Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

1. KYÕ THUAÄT NUOÂI CAÁY
TEÁ BAØO ÑOÄNG VAÄT

2. I. GIÔÙI THIEÄU CHUNG:
• * Harrison (1907),Carrel (1912): nuoâi caáy teá baøo ñoäng vaät
• EÁch laø nguoàn moâ ñaàu tieân ñeå nuoâi caáy
• * Söï thuùc ñaåy cuûa y hoïc buoäc ngöôøi ta quan taâm ñeán caùc loaøi
ñoäng vaät oån nhieät.
• * Doøng Hela ñöôïc Gey vaø coäng söï thieát laäp naêm 1952
• * Naêm 1961 Hayflick vaø Moorhead nghieân cöùu veà nhöõng teá
baøo bình thöôøng coù ñôøi soáng xaùc ñònh
• * Taïo vaccin khaùng virus vaø nghieân cöùu veà ung thö thuùc ñaåy kyõ
thuaät nuoâi caáy TBÑV phaùt triieån.
• * Söï phaùt trieån chung cuûa kyõ thuaät coâng ngheä laøm nuoâi caáy moâ
coù theå ñöôïc quan taâm roäng raõi.
• * Kyõ thuaät nuoâi caáy moâ ñöôïc öùng duïng nhieàu vaøo caùc lónh vöïc
trong y hoïc vaø coâng nghieäp.

3. 1. Nhöõng thuaän lôïi cuûa nuoâi caáy moâ
a. Kieåm soaùt moâi tröôøng
b. Tính ñoàng nhaát cuûa maãu
c. Kinh teá
2. Nhöõng khoù khaên cuûa nuoâi caáy moâ
a. Söï thaønh thaïo cuûa ngöôøi thao taùc
b. Soá löôïng
c. Söï khoâng oån ñònh

4. 3. Nhöõng khaùc bieät chính cuûa teá baøo trong ñieàu
kieän in vitro
•* Thay ñoåi khoâng gian keát hôïp
•* Khoâng coøn tính töông taùc teá baøo chuyeân bieät, töông taùc ña
chieàu.
• * Khoâng thöïc söï ñaïi dieän cho moâ maø töø ñoù caùc teá baøo naøy ñöôïc
taùch ra do thieáu caùc yeáu toá ñieàu hoøa.

5. II. ÑAËC ÑIEÅM CUÛA TEÁ BAØO ÑOÄNG VAÄT
1. Tính cô hoïc yeáu
2. Taêng tröôûng vaø phaân chia chaäm
3. Cô cheá kìm haõm ngöôïc (negative feed-back)
4. Tính chaát caàn giaù ñôõ
5. Thay ñoåi kieåu gen vaø kieåu hình
6. Coù theå ñöôïc baûo quaûn laâu daøi baèng phöông phaùp laïnh saâu
7. Caùc ñaëc tính khaùc

6. III.MOÂI TRÖÔØNG NUOÂI CAÁY TEÁ BAØO ÑOÄNG VAÄT
1. Moâi tröôøng
• *Moâi tröôøng toång hôïp daàn thay theá chieát phaåm sinh hoïc (phoâi
gaø, huyeát thanh ...).
• *Ña soá caùc doøng teá baøo ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng toång
hôïp coù boå sung 5 – 10% huyeát thanh (coù doøng teá baøo caàn boå
sung 20% huyeát thanh).
* Moät vaøi loaïi moâi tröôøng thöôøng ñöôïc söû duïng trong nuoâi caáy teá
baøo vaø moâ ñoäng vaät:
• Moâi tröôøng BM (Basal Medium): teá baøo Hela, teá baøo L.
• Moâi tröôøng E’MEM (Eagle Minimum Essential Medium)
• Moâi tröôøng D'MEM (Dulbecco – Modified Eagle Medium)

7. • Moâi tröôøng F10, F12: do R.G. Ham thieát laäp duøng cho nguyeân
baøo sôïi
• Moâi tröôøng Iscove: do N.N.Iscove thieát laäp treân cô sôû tieáp tuïc
caûi bieán moâi tröôøng DMEM.
• Moâi tröôøng 5A: do T.A. Mc.Coy thieát laäp, thöôøng ñöôïc duøng
cho teá baøo beänh baïch huyeát.
• Moâi tröôøng RPMI-1640: ñöôïc G.E. Moore thieát laäp, ñöôïc duøng
ñeå nuoâi teá baøo vaø moâ baïch huyeát.
• Moâi tröôøng 199: do R.C. Parker thieát laäp duøng ñeå nuoâi teá baøo
moâ cô phoâi gaø trong saûn xuaát vaccin phoøng beänh baïi lieät.

8. Huyeát thanh:
• *Cung caáp chaát dinh döôõng quan troïng cho teá baøo nhö caùc
amino acid thieát yeáu, tieàn chaát cuûa nucleic acid, caùc nguyeân toá vi
löôïng…
• *Cung caáp caùc nhaân toá taêng tröôûng, kích thích cho teá baøo taêng
tröôûng vaø phaân chia.
•* Kích thích söï phuïc hoài caùc toån thöông cuûa teá baøo khi caáy
chuyeàn vaø caùc protein trong huyeát thanh laøm baát hoaït trypsin
traùnh caùc enzym gaây toån thöông teá baøo.
• *Caûi thieän tính tan cuûa caùc chaát dinh döôõng.
• *Caûi thieän tính dính cuûa teá baøo leân beà maët bình nuoâi nhôø caùc
yeáu toá laøm taêng ñoä dính cuûa teá baøo leân giaù ñôõ.
• *Choáng oxy hoùa: huyeát thanh coù tính khaùng oxy hoùa maïnh vaø
öùc cheá ñoäc tính cuûa oxy.

9. 2. Giôùi thieäu veà kyõ thuaät pha moâi tröôøng
Moät soá ñieàu caàn löu yù trong khi pha moâi tröôøng
• Thaønh phaàn moâi tröôøng:
+ Acid amin: cung caáp nguoàn N cho teá baøo
+ Glucose: cung caáp nguoàn C cho teá baøo
+ Vitamine: laø caùc yeáu toá vi löôïng quan troïng trong
hoaït ñoäng soáng cuûa teá baøo
+ Muoái khoaùng: taïo heä ñeäm vaø duy trì aùp suaát thaåm
thaáu phuø hôïp
+ Protein: quan troïng nhaát laø caùc yeáu toá taêng tröôûng
hieän dieän trong huyeát thanh coù vai troø kích thích phaân baøo
• Ñieàu kieän nuoâi caáy: nhieät ñoä, ñoä aåm, noàng ñoä CO2
• Söï voâ truøng

10. IV. KYÕ THUAÄT TAÙCH TEÁ BAØO, CHOÏN DOØNG
TEÁ BAØO VAØ NUOÂI CAÁY TEÁ BAØO ÑOÄNG VAÂÏT
1. Kyõ thuaät taùch teá baøo
Moät soá khaùi nieäm:
• *Doøng teá baøo (cell line)
• *Doøng teá baøo lieân tuïc (continued cell line; established cell
line) Ví duï: CHO (chinese hamster ovary: teá baøo buoàng tröùng
chuoät Trung Quoác), Schneider-2 (teá baøo phoâi ruoài giaám),
COS1 (teá baøo thaän khæ xanh Chaâu Phi), Hela (teá baøo ung thö
coå töû cung ngöôøi), Vero (teá baøo thaän khæ xanh Chaâu Phi). . .
• *Doøng teá baøo taïm thôøi (temporary cell line)
• *Teá baøo sô caáp (primary cell)
• *Teá baøo thöù caáp (secondary cell)

11. Taùch teá
baøo baèng
trypsin

12. 2. Kyõ thuaät choïn doøng teá baøo
Taùch teá baøo töø ñóa nuoâi caáy baèng trypsin
Caáy teá baøo vaøo ñóa nuoâi caáy 1000 teá baøo/ml
Nuoâi uû teá baøo ñeán khi chuùng phaùt trieån thaønh nhöõng colony
Choïn moät colony teá baøo caàn taïo doøng
Coâ laäp colony naøy baèng 1 oáng kim loaïi
Huùt boû moâi tröôøng trong oáng vaø taùch caùc teá baøo töø colony naøy
Caáy sang moät ñóa moâi tröôøng môùi

14. 3. Kyõ thuaät nuoâi caáy teá baøo ñoäng vaät trong
phoøng thí nghieäm
a. Caáy chuyeàn teá baøo
Ñoå boû moâi tröôøng cuõ trong bình roux coù teá baøo
Röûa teá baøo baèng PBS(-)
Taùch teá baøo baèng trypsin
Huyeàn phuø teá baøo baèng moâi tröôøng
Caáy teá baøo sang bình roux môùi
Thay moâi tröôøng

15. b. Baûo quaûn teá baøo
Taùch teá baøo trong bình roux baèng trypsin
Huyeàn phuø teá baøo baèng moâi tröôøng
Ly taâm thu sinh khoái teá baøo
Huyeàn phuø teá baøo baèng moâi tröôøng môùi
Huùt dòch huyeàn phuø cho vaøo tube baûo quaûn teá baøo 2ml
Ñeå tube baûo quaûn vaøo hoäp xoáp beân trong coù loùt boâng goøn
Cho vaøo tuû laïnh -70o
C qua ñeâm
Baûo quaûn tube teá baøo trong Nitô loûng

16. c. Hoaït hoùa teá baøo
Tube teá baøo laáy töø nitô loûng
Cho vaøo becher nöôùc aám 37– 38o
C ñeå giaûi ñoâng.
Huùt dòch huyeàn phuø teá baøo cho vaøo bình roux
Theâm moâi tröôøng töøng gioït vaøo bình
UÛ ôû 37,5o
C trong tuû nuoâi.
Sau 24 giôø, thay moâi tröôøng cuõ baèng moâi tröôøng môùi

17. 4. Kyõ thuaät nuoâi caáy teá baøo ñoäng vaät ôû quy moâ
pilot vaø coâng nghieäp
a. Nuoâi caáy trong bình khuaáy:
- Theå tích: vaøi lit ñeán 20 lit, toát nhaát laø döôùi 10 lit.
- Haáp voâ truøng baèng autoclave.
* Yeâu caàu vôùi caùnh khuaáy:
+ Phaûi ñöôïc giöõ toác ñoä quay oån ñònh töø 10-300rpm
+ Coù moät maùy ño toác ñoä goác chính xaùc
+ Khôûi ñoäng laïi sau khi maát ñieän vaø vaãn giöõ nguyeân toác ñoä ñaõ
caøi ñaët
+ Khoâng toûa nhieät nhieàu
+ Hoaït ñoäng oån ñònh trong trong moâi tröôøng ôû 37o
C.
Tải bản FULL (36 trang): https://bit.ly/31zWOVz
Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net

18. Moâi tröôøng ñöôïc giaûm noàng ñoä huyeát thanh (0.5-5%), boå
sung:
+ Pluronic F-68 (polyglycol) : noàng ñoä 0.1% ñeå baûo veä teá
baøo choáng laïi söï phaù vôû do cô hoïc, ñaëc bieät ôû haøm löôïng
huyeát thanh thaáp.
+ Carboxymethyl cellulose (CMC) : noàng ñoä 0.1% cuõng
duøng ñeå baûo veä teá baøo khoûi söï phaù vôõ cô hoïc.
+ Phaù boït (6ppm) : duøng khi noàng ñoä huyeát thanh treân 2%.
4030965