Wyklad 10

Wykład 10 – Wytwarzanie i zastosowanie leków opartych na kwasach nukleinowych
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Kwasy nukleinowe
1. Polikondensaty zbudowane z nukleotydów
2. Dwa rodzaje: DNA i RNA
3. Trzy formy RNA: mRNA, tRNA i rRNA
4. DNA i mRNA są nośnikami informacji genetycznej
5. Cząsteczki labilne; ulegają denaturacji przy ogrzewaniu;
RNA podatne na hydrolizę alkaliczną
Struktura ogólna nukleotydu

Wiązania fosfodiestrowe
w DNA lub RNA

Zasady purynowe i pirymidynowe
występujące w DNA i/lub RNA


Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych

Struktury przestrzenne RNA: z lewej – mRNA; z prawej - a) tRNA;
b) rybozym hammerhead; c) Intron z mRNA

Model Watsona-Cricka struktury DNA


Kierunek przepływu informacji genetycznej


Możliwości zastosowania kwasów nukleinowych jako leków

1. Wprowadzenie stosunkowo krótkiego fragmentu kwasu nukleinowego
w celu zablokowania ekspresji konkretnego genu.

strategia antysensu

Zadaniem wprowadzonego preparatu (RNA lub DNA) jest hybrydyzacja
do specyficznego odcinka mRNA będącego celem molekularnym, zablokowanie
jego ekspresji i/lub indukcja procesu unieczynnienia. Preparaty otrzymywane
na drodze syntezy chemicznej (ON) lub biologicznej i są na ogół zmodyfikowane.

2. Wprowadzenie kwasu nukleinowego jako kompletnego genu
w celu wywołania jego ekspresji.

terapia genowa (somatyczna, mitochondrialna)
DNA-szczepionki

Substancja czynna w formie plazmidu DNA zawierającego kompletną
sekwencję genu kodującego biologicznie czynne białko. Preparaty
otrzymywane na drodze biosyntezy.


Porównanie rodzajów strategii antysensowych


Strategie antysensowe – preparaty ON otrzymywane na drodze syntezy

Miejsca chemicznej modyfikacji oligorybonukleotydów


Strategie antysensowe – preparaty ON DMTrO
O
Z DMTrO
O
Z

otrzymywane na drodze syntezy
O O
P P O
DMTrO Z Z R'O N
O HO O Z
O R'' R''' O

O O O
Sekwencja reakcji:
1. Przyłączanie 3’-fosforoamidynowych pochodnych [S]
nukleozydów z grupą 5’OH ochronioną grupą DMTr do wolnej
grupy 5’OH nośnika lub poprzedniego nukleotydu.
DMTrO Z
2. Pozostające wolne grupy 5’OH blokuje się poprzez acetylację. O

3. Po zsyntezowaniu łańcucha ON - sulfuryzacja
O
-
O P S
Produkt końcowy: mieszanina ON o długości n (produkt
O Z
dominujący), n-1, n-2, itd.. O

Z –zasada azotowa O
DMTr – 4,4’-dimetoksytrytyl
Schemat syntezy ON na nośniku stałym


Pożądane cechy ON:

- długość 17 – 21 nukleotydów
- sekwencja komplementarna do specyficznej
sekwencji celu molekularnego
- unikanie sekwencji: tworzących niepożądane
struktury II-rzędowe, tworzących G-kwartety,
motywów CpG
- odporność na działanie nukleaz
- zdolność do indukowania działania RNazy H
- brak efektów ubocznych

Zalety Wady
I generacja Oporność na działanie nukleaz Generowanie chiralności
Aktywacja RNazy H Wiązanie z białkami/toksyczność
II generacja Mniejsza toksyczność Brak aktywacji RNazy H
Brak problemów stereochemicznych
Gapmery ON chimeryczne (środek PS, na końcach
OMe lub MOE)
III generacja
PNA Niewielka toksyczność Brak indukcji RNazy H
Problemy z rozpuszczalnością
LNA Duża odporność na działanie nukleaz
Wysokie powinowactwo do mRNA


Strategie antysensowe – peptydowe kwasy nukleinowe


Strategie antysensowe – rybozymy i deoksyrybozymy

Modele struktur II-rzędowych rybozymu Model struktury przestrzennej
„hammerhead” i deoksyrybozymu rybozymu „hammerhead”


Antysensowe oligonukleotydy zaaprobowane do badań klinicznych

Produkt Firma Target (mRNA) Choroba Typ Status
Vitravene ISIS PS Akcept
(Fomivirsen) Pharmaceuticals CMV IE2 CMV retinopatia DNA .
Affinitac PS Faza
(ISIS 3521) ISIS PKC- Nowotwór DNA III
PS Faza
Genasense Genta Bcl2 Nowotwór DNA III
Łuszczyca, Choroba
Alicaforsen Crohna, Wrzodziejące PS Faza
(ISIS 2302) ISIS ICAM-1 zapalenie jelit DNA II/III
Żóltaczka zakaźna typu PS
ISIS 14803 ISIS antywirusowy C DNA Faza II
PS
ISIS 2503 ISIS H-ras Nowotwór DNA Faza II
DNA PS
MG98 Methylgene metylotransferaza Nowotwory lite DNA Faza II
EpiGenesis Receptor PS
EPI-2010 Pharmaceuticals adenozyny A1 Astma DNA Faza II
Reduktaza
Lorus rybonukleotydow PS
GTI 2040 Therapeutics a (R2) Nowotwór DNA Faza II
Reumatoidalne
zapalenie stawów, II
ISIS 104838 ISIS TNF Łuszczyca gener. Faza II
AVI III Faza
Avi4126 BioPharma c-myc Nowotwory, gener. I/II
II Faza
Gem231 Hybridon PKA RI Nowotwory lite gener. I/II
II
Gem92 Hybridon HIV gag AIDS gener. Faza I
Reduktaza
Lorus rybonukleotydow PS
GTI 2051 Therapeutics a (R1) Nowotwory DNA Faza I

Wykład 9 – Biotechnologie otrzymywania enzymów i białek terapeutycznych

Terapia genowa
Rodzaje terapii genowej: somatyczna, mitochondrialna
Techniki somatycznej terapii genowej

Substytucja – wprowadzenie genu, którego brak w organizmie chorym, a występuje w zdrowym
Addycja – wprowadzany gen nie występuje także w organizmie zdrowym


Stany patologiczne/chorobowe, które mogą być leczone terapią genową
Defekty genetyczne Choroby nabyte
Niedobory metaboliczne

Deficyt enzymów cyklu mocznikowego Choroby infekcyjne
Fenyloketonuria
Choroba Gauchera AIDS
Wirusowe zapalenia wątroby typu B i C
Hemoglobinopatie
Choroby neurologiczne
Anemia sierpowata
Thalasemia Choroba Parkinsona

Zaburzenia krzepliwości krwi Choroba Alzheimera
i inne neurodegradacyjne
Hemofilia A i B
Choroby układu sercowo-naczyniowego
Choroby płuc
Arterioskleroza
Zwłóknienie torbielowate (mukowiscydoza) Choroby naczyń obwodowych
Deficyt alfa-1 antytrypsyny Choroba wieńcowa

Choroby układu sercowo-naczyniowego Nowotwory

Rodzinna hipercholesterolemia różne typy


Terapia genowa nowotworów

1. Odwrócenie fenotypu nowotworowego poprzez kontrolę ekspresji onkogenów
lub wstawienie genów supesorowych
Zahamowanie ekspresji uszkodzonych genów tworzących szlak mutacyjny lub zastąpienie
zmutowanego genu jego prawidłowo działającym odpowiednikiem. Stosowanie technologii
siRNA

2. Poprawę odpowiedzi przeciwnowotworowej gospodarza przez uczynienie komórek
nowotworowych bardziej immunogennymi
TIL- T-cell infiltrating lymphocytes (limfocyty naciekające nowotwór). Wprowadzanie genów
kodujących antygeny nowotworu (czerniak, gen HLA-B7). Geny kodujące cytokiny

3. Zniszczenie komórek nowotworowych za pomocą wprowadzenia genów kodujących
białka aktywujące proleki przeciwnowotworowe

4. Ochrona zdrowych tkanek narażonych na działanie czynników cytotoksycznych,
chemoterapii lub radioterapii
Komórki szpiku – geny kodujące białka MDR

5. Wpływ na proces angiogenezy guza
Geny kodujące czynniki antyangiogenne,
w tym przeciwciała anty VEGF, FGF


Problem wprowadzenia DNA do tkanek (komórek)

- DNA jest dużą cząsteczką o charakterze polianionowym,
bardzo słabo przechodzącą przez błony biologiczne;

-„nagie” DNA jest podatne na działanie nukleaz

-DNA tworzy struktury supehelikalne


• Wirusowe: • Niewirusowe:

- retrowirusy - „nagi” DNA
- lentiwirusy
- adenowirusy - liposomy kationowe
- wirusy opryszczki
- wirusy towarzyszące - związki polikationowe
adenowirusom AAV


Nośniki niewirusowe

• Składają się z syntetycznych związków chemicznych lub wysoko oczyszczonych
substancji pochodzenia naturalnego;

• nie ma tu ryzyka aktywacji onkogenów;

• mniejsza wydajność transferu związana z ujemnym ładunkiem plazmidowego DNA i jego
wielkością – potrzebna kondensacja w cząsteczkach nośnika.


Nośniki liposomowe
• Lipidy i liposomy – cząsteczki amfifilowe tworzą biwarstwę
lipidową zbudowaną z lipidów kationowych i neutralnych,
zwróconych do siebie częściami hydrofobowymi;
• do wnętrza wprowadzany
jest skondensowany DNA;
• nośnik wprowadzany
do komórek na drodze
endocytozy.


Somatyczna terapia genowa – nośniki polikationowe


Wektory wirusowe

• Wykorzystanie naturalnej zdolności wirusów do wprowadzania DNA lub
RNA do komórek ssaczych;
• konstruowane za pomocą metod inżynierii genetycznej/biologii
molekularnej;
• plazmidowy wektor i komórki pakujące;
• całość lub część genów jest usuwana –geny odpowiadające za
replikację i kodujące białka otoczki wirusa;
• na ich miejsce wprowadzany jest gen terapeutyczny zwany transgenem.

ETAPY PROCESU PRODUKCYJNEGO EFEKTY

Przedmiot: Podstawy Biotechnologii coli
Fermentacja okresowa E. Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
ETAPY PROCESU PRODUKCYJNEGO EFEKTY

Oddzielenie komórek
Fermentacja okresowa E. coli Zmniejszenie objętości
(separator)
Ogólny schemat
Usunięcie: Ogólny schemat
Oddzielenie komórek Zmniejszenie objętości
procesu produkcyjnego
(separator)
Liza alkaliczna Fragmenty błon komórkowych, procesu produkcyjnego
(NaOH/SDS) Usunięcie:
białka, genomowe DNA otrzymywania
Strącanie octanem potasu otrzymywania
Liza alkaliczna Fragmenty błon komórkowych,
terapeutycznego
(NaOH/SDS)
Strącanie octanem potasu
białka, genomowe DNA
terapeutycznego
Oczyszczanie – klarowanie plazmidowego DNA
(filtracja/wirowanie) Osad plazmidowego DNA
Oczyszczanie – klarowanie
(filtracja/wirowanie) Osad
RNA
Chromatografia Białka
anionowymienna Endotoksyny
RNA
Chromatografia Białka
anionowymienna Endotoksyny

Strącanie Białka
izopropanolem
Strącanie Białka
izopropanolem

Filtracja na żelu/ Genomowe DNA
Filtracja na żelu/ Genomowe DNA
RNA
Chromatografia faz RNA
Chromatografia faz Endotoksyny
odwróconych Endotoksyny
„open circle” plazmid
odwróconych „open circle” plazmid

Nadanie postaci leku
Nadanie postaci leku


Terapeutyczne plazmidowe DNA; typowe specyfikacje procedury zwalniającej

Test Specyfikacja

Wygląd przejrzysty, bezbarwny roztwór

Wielkość, miejsce cięcia zgodność z mapą plazmidu (elektroforeza
restrykcyjnego w żelu agarozowym, analiza restrykcyjna)

Kolisty plazmid DNA (forma CCC) >95% (elektroforeza w żelu agar., HPLC)

DNA, E. coli <0,02 µg/µg plazmidowego DNA (Southern blot)

Białko niewykrywalne (oznaczenie metodą BCA)

RNA niewykrywalne (elektroforeza w żelu agar.)

Endotoksyna <0,1 EU/µg plazmidowego DNA (LAL)

Sterylność brak wzrostu po 14 dniach (USP)

Specyficzna aktywność Odpowiada standardowi referencyjnemu

Wyklad 10

Recommended

Recommended

More Related Content

Viewers also liked

Viewers also liked (19)

Wyklad 10