Download luận văn đồ án tốt nghiệp ngành vi sinh sinh học phân tử với đề tài: Xây dựng chứng nội (internal amplification control) cho quy trình phát hiện thành phần có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm chay dựa trên gen rDNA

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
XÂY DỰNG CHỨNG NỘI (INTERNAL
AMPLIFICATION CONTROL) CHO QUY TRÌNH
PHÁT HIỆN THÀNH PHẦN CÓ NGUỒN GỐC TỪ
ĐỘNG VẬT TRONG THỰC PHẨM CHAY DỰA TRÊN
GEN 16S rDNA
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ
GVHD: ThS. Lao Đức Thuận
SVTH: Phan Thị Trâm
MSSV: 1153010895
Khóa: 2011 – 2015
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
XÂY DỰNG CHỨNG NỘI (INTERNAL
AMPLIFICATION CONTROL) CHO QUY TRÌNH
PHÁT HIỆN THÀNH PHẦN CÓ NGUỒN GỐC TỪ
ĐỘNG VẬT TRONG THỰC PHẨM CHAY DỰA TRÊN
GEN 16S rDNA
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ
GVHD: ThS. Lao Đức Thuận
SVTH: Phan Thị Trâm
MSSV: 1153010895
Khóa: 2011 - 2015
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

3. LỜI CẢM ƠN
Trong thực tế không có sự thành công nào không gắn liền với những sự hỗ trợ,
giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt thời gian
từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học đến nay, em đã nhận được rất nhiều sự
quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô Khoa Công Nghệ
Sinh Học - Trường Đại Học Mở Tp. Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết
của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học
tập tại trường. Và đặc biệt em xin chân thành cảm ơn thầy ThS. Lao Đức Thuận đã tận
tâm hướng dẫn, giúp đỡ em qua từng buổi nói chuyện, thảo luận về đề tài. Nếu không
có những lời hướng dẫn, dạy bảo của thầy em nghĩ bài báo cáo này của em rất khó có
thể hoàn thiện được. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy.
Con cảm ơn gia đình đã tiếp thêm nguồn động lực, luôn bên cạnh chăm sóc, an
ủi, động viên lúc con gục ngã, yếu lòng và cảm ơn những người bạn tốt luôn ở bên tôi
chia sẻ những vui buồn, bên tôi những lúc khó khăn nhất.
Bài báo cáo được thực hiện trong khoảng thời gian 5 tháng. Kiến thức của em còn
hạn chế và nhiều bỡ ngỡ. Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót là điều chắc chắn,
em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô để kiến thức
của em hoàn thiện hơn.
Sau cùng, em xin kính chúc quý Thầy Cô Khoa Công Nghệ Sinh Học thật dồi dào
sức khỏe, niềm tin để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến
thức cho thế hệ mai sau.
Trân trọng.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015
Sinh viên thực hiện
Phan Thị Trâm

4. Trang iv
DANH MỤC VIẾT TẮT
µL – microlit
16S rRNA – gen 16S ribosome RNA
BLAST – Basic Local Alignment Search Tool
bp – base pair
DNA – Deoxyribo Nucleic Acid
g – gam
IDT – Integrated DNA Technologies
mg – miligam
mL – mililit
mtRNA – mitochondria RNA
NCBI – National Center for Biotechnology Information
nm – nanomet
OD – Optical Density
PCR – Polymerase Chain Reaction
RNA – Ribonucleic Acid
S (16S) – đơn vị Svedberg (kí hiệu cho tốc độ lắng của các vật thể)
Ta – nhiệt độ bắt cặp
Tm – nhiệt độ nóng chảy của mồi

5. Trang v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Biểu đồ thể hiện tình hình ăn chay của người Việt Nam
Hình 1.2. Bản đồ bộ gen ty thể của con người
Hình 1.3. Cấu trúc của lục lạp
Hình 3.1. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của mồi TP1
Hình 3.2. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của mồi TP2
Hình 3.3. Cặp mồi TP1-TP2 được kiểm tra độ đặc hiệu và tương đồng bằng phần
mềm Annhyb
Hình 3.4. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của mồi xuôi CLO-1-F
Hình 3.5. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của mồi ngược CLO-1-R
Hình 3.6. Cặp mồi chứng nội được kiểm tra độ đặc hiệu và tương đồng bằng phần
mềm Annhyb
Hình 3.7. Kết quả điện di 6 mẫu thực phẩm chay trên thị trường
Hình 3.8. Kết quả giải trình tự mẫu thực phẩm chay (mẫu 1) của mồi TP1
Hình 3.9. Kết quả giải trình tự mẫu thực phẩm chay (mẫu 1) của mồi TP2
Hình 3.10. Một số nucleotide đã hiệu chỉnh trên mạch xuôi (H1-F) bằng phần mềm
Chromas lite 2.1.1
Hình 3.11. Kết quả BLAST giải trình tự mẫu 1 thực phẩm chay của mồi xuôi TP1
Hình 3.12. Trình tự DNA của mẫu 1 trên giao diện BLAST với kết quả loài tương
đồng (Gallus gallus)
Hình 3.13. Kết quả điện di với 1 mẫu thực vật, 1 mẫu động vật và 1 mẫu hỗn hợp
thực vật : động vật
Hình 3.14. Kết quả giải trình tự mẫu cải bắp của mồi CLO-1-F
Hình 3.15. Kết quả giải trình tự mẫu cải bắp của mồi CLO-1-R

6. Trang vi
Hình 3.16. Một số nucleotide đã hiệu chỉnh trên mạch xuôi (M1-F) bằng phần mềm
Chromas lite 2.1.1
Hình 3.17. Kết quả BLAST giải trình tự mẫu cải bắp của mồi xuôi CLO-1-F
Hình 3.18. Trình tự DNA của mẫu cải bắp trên giao diện BLAST với kết quả loài
tương đồng (Brassica oleracea)
Hình 3.19. Kết quả điện di với 5 mẫu thực phẩm chay trên thị trường

7. Trang vii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Bảng liệt kê các trình tự gen 16S rRNA của các loài động vật, thực vật và
vi sinh vật
Bảng 3.2. Các thông số đánh giá mồi của IDT cho phản ứng PCR khuếch đại gen
16S rRNA
Bảng 3.3. Bảng cơ sở dữ liệu trình tự gen cpDNA
Bảng 3.4. Các thông số đánh giá mồi của IDT cho phản ứng PCR khuếch đại gen
lục lạp
Bảng 3.5. Kết quả đo OD của 6 mẫu thực phẩm chay, 1 mẫu động vật, 1 mẫu thực
vật
Bảng 3.6. Bảng hiệu chỉnh các nucleotide tại các vị trí trên mạch xuôi (H1-F)
Bảng 3.7. Bảng hiệu chỉnh các nucleotide tại các vị trí trên mạch xuôi (M1-F)
Bảng 3.8. Kết quả đo OD của 5 mẫu thực phẩm chay, 1 mẫu động vật, 1 mẫu
thực vật

8. Trang viii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................... iii
DANH MỤC VIẾT TẮT ........................................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH...................................................................................................v
DANH MỤC BẢNG............................................................................................... vii
MỤC LỤC.............................................................................................................. viii
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1. THỰC PHẨM CHAY ...............................................................................3
1.1.1. Khái niệm ...................................................................................3
1.1.2. Lợi ích của việc ăn chay.............................................................3
1.1.3. Các thống kê/khảo sát về việc sử dụng thực phẩm chay ở Việt
Nam và một số quốc gia trên thế giới ........................................4
1.2. THÔNG TIN VỀ GEN 16S rDNA ............................................................6
1.2.1. Ty thể..........................................................................................6
1.2.2. Gen 16S rDNA............................................................................8
1.3. CHỨNG NỘI - IAC (Internal Amplification Control)..............................8
1.4. HƯỚNG NGHIÊN CỨU, PHÁT HIỆN DNA ĐỘNG VẬT TRONG
THỰC PHẨM CHAY .............................................................................11
1.4.1. Trên thế giới .............................................................................11
1.4.2. Việt Nam ..................................................................................12
PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. KHẢO SÁT IN SILICO...........................................................................14
2.1.1. Thu thập trình tự gen mục tiêu .................................................14
2.1.2. Kế thừa cặp mồi, kiểm tra độ đặc hiệu và tương đồng.............14
2.1.3. Danh mục các phần mềm sử dụng............................................14
2.2. THỰC NGHIỆM: KIỂM TRA TÍNH THUẦN CHAY CỦA 6 MẪU
THỰC PHẨM CHAY .............................................................................15

9. Trang ix
2.2.1. Vật liệu .....................................................................................15
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu..........................................................17
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO TRÊN GEN TY THỂ 16S rRNA .24
3.1.1. Thu thập trình tự đích 16S rRNA.............................................24
3.1.2. Kế thừa và đánh giá mồi cho phản ứng PCR ...........................25
3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO CHỨNG NỘI.................................29
3.2.1. Thu thập trình tự gen mục tiêu .................................................29
3.2.2. Kế thừa và đánh giá mồi được chọn làm chứng nội.................31
3.3. THỰC NGHIỆM .....................................................................................34
3.3.1. Kiểm tra tính thuần chay của 6 mẫu thực phẩm chay..............34
3.3.2. Kết quả đo mật độ quang sản phẩm tách chiết.........................35
3.3.3. Kết quả khảo sát với một số mẫu thực phẩm chay trên
thị trường..................................................................................36
3.3.4. Kết quả giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự của cặp mồi
TP1-TP2 ...................................................................................37
3.3.5. Bước đầu thiết lập quy trình multi-PCR để khảo sát
mồi chứng nội...........................................................................41
3.3.6. Kết quả giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự của cặp mồi
CLO-1.......................................................................................42
3.3.7. Kết quả khảo sát multi-PCR với một số mẫu thực phẩm chay
trên thị trường...........................................................................46
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN .............................................................................................50
4.2. ĐỀ NGHỊ.................................................................................................50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................51

10. Trang 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Những tiến bộ trong nghiên cứu về dinh dưỡng vài thập kỷ qua đã thay đổi
hiểu biết của các nhà khoa học về lợi ích của chế độ ăn chay đối với sức khỏe con
người và bệnh tật [36]
. Vì những lý do như tôn giáo, y tế, nền kinh tế và bảo tồn sinh
thái, những người ăn chay đã trở thành một phần lớn dân số, tạo ra cơ hội kinh
doanh lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm [24]
. Hiện nay, trên thị trường Việt
Nam có rất nhiều sản phẩm thực phẩm chay từ các công ty hoặc các tiểu thương ở
chợ như: chả cá chay, bò lát chay, cá thu sốt cà chay,…nhưng tính “thuần chay”
chưa được xác nhận và đảm bảo. Một chế độ ăn chay được định nghĩa là trong đó
không bao gồm thịt, hải sản, hoặc các sản phẩm có chứa những thành phần kể trên
[12]
. Nhiều người ăn chay hiện nay rất chú trọng đến tính “thuần chay”, nghĩa là
không lẫn bất kì thành phần nào có nguồn gốc từ động vật. Đây là một đặc tính
quan trọng trong chế biến và sản xuất thực phẩm chay [2]
.
Trình tự gen 16S ribosome RNA (rRNA) là trình tự được sử dụng rộng rãi để
xác định loài vi khuẩn và thực hiện các nghiên cứu phân loại [9]
. Trình tự đích chúng
tôi chọn thuộc gen 16S rRNA bởi các lí do sau: (i) hiện diện ở hầu hết các loài vi
khuẩn, (ii) có nhiều bản sao trong tế bào, (iii) bảo tồn cao, chức năng qua thời gian
thường không có sự thay đổi, (iv) gen 16S rRNA (1,500 bp) đủ lớn cho mục đích
nghiên cứu thông tin [33]
, (v) mtDNA di truyền theo dòng mẹ nên có tính ổn định
cao [30]
.
Một nhược điểm chính của hầu hết các nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR
được công bố cho thấy chúng không chứa chứng nội - điều khiển khuếch đại bên
trong (IAC) [18]
. Ủy ban Tiêu chuẩn hóa châu Âu (CEN), phối hợp với tổ chức tiêu
chuẩn hóa quốc tế (ISO), đã đề xuất một hướng dẫn chung cho thử nghiệm PCR đòi
hỏi phải có sự hiện diện của IAC trong hỗn hợp phản ứng. Vì vậy, chỉ PCR chứa
IAC mới có thể trải qua thử nghiệm hợp tác đa trung tâm và là một điều kiện tiên
quyết cho việc chuẩn hóa [8]
.
Trong việc thiết lập chứng nội cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành chọn
trình tự gen đích là cpDNA (chloroplast DNA). Lý do lựa chọn trình tự gen đích này

11. Trang 2
do: (i) lục lạp là bào quan đặc trưng cho thực vật, (ii) trong mỗi lục lạp có chứa
khoảng 50 - 100 bản sao DNA [13]
, (iii) nguyên liệu làm thực phẩm chay có thành
phần chủ yếu từ thực vật [36]
, (iv) cpDNA có tình bảo tồn cao [3]
.
Nhằm bổ sung cho đề tài thực tập tốt nghiệp “Kiểm tra tính thuần chay ở một
số mẫu thực phẩm chay dựa trên gen 16S rDNA” được hoàn thiện hơn chúng tôi đã
tìm hiểu và thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp: “Xây dựng chứng nội
(internal amplification control) cho quy trình phát hiện thành phần có nguồn
gốc từ động vật trong thực phẩm chay dựa trên gen 16S rDNA”.
Mục tiêu của nghiên cứu: Mục tiêu của đề tài là xây dựng chứng nội - IAC
(internal amplification control) cho quy trình phát hiện thành phần có nguồn gốc từ
động vật trong thực phẩm chay dựa trên gen 16S rDNA.

12. 1. TỔNG QUANPHẦN

13. Trang 3
1.1. THỰC PHẨM CHAY
1.1.1.Khái niệm
Các thành phần của một chế độ ăn chay lành mạnh bao gồm nhiều loại rau,
trái cây, ngũ cốc nguyên hạt, các loại đậu và các loại hạt [37]
.
Trong nghiên cứu này thực phẩm chay được hiểu là thực phẩm không chứa
các thành phần có nguồn gốc từ động vật.
Những người ăn chay hình thành các nhóm không đồng nhất bao gồm [15]
:
+ Nhóm semivegetarians (thực vật, sản phẩm sữa, trứng và cá)
+ Nhóm lacto - ovo vegetarians (thực vật, sản phẩm sữa, trứng)
+ Nhóm người thuần chay (chỉ ăn thực vật)
1.1.2. Lợi ích của việc ăn chay
Ngày nay, ăn chay đang phát triển toàn cầu và ngày càng được chấp nhận.
Nguyên nhân chính của xu hướng này là vấn đề sức khỏe, đạo đức, sinh thái học và
các vấn đề xã hội. Tương lai của việc ăn chay đầy hứa hẹn bởi vì dinh dưỡng đầy đủ
là rất quan trọng cho sức khỏe con người. Ngày càng có nhiều người không muốn
giết động vật, không muốn biến đổi khí hậu, để phòng tránh một số bệnh và đảm
bảo một tương lai sống tốt hơn cho thế hệ mai sau [23]
.
Chế độ ăn chay thường có ít chất béo, đặc biệt là ít chất béo bão hòa, có nhiều
chất xơ hơn. Nó cũng có thể bao gồm nhiều loại ngũ cốc nguyên hạt, các loại đậu,
các loại hạt, protein đậu nành, và không hiện diện thịt màu đỏ, chế độ ăn chay này
có thể cung cấp nhiều lợi ích về các vấn đề sức khỏe mãn tính, phòng ngừa và điều
trị bệnh béo phì, bệnh tiểu đường và cả bệnh tim mạch. Mặc dù ăn chay có thể đáp
ứng tất cả các nhu cầu dinh dưỡng của một cá nhân, nhưng cần đặc biệt chú ý đến
một số chất dinh dưỡng để đảm bảo khẩu phần đầy đủ, đặc biệt là nếu người đó là
người chỉ ăn chay [26]
. Hiện nay có một số lượng đáng kể các nghiên cứu cho thấy
những lợi ích sức khỏe của chế độ ăn chay và thực vật, trong đó có liên quan đến
việc giảm nguy cơ béo phì, tiểu đường, bệnh tim, và một số loại ung thư cũng như
tăng tuổi thọ. Trong một nghiên cứu bệnh chứng ở một bệnh viện cựu chiến binh tại

14. Trang 4
Đài Loan, cho thấy việc tiêu thụ các loại thực phẩm chay địa phương có lượng chất
béo thấp có tác dụng bảo vệ chống lại ung thư tuyến tiền liệt đối với nam giới trong
quần thể nghiên cứu này [10]
. Quan điểm cho rằng chế độ ăn uống có thể ảnh hưởng
đến bệnh viêm thấp khớp (Rheumatoid Arthritis - RA) là một trong văn hóa dân
gian, nhưng thông tin hỗ trợ khoa học cho quan điểm này còn ít. Kết quả nghiên
cứu cho thấy điều trị bằng chế độ ăn uống có thể là một loại thuốc hỗ trợ có giá trị
cho việc điều trị cho RA [22]
. Các nghiên cứu dịch tễ học cũng cho rằng một chế độ
ăn chay cân bằng cũng có nhiều lợi ích sức khỏe, tỷ lệ mắc các bệnh về hệ tuần
hoàn ở người ăn chay thấp hơn so với người ăn động vật. Nghiên cứu này còn đưa
ra một lối sống thường xuyên ăn chay không có tác động tiêu cực đến tình trạng sức
khỏe ở người cao tuổi [14]
. Nghiên cứu của Sharma S. và cs (2014) cho rằng ăn chay
là một lựa chọn an toàn và hữu hiệu đối với các bệnh nhân bị bỏng [38]
. Và một
trong những phát hiện bất ngờ nhất trong dịch tễ học dinh dưỡng cho rằng ăn các
loại hạt dường như giúp bảo vệ chống lại bệnh tim do thiếu máu cục bộ (Ischaemic
Heart Disease - IHD). Tần suất tiêu thụ các loại hạt được phát hiện tỷ lệ nghịch với
tất cả các nguyên nhân gây tử vong ở một số nhóm dân số như người da trắng, da
đen và đặc biệt đối với người già. Như vậy, tiêu thụ hạt có thể không chỉ giúp bảo
vệ chống lại IHD, mà còn làm tăng tuổi thọ [35]
.
1.1.3. Các thống kê/khảo sát về việc sử dụng thực phẩm chay ở Việt Nam
và một số quốc gia trên thế giới
1.1.3.1. Việt Nam
Tháng 8 - 2012, công ty nghiên cứu thị trường trực tuyến W&S đã thực hiện
một cuộc khảo sát nhanh trên 659 người về “Xu hướng ăn chay của người Việt
Nam” nhằm tìm hiểu về nét văn hóa ẩm thực đặc biệt này. Cuộc khảo sát được tiến
hành điều tra trên 355 nam và 304 nữ từ 16 tuổi trở lên. Trong tổng số 659 người
tham gia khảo sát thì có hơn một nửa thường xuyên ăn chay (chiếm 58,9%).

15. Trang 5
Hình 1.1. Biểu đồ thể hiện tình hình ăn chay của ngƣời Việt Nam
Đa số thường ăn chay vào các thời điểm như ngày rằm và mồng một hàng
tháng, hay vào những dịp lễ lớn của Phật giáo. Giữa nam giới và nữ giới không có
sự khác biệt nhiều về mức độ thường xuyên ăn chay. Kết quả khảo sát còn cho thấy
có 3 lý do ăn chay được nhiều người đồng tình nhất: (i) vì ăn chay giúp tâm hồn
thanh thản, nhẹ nhàng (40,7%), (ii) vì họ muốn cầu nguyện (39%) và (iii) ăn chay
giúp mọi người bổ sung/ngăn ngừa một số chất, giúp tăng cường bảo vệ sức khỏe
(33,1%). 46% trong tổng số 659 người tham gia trả lời khảo sát cho biết ăn chay là
một việc có ý nghĩa đối với cuộc sống của họ. Ăn chay ngày nay không còn đơn
thuần là vì sức khỏe của mỗi cá nhân, con người riêng biệt mà còn được nâng lên
một tầm cao mới. Mọi người còn ăn chay để hướng tới cộng đồng nhân loại toàn
cầu, bảo vệ môi trường sinh thái, hệ động thực vật trên Trái Đất.
1.1.3.2. Một số quốc gia trên thế giới
Theo một cuộc thăm dò ý kiến của Hiệp hội các Nhà hàng Quốc gia thì người
dân Hoa Kỳ đang quan tâm nhiều hơn đến món ăn chay trong các thực đơn. Từ năm
1970 đến năm 2007, số người ăn chay gia tăng khoảng 30%. Sự phổ biến các thông
tin sự liên hệ mật thiết giữa chế độ ăn uống và bệnh tật là một nguyên do thúc đẩy
phong trào ăn chay gia tăng ở Mỹ và những nước Tây Âu [6]
.
Vào năm 2009, cuộc thăm dò của Vegetarian Resource Group cho biết ở Hoa
Kỳ có 8% số người trưởng thành nói họ không bao giờ ăn thịt và các loại hải sản.
Cũng theo thăm dò của nhóm này vào năm 2010, có 7% trẻ em tuổi từ 8 - 18 và

16. DOWNLOAD ĐỂ XEM ĐẦY ĐỦ NỘI DUNG
MÃ TÀI LIỆU: 51092
DOWNLOAD: + Link tải: Xem bình luận
Hoặc : + ZALO: 0932091562