2. CHE COS'E'?
CRISPR= Clustered regularly-interspaced short palindromic repeats
I crisper sono frammenti di DNA
contententi brevi sequenze
palindromiche ripetute più volte.
Tra queste sequenze ripetute più
volte (dette repeats), vi sono
degli spacer.
3. COME SI E' ARRIVATI
ALLA SCOPERTA?
La prima descrizione della CRISPR
avvenne nel 1987 da uno scienziato
giapponese che studiando le E.Coli lo
clonò accidentalmente insieme al gene iap
(inibitore dell’apoptosi).
Nel 1993 il microbiologo Mojica studiando
il genoma degli archeobatteri, scoprì la
presenza di queste sequenze
palindromiche ripetute più volte.
4. COSA E'
STATO
IPOTIZZATO?
Nel 2005 fu ipotizzato che gli spacer presenti nei
crispr non erano altro che piccole sequenze di dna
acquisite dal procariote a seguito di un’infezione
da parte di un batteriofago.
Proprio questa osservazione suggerì che nei
procarioti le crispr svolgono un ruolo di immunità
acquisita : cioè ipotizzò che in caso di successive
infezioni dallo stesso battieriofago, queste
sequenze spacer vengono trascritte ad RNA, che
hanno una sequenza complementare al genoma
virale, che poi sarà degradato.
5. LE PROVE:
Tale ipotesi venne provata solo nel 2007, quando
vennero condotti degli esperimenti sul
batterio Streptococcus thermophilus. Infatti fu
rivelato che :
>Una regione CRISPR di Streptococcus
thermophilus acquisì delle sequenze di DNA-
spacer a seguito dell’infezione di un
batteriofago.
>Si osservava che Streptococcus
thermophilus diventava "resistente" al
batteriofago se si aggiungeva un DNA-spacer
simile a quello del batteriofago.
6. ULTERIORI
SCOPERTE:
• Tutta via, l’importanza delle crispr fu
compresa solo dopo la scoperta di un
complesso di geni associati a tali
sequenze, che sintetizza l’enzima nucleasi
CAS9 (crispr-associated),
enzima specializzata nel taglio del DNA: ha
due siti di taglio attivi (HNH and
RuvC), uno per ciascun filamento della
doppia elica di DNA.
7. SCHEMA MECCANISMO
AZIONE CRISPER CAS9:
• Acquisizione di una sequenza spacer, a seguito
di un infezione del batteriofago, nel locus
CRISPR del genoma batterico;
• Trascrizione di un DNA-crisper in RNA-crisper.
• La frammentazione dell’Rna-crisper in tanti
Trans-activating-Rna-crisper, ciascuno dei quali
contiene un singolo spacer , a cui poi si lega la
CAS9;
• Utilizzo di questi Rna-spacer. Nel caso di una
nuova infezione dello stesso batteriofago l’ Rna-
spacer si lega al genoma virale complementare,
fungendo da guida per la Cas9 che lo degrada
8. LA RIVOLUZIONE
• La rivoluzione del sistema crispr/cas9 inizia nel
2011/2012 quando Doudna e
Charpentier riescono a re-ingegnerizzare tale
sistema per poterlo utilizzare nelle cellule umane
e impiegarlo come tecnica di editing genomico:
• infatti Il complesso Crispr-Cas9 è in grado di
individuare un punto preciso del genoma per poi
correggerlo, sostituirlo o cancellarlo. Per farlo
sfrutta l’enzima Cas9 che è in grado di tagliare in
punti precisi la doppia elica del Dna, proprio
come delle forbici.
• Per dirigere la cas9 sulla sequenza desiderata si
utilizza una “guida”: una sequenza di Rna
complementare al Dna che si vuole modificare.
9. Ma come fa il sistema a
legarsi ad un punto preciso
del genoma?
• Antecedente alla sequenza di dna dove vogliamo avvenga il taglio
deve esserci una sequenza detta PAM, che per la CAS9 deve
essere NGG dove n è un nucleotide qualsiasi. Una volta
riconosciuta la pam, la cas9 effettuerà il taglio a 3 coppie di
nucleotidi a monte di essa
• Potenzialmente possiamo reperire il kit per editare il genoma
facilmente : abbiamo bisogno di dna bersaglio, rna guida e cas9.
• Dobbiamo trovare un bersaglio ideale per la cas9 all’interno di
questa sequenza (ricorda che antecedente a questo ci deve stare la
pam), e per farlo usiamo un sistema bio-informatico disponibile
online gratuitamente : qui inseriamo la sequenza di dna dove
vogliamo avvenga il taglio e ci sceglie il bersaglio ideale e la
sequenza dell’rna guida che possiamo produrre noi stessi in
laboratorio, oppure acquistandolo da una casa farmaceutica
10. La Crisper/Cas9 come può essere impiegata in
ambito medico?
• Questo metodo , che è ad oggi è il più innovativo e preciso per l’editing genomico, (definito
«taglia e incolla genico») , in ambito medico può essere impiegato per trattare e
prevenire malattie genetiche, dove la causa è l’alterazione di un solo gene. (se sono di più
i geni alterati le possibilità si interrompono) . Ad esempio:
• Leucemia mieloide acuta = causata dalla mutazione di un gene nelle cellule li della linea
mieloide.
• Emofilia = provocata dalla mancanza del fattore VIII della coagulazione e, di
conseguenza, frequenti emorragie interne.
• Talassemia = provoca un'anemia cronica a causa della mancanza una delle catene
polipeptidiche presenti nella molecola dell’emoglobina.
• Fibrosi cistica = colpisce fegato, polmoni e pancreas e che arriva a distruggere la
funzionalità di tutti gli organi.
11. La Crisper/Cas9 come può essere impiegata in
ambito medico?
• Oltre a malattie genetiche, le applicazioni della crisper/cas9
sono orientate anche verso la cura delle malattie infettive
come :
• La malaria: non è una malattia genetica, ma viene trasmessa
dall'esemplare femmina della zanzara anopheles, una volta
che questa è già stata attaccata dal parassita Plasmodium
falciparum. L'ipotesi sarebbe dunque quella di agire
direttamente sull'animale, modificando il suo Dna in modo
che diventi lui stesso immune al microorganismo.
• L’HIV: la crisper cas9 andrebbe ad agire sul gene CCR5, che
codifica una proteina di membrana dei Linfociti T che si ritiene
costituisca la “porta d’accesso” dell’hiv alle cellule.
Inattivando questo gene, il virus hiv non sarebbe più in grado
di accedere nelle nostre cellule e di provocare la malattia.
12. STOPCovid, il test rapido basato su CRISPR
• La cas9 oltre all’editing può avere una funzione
diagnostica : l’operazione è chiamata knockdown
• La pandemia ha dimostrato che i classici tamponi
basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR)
non bastano più. La CRISPR/CAS9 in questo caso non
serve per l’editing delle sequenze genetiche, ma per il
loro rilevamento.
• LA SOLUZIONE : Il batterio Alicyclobacillus
acidophilus, che contiene un enzima della famiglia Cas
detto AapCas12b. Grazie a questa proteina, e a un
marcatore fluorescente, è possibile rilevare la Sars-
covid-19 all’interno della nostra saliva
13. La Cas9 è cancerogena?
• I due studi pubblicati lo scorso 11 giugno su Nature
Medicine indicano che l’utilizzo della tecnologia
CRISPR–Cas9 potrebbe aumentare il rischio di cancro
. Questa notizia, ha generato un 'terremoto’ mediatico.
• Come sappiamo , nel nostro patrimonio genetico esiste
un gene chiamo «P53», che codifica una proteina
oncosopressore detta «GUARDIANO DEL GENOMA»:
essa infatti si assicura che non vi siano danni al dna, se
vi sono li modifica, e in caso di danni irreversibili induce
la cellula all’apoptosi (evitando che cellule
potenzialmente tumorali proliferino.)
• È ovvio che, i tagli del DNA effettuati da CRISPR-
Cas9 attivano p53 (il che non sorprende visto che
questa proteina deve monitorare eventuali danni a
carico del DNA) ed è proprio l’azione di questa
proteina ad impedire editing genomico : di fatti o
viene riparato «il danno» o la cellula va incontro a
«apoptosi».
14. La Cas9 è cancerogena?
Il punto critico sollevato da entrambi i lavori è che, per avere
una buona efficienza, CRISPR-Cas9 potrebbe selezionare le
cellule che hanno il sistema p53 difettivo e che hanno
quindi un’intrinseca potenzialità tumorale.
Tuttavia ricerche recenti hanno mostrato come somministrando
alle staminali del sangue un inedito cocktail proteico durante
l’editing genetico, si sia riusciti a bloccare temporaneamente
l’azione della p53, per poi farla tornare a funzionare
regolarmente.
15. ALTRE CAS : scoperte nuove nucleasi
• La famiglia di cas è veramente vasta:
• CASX: è di recente scoperta. Delle ultime
ricerche sembra evidenziare minore
problematiche oncologiche rispetto alla
cas9. Ciò probabilmente è da attribuire alla
diversa natura della nucleasi (isolate in
batteri diversi) e dalle minori dimensioni.
Circa 1000 amminoacidi
• CAS 12: ha dimensioni ancora più piccole
(circa 800amino). Genera estremità
coesive, rendendo più agevole l’inserimento
di dna esogeno.
• CAS 13: è una nucleasi per RNA
16. ZFN (zinc finger nucleases)
• Sono le così dette. «nucleasi a dita di zinco»
• Presenta un DOMINIO DI LEGAME con il
quale si lega al dna bersaglio. E un
DOMINIO DI SCISSIONE dove presenta
l’enzima di restrizione FOLK.
• Il taglio realizzato genera delle estremità
coesive.
17. TALEN :(transcription activator-like effector
nucleases)
• È simile alla ZFN , anche qui vi è
un dominio di legame, in questo
caso definito TALEN (riconosce la
sequenza da modificare) e un
dominio di scissione.
• Ha dimensioni maggiori
• È più precisa rispetto alla zfn, ma
il costo è maggiore
