4. Neurokinin B (NKB)/NK3
Neurokinin B reseptör (NK3R)
Kisspeptin/KISS1
Kisspeptin reseptör (KISS1R)
Ovaryum, tuba uterina ve uterusda,messenger RNA
(mRNA) düzeylerinin ve peptit lokalizasyonlarının
gösterilmesi ,olası birlikte ekspresyonların tespit
edilmesi
5. Neurokinin B (NKB)
Tachykinin neuropeptit ailesi :
Substance P (SP)
Neurokinin A (NKA)
Neurokinin B (NKB)
Endokinins
Hemokinins
Page NM. Ve ark. - 2005
10-11 aminoasit
Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2
Pennefather JN ve ark. - 2004
TAC3 geni NKB ( Almeida TA. ve ark. – 2004 )
Neurokinin B Reseptör ( NK3R )
SP
NKA
NKB
NK1R
NK2R
NK3R
Tacr1 geni
Tacr2 geni
Tacr3 geni
Mussap CJ ve ark. .- 1993
Seabrook GR. ve ark. - 1995
6. Kisspeptin
Kiss 1 geni
( 1q32 )
KP-145
145 Aminoasitlik öncül protein
Kisspetin – 54, 14, 13, 10
Kisspeptin Reseptör/ KISS1R (GPR54)
KISS1R geni KISS1R
G- Proteini bağımlı reseptörler
Galanin reseptörleri ile %45’lik benzerlik gösterir.
(Lee DK. Ve ark. 1999 )
( Kispeptin 54 - Lee DK. ve ark. 1999)
( Gottsch ML. ve ark. 2004 - 2009 )
7. de Roux N ve ark. (2003 )
Seminara SB ve ark. (2003)
Navarro VM ve ark. ( 2004 )
KISS1 ve KISS1R üreme fonksiyonlarının düzenlenmesinde rol üstlenmesi
KISS1R (GPR54 ) reseptörünün fonksiyon kaybına yol açan mutasyonların,
Pubertal gelişme eksikliği
Üreme aktivitelerinde kayıp
Hipogonadotropik hipogonadizm
8. NKB ve NK3R proteinlerini kodlayan TAC3 ve TACR3 genlerinde görülen mutasyon;
Normosmic hypogonadotropic hypogonadism
( Seksuel gelişim bozukluğu,hatalı gametogenez,infertilite )
NKB ve NK3R ligand reseptör ilişkisinin üreme
fonksiyonlarının düzenlenmesinde anahtar rol üstlenmesi
Topaloglu AK, Semple RK
ve ark. ( 2009 , 2010 )
Young J ve ark. (2010)
Gianetti E ve ark. (2010)
9. NKB’ nin , hipotalamus da bulunan GnRH salınımının düzenlendiği ayrı norönal
populasyonlardan sentezlendiği gösterilmiştir. (Goodman RL ve ark. 2007 ),
(Rance NE. ve ark. 2009 )
NKB eksprese eden bu nöronlarda; postmenapozal dönemde ve ovariektomi
sonrası NKB ekpsresyon artışı, östrojenin down-regule edici etkisi
saptanmıştır.(Rance N ve ark. 1991 ve 2009 )
NKB / kisspeptin / dynorphin birlikte eksprese edildiği,hipotalamusta arcuate
çekirdeklerin içerisinde yer alan, KNDy adı verilen nöronlar tespit
edilmiş,(Lehman MN ve ark. 2010 ) ve bu 3 peptitlerin birlikte GnRH salgılanması
ve gonadotropin salınımında anahtar modülator oldukları sunulmuştur. (Navarro
VM ve ark. 2011)
10. Merkezi düzeyde NKB ve NK3R işlevlerinini yanı sıra, üreme organlarında
fonskiyonlarında önemli rolleri hakkında bir çok bilgi araştırmacılar tarafından
sunulmuştur.
NKB ve NK3R çeşitli memeli türlerinde plesanta , ovaryum, testis ve prostat da
saptanmıştır. (Page NM ve ark. 2000 ) Diğer bir çeşit üreme hücreleri olan oosit ve
olgun spermatozoa da da eksprese edildiği gösterlimiştir.(Cintado CG ve ark. 2007)
Tüm bu verilere rağmen NKB, NK3R, kisspeptin ve KISS1R ekspresyonu yapan üreme
organlarında yer alan hücre tipleri hakkında bilinenler azdır.
11. • RT-PCR
Ovaryum
5 - Postmenapoz dönemi hasta *
( non-ovarian olgusu ile ooferektomi )Tuba Uterina
Uterus 6 - Orta üreme dönemi hasta*
5 - Postmenapoz dönemi hasta*
( benign uterus olgusu ile histerektomi )
* Yaş aralığı 36 – 77 arasında olan gebe olmayan hastalar
30 mg doku örneklerinden - Total RNA izolasyonu TriReagent ( Sigma )
cDNA sentezi – Quantitect Revers Trasncription Kit ( Qiagen )
12. • RT-PCR
PCR hedef geni Primerler
TAC3 – 266 bp. F 5’-CCAGTGTGTGAGGGGAGCA-3’
R 5’-TCCAGAGATGAGTGGCTTTTGA-3’
TAC3R – 178 bp. F 5’-TTGCGGTGGACAGGTATATGG-3’
R 5’-GGCCATTGCACAAAGCAGAG-3’
KISS1 – 295 bp. F 5’-CCACTTTGGGGAGCCATTAG-3’
R 5’-CCAGTTGTAGTTCGGCAGGTC-3’
KİSS1R – 166 bp. F 5’-GGACGTGACCTTCCTCCTGT-3’
R 5’-GTACCAGCGGTCCACACTCA-3’
b-actin – 362 bp. F 5’-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3’
R 5’-ATCTGCTGGAAGGTGGACAG-3’
*** Pozitif kontrol amaçlı 20 farklı doku örneği içeren “cDNA havuzu” kullanılmıştır.
13. • İmmünohistokimya
Myometrium 6 - Üreme Dönemi Hasta
( 3 sekretuar faz- 2 proliferatif faz- 1 menstruel faz )
1 - Postmenapoz Dönemi Hasta
( uterin leiomyoma olgusu ile histerektomi )
Ovaryum 3- Üreme Dönemi Hasta
( farklı mensturel dönemlerde )
4 - Postmenapoz Dönemi Hasta
( non- ovarian olgusu ile ooferektomi )
% 10 tamponlanmış Formaldehit – Fiksasyon
Parafin bloklama
3 mM kesitlerin alınması
Deparafinizasyon - TBS tamponu ile ve rehidratasyon
14. • İmmünohistokimya
Primer poliklonal antikorlar ile oda sıcaklığında gece boyu inkübasyon
NKB (sc-14109 ; Santa Cruz Biotechnology - Keçi anti insan )
NK3R ( Sigma )
KISS (sc-15400 ; Santa Cruz Biotechnology – Tavşan anti insan )
KISS1R (sc-48220 ; Santa Cruz Biotechnology – Keçi anti insan )
1:30 dilusyon
% 0,2 Tritron X-100
içeren TBS
tamponunda
Biotin isaretli sekonder antikor ile 1:1000 dilusyonda 60 dakika inkübasyon
Streptavidin – peroxsidase ile 1:1000 dilusyonda 60 dakika inkübasyon
Peroxsidase aktivitesinin tespiti için 4-chloro-1-napthol ( Sigma ) ve %0,01 hidrojen peroksit
*** Mast hücrelerinin tayini amaçlı Toluidine Blue boyaması yapılmıştır.
15. • İmmünohistokimya
Endometriyum 6 – Hasta *
( bening uterus olgusu ile histerektomi )
Tuba Uterina 6 – Hasta *
( malign uterus olgusu )
* Hasta yaş aralığı : 36-77
Kesitler primer antikorla ile 30 dakika oda sıcaklığında 1:100 diluyonda inkübasyon
Ultra View Universal DAB detection kit ( Ventana medical Systems ) - BenchMark XT
*** Negatif kontrol örnekleri primer antikor ile inkübasyon edilmemiştir.
18. İmmünohistokimya
Myometrium da NK3R ekspresyonu, özellikle
düz kas hücrelerinde, hormanal düzeye bağımlı
olarak belirgin değişiklikler göstermiştir.
Bu gözlemlerde araştırmacıların daha önceki
çalışmalarında insan,fare,sıçan uteruslarında
gözlemledikleri östrojen baskısının olduğu
koşullarda TACR3 gen ekspresyonunun yüksek
oranda düştüğü verisini doğrulamıştır.
NBK/NK3R ekspresyonunun vasküler ve epitel
hücreler de görüldüğü gibi mast hücrelerinde
görülmesi, bu sistemin uterus ile immün sistem
arasında haberleşmede rol aldığı idda edilebilir.
Proliferatif Faz NK3B Sekretuar Faz NK3B
Proliferatif Faz NKB Sekretuar Faz NKB
20. İmmünohistokimya
İlk defa Kisspeptin /
KISS1R ekspreyonları
insan endometrium ve
tuba uterina da
gösterilmiştir.
Kisspeptin / KISS1R ligand
reseptör ilişkisinin GnRH
nöronal kontrolu araçılığı
ile merkezi üreme
fonksiyon
düzenlenmesindeki
rolüne ek olarak periferik
düzenlemelerde görev
aldığı gösterilmişir.
Tuba Uterina - NBK/NK3R ve kisspeptin/KISS1R
21. İmmünohistokimya
Uterus lümen epitelinde ve tuba uterina da ; Kisspetin ve NBK peptit sistemlerinin
birlikte ekspresyonları gösterilerek ; sperm transportu, oosit fertilizasyonu,
blastosist implantasyonu gibi epitel fonksiyonlarının düzenlenmesinde rol
alabilcekleri öne sürülmüştür.
23. İmmünohistokimya
Ovaryumda NBK/NK3R immünoreaktivitesinin corpus luteum da
yüksek,gelişmekte olan foliküllerde düşük seviyede olmasını ; folikül gelişimin
başlangıç aşamasında östrojen miktarının yüksekliği ve buna bağlı olarak NK3R
ekspresyonunu baskılanması ile açıklanabilir.
Corpus luteum da NBK/NK3R ve Kisspeptin / KISS1R immünoreaktivite
göstermesi peptit sisteminin lokal ovulasyon kontrolünde yada postovulatuar
ovaryan süreclerde, ovaryan steroidogenesis’ in kontrolünde potansiyel rol
oynadığını düşündürmektedir
24. NBK
NK3R
KISS
KISS1R
U
T
E
R
U
S
Myometrium
Bağ Doku
Vasküler Düz
Kas
Myometrial
Düz kas
Bağ Doku
Vasküler Düz
Kas
Myometrial
Düz kas
Mast hücreleri
Endometrium
Lümen ve Bez Epitel Hücreleri
Tuba Uterina Epitel Hücreleri
Ovaryum Corpus Luteum
Antral Folikül
Granüloza
Hücreleri
Teka Hücreleri
25. Çalışma da NBK/NK3R ve kisspeptin/KISS1R sitemlerinin uterus (myometrium – endometrium
),ovaryum ve tuba uterina da mRNA ekspresyonları ve proteinlerin lokalizasyonları
gösterilmiştir.
NBK/NK3R ligand - reseptör ilişkisinin hem merkezi hemde periferal anlamda üreme
fonksiyonlarında önemli rolü olduğu gösterilmiştir.
İlk kez NBK/NK3R ligand ve reseptör düzeyinde ekspresyonu endometrium ve tuba uterina
epitelinde, myometriumdaki vasküler düz kas ve bağ doku hücrelerinde, mast hücrelerinde
gösterilmişitir.
26. NBK/NK3R ve Kisspeptin / KISS1R peptit sistemlerinin immünoreaktivitesi göz önünde
bulundurulduğunda üreme hastalıkları ile ilgili bir biomarker özellik taşımadığı ve pregenitör
olarak kullanılamayacağı tespit edilmiştir.
Genel olarak çalışmada NBK/NK3R ve Kisspeptin / KISS1R peptit sistemlerinin non-nöronal
üreme hücrelerinde birlikte eksprese oldukları gösterilmiş ve bu bulguların periferal
üremedeki rollerinin gelecekte araştırlması için öncülük edeceği düşünülmektedir.
