Wyklad 2

Wykład 2 – Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych
Przedmiot: Podstawy Biotechnologii Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna
TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Komórka i jej składniki
1


Najważniejsze rodzaje komórek stosowanych w biotechnologii
przemysłowej
Komórki prokariotyczne:

1. Bakterie gramdodatnie i gramujemne producenci kwasów, alkoholi,
aminokwasów, białek
- w tym promieniowce producenci antybiotyków

Komórki eukariotyczne

2. Grzyby

drożdże producenci etanolu i białek

grzyby pleśniowe producenci białek i antybiotyków,
i niektórych związków prostych

3. Komórki zwierzęce
- komórki owadzie, CHO, BHK producenci białek


Komórki bakteryjne

Morfologia komórek bakteryjnych


Prokariotyczna komórka bakteryjna


Skład i funkcja biologiczna elementów komórki prokariotycznej
Składnik Skład molekularny Funkcja biologiczna
Ściana komórkowa, Polisacharydy usieciowane
Ochrona przed stresem
wici i rzęski peptydami, otoczone
osmotycznym i mechanicznym,
lipopolisacharydami
Ruch (wici), adhezja i koniugacja
(rzęski)

Błona komórkowa, Biwarstwa lipidowo (40%)
Selektywnie przepuszczalna bariera
mezosom -białkowa (60%); mezosom
umożliwiająca transport składników
to wpuklenie błony
pokarmowych i metabolitów

Obszar jądrowy Zawiera chromatynę
Genom. Miejsce przechowywania
-kompleks DNA i białek
i powielania informacji genetycznej
histonowych

Rybosomy Kompleksy RNA (65%)
Miejsce biosyntezy białek
i białek (35%)

Cytoplazma Małe cząsteczki, białka
Miejsce zachodzenia większości
rozpuszczalne, enzymy,
reakcji metabolicznych
sole nieorganiczne

Przedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Komórki bakteryjne są otoczone ścianą komórkową

Uproszczone struktury osłon zewnętrznych komórek bakteryjnych

Bakteryjna ściana komórkowa i jej biosynteza
to miejsca działania ważnych antybiotyków

Antybiotyki beta-laktamowe

Wankomycyna
Peptydoglikan
Liza komórki bakteryjnej


Promieniowce (Actinomycetales)


Eukariotyczna komórka zwierzęca


Eukariotyczna komórka roślinna


Skład i funkcja biologiczna organeli komórki eukariotycznej
Organela Skład molekularny Funkcja biologiczna
Błona komórkowa Biwarstwa lipidowo (50%) Selektywna bariera transportowa;
-białkowa (50%); komunikacja międzykomórkowa

Jądro Zawiera chromatynę -kompleks DNA Miejsce przechowywania i powielania
i białek histonowych + RNA informacji genetycznej i transkrypcji

Siateczka środplazmatyczna Zespoły błon lipidowo-białkowych Miejsce biosyntezy białek
z rybosomami + rybosomy
Miejsce wydzielania „odpadów”
Aparat Golgiego j.w. + polisacharydy komórkowych i obróbki białek

Mitochondria Otoczone podwójną błoną, Miejsce części reakcji katabolicznych
zawierają enzymy, DNA i RNA i syntezy ATP

Lizosomy (zwierzęta) Pęcherzyki zawierające enzymy Metabolizm materiałów pobranych
hydrolityczne na drodze endocytozy
Peroksysomy (zw.) Pęcherzyki zawierające katalazę Miejsce reakcji katabolicznych,
lub glioksysomy (rośliny) i inne enzymy utleniające w których powstaje H2O2

Chloroplasty (rośliny) Otoczone podwójną błoną, Miejsce fotosyntezy
zawierają białka, lipidy, chlorofil,
RNA, DNA i rybosomy

Cytoplazma Małe cząsteczki, białka Miejsce zachodzenia większości
rozpuszczalne, enzymy, reakcji metabolicznych oraz struktura
sole nieorganiczne, cytoskeleton nadająca kształt komórce


Jądro komórkowe

Obraz komórek HeLa z jądrami
komórkowymi zaznaczonymi
barwnikiem Hoechst


Mitochondrium

Obraz w mikroskopie elektronowym
mitochondriów komórek pęcherzyków
płucnych


Siateczka śródplazmatyczna – retikulum endoplazmatyczne

Obraz w mikroskopie elektronowym
1- jądro; 2 – por jądrowy; retikulum endoplazmatycznego
3 – szorstkie RE; 4 – gładkie RE;
5 – rybosom; 6 – białko transportowane
w RE; 7 – pęcherzyk transportowy;
8 – aparat Golgiego (AG); 9 – strona
cis AG; 10 – strona trans AG;
11 – cysterna AG


Rybosomy

Rybosomy prokariotyczne: 30S + 50S → 70S
Rybosomy eukariotyczne: 40S + 60S → 80S

Wizualizacja struktury rybosomu Katalityczny rdzeń rybosomu
zbudowany jestrybosomu
Struktura z rRNA


Grzyby w biotechnologii

Grzyby są organizmami heterotroficznymi – pasożyty lub saprofity

Przykłady ról grzybów w środowisku:

- dekompozycja martwej tkanki biologicznej (np. degradacja składników
drewna)
- czynniki chorobotwórcze – rośliny (ponad 5 000 chorób), zwierzęta
- Mycorrhizae – symbioza z korzeniami roślin

W biotechnologii - procesy fermentacyjne,
wytwarzanie antybiotyków
producenci białek terapeutycznych


Drożdże

Obraz komórek
drożdży w skaningowym
Budowa komórki drożdżowej mikroskopie elektronowym

Morfologia drożdży


chityna

mannoproteiny

Struktura grzybowej ściany komórkowej

Przedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNA
GRZYBY
Zygomycetes – grzyby pleśniowe,
sprzężniaki
Grzybnia zbudowana z niepodzielnego mycelium.
Rozmnażanie płciowe poprzez zarodniki zwane
zygosporami lub bezpłciowe poprzez spory
w sporangium.

Mucor racemous

Aspergillus fumigatus

Ascomycetes – workowce
Grzyby jednokomórkowe lub tworzące grzybnię
w postaci podzielnych strzępek.
Rozmnażanie płciowe poprzez askospory
lub bezpłciowe przez konidia. Do tej klasy należą
m.in. Neurospra, Penicillium.
Penicillium chrysogenum

Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA
Basidomycetes – podstawczaki
Grzyby jednokomórkowe lub rozgałęzione.
Rozmnażanie płciowe poprzez basidospory
lub bezpłciowe poprzez konidia. Do tej klasy
należą grzyby kapeluszowe.

Amanita phalloides

Deuteromycetes – grzyby niedoskonałe
Grzyby jednokomórkowe lub rozgałęzione.
Cecha charakterystyczna – brak rozmnażania
płciowego.

Candida albicans


Grzyby pleśniowe

Aspergillus nidulans

Grzyby - rozmnażanie


Drobnoustroje jako biologiczne źródło nowych potencjalnych leków
Drobnoustroje prokariotyczne i eukariotyczne wytwarzają olbrzymią
ilość małocząsteczkowych metabolitów wtórnych, z których wiele
wykazuje selektywną toksyczność wobec innych drobnoustrojów
(antybiotyki przeciwdrobnoustrojowe), działanie przeciwnowotworowe
(antybiotyki przeciwnowotworowe), ale także obniżające ciśnienie,
hamujące biosyntezę cholesterolu, o działaniu przeciwbólowym,
immunosupresyjnym i innym.

- wyizolowano i opisano około 20 000 metabolitów wtórnych;
- połowa z nich działa antybiotycznie lub cytostatycznie
- zastosowanie medyczne – około 150

Potencjalne dalsze możliwości:
- z 40 000 gatunków bakterii poznano około 5 000
- z 1,5 mln gatunków grzybów poznano około 70 000
- bardzo słabo poznane: drobnoustroje morskie, ekstremofilne


Biofarmaceutyki białkowe

Systemy ekspresyjne:
Komórki ludzkie – gen zmodyfikowany w obszarze promotora
CHO – Chinese hamster ovary (komórki jajnika chomika
chińskiego)
BHK – baby hamster kidney (komórki nerki chomika)
Komórki owadzie, gen włączony w genom baculowirusa
Autographa californica
Drożdże – S. cerevisiae, Pichia pastoris
Bakterie – E. coli, Bacillus spp.
Transgeniczne rośliny i zwierzęta


The purpose of micro-organism is....

...to make another micro-organism

Cel procesu biotechnologicznego:
1) jak najwięcej komórek drobnoustrojów
w jak najkrótszym czasie...
lub
2) jak najwięcej pożądanego produktu

Przypadek 2) sprzeczny z życiowym celem drobnoustroju

Przedmiot: Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna

Metabolizm = anabolizm + katabolizm

Procesy anaboliczne – endoergiczne i redukcyjne
Procesy kataboliczne – egzoergiczne i utleniające


Bilans masowy utleniania glukozy w warunkach tlenowych i beztlenowych


Metabolizm
kluczowe cząsteczki

A + B + ATP → AB + ADP + Pi
A + B + ATP → AB + AMP + PPi

A + ATP → A-P + ADP


Etapy katabolizmu


Katabolizm

Główne szlaki kataboliczne jako źródła prekursorów
dla biosyntezy składników biomakromolekuł


W warunkach beztlenowych
w mięśniu pirogronian jest
przekształcany w mleczan

Obecność dodatkowej reakcji umożliwia
regenerację NAD+
Cykl Corich
Mleczan powstający w pracującym mięśniu
ulega w wątrobie przekształceniu w glukozę


Przekształcenie pirogronianu w etanol w komórkach drożdży
w warunkach fermentacji alkoholowej


Produkty metabolizmu beztlenowego w różnych drobnoustrojach
Reakcje prowadzące do odtworzenia NADH są zaznaczone jako R


Regulacja metabolizmu drobnoustrojów

Zasady podstawowe

1. Równowaga pomiędzy procesami wytwarzającymi
i zużywającymi metabolity pośrednie

2. Energetyczne sprzężenie metabolizmu – bilansowanie
zysku reakcji katabolicznych z sumą potrzeb energetycznych
komórki


Etapy ekspresji genu


Regulacja ekspresji genu przez białka regulatorowe


Główne mechanizmy regulacji transkrypcji genów
kodujących enzymy metabolizmu podstawowego

Katabolizm:
indukcja substratowa
Substrat lub jego metabolit działa jako induktor lub efektor pozytywny
aktywatora. Regulacja dotyczy szlaku katabolizmu danego substratu
-represja kataboliczna
Łatwiej przyswajalne źródło węgla lub efektor syntezowany w komórce w jego
obecności działa jako korepresor lub efektor negatywny aktywatora.
Regulacja dotyczy szlaku katabolizmu trudniej przyswajalnego źródła węgla
-represja azotowa
j.w., ale dotyczy szlaku przyswajania źródła azotu. Dotyczy także białek
transportowych

Anabolizm:
- represja końcowym produktem szlaku
końcowy produkt szlaku działa jako korepresor lub efektor negatywny
aktywatora. Dotyczy szlaku biosyntezy
-atenuacja
mechanizm specyficzny dla drobnoustrojów prokariotycznych


Diauksja – dwufazowość wzrostu drobnoustrojów
w obecności dwóch źródeł węgla

Produkcja penicyliny przez Penicillum chrysogenum


Inne mechanizmy regulacji metabolizmu podstawowego

Regulacja aktywności enzymów

1. Enzymy regulatorowe – regulacja allosteryczna

2. Kowalencyjna modyfikacja enzymów

3. Kompleksy wieloenzymowe

Regulacja transportu metabolitów

1. Transport białek przez błony

2. Regulacja ilości i aktywności białek transportowych
(permeaz)


Grupy specyficznych produktów metabolizmu drobnoustrojów

alkaloidy fenazyny pirydyny
aminocukry flawonoidy pirole
aminoglikozydy fosfoglikolipidy pirony
aminokwasy ftalaldehydy poliacetyleny
antocyjaniny glikozydy polieny
ansamycyny hydroksyloaminy polietery
antrachinony laktony polikwasy
antracykliny makrolidy polipeptydy
chinoliny naftochinony polisacharydy
chinolinony nitryle salicylany
chinony nukleozydy steroidy
depsipeptydy peptydy tetracykliny

Przedmiot: Politechnika Gdańska, Inżynieria Biomedyczna

Przemiany peryferyjne a przemiany centralne


Idiolity są syntezowane w idiofazie


Koncepcje wyjaśniające przyczyny biosyntezy idiolitów
1. Uzyskanie przewagi w danym środowisku

2. Przystosowanie się do zmieniających się warunków
środowiska dzięki dodatkowym szlakom metabolicznym

3. Utrzymanie stanu równowagi ze otoczeniem, gdy normalny
wzrost nie jest możliwy

4. Wynik rozregulowania metabolizmu. Nadprodukcja idiolitów
rodzajem „wentyla” dla niezbilansowanych przemian

5. Obszar „wolnej gry” ewolucyjnej poza zakresem ścisłych
reguł selekcji eliminujących zmiany niekorzystne dla
organizmu. Niektóre z idiolitów znajdują w końcu
zastosowanie w metabolizmie producenta


Szlaki biosyntezy metabolitów wtórnych

1. Szlak poliketydowy
2. Polimeryzacja jednostek izoprenoidowych
3. Nierybosomalna synteza peptydów
4. Mieszana biosynteza poliketydów i peptydów
5. Biosynteza aminoglikozydów oraz amino- i peptydylonukleozydów

Fazy biosyntezy metabolitów wtórnych

1. Biosynteza i aktywacja prekursorów
2. Oligomeryzacja
3. Modyfikacja
4. Kondensacja składników
5. Modyfikacje końcowe
6. Ukierunkowany eksport


Szlak poliketydowy – biogeneza niektórych antybiotyków


Regulacja biosyntezy idiolitów

MECHANIZMY KONTROLI BIOSYNTEZY IDIOLITÓW

- indukcja substratowa;
- indukcja powodowana przez regulatory metaboliczne;
- represja i hamowanie kataboliczne;
- regulacja związkami azotu;
- regulacja fosforanowa i energetyczna;
- hamowanie w sprzężeniu zwrotnym – zarówno
przez metabolity podstawowe jak i specyficzne;
- regulacja z udziałem pierwiastków śladowych;
- regulacja tlenowa;
- regulacja innymi czynnikami, takimi jak temperatura lub pH



Indukcja substratowa

1. Biosynteza cefalosporyny C
w C. acremonium – obecność
w podłożu DL-cysteiny
lub DL-norleucyny
2. Biosynteza alkaloidów sporyszu
przez grzyby Clavicepsis
– DL-tryptofan

Warunek – induktor dodawany
w fazie wzrostu, a nie w fazie produkcji


Regulacja fosforanowa

Zasada ogólna – niskie stężenie fosforanu stymuluje biosyntezę idiolitów


Inżynieria metaboliczna szczepów przemysłowych

Producenci metabolitów pierwotnych:

- wprowadzenie zmian umożliwiających nadprodukcję
- maksymalizacja nadprodukcji
- zmiany umożliwiające pozakomórkowe wydzielanie produktu

Producenci metabolitów wtórnych:

- maksymalizacja wydajności produktu
- możliwość wytwarzania produktów innych niż naturalny


Cechy szczepu wysokowydajnego

maksymalna wydajność pożądanego produktu

minimalizacja wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych

stabilność genetyczna

odporność na zakażenia wirusowe


Klasyczne metody otrzymywania
i hodowli szczepów wysokowydajnych

nieukierunkowane zmiany genetyczne - mutageneza

wytwarzanie, fuzja i odnawianie protoplastów

optymalizacja warunków wzrostu


Mutanty szczególnie przydatne dla otrzymywania
wysokowydajnych producentów metabolitów pierwotnych

MUTANTY AUKSOTROFICZNE (ŻYWIENIOWE)

Komórki pozbawione aktywności co najmniej jednego
enzymu katalizującego reakcję szlaku biosyntetycznego

MUTANTY REGULATOROWE

-mutacja w genie regulatorowym lub w obszarze promotorowym
powodująca stałą derepresję biosyntezy;
-mutacja w genie strukturalnym, w efekcie której produkt genu
ma niezmienioną aktywność katalityczną, ale traci wrażliwość
na działanie inhibitora allosterycznego


Cel – uzyskanie nadprodukcji
związku G

Możliwość osiągnięcia celu:

Mutant auksotroficzny wobec związku F


Biosynteza kwasu cytrynowego

Cykl Krebsa


Nadprodukcja kwasu cytrynowego w Aspergillus niger
Aktywność fosfofruktokinazy I,
kluczowego enzymu regulatorowego
glikolizy jest hamowana przez ATP
i cytrynian

Efekt Pasteura

U drobnoustrojów względnie anaerobowych,
wydajność biomasy jest dużo większa w obecności tlenu,
który hamuje fermentację alkoholową.
Mechanizm: hamowanie glikolizy przez ATP i cytrynian

Efekt Crabtree

W hodowlach tlenowych następuje częściowe
hamowanie oddychania przy bardzo dużych
stężeniach glukozy


Nadprodukcja kwasu cytrynowego w Aspergillus niger

Droga alternatywna funkcjonuje w warunkach niskiego stężenia fosforanów
I silnego napowietrzania


Jakie warunki należy spełnić, aby możliwa była wysoko wydajna produkcja kwasu cytrynowego?

1. Wysoko wydajny szczep Aspergillus niger
- obecność alternatywnego łańcucha oddechowego
- mutant regulatorowy – PFK-I niewrażliwa na hamowanie przez cytrynian

2. Odpowiednie warunki hodowli
- skład pożywki: wysokie stężenie cukru; niskie stężenie jonów Fe(II) i Mn(II; niskie pH, około 2);
niskie stężenie fosforanów
- bardzo intensywne napowietrzanie


Hybrydyzacja – fuzja protoplastów

Przykłady zastosowania:

• Praktycznie wszystkie szczepy przemysłowe używane do produkcji
antybiotyków w wiodących firmach farmaceutycznych są rekombinantami
otrzymanymi w wyniku fuzji protoplastów;
• Szczepy zawierające wiele kopii genów odpowiedzialnych za biosyntezę
antybiotyku (np. Penicillium chrysogenum zaw. 20 zestawów genów
kodujących wytwarzanie penicyliny G);
• Fuzja protoplastów dwóch szczepów Cephalosporium acremonium
wytwarzających cefalosporynę C: wysokowydajnego, ale wolno rosnącego
i nie wytwarzającego spor oraz drugiego o cechach odwrotnych.
Rekombinant posiadał kombinację cech korzystnych; wydajność
o 40% lepsza niż wydajniejszy ze szczepów rodzicielskich.

Wyklad 2

Recommended

Recommended

More Related Content

Viewers also liked

Viewers also liked (6)

Similar to Wyklad 2

Similar to Wyklad 2 (20)

More from marwron

More from marwron (20)

Wyklad 2