. K thu t vi thao tác (micromanipulation technique), ư c coi là chìa khóa c a t o dòng vô tính in vitro ng v t, c p phôi và t bào. Nhìn chung, trong công ngh t o dòng vô tính in vitro trên ng v t h u nhũ u s d ng noãn bào trư ng thành ã ư c lo i b nhân 1n v i các th pháp i n hình sau: III.1. Tách phôi (embryo spitting) M t phôi có th ư c tách (in vitro) b ng vi thao tác thành hai hay nhi u ph n tương i b ng nhau, th m chí là tách thành t ng t bào riêng r .
- 48. Phôi giai on cu i c a phôi dâu ho c giai o n u c a phôi nang s cho k t qu tách ôi cao hơn các giai o n sau. Khi c t phôi các giai o n mu n hơn, t bào phôi ã bi t hóa hình thành nên các lá phôi nên xác xu t cho m t cơ th tr n v n khó ư c m b o, thông thư ng thai b ch t trư c khi sinh. tách r i các t bào c a phôi, c n th c hi n giai o n s m (thư ng là 2 – 4 hay 8 t bào) và m i t bào s có th phát tri n thành m t cơ th hoàn ch nh v i i u ki n thích h p v i chúng. Hình 3.4. Chi n lư c t o dòng b ng tách phôi thành các t bào ơn * Ý nghĩa c a tách phôi: - Tăng nhanh s lư ng phôi t m t phôi ban u, i u này giúp ngư i chăn nuôi có ư c nhi u con gi ng hơn, c bi t là nh ng con gi ng nhau v m t di truy n. - Giúp xác nh gi i tính s m c a v t nuôi. - Giúp cho các v n nghiên c u cơ b n và ng d ng khác phát tri n. Tuy nhiên, s lư ng phôi tăng lên t k thu t tách, c t không nhi u. III.2. Chuy n nhân (nuclear transfer) Chuy n nhân là k thu t then ch t c a công ngh t o dòng ng v t, trong ó, nhân t bào sinh dư ng c a cơ th trư ng thành (hay c a t bào phôi) ư c thu nh n và chuy n vào tr ng trư ng thành ã lo i b nhân). K thu t này giúp t o các dòng t bào m i, và n u ti p t c phát tri n, m t “phôi” m i s hình thành cho ra m t cá th m i thông qua c y phôi. Cá th con ra i có “b n sao” DNA chính xác c a cơ th m ã cung c p ngu n t bào sinh dư ng ban u nói trên. Hình 3.5. Ti n trình chuy n nhân t o c u Dolly Các t bào c a m t phôi ban u T bào phôi ư c tách r i Phát tri n thành phôi C y phôi vào các con nh n khác nhau Các cá th con ra i gi ng nhau
- 49. 49 * Quy trìnhchuy n nhân ư c khái quát g m năm bư c sau: a) Bư c 1: Chu n b cytoplast: Các t bào tr ng chưa th tinh ư c s d ng như là t bào nh n nhân m i, sau khi lo i b nhân c a chính chúng. Các tr ng này thư ng ư c thu nh n b ng phương pháp ch c hút bu ng tr ng, sau ó, nuôi trư ng thành in vitro và cu i cùng lo i b nhân. Hình 3.6. Lo i nhân t bào tr ng (a) Tr ng (chưa th tinh) ư c v i thu c nhu m DNA nh v DNA (b) Pipette gi tr ng và pipette xuyên màng ZP hút nhi m s c th và th c c th nh t (c) Tr ng ã lo i b nhân, ch còn ch a ch t nguyên sinh (cytoplast) b) Bư c 2. Chu n b t bào cho nhân: Các t bào cho có th l y t nhi u ngu n khác nhau v i nhi u m c bi t hóa khác nhau (t bào tuy n vú, t bào mô cơ, t bào g c bi u mô, t bào uôi, t bào granulosa, t bào gan, t bào th n kinh v não, t bào t cung, t bào mô tinh hoàn, mô g sinh d c, t bào g c da, mô da, t bào cumulus, t bào m m sinh d c, t bào g c, t bào máu, t bào mũi...) Hình 3.7. Phương pháp thu nh n nhân (2n) c a t bào sinh dư ng Các t bào cho nhân ư c nuôi c y in vitro và t o s phù h p (v chu kỳ t bào) v i tr ng thái nguyên sinh ch t c a tr ng. Trong vài trư ng h p, ngư i ta b ói t bào cho nhân ưa chúng v chu kỳ mong mu n. c) Bư c 3. Chuy n nhân: Thông thư ng là dung h p màng c a t bào cho và t bào tr ng. Có ba k thu t ph bi n: kích thích xung i n, x lý hóa ch t (polyethylene glycol – PEG), dùng virus Sendai. a b c
- 50. 50 d) Bư c4. Ho t hóa phôi: Phôi m t t bào hình thành ư c ho t hóa b ng các tín hi u hóa h c hay xung i n kh i ng quá trình phát tri n ti p theo. Tín hi u thư ng dùng là ionomycin, ethanol, thimerosal, inositol 1,4,5-triphosphate, calcium ionophore 23178. Ngoài ra, d ch chi t tinh trùng cũng có th ư c s d ng. e) Bư c 5. Nuôi và c y phôi: Phôi sau khi ã ho t hóa, ư c nuôi c y in vitro v i môi trư ng thích h p. Sau th i gian này, phôi s phát tri n t i blastocyst (kho ng 120 t bào), ây là giai o n thích h p cho c y truy n. III.3. Chuy n t bào sinh dư ng Thay vì chuy n nhân, m t t bào 2n nguyên v n ư c chuy n th ng vào noãn bào trư ng thành ( ã ư c làm m t nhân) b ng vi thao tác ho c vi thao tác có h tr xung i n (Piezoelectric assisted nuclear transfer). Hình 3.8. Chuy n t bào vào tr ng ã lo i nhân (a) T bào fibroblast ư c l a ch n, hút vào trong pipette. (b) âm pipette vào màng zona, t bào ư c t vào kho ng gi a ZP và cytoplasm. (c) Rút nh nhàng pipette ra. III.4. Dung h p (fusion) - Dung h p (fusion) tr ng v i t bào 2n: v b n ch t, trư ng h p này gi ng v i chuy n t bào, chúng ch khác nhau v cách chuy n. Dung h p t bào v i tr ng ( ã lo i nhân) có th ư c th c hi n b ng nhi u cách khác nhau, trong ó vi c dùng xung i n ư c ti n hành ph bi n hơn. III.5. Trinh s n - T o dòng vô tính ng v t b ng k thu t trinh s n (Parthenogenesis technique) v i các tác nhân kích thích lý h c, hóa h c hay cơ h c... ã phát tri n r t s m và g t hái nhi u thành t u, óng góp vào s thành công chung c a lĩnh v c t o dòng vô tính. Có nhi u tác nhân ư c xác nh có kh năng kích thích trinh s n: tia i n, châm kim, các l c cơ h c, áp su t th m th u, nhi t ... ã có nhi u báo cáo kích thích trinh s n thành công trên nhi u ng v t, k c ng v t có vú như th , chu t nh t, heo… a b c
- 51. 51 Hình 3.9. Cácd ng phôi ư c t o b ng phương pháp trinh s n (a) Phôi heo blastocyst ang thoát nang và phát tri n sau khi IVM 44 gi , ư c kích thích liên t c 3 xung i n 80-µsec, 1,0 kV/cm DC. Sau ó x lý Cytochalasin B 7 µg/ml trong 6 gi c m ng lư ng b i hóa (Jie Zhu và cs, 2001). (b) Phôi chu t c ng ư c ho t hóa b ng strotinum phát tri n n giai o n 2 t bào. (Otaegui và cs, 1999) IV. M T S KHI M KHUY T NG V T T O DÒNG VÔ TÍNH IV.1. CÁC BI U HI N I N HÌNH Nh ng ng v t ra i b ng k thu t t o dòng thư ng không h n là m t dòng th c s , b i chúng có vài khác bi t so v i hai cá th sinh ôi cùng tr ng. Hình 3.10. Chu t t o dòng có nhau thai và kích thư c cơ th l n hơn bình thư ng (a) Cùng 13 ngày tu i, thai chu t t o dòng có nhau thai l n hơn chu t i ch ng (b) (th tinh in vitro). (c): Chu t t o dòng vô tính (trái) n ng 77,95 g, i ch ng (th tinh in vitro) (ph i) n ng 42,90 g cùng 12 tháng tu i (Atsuo và cs, Kellie và cs, 2000). H u h t các khi m khuy t bi u hi n s gia tăng v kích thư c, b t thư ng nhau thai. M t s khác có các v n v ph i, th n và h tim m ch, r i lo n t ch c gan, kh p và não, suy thoái ch c năng h mi n d ch, tăng tr ng không bình thư ng sau khi sinh… Nhi u khi m khuy t nói trên không th ư c ch n oán và ngăn ch n b ng các k thu t hi n t i, do v y, các mô và cơ quan có th phát tri n l ch l c. T t c u gi thi t r ng, nh ng b t thư ng và khi m khuy t nói trên ng v t t o dòng là do s bi u hi n gen b t thư ng, sai l ch trong giai o n s m c a phôi. Không ch con, các ”bà m ” tham gia vào công ngh t o dòng cũng có th có nh ng nh hư ng nh t nh. T l t vong và b nh t t c a các cá th m (bò và c u) này tăng áng k b i nhi u nguyên nhân, ch ng h n, thai ch t s m trong khi ch a, thai gia tăng kích thư c, b t thư ng trong nhau thai, s ng c c a thai… ba c a b
- 52. 52 Như v y,vi c t o dòng sinh s n có r i ro cao v s c kh e c a thai hay con non và c m (mang thai) c a nó. IV.2. NGUYÊN NHÂN PH BI N * Th t b i trong quá trình tái thi t l p chương trình Tái thi t l p chương trình là quá trình mà DNA và các protein k t h p trong nhân c y t t bào sinh dư ng ư c i u ch nh l i s n sàng ph i h p v i bào tương tr ng. S hoà h p ng b này là y u t tiên quy t, c n cho các quá trình phát tri n s m và t o ra các s n ph m c n thi t cho s phát tri n c a phôi s m. Tuy nhiên, sau khi chuy n, nhân có th không th i gian hoàn t t quá trình tái thi t l p chương trình trư c khi phôi b t u phát tri n lên giai o n blastocyst, làm cho các s n ph m không thích h p và không ph i h p ư c. Nh ng l i c a quá trình tái thi t l p chương trình có th liên quan n b t kỳ gen nào. * Th t b i quá trình in d u b gen Nh ng thay i trong s bi u hi n gen ã in d u có th x y ra trong su t quá trình nuôi c y in vitro. Nh ng b t thư ng c a ng v t t o dòng (và ch th y ng v t t o dòng) có có l là h u qu c a quá trình c y nhân. G n ây, nhi u ý ki n cho r ng cho r ng, nh ng tác ng c a sai sót trong quá trình in d u không ch nh hư ng lên s phát tri n phôi và ch c năng nhau thai, mà chúng còn gây nhi u h u qu x u lên s phát tri n c a não b và trí nh khi ã hình thành cơ th (Georgiades và cs, 2001). * D ty th (Mitochondrial heteroplasmy) và s i ngh ch D ty th là hi n tư ng tr n l n các ty th trong cùng m t t bào do thao tác chuy n noãn tương. k thu t SCNT, hi n tư ng d ty th có th x y ra. Tuy nhiên, m t lư ng nh ty th c a t bào ưa vào có th b kìm hãm b i ty th c a tr ng và cũng có th trong trư ng h p nào ó nó b tr ng lo i b . Trong k thu t chuy n nhân t bào sinh dư ng, DNA c a nhân cho có th xem ty th c a tr ng như m t v t ngo i lai, và do ó x y ra s i kháng gi a nhân cho và b gen c a ty th c a tr ng. i u ó có th gây nên s khi m khuy t tăng trư ng và i u hòa sai l ch m t s gen. * S ng n d n c a telomere Telomere là nh ng ph c h p DNA-protein t i các u mút c a các NST t bào nhân th t, c n thi t cho s toàn v n c a NST và s phát tri n t bào bình thư ng. Trong các t bào sinh d c, ph n này ư c xây d ng l i b i enzyme telomerase. Do ó, có m t kh năng là các ng v t t o dòng t các t bào sinh dư ng s có telomere ng n, i u này s làm cho các t bào già trư c tu i các ng v t t o dòng và th m chí, s n xu t sai các protein t nh ng gen vùng g n telomere. Trong th c nghi m, có th làm gi m t i thi u nh hư ng này b ng cách l a ch n ki u t bào cho nhân. * S t bi n Ngu n nhân s d ng cho t o dòng sinh s n ư c l a ch n r t c n th n. Ngư i ta thư ng h n ch ch n nh ng t bào có nhi u nguy cơ tích l t bi n như nh ng t bào cơ th già, t bào phát tri n trong các ĩa nuôi c y in vitro trong th i gian dài… * S b t ho t NST X Th c nghi m c a Eggan K và cs. (2000) cho th y s b t ho t NST X trong ti n trình in vitro không h n là nguyên nhân áng chú ý gây khi m khuy t nghiêm tr ng ng v t t o dòng.
- 53. 53 V. NG DNG C A T O DÒNG VÔ TÍNH NG V T * ng d ng trong nông nghi p - T o ra nh ng b n sao c a nh ng ng v t mang tính tr ng mong mu n, giá tr cao. - Gi m thi u các ch t c h i trong môi trư ng. Dư ng như các s n ph m thu nh n t ng v t t o dòng không ti m n r i ro nào i v i s c kh e con ngư i. * ng d ng trong y h c - ng v t t o dòng (k t h p v i chuy n gen b nh c a ngư i) là mô hình lý tư ng cho nghiên c u b nh. - ng v t t o dòng (k t h p v i chuy n gen s n xu t protein mong mu n c a ngư i) là nh ng “bioreactor” lý tư ng s n xu t các protein mong mu n. Tuy nhiên, vi c s d ng các s n ph m này dư ng như còn ti m n m t s r i ro nên các s n ph m c n ư c ki m tra m c an toàn trong các i u ki n nh t nh trư c khi ư c ưa ra th trư ng. - ng v t chuy n gen và t o dòng ( ư c s d ng ph bi n là heo) là i tư ng cho mô ghép ph c v cho d ghép r t ư c quan tâm. Tuy nhiên, v n này v n ang v p ph i m t s quan i m không ng tình v xã h i và o c như: kh năng truy n b nh t ng v t cho sang ngư i nh n, s tương h p gi a sinh lí và gi i ph u c a cơ quan ng v t cho và ngư i, s th i lo i các cơ quan c y ghép. - Thu nh n t bào g c phôi và bi t hóa tr c ti p chúng thành các dòng t bào chuyên bi t, phù h p v i ngư i b nh c y ghép (li u pháp t bào). - T các th nghi m t o dòng vô tính trên mô hình ng v t, thu nh n ư c các quy trình, k t qu , k thu t thao tác, tìm hi u nguyên nhân… nh m i u tr các b nh có liên quan t i sinh s n. * ng d ng trong nghiên c u - Các ng v t nhân dòng vô tính ư c s d ng như là nh ng mô hình cho nghiên c u, c bi t là nh ng nghiên c u v nh hư ng c a môi trư ng lên s i u hòa bi u hi n c a b gen. - ng v t t o dòng là công c nghiên c u s bi t hóa t bào, làm ti n cho s phát tri n c a các li u pháp tr b nh m i. - Ngoài ra, t o dòng ng v t còn ư c s d ng nh m c u vãn các loài ng v t có nguy cơ tuy t ch ng. VI. V N T O DÒNG VÔ TÍNH NGƯ I Nhân dòng vô tính ngư i cho m c ích sinh s n v p ph i r t nhi u khó khăn, c bi t là s ph n i c a xã h i và pháp lu t. Tuy nhiên, g n ây ã có báo cáo thành công trong nhân b n phôi ngư i cho m c ích này – các phôi nhân b n ã phát tri n n giai o n 4 – 8 t bào sau 4 ngày chuy n nhân và ã ư c tr l nh. Hi n nay, h u như t t c các nư c trên th gi i u c m t o dòng sinh s n ngư i. Quan i m t o dòng vì m c ch tr li u cũng chưa ư c ch p nh n r ng rãi, nhưng rõ ràng là nó có ý nghĩa áng k trong vi c kh c ph c ư c s mi n d ch th i lo i trong c y ghép t bào, mô và cơ quan.
- 54. 54 CHƯƠNG 4 M TS THÀNH T U I N HÌNH C A CÔNG NGH SINH H C NG V T I. H TR SINH S N Năm 1982, Brackett và cs, ã nuôi và s d ng t bào tr ng chín in vivo, sau ó th nghi m k thu t IVF (in vitro fertilization) cho ra i con bê t ng nghi m u tiên trên th gi i. T ó, phôi c a nhi u loài ng v t ã ư c s n xu t theo cách này như bò (Gordon và Lu, 1990), dê (Hanada 1985), heo (Cheng và cs, 1986)… Th tinh trong ng nghi m trên ngư i ư c manh nha t năm 1961, nhưng mãi n năm 1978 m i có em bé u tiên ra i (bé Louise Brown). T ó, công ngh này phát tri n vư t b c: tính n năm 1990, trên th gi i, ã có t i g n 100.000 bé ra i b ng th tinh trong ng nghi m, năm 2006, con s này lên n hàng tri u. khu v c ông Nam Á, cùng v i Thái lan, Singapore, Malaysia…Vi t nam cũng ã th c hi n thành công k thu t này vào năm 1998. Công ngh IVF th c s ã mang l i ni m hy v ng cho nhi u c p v ch ng hi m mu n. T i nay, s ti n b c a k thu t IVF có th i u tr h u h t các ch ng vô sinh. V i s ra i c a nhi u k thu t m i như ET (embryo transfer – chuy n phôi vào t cung), GIFT (gamete intrafallopian transfer – chuy n giao t vào vòi tr ng), ZIFT ( zygote intrafallopian transfer – c y chuy n phôi vào vòi tr ng c a ng v t mang), ROSI (Round spermatid injection – tiêm nh ng tinh trùng hình tròn) giúp tăng áng k hi u qu h tr sinh s n, n nay, ngư i ta ã có th i u tr h u h t các ch ng vô sinh. K thu t IVM (in vitro maturation–nuôi chín trong ng nghi m) có ý nghĩa l n i v i các b nh nhi ư c i u tr b ng nh ng tác nhân có kh năng gây t bi n di truy n, giúp cho nh ng ngư i này v n có th có con bình thư ng khi trư ng thành. K thu t ông l nh b o qu n phôi ã t ư c nh ng thành công to l n và ư c ng d ng r ng rãi ngư i và ng v t. Các phương pháp ông l nh m i t ra r t hi u qu , nh t là trong vi c b o t n ngu n gen c a các loài có nguy cơ tuy t ch ng. B o qu n t bào g c phôi là m t phương pháp h u hi u bào t n ngu n gen. Thông qua vi c ch n l c gi i tính tinh trùng ho c xác nh tr c ti p gi i tính phôi, ngư i ta có th i u khi n gi i tính phôi, i u này r t có ý nghĩa trong chăn nuôi. K thu t t o dòng (cloning) ng v t b ng phương pháp c t phôi (EMS) hay chuy n nhân (BNT) là m t thành t u khoa h c quan tr ng. C u Dolly là ng v t h u nhũ u tiên ư c nhân dòng t t bào 2n trư ng thành (1997), ây cũng là v n gây nhi u tranh cãi v o lý sinh h c. Sau ó, nhi u ng v t khác cũng ư c nhân dòng theo phương pháp trên. K thu t nhân dòng ư c s d ng nhân nhanh gi ng v t nuôi (VD: nhân dòng bò Holstein b ng k thu t c t phôi) và b o t n các loài ng v t có nguy cơ tuy t ch ng và ph c v nghiên c u y sinh.
- 55. 55 Hình 4.1. Cácchi n lư c b o t n và tái thi t l p b y àn II. NG V T BI N I GEN M t trong nh ng xu hư ng ch o c a vi c ng d ng công ngh di truy n là t o ra nh ng ng v t bi n i gen và dùng các sinh v t này s n xu t nh ng s n ph m không truy n th ng, ph c v cho nhu c u c a con ngư i: ngu n thu c ( ng v t s n xu t hormone, protein máu… t s a, tr ng, máu… cho ngư i và ng v t; ngu n t bào, mô và cơ quan s ng ph c v cho tr li u d ghép (xenotransplantation); t o mô hình ng v t thí nghi m ph c v cho nghiên c u b nh lí, dư c lí và c h c; t o ngu n th c ph m cho ngư i và ng v t cùng các s n ph m h u d ng khác (vaccine, s i...). ng v t bi n i gen là nh ng ng v t ã ư c làm thay i c tính di truy n không thông qua s giao ph i t nhiên hay tái t h p t nhiên c a cá gen. Quá trình t o nên các ng v t bi n i gen ư c g i là quá trình bi n i gen ng v t. Có nhi u cách khác nhau làm bi n i gen c a ng v t: chuy n gen (transgenesis), b t ho t gen (knock out), thay th gen (knock in), công ngh NST (chromosome engineering), gây t bi n (b ng tia phóng x , hóa ch t, virus ch n l c dòng) hay k thu t nhân b n… S d ng ng v t bi n i gen có hàng lo t nh ng ưu i m như: chúng có kh năng sinh s n bình thư ng phát tri n th h các ng v t chuy n gen ti p theo, kh năng s n xu t c a chúng r t linh ng, s lư ng s n ph m ph thu c vào s lư ng cá th hay b y àn. c bi t, các ng v t này có kh năng t duy trì ngu n năng lư ng, ngu n nguyên v t li u cho chính b n thân chúng. B o t n in situ B o t n in vitro Cá th Cá th c Cá th cái Gi i ông C y truy n H tr sinh s n BotnThitlpbyàn B o qu n phôi, tinh Tinh T bào sinh dư ng T o dòng vô tínhTinhTr ng T bào sinh tinh, sinh tr ng Phôi B o t n B y àn
- 56. 56 * ng dng ng v t bi n i gen trong y h c Hình 4.2. Các m c ích chính c a nghiên c u chuy n gen v t nuôi - Mô hình gen gây b nh: các nhà khoa h c ã t o ra nh ng ng v t bi n i gen như là mô hình b nh lý ngư i giúp tìm hi u con ư ng gây b nh, cũng như ánh giá các li u pháp tr li u m i. - T o ng v t bi n i gen nghiên c u ch c năng gen: ng v t bi n i gen cũng ư c t o ra như là nh ng mô hình phân tích ch c năng c a gen. Nh ng mô hình ng v t này óng góp to l n trong nghiên c u nhi u quá trình t bào cơ b n. - Ki m tra ch t c: ng v t chuy n gen ư c s d ng th nghi m nh ng h p ch t m i trư c khi ưa ra kh i phòng thí nghi m, c bi t trư c khi ưa vào th c ph m, m ph m, thu c hay nh ng dung d ch công nghi p khác. Các này cho k t qu nhanh, r , sàng l c ư c lư ng l n thu c và hóa ch t ch a y u t c hay có kh năng ung thư. Ngày nay, các phòng thí nghi m còn s d ng nhi u phương pháp khác như: d a vào máy tính; các k thu t lý-hóa; microarry; nuôi c y cơ quan, mô, t bào; phôi và sinh v t b c th p nh m làm gi m s lư ng ng v t th nghi m cũng như gi m stress i v i ng v t nuôi. - T o s n ph m trong cơ th ng v t: ng v t bi n i gen ư c s d ng như là m t nhà máy dư c ph m r t hi u qu . n nay, có kho ng 29 protein li u pháp ngư i ư c s n xu t b i các ng v t chuy n gen, h u h t chúng có trong s a, m t s máu, nư c ti u hay d ch tinh trùng. M t s loài ư c s d ng thu nh n protein tr li u: gà, th , dê, c u, bò… Tuy nhiên, phương pháp này cũng t n t i hai r i ro l n cho ngư i s d ng: th nh t là s truy n nhi m các b nh t ng v t sang ngư i ( c bi t là virus); th hai là xu t hi n các protein m i l , b bi n i trong các th h con cháu c a ng v t bi n i gen, khi th i gian i u hòa ban u c a gen ã h t. - C y ghép: ng v t chuy n gen là ngu n cung c p các mô, cơ quan cho d ghép ngư i. Khó khăn khi s d ng li u pháp này là các m i nguy v truy n nhi m virus t ng v t cho và s tương h p sinh lí gi a m nh ghép và cơ th nh n m nh ghép. Bên c nh ó, chuy n gen ng v t nh m m c ích c y ghép còn ph i ương u v i m i nguy l n là s c kh e c a ng v t, v n tr t t b gen loài hay s lây nhi m ngu n gen trong th gi i s ng… DNA V t nuôi chuy n gen C i thi n s c kh e, s n ph m ng v t S n xu t dư c li u, cơ quan c y ghép Các thông tin khác
- 57. Hình 4.3. iu tr b ng li u pháp c y ghép - Ngoài ra, ng v t bi n i gen còn ư c s d ng cho các m c ích khác như s n xu t th t, len, s a, tơ nh n, kháng b nh trong thú y, gi m ô nhi m phosphor, tăng kh năng ch ng ch u c a ng v t nuôi (cá, giáp xác…), t o côn trùng kháng s truy n b nh… Bên c nh nhi u l i ích, các ng v t chuy n gen nói riêng, sinh v t chuy n gen nói chung, cũng làm n y sinh nhi u tranh cãi v tính an toàn cho ngư i tiêu dùng và cho môi trư ng. III. CÔNG NGH T BÀO G C T bào g c là nh ng t bào chưa bi t hóa, có kh năng t tr hóa lâu dài, và có th bi t hóa thành các lo i t bào ch c năng khác… T bào g c có nhi u ng d ng: Hình 4.4. M t s b ng ch ng tính m m d o t bào g c trư ng thành Thu nh n (t bào, mô, cơ quan) Chuy n vào ngư i (t bào, mô, cơ quan) B nh nhân c n thay th (t bào, mô, cơ quan) Chèn gen Immunoprotective c a ngư i vào heo Gan Não T bào g c CNS T y xương Xương Cơ xương T bào máu M ch máu T bào m T bào th n kinh T bào bi u mô T bào n n t y xương Cơ tim
- 58. 58 - C yghép t bào, mô và cơ quan: mô, cơ quan ư c t o t t bào g c phôi c a ngư i là ti m năng quan tr ng nh t. Nhi u b nh có th ư c i u tr b ng c y ghép t bào g c phôi ngư i ã ư c ghi nh n g m Parkinson, ti u ư ng, ch n thương c t s ng, suy thoái t bào purkinje, lo n dư ng cơ Duchenne’s, tim, t o xương… Các t bào g c phôi ư c c y ghép có th t n t i, h p nh t và có ch c năng trong cơ th nh n. Tuy nhiên, vi c c y ghép t bào g c phôi cũng ti m n b t l i là xu hư ng c m ng hình thành kh i u (dù là u lành tính và hi n nay ngư i ta ã có th tránh ư c s hình thành kh i u này). Hình 4.5. Chi n lư c ghép t bào g c - Li u pháp gen: s d ng t bào g c bi n i di truy n như m t vector mang gen chuy n ưa gen mong mu n vào cơ th . Hình 4.6. Chi n lư c dùng t bào g c trong li u pháp gen - Ki m nghi m hóa ch t: Các t bào g c là nh ng t bào bình thư ng v di truy n, ng nh t trong qu n th nên có th nuôi c y và duy trì trong m t th i gian dài. Vì v y, vi c ng d ng t bào g c ng v t có vú m ra li u pháp m i trong các th nghi m d a trên t bào, thu n l i hơn s d ng nh ng t bào non, t kh i u lành tính hay nh ng t bào bi n i di truy n như truy n th ng. °Ο ° ° ° °Ο °Ο °° °Ο T bào th n kinh T bào tim T bào máu T bào cơ Thu nh n và khu ch i ES Phát tri n blastocyst in vitro Tái thi t l p chương trình Chuy n nhân T bào g c th n kinh T bào g c máu T bào th n kinh C y ghép T bào m m phôi Nhân T bào sinh dư ng Tương h p MHC Tb t y Tb máu Tb da… T ng h p gen Vector B nh di truy n B nh ung thư B nh mi n d ch ...
- 59. 59 - Trong nghiênc u: các t bào g c phôi c a ngư i có th cho phép nghiên c u quá trình, th i i m nh hư ng và phương th c bi t hóa c a t bào thành các dòng chính c a cơ th . T ó, giúp các nhà nghiên c u hi u ư c nguyên nhân c a nhi u b nh t t ưa n hư ng kh c ph c úng n và h p lý. Các t bào g c phôi còn cung c p các d ng t bào và mô cho nghiên c u b nh. Hi n nay, ngư i ta có xu hư ng s d ng nh ng t bào g c ư c thu nh n t t y hay các mô khác c a chính b nh nhân tr li u, g i là myES (my stem cell). Các myES h u như an toàn và khó b th i lo i. IV. CH N OÁN B NH Có ba phương pháp: - Ch n oán tr c ti p: quan sát phân bi t b ng kính hi n vi, phương pháp ELISA, k thu t phân t d a vào b gen (PCR, LCR, NASBA, bDNA, Realtime PCR, lai phân t , SSCP, RFLP...) nh n di n tác nhân gây b nh. - Ch n oán gián ti p: nuôi c y các tác nhân b nh và d a trên các cơ ch mi n d ch (RIA, EIA, WB, RIBA, Line immuoassay…) nh n di n tác nhân gây b nh. - Phương pháp huy t thanh. Nh ng ti n b c a y sinh h c ngày nay giúp ch n oán phân t có nhi u ưu i m v nhanh, nh y và chính xác. V. LI U PHÁP GEN Có nhi u phương pháp i u tr các b nh gây nên b i các gen t bi n: - Ăn kiêng ( i v i lo i b nh gây nên b i các khi m khuy t trong cơ ch chuy n hóa) - C y ghép t y xương hay cơ quan thay th cho các mô b t n thương. - Thay th nh ng gen h ng b ng gen lành (li u pháp gen) Li u pháp gen là nh ng k thu t s a sai nh ng gen b h ng gây b nh, bao g m nh ng chi n lư c sau: - Gen lành ư c chèn vào b t kỳ m t v trí nào trong cơ th thay th ch c năng cho các gen b nh. Ho c gen lành thay th gen b nh thông qua s tái t h p. Hình 4.7. Sơ chi n lư c i u tr b ng gen IN VIVO Gen li u pháp Tiêm vào b nh nhân EX VIVO T bào b nh nhân (thư ng là t bào g c) ưa gen vào t bào Tăng sinh t bào bi n i di truy n Mô nh n C y t bào vào b nh nhân
- 60. 60 - Gen bnh có th ư c s a sai b ng cách thông qua t bi n ngư c ch n l c (selected reverse mutation) thành gen lành. - i u hoà ho t ng c a m t gen c bi t nào ó. - Li u pháp antisen, li u pháp RNAi, vaccine DNA. VI. V T LI U Y - SINH • óng vai tr thi t y u trong vi c thay th và c i thi n ch c năng c a m i h th ng chính trong cơ th • Năm 1952, các ho t ch t sinh h c nhân t o ã ư c dùng trong ph u thu t tim m ch • Hơn 600000 o n m ch d n ư c c y ghép m i năm thay th nh ng m ch máu b t n thương • Phát tri n các màng s ng có c nh thu c và t bào ng d ng trong tr li u và nuôi c y t bào V t li u sinh h c ngày nay óng vai trò thi t y u trong vi c thay th và c i thi n ch c năng c a m i h th ng chính trong cơ th (h xương, h tu n hoàn…). M t vài m nh c y ghép thông thư ng có th k n là nh ng b ph n ch nh hình (kh p g i, kh p háng, m nh ghép t y s ng, v t c nh xương); nh ng m nh ghép tim (van tim và nút xoang nhĩ nhân t o); nh ng m nh ghép m m (m nh ghép ng c, collagene dùng bơm vào tăng kích thư c mô m m); m nh ghép trong nha khoa thay th răng, chân răng và nh ng mô có xương trong khoang mi ng… Nh ng ho t ch t sinh h c nhân t o ã ư c dùng trong ph u thu t tim m ch vào năm 1952, khi ó m nh ghép Hufnagel là van tim nhân t o u tiên thành công, và Voorleses cũng là ngư i gi i thi u m nh ghép tim nhân t o u tiên. Hi n nay, m i năm có hơn 600.000 o n m ch d n ư c c y ghép thay th nh ng m ch máu b t n thương các b nh nhân. Ngoài các v t li u có ch c năng v t lý, th i gian g n ây, CNSH cũng ã phát tri n hàng lo t v t li u có tính ch t sinh hóa, ó là các màng s ng có c nh thu c và t bào, nh m ng d ng tr li u ho c phát tri n công ngh t bào ng v t…
- 61. 61 TÀI LI UTHAM KH O 1. Hoàng Kim Giao, 2003. Công ngh c y truy n phôi gia súc, NXB Khoa h c K thu t. 2. Nguy n ình Gi u, Nguy n Chi Mai, Tr n Th Vi t H ng, 1999. Sinh lí h c ngư i và ng v t. NXB i h c Khoa h c T nhiên. 3. Phan Kim Ng c, H Huỳnh Thùy Dương, 2000. Sinh h c c a s sinh s n. NXB Giáo d c. 4. Phan Kim Ng c, Ph m Văn Phúc, 2007. Công ngh sinh h c trên ngư i và ng v t. NXB Giáo d c.