GK-kisspeptin&cox-2

2. ü Genel Bilgiler
ü Çalışma Kapsamında
Yapılacaklar
ü İleri Hedefler

3. Çalışmanın Temel Hedefi
• Oosit maturasyon arres@ görülen IVF olgularında;
ü Kisspep@n
ü Kisspep@n Reseptörü (GPR54)
ü Siklooksijenaz 2
ekspressyon seviyelerinin tespi@ ve etkinliğinin gösterilmesi

4. Oosit Maturaston Arre@

5. • Fetal hayat
6. -7. haZa
10.000
8. haZa
600.000
16. – 20. haZa
6 milyon
28 . HaZa mitoz
durur
Hızlı Mitoz
Partum Öncesi
2 – 3 Milyon
Puberte
300.000
² Primordial germ hücreleri 5-6 haZa genital kabarbya göç eder.
“Oogonia “
GENEL BİLGİLER

6. Oosit Maturasyonu
(Puberteye kadar)
ü Mayoz I arrest – Germinal vezikül -
primer oosit
ü Mural Granüloza hücrelerinde
sentezlenen, Natriure;c pep;t
precursor ;p C (NPPC) ile cGMP
üre;mi
ü Gap junc@on aracılı oosite geçiş
ü cGMP – fosfodiesteraz 3A enziminin
cAMP hidrolizi inhibisyonu
ü Mayo;k arres;n korunması

7. Oosit Maturasyonu
(Puberte)
v Ovulasyon öncesindeki LH arbşı
yada hCG uygulanması
ü Foliküler cGMP seviyelerinde
düşme
ü Oosit – kumulus gap jun@on
kapanması
ü Oosit cAMP hidrolizi
ü “ GVBD “
ü Mayoz devamı
ü Ovulasyon ile Mayoz II arrest –
sekonder oosit ablımı

8. Oosit Maturasyonu Sinyal Yolakları
cGMP
PDE3 cAMP
PKA
CDC25B + WEE1B
CDK1+SiklinB1(MPF)
MATURASYON ARREST

9. IVF olgularında %8.6 - %15.2 en az bir mayo@k maturasyonu yetersiz oosit eldesi

10. GV arrest
MI arrest
MII arrest

11. ü Oosit maturasyon yetmezliği @p I: GV arrest
MPF ak@vasyonundan sorumlu uyarı kaskadında defektler
ü Oosit maturasyon yetmezliği @p 2: MI arrest
Kromozomlarda kondensasyon, metafaz iğcikleri oluşumu, kromozomların gruplaşması
ve sonrasında homolog kromozomların seperasyon ve segregasyon defektleri
ü Oosit maturasyon yetmezliği @p 3: MII arrest
Morfolojik maturite ve kapasite arasındaki bu uyuşmazlık
ü Oosit maturasyon yetmezliği @p 4: Mix arrest
Oosit Donasyonu & İn Vitro Maturasyon

12. ü Kisspep@n, maling melanoma hücrelerinde metastaz-baskılayıcı gen olarak keşfedilen KISS1
geninin ürünü olan pep@t
ü KISSPEPTIN (KISS-1)

13. Kisspep@n mul@-fonksiyonel bir pep@t

14. KISS1R (GPR54 ) reseptörünün fonksiyon kaybına yol açan mutasyonların:
ü Pubertal gelişme eksikliği
ü Üreme ak@vitelerinde kayıp
ü Hipogonadotropik hipogonadizm

15. ü Kp sistemik şekilde üreme
aksisinin ana düzenleyicisi

16. ü Kp, GnRH-gonadotrophin salgılayıcı en potansiyel araç

17. ü Gonadal gelişim,
ü Puberte başlangıçı
ü Fer@litenin korunması için
KP – GPR54 sinyal sistemi şart!

18. proestrus (P)
estrus (E)
metestrus (M)
diestrus (D)

21. ELISA Kp seviyesi
Foliküler sıvıda.
335±22.5 pgmL-1
Serum
25±,.2 pgmL-1, P<0.05).

26. ü SİKLOOKSİJENAZ (COX-2)
ü Prostaglandin endoperoksit sentaz – 2 (PTGS2)

28. PTGS2;
ü Preovulatuar prostaglandin sentezi
ü Kumulus ekspansiyonu
ü Foliküler Rüptür
LH – bağımlı PTGS-2
OVULASYON

31. Çalışma Hipotezi
ü Foliküler mikroçevrede ekspressyonu
saptanan Kisspep@n sinyal sisteminin, oosit
masturasyon basamaklarına bağımlı
siklooksijenaz -2 enzimi ile nega@f korelasyon
göstermektedir.

32. ÇALIŞMANIN AMACI
Matürasyonunu tamamlayamamış oositlerde;
ü Bu oositlerin metabolik ve hücresel etkileşim içerisinde bulunduğu kumulus
hücrelerinde, foliküler sıvılarında ve serum düzeyinde Kp ve reseptörü ile
Cox-2 (PTGS2) ekspresyon düzeylerinin tespiL
ü Kp ile Cox-2 ekspresyonları arasındaki korelasyonunun değerlendirilmesi

33. ÇALIŞMANIN AMACI
Foliküler Mikroçevre
ü Kumulus Hücreleri
ü Foliküler Sıvı
Oosit Maturasyonu
ü GV
ü MI
ü MII
Serum
Kisspep@n COX-2

34. ÇALIŞMA GRUPLARI
ÖRNEK (n=25 folikül)
Oosit Maturasyon
Arrest Olguları
KONTROL (n=25 folikül)
Matur Oosit Olguları
KISITLAMALAR
İnfer@lite etyolojisi düşük over rezervi, ağır endometriyozis, ağır
oligoastenoteratozoospermi ya da azospermi ve 39 yaş ve üzerinde
kadın hastalar

35. ü U.Ü.T.F. Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı Üreme
Sağlığı ve İnfer@lite Merkezi Polikliniği ve Ameliyathanesinde
ü U.Ü.T.F. Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı Üreme
Sağlığı ve İnfer@lite Merkezi Embriyoloji Laboratuvarında
ü U.Ü.T.F. Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı
Laboratuvarlarında
ü U.Ü.T.F. Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuvarlarında
Çalışma Kapsamında Yapılacaklar

36. U.Ü.T.F. Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı Üreme
Sağlığı ve İnfer@lite Merkezi Polikliniği ve Ameliyathanesinde
ü Ovaryan s@mülasyon protokolü
ü Folliküler gelişim sürecinin takibi
ü Follikül aspirasyonu

37. U.Ü.T.F. Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı Üreme
Sağlığı ve İnfer@lite Merkezi Embriyoloji Laboratuvarında
ü Follikül aspirasyonu sonrası follikül sıvısı içinden OCC’nin
toplanması
ü OCC in vitro kültürü ve oosit matürasyonunun
değerlendirilmesi
ü Fer@lizasyon öncesi oosi@n hazırlığı, fer@lizasyon yöntemi
tayini ve uygulaması
ü İnvitro embriyo kültürü, değerlendirmesi ve embriyo transferi
ü Follikül sıvılarının ve kumulus hücrelerinin toplanması

38. U.Ü.T.F. Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Laboratuvarlarında
ü Follikül sıvılarının ve kumulus hücrelerinin dondurulması ve
saklanması
ü Çözülmüş oositlerin ışık mikroskobik ve elektron mikroskobik
olarak morfolojisini değerlendirmek amacıyla uygun
solüsyonlarda fiksasyonu ve doku takibi
ü Oositlerin ultrastriktürel morfolojisinin değerlendirmesi
ü Oositlerin immünohistokimyasal analizi

39. U.Ü.T.F. Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuvarlarında;
ü ELISA yöntemi ile follikül sıvısı, serum Kıss1 ve Cox-2 miktar
tayini
ü Kumulus hücreleri ve oositlerin real @me-PCR yöntemleriyle
Kıss-1 ve reseptörü, Cox-2 ekspresyon analizi

40. ü Işık mikroskobik ve elektron mikroskobik olarak oosit morfolojisini
değerlendirilmesi
ü Oosit ve kumulus hücreleri KISS1 / KISS1R / COX-2 immünohistokimyasal
tayini (?)
ü Total RNA eldesi, semiquanLtaLf (qPCR) ve real-Lme PCR
ü Eliza – Foliküler Sıvı ve Serum KISS1 ve GPCR54 seviye tayini
Gereç ve Yöntemler

41. Işık mikroskobik ve elektron mikroskobik olarak oosit
morfolojisini değerlendirmesi

42. ü Total RNA eldesi, semiquanLtaLf (qPCR) ve real-Lme qPCR
50 adet Oosit – Kumulus Hücre Grubu
(DNA-free) Total RNA Extrac@on Kit RNA
25 adet kontrol 25 adet hasta

43. cDNA
Superscript III reverse transcriptase
Real ;me qPCR
• KISS1 / KISS1R / COX-2
genlerinin GAPDH ekspresyonu
ile göreceli gen anlabm
pazernleri kıyaslanması

44. ü Eliza
Kisspep;n ELİSA kit
Serum Foliküler Sıvı ( PFF )

46. Oosit maturasyonunda etkin hücre içi sinyal yolaklarının
Ak;vasyonu / İnhibisyonu (?)
Oosit in vitro maturasyon kültürlerine
KP eklen;si / KP inhibitör eklenmesi (?)
Kisspep@n ALTERNATİF Mİ ? / GEREKLİ Mİ ?

47. TEŞEKKÜR EDERİM…