Wyklad 3

Wykład 3 – Procesy biotechnologiczne
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Rodzaje przemysłowych procesów fermentacyjnych

- procesy, w których produktem jest biomasa

- procesy, w których produktem jest białko, najczęściej
enzym

- procesy, w których produktem jest metabolit (biosynteza)

- procesy, których celem jest przekształcenie
związku dodanego do mieszaniny fermentacyjnej
(biotransformacja)

- procesy mikrobiologicznej degradacji makromolekuł
(biodegradacja)


Rodzaje bioprocesów

Biosynteza

Biotransformacja

Biohydroliza

Fermentacja

Bioługowanie

Biodegradacja


Blokowy schemat technologiczny procesu biosyntezy mikrobiologicznej


Cechy charakterystyczne procesu biotechnologicznego
trzy wyraźne fazy:

przygotowanie produkcji (upstream processing)

właściwa fermentacja

obróbka poprodukcyjna (downstream processing)

• przygotowanie produkcji odbywa się w warunkach laboratoryjnych

• konieczność kilkukrotnego powiększania skali

• konieczność utrzymania i przechowywania szczepów produkcyjnych

• konieczność zapewnienia warunków aseptycznych

• konieczność rygorystycznej kontroli parametrów fermentacji


Sposoby prowadzenia procesów biotechnologicznych

A – proces okresowy; B – proces okresowy z zasilaniem; C – proces ciągły w układzie homogenicznym;
D – proces ciągły homogeniczny z częściową recyrkulacją ; E – proces ciągły dwustopniowy; F – proces
ciągły heterogeniczny w reaktorze z przepływem tłokowym; G – proces ciągły heterogeniczny z częściową
recyrkulacją; H – proces ciągły dwustopniowy w układzie mieszanym; I – proces z odprowadzeniem
produktu metodą dializy; J – proces okresowy w kolumnie ze złożem biokatalizatora, z recyrkulacją cieczy;
K – proces ciągły w kolumnie ze złożem biokatalizatora; L – proces jak w K, z częściową recyrkulacją


Sposoby prowadzenia procesów biotechnologicznych
z wykorzystaniem drobnoustrojów
Hodowle w podłożach ciekłych: wgłębne lub powierzchniowe;
z unieruchomionym materiałem biologicznym

Hodowle w podłożach stałych (jedynie dla grzybów strzępkowych)

Procesy okresowe – prostota technologiczna, łatwość utrzymania warunków
jałowych, odnawialność zaszczepki, ale konieczność powtarzania
w każdym cyklu operacji przed- i poprocesowych, niska produkcyjność
-m.in. produkcja enzymów i białek terapeutycznych.
Hodowle wielokrotne – browarnictwo, produkcja octu

Procesy ciągłe – m.in. wytwarzanie białka paszowego, fermentacja alkoholowa,
fermentacja octanowa, oczyszczanie ścieków metodą osadu czynnego

Procesy okresowe z zasilaniem – namnażanie drożdży w celu produkcji SCP,
produkcja antybiotyków, witamin, aminokwasów. Szczególne zastosowanie –
nietypowe źródła węgla.


Hodowla okresowa (ang. batch culture) – system zamknięty

Q – natężenie dopływu
pożywki
X – gęstość komórek
S – stężenie składników
odżywczych

Bilans biomasy

µ- szybkość wzrostu
dX
= µX − αX α - szybkość obumierania
dt
µ jest funkcją stężenia substratu limitującego wzrost

Zakładając α ≈ 0, r-nie upraszcza się do postaci:

dX
= µX
dt


Hodowla okresowa z zasilaniem (ang. fed batch culture)

pożywki
odżywczych

Bilans biomasy
Biomasa akumulowana = biomasa dopływająca + przyrost biomasy – komórki martwe

d (VX ) QX 0 µ- szybkość wzrostu
= + µVX − αX α - szybkość obumierania
dt V

Zakładając α ≈ 0 i brak zasilania biomasą, r-nie upraszcza się do postaci:

d (VX )
= µVX
dt


Hodowla ciągła (ang. continuous culture)

pożywki
odżywczych

Biomasa akumulowana = biomasa dopływająca + przyrost biomasy –
biomasa usuwana – komórki martwe

dX QX 0 QX µ- szybkość wzrostu
= + µX − − αX α - szybkość obumierania
dt V V
Wprowadzając: D = Q/V – szybkość rozcieńczania, zakładając α ≈ 0
i brak zasilania biomasą, r-nie upraszcza się do postaci:
dX QX
= µX −
dt V

Hodowla ciągła z recyrkulacją biomasy (Chemostat) Q – natężenie dopływu
pożywki
odżywczych
γ - współczynnik
recyklingu
C – współczynnik
zatężenia biomasy
zawracanej
Bilans biomasy
Biomasa akumulowana = biomasa dopływająca + przyrost biomasy –
biomasa usuwana – komórki martwe

dX QX 0 QCγX (1 + γ )QX µ- szybkość wzrostu
= + + µX − − αX α - szybkość obumierania
dt V V V
Wprowadzając: D = Q/V – szybkość rozcieńczania, zakładając α ≈ 0
i brak zasilania biomasą oraz uzyskanie stanu równowagi, czyli dX
otrzymujemy: =0
dt
µ = D(1 + γ - γC)


BIOTECHNOLOGICZNE PROCESY CIĄGŁE

Zalety:

1. Wyeliminowanie wpływu czasu hodowli na zmiany warunków w pożywce
i fizjologię drobnoustrojów
2. Możliwość prowadzenia hodowli dowolnie długo w ustalonych, optymalnych warunkach
3. Możliwość regulacji stanu fizjologicznego komórek przez dobór zasilania
i składu podłoża zasilającego hodowlę
4. Jednorodność fizyczna i chemiczna hodowli
5. Możliwość automatyzacji procesu
6. Większa szybkość i wydajność wielu procesów
7. Możliwość maksymalnego wykorzystania aparatury i jej równomiernego obciążenia

Wady:

1. Możliwość degeneracji szczepów lub pojawienia się niekorzystnych mutacji i opanowania
hodowli przez populacje komórek o pogorszonych właściwościach produkcyjnych
2. Trudności w utrzymaniu warunków aseptycznych procesu w bioreaktorze przez dłuższy
czas
3. Niekorzystny sposób rozwoju niektórych drobnoustrojów, tworzących układy
wielokomórkowe, skupiska w postaci kłaczków i kuleczek, obrastanie przewodów
4. Niekorzystna relacja pomiędzy wzrostem drobnoustrojów, a tworzeniem niektórych
produktów metabolizmu syntezowanych przez komórki nie rosnące


Porównanie profili wzrostu drobnoustrojów i produkcji antybiotyku w warunkach
hodowli okresowej i hodowli okresowej z zasilaniem


Podstawowe typy bioreaktorów do tlenowych procesów wgłębnych

A – bioreaktor z mieszadłem tarczowo-turbinowym i bełkotką; B – bioreaktor z mieszadłem aeratorem;
C – bioreaktor strumienicowy z pompą zewnętrzną i eżektorowym zasysaniem powietrza; D – bioreaktor
kolumnowy z bełkotką; E – bioreaktor kolumnowy z inżektorowym doprowadzeniem powietrza i rurą
cyrkulacyjną; F – bioreaktor z mieszadłem śmigłowym, dyszą doprowadzającą powietrze i rurą cyrkulacyjną
G – bioreaktor z hydrostatyczną cyrkulacją zewnętrzną


BIOREAKTORY

Bioreaktory przemysłowe Bioreaktor laboratoryjny


Bioreaktor
(1) korpus; (2) płaszcz; (3) izolacja; (4) zamocowanie;
(5) króciec do podawania inokulum; (6) króćce czujników
pH, temperatury i poziomu tlenu; (7) mieszadło;
(8) bełkotka; (9) uszczelka mechaniczna; (10) sprzęgło;
(11) napęd; (12) króciec odbioru produktu; (13) króćce
doprowadzenia czynnika chłodzącego do płaszcza;
(14) króciec do poboru próbki z podłączeniem do
przewodu dostarczającego parę; (15) wziernik boczny;
(16) króćce przewodów podawania czynników
regulujących pH oraz środków antypieniących;
(17) króciec wlotu powietrza; (18) pokrywa;
(19) króciec dopływu pożywki; (20) dysza wylotowa
gazów; (21) inne podłączenia; (22) mechaniczny
rozbijacz piany; (23) wziernik w pokrywie i podłączenie
do przewodu odprowadzającego parę; (24) dysza
z zaworem bezpieczeństwa.


Rodzaje mieszadeł mechanicznych stosowanych w biofermentorach:
a/ turbina Rushtona; b/ turbina z łopatkami wklęsłymi;
c/ turbina hydropłatowa; d/ turbina typu śruby okrętowej


PROBLEMY ZWIĄZANE Z PIENIENIEM

1. Wzrost heterogeniczności środowiska spowodowany wynoszeniem
stałych części podłoża i komórek wraz z pianą i osadzaniem ich na
ścianach lub innych elementach bioreaktora
2. Utrudnienie lub wręcz uniemożliwienie kontroli stężenia składników
podłoża oraz objętości hodowli, co jest szczególnie niekorzystne
w przypadku procesu ciągłego
3. Zagrożenie wypienienia hodowli z bioreaktora oraz możliwość jego
zainfekowania obcą mikroflorą przez zawilgocony pianą układ wentylacyjny
4. Obniżenie pojemności użytkowej bioreaktora o 30-50%
5. Konieczność stosowania oprzyrządowania przeciwdziałającego pienieniu,
co podraża proces
6. Możliwość przechodzenia śladowych ilości substancji przeciwpianowych
do produktów
7. Możliwość pogarszania się warunków natlenienia na skutek wprowadzania
środków przeciwpianowych
8. Możliwość niekorzystnego wpływu środków przeciwpianowych
na morfologię i fizjologię drobnoustrojów


Urządzenia do mechanicznego rozbijania piany

A – dysk szybkoobrotowy (1 – wylot powietrza, 2 – doprowadzenie chemicznego środka
przeciwpianowego); B – mieszadło łapowe pomiędzy dwoma dyskami; C – fundafom CHEMAP
(1 – zasysanie piany, 2 – wylot powietrza, 3 – wyrzut cieczy); D –cyklon (1 – pompa, 2 - wylot
powietrza)


Rozwiązania techniczne bioreaktora typu air-lift

Kontrola procesów biotechnologicznych
Wielkości fizyczne mierzone w bioreaktorach

Temperatura czujniki opornościowe, termistory, termopary
Natężenie przepływu powietrza kryzy pomiarowe, rotametry
Natężenie przepływu cieczy j.w., przepływomierze łopatkowe
Poziom cieczy czujniki pojemnościowe, oporowe
Poziom piany czujniki pojemnościowe
Ciśnienie przetworniki membranowe
Szybkość obrotów mieszadła czujniki elektryczne lub optyczne
Lepkość płynu reometry śrubowe, rotacyjne

Wielkości chemiczne mierzone w bioreaktorach

Stężenie rozpuszczonego tlenu elektrody polarograficzne lub galwaniczne
pH elektrody pH-metryczne
Potencjał redoks elektrody platynowe
Stężenie tlenu w gazach analizatory paramagnetyczne
Stężenie CO2 w gazach analizatory IR
Gęstość biomasy czujniki nefelometryczne, fluorymetryczne
Stężenie cukrów elektrody enzymatyczne
Skład roztworu elektrody jonoselektywne, enzymatyczne

Schemat dodatkowych urządzeń kontrolnych bioreaktora

biomasa – czujnik optyczny
fluorescencja - czujnik
fluorescencyjny
piana – detektor piany
FFF – rozdzielanie w polu
przepływu
FIA – iniekcyjny analizator
przepływu
GC- chromatograf gazowy
HPLC – wysokosprawny
chromatograf cieczowy
MS – spektrometr mas
redoks – czujnik potencjału
redoks
W – masa
∆T – różnica temperatury
między zawiesiną hodowlaną
i płaszczem wodnym

Schemat układu pomiarowego i sterującego bioreaktora

Standardowe zmienne bioprocesowe
F – objętościowe natężenie przepływu
zasilania; p – ciśnienie; pH – wartość pH
cieczy; pO2 – prężność cząstkowa tlenu
rozpuszczonego; P – moc pobierana
napędu mieszadła; rpm – częstotliwość
obrotów mieszadła; T – temperatura
cieczy; vvm- szybkość napowietrzania;
VL – objętość cieczy; W – masa reaktora


Schematy wybranych bioreaktorów do procesów z biokatalizatorami
immobilizowanymi

A – kolumna ze złożem upakowanym; B – kolumna ze złożem zraszanym; C – kolumna ze złożem fluidalnym;
D – bioreaktor z mieszadłem mechanicznym; E – bioreaktor z wkładami unieruchomionego biokatalizatora;
F – bioreaktor z krzyżowym przepływem fazy ciekłej i gazowej; G – bioreaktor rurowy z wkładami (włóknami)
z materiału półprzepuszczalnego


Sposoby sterylizacji

- jałowienie termiczne parą wodną – podłoża, biofermentory, rury, zawory

-- sterylizacja chemiczna lub fizyczna (tlenek etylenu, lizol, chloraminy, UV)
pomieszczenia

- sterylizacja przez filtrację (filtry membranowe) – powietrze, tlen


Metody wyjaławiania podłoża

A – okresowa; B- ciągła przeponowa, wymienniki płytowe; C – ciągła bezprzeponowa
1- inżektor parowy, 2 – rura sterylizacyjna, 3 – komora „próżniowa”


Sterylizacja podłoża z użyciem wymienników spiralnych


Instalacja do sterylizacji gazów odlotowych


Schemat postępowania podczas przygotowania
materiału posiewowego do procesu biosyntezy


Przemysłowymi producentami antybiotyków są szczepy wysokowydajne

Cechy szczepu wysokowydajnego

maksymalna wydajność pożądanego produktu

minimalizacja wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych

stabilność genetyczna

odporność na zakażenia wirusowe

Przykład wyniku optymalizacji szczepu:
Penicillium chrysogenum wytwarzający Penicylinę G

oryginalny szczep producencki 0.1 mg/ml
- szczep zoptymalizowany 30 mg/ml


Schemat namnażania inokulum do procesu biosyntezy

Namnażanie zaszczepki

Dane dotyczą wytwarzania sagamycyny przez Micromonospora sagamiensis


Trójstopniowa instalacja przemysłowa do namnażania
zaszczepki


Parametry przykładowego procesu fermentacyjnego


Porównanie składów pożywek dla fazy wzrostu i fazy produkcyjnej

Zaszczepka w kolbie Biofermentor produkcyjny

Glukoza 3–5% Glukoza 0,5 – 0,8 %
WNK 3 – 5% Skrobia 3 – 5%
Węglan wapnia 0,5 – 1 % WNK 5 – 8%
Fosforan 0,1 – 0,5% Mąka sojowa 1 – 5%
Siarczan amonu 0,1 – 1,0% Siarczan amonu 0,5 – 1%
Mocznik 0,1 – 0,5% + uzup. periodyczne
Olej roślinny 0,1 – 0,5% Fosforan 0,1 – 1,0%
Olej roślinny 1% + uzup. stałe
Syrop kukurydziany zasilanie stałe

Różnice warunków hodowli w kolbie i w fermentorze
Hodowla w kolbie Hodowla w biofermentorze

10 – 50 ml w kolbie 100 - 500 ml objętości 10 – 100 000 litrów

tylko hodowla okresowa hodowle okresowe, okresowe z
zasilaniem, chemostat, ciągłe

możliwość kontroli T, brak kontroli O2 kontrola temperatury, pH, poziomu O2

wysokie początkowe stężenia możliwość stopniowanego dodawania
substratów, prekursorów, induktorów

ciśnienie normalne możliwe nadciśnienie do 2 atn

utrudnione pobieranie próbek łatwość pobierania próbek

zmniejszanie objętości hodowli możliwość zwiększania objętości

wzrost drobnoustrojów na ściankach wzrost jednorodny

brak problemów z pienieniem konieczność stosowania antypieniaczy


Budowa aseptycznej jednostki pracy
I – obszar niesterylny; II – obszar czysty;
Sterylne stanowisko pracy z zastosowaniem III – obszar sterylny
laminarnego przepływu powietrza ak – autoklaw w ścianie z podwójnymi
1 – komora; 2 – filtr wstępny; 3 – filtr HEPA drzwiami jako śluza materiałowa
4 – wentylator; 5 – regulacja tyrystorowa; szare prostokąty – śluzy powietrzne
6 - wskaźniki


OBRÓBKA POPRODUKCYJNA – DOWNSTREAM PROCESSING
Fermentacja

brzeczka
pofermentacyjna
Dezintegracja

Separacja
ciecz/składniki nierozpuszczalne

roztwór osad

Zatężenie

produkt surowy zagospodarowanie
ciecz
odpadów
Oczyszczanie

produkt oczyszczony
odpady

Formulacja

produkt w formie ostatecznej



0,25 – 5 obr/min

powierzchnia
filtracji
2 – 10 m2

Obrotowy filtr bębnowy próżniowy – rotary drum vacuum filter


Prasa filtracyjna

Powierzchnia filtracyjna
od 100 do 15 000 cm2 na płytę


Wirówki wykorzystywane
w przemysłowych procesach
separacji zawiesin pofermentacyjnych

a) kalander rurowy

b) c) wirówka talerzowa;
30 – 200 talerzy pod kątem około 40°

d) wirówka ślimakowa
do bardzo gęstych zawiesin


Przemysłowe metody dezintegracji komórek

A. Metody mechaniczne
1. Poddawanie działaniu wysokiego ciśnienia
2. Ucieranie (młyny kulowe)
3. Mikrofluidyzacja

B. Metody niemechaniczne

1. Suszenie/zawieszanie w roztworze
2. Szok osmotyczny
3. Szok termiczny
4. Traktowanie rozpuszczalnikami organicznymi lub surfaktantami
5. Zastosowanie enzymów litycznych


Przemysłowe metody zagęszczania roztworów

1. Odparowywanie, w tym: odparowywanie ze spływającą warstwą,
odparowywanie płytowe
2. Ekstrakcja ciecz/ciecz
- prosta
- dysocjatywna
- reakcyjna
3. Wytrącanie
- frakcjonowanie siarczanem amonu
- wytrącanie powinowactwa
- immunoprecypitacja
3. Adsorpcja
- na węglu aktywnym
- na żywicach jonowymiennych
- na adsorbentach hydrofobowych
metoda złoża fluidalnego w kolumnie – proces ciągły


Ekstrakcja płynem w stanie nadkrytycznym

Diagram fazowy pojedynczej substancji
Pc – ciśnienie krytyczne; Tc – temperatura krytyczna


Zestaw do ultrafiltracji spiralnej


Zasada działania hollow fibre filtration


Przemysłowe techniki chromatograficzne

Stosowane głównie dla oczyszczania białek i DNA

Techniki:

- Chromatografia rozmiarów wykluczających (Sephadex, Sepharose)
- Chromatografia jonowymienna (DEAE-, Q-, CM-, S)
- Chromatografia hydrofobowa (Phenyl-Sepharose)
- Chromatografia adsorpcyjna (hydroksyapatyt)
- Chromatografia powinowactwa


Metody formulacji produktu
Liofilizatory
- krystalizacja
- suszenie
- liofilizacja

Suszarka z wymuszonym obiegiem powietrza

Wyklad 3

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Viewers also liked

Viewers also liked (6)

Similar to Wyklad 3

Similar to Wyklad 3 (7)

More from marwron

More from marwron (20)

Wyklad 3