immobilisasi enzim

1. Ani novitasari
Mita maharani bahriah
Nida awalia hanifah
Tiara rismayanti
Vina oktapiani

2. Gambar 1. Representasi metode Imobilisasi enzim metode reversible yang
berbeda d) adsorpsi e) ionik mengikat
ion logam f) afinitas mengikat dan g) Imobilisasi

3. Metal Binding /Chelation
Transisi
logam garam atau hidroksida diendapkan pada permukaan
organik dan terikat dengan kelompok-
kelompok nukleofilik pada matriks. Terutama garam
Titanium dan Zirkonium digunakan dengan metode yang di
kenal sebagai"logam link Imobilisasi"(Cabral, J.M.S. and
Kennedy, J. F, dkk (1991)).
Garam logam atau hidroksida diendapkan (misalnya,
selulosa, kitin, asam alginat, dan operator berbasis silika)
dengan cara pemanasan atau netralisasi. Faktor sterik
menyebabkan matriks tidak bisa menempati semua posisi
koordinasi logam, oleh karena itu beberapa posisi bebas
untuk berkoordinasi dengan kelompok-kelompok lain dari
enzim.
Logam
ion kemudian terikat oleh koordinasi dan kompleks stabil
terbentuk dapat digunakan
untuk retensi protein. Elusi protein terikat dapat dengan
mudah dicapai
oleh persaingan dengan ligan larut atau dengan
menurunkan pH.
kemudian
diregenerasi dengan mencuci dengan chelator yang kuat
seperti etilena diamina
Asam tetraacetic (EDTA) bila diinginkan. Logam chelated
dukungan tersebut diberi nama
Adsorben IMA Imobilisasi Logam-Ion Affinity (IMA) dan
telah digunakan
ekstensif dalam kromatografi protein (Porath, J.
,dkk.(1992)).

4. Pemilihan Bahan Pendukung
• Karakteristik dari matriks sangat penting dalam menentukan
kinerja sistem imobilisasi enzim. Sifat bahan pendukung yang
ideal, meliputi ketahanan fisik untuk kompresi, hidrofilisitas,
inert terhadap enzim yang mudah terderivatisasi,
biokompatibilitas, ketahanan terhadap serangan mikroba, dan
biaya yang rendah (Gale EF, Epps MR, Biochem J dkk: 1944).

5. Klasifikasi bahan pendukung
Bahan pendukung dapat diklasifikasikan sebagai bahan organik
dan anorganik menurut komposisi kimianya. Yang terdapat pada
tabel berikut :

6. • Karakteristik fisik dari matriks meliputi diameter partikel,
sifat, kekuatan mekanik, dan sifat kompresi.
• Ukuran partikel menentukan total luas permukaan dengan
demikian sangat mempengaruhi kapasitas pengikatan enzim.
• Karakteristik dari matriks sangat penting dalam menentukan
kinerja sistem imobilisasi enzim. Sifat bahan pendukung yang
ideal, meliputi ketahanan fisik untuk kompresi, hidrofilisitas,
inert terhadap enzim yang mudah terderivatisasi,
biokompatibilitas, ketahanan terhadap serangan mikroba, dan
biaya yang rendah (Gale EF, Epps MR, Biochem J dkk: 1944).

7. Keywords:papain,immobilizedmetalion(IMI)carrier,immobilization,thermalstability,
regenerationofmatrix.

8. Prinsipdan latar belakang
pasangan kovalen dari enzim dapat memproduksi penurunan
aktivitas yang terjadi karena pengaruh dari kondisi pasangan dan
perubahan kompormasi dari struktur enzim.
ikatan irreversibel dari enzim dengan carrier selama
pemasangan kovalen tidak dapat mengalami perbaikan carrier
dari kompleks carrier - enzim
metode yang dibutuhkan adalah carrier harus lebih mudah
diregenerasi dan digunakan tanpa menurunkan hasil imobilisasi.
percobaan yang telah dilakukan secara langsung dan sebuah
carrier kelat metal regenable telah digunakan dalam imobilisasi
papain.
imobilisasi ini berdasarkan kemampuan sisi aktif protein dari
sistein, histidin dan triptopan untuk mensubtitusi ikatan ligan
yang lemah dalam kompleks metal.

9. BAHAN YANG DIGUNAKAN
papain serbuk telah diperoleh dari sigma
chemical company USA , pengkelat separosa
yang diproduksi oleh pharmasia biotech,
uppsala, swedia. kasein, sistein dan bahan kimia
lainnya didapatkan dari lab penelitian mumbai
india.

10. Metode
imobilisasi dari papain melalui
pengkelatan metal separosa yang
diaktivasi oleh ion Cu2+.
regenerasi matriks dari papain
terimobilisasi
reimobilisasi dari papain
teregenerasi separosa yang
diaktivasi oleh ion Cu2+
pengujian logam enzim

11. Pembuatan buffer fosfat
Natrium dihydrogen fosfat (NaH2PO4) 0,2 M dibuat dengan
melarutkan 27,8 gram natrium dihidrogen fosfat dalam aquades
sampai volume larutan 1 L , dalam labu takar.
Dinatrium hidrogen fosfat (Na2HPO4) 0,2 M dibuat dengan
melarutkan 53,65 gram Na2HPO4 dalam aquades sampai
volume larutan 1 L, dalam labu takar.

12. imobilisasi dari papain melalui pengkelatan metal
separosa yang diaktivasi oleh ion Cu2+.
0,5 ml pengkelat
separosa + 1 ml
aquades
sentrifigus selam 30
detik + diulang
sebanyak 4 kali
cuci seluruh matrik
yang telah diisi dengan
ion metal (Cu2+)
stirer pada suhu ruang
selama 30 menit yang
disentrifugasi sesaat
untuk membuang
supernatan.
cuci matriks dengan 1
ml aquades sebanyak 4
kali dengan 1 ml
buffer sodium fosfat
pH 8,2 10 mM
matriks ini dicampur
dengan 1,5 ml larutan
papain (8,9 mg/ml),
stirer pada subu
ruangan selama 3 jam
sentrifugasi selama 30
detik dan ambil
supernatan
dicuci kembali dengan
1 ml buffer fosfat pH
8,2, 10mM sampai
tidak terdeteksi
aktivitas setelah
pencucian.

13. regenerasi matriks dari papain
terimobilisasi
0,5 ml matriks
enzim dalam 2 ml
elusi (0,05 M
EDTA dan 0,5M
NaCl) selama 1
jam
Cuci dengan 10
mM buffer fosfat
pH 8,2
diresuspensi
dalam 0,5 ml
buffer pencuci
Dihasilkan elusi
dan matriks tanpa
warna
diulang hingga
total empat kali
siklus.

14. reimobilisasi dari papain teregenerasi
separosa yang diaktivasi oleh ion Cu2+
0,2 ml dari
regenerasi matriks
(tanpa warna)
dicuci dengan 1 ml
akuades (sebanyak
tiga kali).
buang supernatan
dan campur matriks
dengan 0,4M
CoCl2 pada volume
yang sama (0,2 ml).
larutan distirer
dalam suhu ruang
selama 30 menit,
disentrifugasi, dan
buang supernatan.
matrik dicuci dua
kali dengan 1 ml
akuades dan 10
mM buffer fosfat
pH 8,2.
keseluruhan matrik
disuspensi dalam
1,0 ml larutan
papain (8,9 mg/ml).

15. Pengujian Logam Enzim
• aktivitas larutan papain ditentukan dengan
menggunakan kasein sebagai substrat pada suhu
37C dan ph 8,2.
• aktivitas enzim papain terimobilisasi secara
berkelanjutan selama bereaksi dalam stirer.
• satu unit dari aktivitas enzim adalah jumlah dari
enzim yang menghasilkan larutan TCA Peptida
atau asam amino yang memberikan warna biru
yang setara dengan 0,5 µg pirosin permenit pada
30C.

16. ImobilisasiDanReimobilisasiPapainDalamPengkelatSeparosaYang
DiaktivasiOlehIonCu2+
Hasil yang ditampilkan ini adalah hasil penghitungan mean dan standar deviasi
dari tiga penyiapan imobilisasi yang berbeda. hasil dari aktivitas dan
imobilisasi dihitung dari nilai mean.

17. Hasilreimmobilisasidaripapainpadapengkelatseparosayang
diaktivasiolehCo2+yangtelahdiregenerasi.

18. inaktivasitermal padalarutanpapindanpapainterimobilisasi
Stabilitas termal dari
larutan dan papain
terimobilisasi yang
ditentukan setelah
inkubasi pada suhu
65◦C, pada durasi yang
berbeda. aktivitas
papain ditentukan
setelah inkubasi
berakhir dibawah
kondisi standar. (o)
larutan papain, (●)
papain terimobilisasi.

19. Hasil dan Diskusi
dalam tabel 1. diterangkan dalam tabel aktivitas dan hasil imobilisasi
adalah 78% dan 98%, yang secara signifikan lebih tinggi ketika
dibandingkan dengan ikatan kovalen papain (Zhuang and Butterfield,
1992). aktivitas dan hasil imobilisasi dari papain berikatan kovalen
hanya 6% dari 10,5% dalam penelitian yang dilakukan oleh Zhuang and
Butterfield, 1992.
enzim papain terimobilisasi menunjukkan sebuah tanda peningkatan
aktivitas setelah 1 jam inkubasi pada suhu 65C ketika pasangan larutan
hampir 75% hilang dari aktivitas sebenarnya. Stabilitas yang lebih tinggi
pada papain IMI yang berikatan dapat mengurangi autolisis dari enzim
yang tetap dalam pendukung. penjelasan kemungkinan yang kedua yang
berhubungan dengan kekakuan dari konformasi molekul enzim yang
dihasilkan dari matriks yang berikatan.