2. 10
20
ČESKOSLOVENSKÁ SOCIALISTICKÁ REPUBLIKA
Vydáno 15. srpna 1961
Vyloženo 15. března 1961
Třída 30 h, 6
12 . /01
PATENTNÍ SPIs č.
100738
Právo k využití vynálezu přísluší státu podle 3 odst. 6 zák. . 34/1957 Sb.
Inž. JINDŘICH LIEBSTER, PRAHA, JAROSLAV KOZEL, HOROMĚŘICE u Prahy,
MILADA DOBIÁŠOVÁ, promovaná chemička, PRAHA
a RNDr. JIŘINA KOPOLDOVĀ, PRAHA .
Způsob výroby aminokyselin značkovaných 14C
Přihlášeno 3. května 1960 (PV 2907-60) Platnost patentu od 3. května
1960
Vynález se týká způsobu výroby aminokyselin značkovaných 14C. Aminokyseliny
nespecificky značkované 14C jsou významnými slou
čeninami pro metabolické studie. Pro tyto účely se jich používá ros
toucí měrou. Jejich příprava biosynthesou, zejména fotosyńthesou auto
trofními mikroorganismy, dovoluje získání řady nejdůležitějších aminokyselin s vysokým
výtěžkem, vysokou specifickou aktivitou a jednodu
chým způsobem.Nejčastějise k těmto účelům používá řasy Ćhlorella
vulgaris.
Dosud známé způsoby spočívaly v tom, že řasa Chlorella vulgaris byla kultivována
na anorganickém substrátě v prostředí 14CO2, který byl vyvinut jednorázově. Tento
způsob lze označiti jako jednofázový, protože řasa po celou dobu fotosynthetického

3. procesu je udržována v prostředí 14CO2 se stejnou specifickou radioaktivitou. Po
spotřebování 14CO2 v tomto jednofázovém procesu byla řasa frakcionována kyselinou
trichloroctovou a bílkoviny po enzymatické hydrolyse extrahovány, přičemž byly
isolovány pouze nukleové kyseliny a bílkoviny. Rozdělení amínokyselín nebylo
provedeno. Fotosynthesa se prováděla ve skleněné kultivační spirále osvětlené
žárovkami, 14CO2 byl uměle cirkulován a úbytek radioaktivity měřen vestavěným
GeigerMüllerovým počítačem. Tento způsob měl řadu nedostatků, tak např. vedl
jednofázový syn

5. 100738
thetický proces k značným ztrátám radioaktivity, neboť řasa podléhá během kultívačního
procesu autolyse a značný podíl vysoce aktivních metabolitů se pak najde v substrátu ve směsi,
kterou nelze hospodárným způsobem rozdělit. Kultivační spirála se při bohatém nárůstu řasy
během fotosynthesy zanese, cirkulace 14CO2 vázne, čímž jsou autolytické pochody ještě
podporovány. Hlavním problémem při výrobě aminokyselin značkovaných 14C je proto vhodná
úprava aparatury a snížení ztrát radioaktivity při fotosynthetickém procesu.
. Předmětem vynálezu je způsob výroby aminokyselin značkovaných 14C
fotosynthesou autotrofními mikroorganismy, např. řasou Chlorella vulgaris,
kultivovanými v prostředí anorganických živných solí a 14CO2, a následující isolací z
živného prostředí po skončení kultivace. Jeho podstata spočívá v tom, že se nejprve
provádí fotosynthesa v prostředí 14CO2 o specifické radioaktivitě řádově 40 uC1g
14CO2 a po poklesu původní radioaktivity na 10 až 20% při rychlosti úbytku
radioaktivity 10 až 15% za hodinu se pokračuje ve fotosynthese v prostředí 14CO2 o
specifické radioaktivitě řádově 400 mC1 g 14CO2 a proces se nechá proběhnout
minimálně do 90% spotřeby nasazené radioaktivity.
K provedení tohoto způsobu bylo sestrojeno zařízení, které je součástí předmětu vynálezu
a které sestává z kultivačního prostoru, ze zařízení pro měření radioaktivity, z plynojemu s
čerpadlem a z absorpčního okruhu pro nespotřebovaný 14CO2. Jeho podstata spočívá v tom,
že kultivační prostor je tvořen válcovitou nádobou ukončenou na spodním konci fritou opatřenou
chladicím pláštěm a na horním konci navazující na kondensační systém, přičemž zařízení je
dále opatřeno alespoň dvěma zářivkami uspořádanými kolem kultivačního válce, jejichž
spektrum příznivě ovlivňuje tvorbu bílkovin. ·
Způsobem podle vynálezu se odstraňují nedostatky dřívějších způsobů výroby a
umožňuje se získání čistých aminokyselin s výtěžkem 5055% nasazené radioaktivity.
Mimo to se získá také malé množství lipidů, které jsou rovněž žádaným produktem
použitelným pro metabolické studie.
Kultivace řasy Chlorella vulgaris se podle vynálezu provádí ve válci, do kterého se 14CO2
vhání přes fritu, čímž se dosahuje stejnoměrného provzdušnění substrátu po celou dobu
kultivace, což při dříve použitém kultivačním hadu bylo zejména v pozdější fázi obtížné.
Fotosynthetický proces je rozložen do dvou fází, čímž se zajišťuje, že asimilace 14CO2 probíhá
v druhé fázi velmi rychle a popřípadě v první fázi do substrátu přecházející metabolity mají jen
nepatrnou radioaktivitu. Zároveň dovoluje tento způsob funkční zkoušku aparatury a
mikroorganismu, zaručující dobré a rychlé využití 14CO2. Postup se provádí tak, že se řasa
podrobí nejprve v aparatuře fotosynthese v prostředí 14CO2 s velmi nízkou specifickou
radioaktivitou, přičemž se sleduje rychlost úbytku 14CO2 měřením radioaktivity zabudovaným
GM po- .
čítačem. Vykazujeli radioaktivita v aparatuře v předepsané době po

6. žadovaný prudký pokles, je to znamení, že všechny podmínky pro hladký průběh preparativní
fotosynthesy jsou dány a přidává se 14CO2 s vysokou specifickou radioaktivitou, který je
spotřebován během asi 7 hodin. Prakticky veškerá radioaktivita pak je v řase a z toho 80% v
aminokyselinách. Způsob zpracování je pak velmi jednoduchý. Lipidy a barviva se extrahují
alkoholéterem, bílkoviny se hydrolysují trypsinem a pepsinem a tak se oddělí od zbytku buněk.
Enzymatický hydrolysát se pak dohydrolysuje kyselinou solnou a směs aminokyselin se
rozděluje na iontoměniči. Aby byl získán produkt prostý soli, pracuje se s těkavými pufry, jako
pyridinmravenčanovými a pyridinacetátovými, za použití systému gradientové eluce. Identifikace
aminokyselin.

8. 100
110
120
130
100738
se provádí chromatograficky a relativní složení eluátů se stanoví na základě radioaktivity
jednotlivých frakcí. Výtěžky aminokyselin obnášejí až 70% aktivity hydrolysátu, respektive 50%
celkové nasazené radioaktivity. Rozložením fotosynthetického procesu do dvou fází se
dosahuje, že metabolity, resp. produkty autolysy řasové buňky, které se na začátku kultivace
dostanou do substrátu, tím, že odumírají starší buňky, mají velmi nízkou specifickou
radioaktivitu, čímž se dosahuje snížení ztráty radioaktivity na minimum. Zároveň se takto
umožňuje
sledování úbytku radioaktivity v závislosti na době, stanovení rychlosti
fotosynthesy a volení okamžiku maximální metabolické aktivity pro přidání 14CO2 s vysokou
specifickou radioaktivitou, který je pak asimilován téměř beze ztrát v krátké době.
Aparatura pro provádění fotosynthesy, znázorněná na připojeném Výkresu, sestává z
kultivačního válce 14 ukončeného nahoře zábrusem, na který je nasazen kondensační systém ,
9, 9a s filtry , 8 pro dů- kladné odstranění vodních par, na spodní konec válce je uváděn 14CO2
trubicí 6 s fritou. Válec je opatřen chladicím pláštěm a osvětlen čtyřmi zářivkami upravenými
okolo válce 14. Ostatní části aparatury se skládají z měřicí části opatřené Geiger-Müllerovým
počítačem 10, z plynojemu 3 s čerpadlem , z vyvíječe 14CO2 1, 2, 2a a z absorpčního okruhu
12, 13. Provoz je regulován kohouty K1 až K15 a manometrem 11.
Jako kultury se použije řasy Chlorella vulgaris, var. viridis. Tři týdny stará kultura se
naočkuje do sterilního substrátu. Kultivace se provádí při 24° C, osvětluje se 200 W žárovkou
po 14 dní. Substrát pak obsahuje 100 mg sušiny na 100 ml. Substrát pro preparativní
fotosynthesu má toto složení: 1 N KNO3 10 ml, 1 M KH2PO4 1 ml, 1 M MgSO4 2 ml, ,1 M
CaNO3)2,5 ml, ,01 M 1 ml, ,01 M. MnCl2 1 ml, ,01 M ZnSO4 1 ml, ,01 M CuSO4 1 ml, ,01 M ·
H2MoO4 1 ml, ,01 M FeNH4)SO4)1 ml ad 1000 ml H2O dest.
Kultivace se provádí v aparatuře sestavené v principu podle Dalglieshe a spol. (C.
E. Dalgliesh, R. W. Dutton: J. Chem. Soc., 3784 a 3792, 1956), avšak kultivační had byl
nahrazen 70 cm dlouhým válcem o průměru 5 cm na obou koncích zabroušeným, s
nataveným chladicím pláštěm, vybaveným skleněnou uváděcí trubicí, ukončenou dole
fritou G1 o průměru 7 mm pro vhánění 14CO2. Osvětlí se 4 zářivkami 20wattovými, 60
cm dlouhými, okolo nichž jsou umístěna zrcadla pro lepší využití světla.
200 ml stacionární kultury řasy se odstředí ve sterilní zkumavce (sušina sedimentu
210 mg). Sediment se suspenduje v 820 ml sterilního substrátu a naplní do kultivační
kolony. V první fázi se vyvíjí 14CO2 z 2,2 g Ba14CO3 o aktivitě 28 uC. Při 2027° C je
po 28 hodin zaznamenán prudký pokles radioaktivity, která během dalších 7 hndin klesá
na 15% původní hodnoty. V druhé fázi se přidá 630 mg Ba14CO3 s radioaktivitou 50

9. mC. Po deseti hodinách je 97% radioaktivitv spotřebováno. Substrát se vypustí a
odstředí (radioaktivita supernatantu ,2% původní radioaktivity). Sediment se ihned
extrahuje směsí ethanoléter (4 : 1) 6 hodin (suchá váha sedimentu činí ,6113 g). Extrakt
má radioaktivitu ,3 mC. Po odpaření extraktu se lipidy a barviva extrahují petroléterem
(radioaktivita ,5 mC). Sediment (o radioaktivitě 38 mC) se suspenduie v 20 ml vody a
hydrolysuje při pH 2 (HCl). 2X24 hodiny s 2 X 20 mg pepsinu při 37° C a pak při pH 8
(NaOH) 2x24 hod. : s 2x10 mg trypsinu při 37° C. Po odstředění obsahuje supernatant
36,5 mC. Po zahuštění ve vakuu na malý objem se hydrolysa dokončí v prostředí 6 N
HCl při 100° C 16 hodin. Konečná radio

11. 140
150
160
170
4 100738
aktivita obnáší asi 34 mC. HCl se odpaří ve vakuu za opakovaného přidávání ethanolu.
Bílkovinný hydrolysát se rozdělí na iontoměniči ze styrendivinylbenzenového polymeru
(například výrobek označovaný v obchodě, Dowex 50 W 200400 mesh) v Nacyklu.
Iontoměničová kolona má rozměry: průměr 9 cm, délka 150 cm. Bílkovinný hydrolysát
(radioaktivita 10 mC, váhové množství 160 mg) se nanese v pufru . 1. Gradientová eluce se
provádí s rychlostí 12 mlh při konstantní teplotě 37° C. Při známém sledu aminokyselin ve
standardní šarži se odkapávající eluát měří přímo GeigerMüllerovou trubicí, impulsy se
zaznamenávají přes integrátor s automatickou registrací a přímo odebírají jednotlivé frakce
odpovídající aminokyselinám. Relativní množství aminokyselin se stanoví planimetrováním
ploch pod vrcholy. Je použito pěti pufrů. Pufr . 1 (0,1 M pH ,1, 460 ml), vyměněn po valinu, pufr
č. 2 (0,2 M, pH ,1 do 960 ml), vyměněn po leucīnu, pufr . 3 (0,2 M, pH ,4, do 1520 ml), vyměněn
po tyrosinu, pufr . 4 1,0 M, pH ,1 do 2500 ml), vyměněn po lysinu, pufr . 5 (2 M, pH ,1, do 2580
ml), vyměněn po argininu. Pufry sestávají z pyridinu, pH u pufrů č. 1 a 2 se upravuje kyselinou
mravenčí a u pufrů č. 3 až 5 kyselinou octovou.
Způsobem podle vynálezu se umožňuje ekonomická výroba aminokyselin značkovaných
14C fotosynthesou. Získají se tyto aminokyseliny: kyselina cysteová, cystin, methioninsulfoxyd,
kyselina asparagová, threonin, serin, prolin, kyselina glutamová, alanin, glycin, valin, isoleucin,
leucin, fenylalanin, tyrosin, histidin, lysin, arginin, výtěžky činí 50% celkové nasazené
radioaktivity. Jednotlivé stupně procesu jsou snadno zvládnutelné pro osobu znalou obvyklé
techniky. Výtěžky dosažené jsou velmi blízko výtěžkům teoreticky dosažitelným. Za daných
kultivačních podmínek obsahuje řasa vysoké procento bílkovin.
Předmětpatentu
1. Způsob výroby aminokyselin značkovaných 14C fotosynthesou
autotrofními mikroorganismy, např. řasou Chlorella vulgaris, kultivovanými v prostředí
anorganických živných solí a 14CO2, a následující
isolací z živného prostředí po skončení kultivace, vyznačený tím, že
se nejprve provádí fotosynthesa v prostředí 14CO2 o specifické radioaktivitě řádově 40 uC1 g
14CO2 a po poklesu původní radioaktivity na 10 až 20% při rychlosti úbytku radioaktivity 10 až
15% za hodinu se pokračuje ve fotosynthese v prostředí 14CO2 o specifické radioaktivitě
řádově 400 mC1 g 14CO2 a proces se nechá proběhnout minimálně do 90% spotřeby
nasazené radioaktivity.
2. Zařízení k provádění způsobu podle bodu 1, sestávající z kultivačního
prostoru, ze zařízení pro měření radioaktivity, z plynojemu
s čerpadlem a z absorpčního okruhu pro nespotřebovaný 14CO2, vyzna

12. čené tím, že kultivační prostor je tvořen válcovitou nádobou (14) ukončenou na spodním konci
fritou (6) opatřenou chladicím pláštěm a na horním konci navazující na kondensační systém (7,
9, ), přičemž zařízení je dále opatřeno alespoň dvěma zářivkami uspořádanými kolem
kultivačního válce, jejichž spektrum příznivě ovlivňuje tvorbu bílkovin.
Severografia, n. p, závod 03

14. Příloha k patentnímu spisu č. 100738