Kisspeptin Çelişkili Etkisi

1. S
Kisspeptinin Çelişkili Etkisi :
Oositin in vitro maturasyon değerini arttırırken, in vitro
kültürde “hatched” blastosist üzerinde olumsuz
etkilere sahiptir.
Arş. Gör. Göktan KUŞPINAR
Moderatör:
Prof. Dr. İlkin ÇAVUŞOĞLU

3.  Bulgular ve Yorum
 Giriş ve Çalışmanın Amacı
Gereç ve Yöntem
Deneylerin Tasarımı ve Hedefleri

4.  Giriş ve Çalışmanın Amacı
 Kisspeptin hakkında genel bilgiler
Kisspeptin, maling melanoma hücrelerinde metastaz-baskılayıcı gen olarak kesfedilen
KISS1 geninin ürünü olan peptit

5.  Giriş ve Çalışmanın Amacı
 Kisspeptin hakkında genel bilgiler

6.  Giriş ve Çalışmanın Amacı
 Kisspetinology

7.  Giriş ve Çalışmanın Amacı
 KISS/KISS1R sisteminin üreme boyutu;

8.  Giriş ve Çalışmanın Amacı
 Kisspeptin hakkında genel bilgiler
 Kp sistemik şekilde üreme aksisinin ana
düzenleyicisi

9.  Kp, GnRH-gonadotrophin salgılayıcı en potensiyel araç
 Kisspeptin hakkında genel bilgiler

10.  Giriş ve Çalışmanın Amacı
 Kisspeptin hakkında genel bilgiler
Üreme dönemindeki – cyclic- sıçanlardan alınan ovaryum dokularında Kp ve
KISS1R immünoreaktivitesi,
 KISS1R gen ekspresyonu hipofizer LH regülasyonu altındaki döngü içerinde
dalgalanmalar

11.  KISS1 ve KISS1R genlerinin ovaryumdaki ekspresyonları
• Balık (Nocillado et al. 2007; Filby et al. 2008)
• Hamster (Shahed and Young 2009)
• Domuz , keçi(Inoue et al. 2009)
• Primatlarda (Gayta´n et al. 2009)
 Ovulasyonu ve folikül atılımını engellediği bilinen, siklooksigenaz-II
inhibitörü, sıçan ovaryumunda KISS1 gen ekspresyonunu engelledi.
(Gayta´n et al. 2009)
 Kisspeptin hakkında genel bilgiler

12. Kisspeptin
Oosit Maturasyonu

13.  Giriş ve Çalışmanın Amacı
 Kisspeptin hakkında genel bilgiler
 Dişi pubertesi ve pre-ovulatuar gonadotropin artışında Kp kritik
rollerini sunacak potansiyel Kp inhibitörünü (p234) keşfetti.

14.  Giriş ve Çalışmanın Amacı
 Kisspeptin hakkında genel bilgiler
 Kp, trofoblast invasyonunun endokrin – parakrin düzenyeyicisi

15. Domuz üreme sisteminde ;
 Ovaryumda Kisspeptin hiyerarşisinin lokal varlığını ortaya çıkartmak
 İn vitro oosit maturasyonunda ve sonrasındaki embriyonik gelişimdeki
etkilerini araştırmak
 Kisspeptin eklentisinin blastosist canlılığı ve “hatching” sonraki in vitro
gelişime etkisini göstermek
Çalışmanın Amacı

16.  Gereç ve Yöntem
 Ovaryum ve peptidlerin eldesi
 Kumulus-Oosit kompleksi (COC) ve domuz foliküler sıvısı (PFF) toplama
 Oosit in vitro maturasyonu (IVM)
 Partenogenetik aktivasyon ve mature oositin in vitro kültürü

17.  Gereç ve Yöntem
 Blastosit kültürü
 Total Blastosit hücre sayısı
 Total RNA eldesi, semiquantitatif (qPCR) ve real-time PCR
 Eliza
 COC’larda ve erken embriyolarda KISS1R immünoflourasans işaretleme

18.  Gereçler ve Yöntem
Ovaryum ve peptidlerin eldesi
• 0.9% NaCl içerisinde 25–30oC koşullarında 1 saat içerisinde
laboratuvara getirildi.
• Kp peptit analoğu ve Kp antagonist (p234) Phoenix Pharmaceuticals
Inc. (Burlingame, CA, USA)

19.  Gereç ve Yöntem
Kumulus - Oosit kompleksi (COC) ve domuz foliküler sıvısı (PFF)
toplama
• Kumulus - oosit kompleksi antral folikülden aspire
• Oositler TCM-199- HEPES ( doku kültürü medium’u ) 3 kere yıkama
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) - in vitro maturasyon seçilim

20.  Gereç ve Yöntem
Kumulus-Oosit kompleksi (COC) ve domuz foliküler sıvısı (PFF)
toplama
• Domuz foliküler sıvısı (PFF) 6-8 mm folikül boyutlarından aspire -
1600 g de 1 dk 25 oC santrifüj edildi.
• 1.2 ile 0.45 um por kalınlıklarında filtre edildikten sonra kullanıma
kadar -20 oC’ de saklandı.

21.  Gereç ve Yöntem
Oosit in vitro maturasyonu (IVM)
Tanımlanmış Besiyeri Tanımlanmamış Besiyeri
FSH
FSH + PFF
FSH + p234
FSH + KP
FSH + KP + p234
KP
FSH + PFF + p234
FSH + LH
LH
LH + p234

22.  Gereç ve Yöntem
Oosit in vitro maturasyonu (IVM)
• TCM-199 besiyerine ek olarak ;
10 ngmL-1 epidermal growth factor (EGF), 0.57mM cysteine, 0.91mM sodium
pyruvate, 5 mgmL-1 insulin and 1% (v/v) Pen-Strep (Invitrogen)
• 4’lü well dishes’lerde 25 oC ve nemli havada %5 lik CO2 44 saat – 22 saatlik 2
pasaj
• Tanımlanmayan koşullar besiyerine ek olarak; %10 PFF
• Tanımlanan koşullar 1 mg/mL FSH yada 1 mg/mLLH

23.  Gereç ve Yöntem
Oosit in vitro maturasyonu (IVM)
• Oosit ve kumulus hücreleri 0.1% hyaluronidase içeren 0.1%
polyvinyl alcohol eklenmiş Dulbecco’s PBS (Invitrogen) de pipetaj
ile ayırıldı.
Yalın oosit ve ayrılmış kumulus hücreleri:
• Birinci polar cisimciğin atılım yüzdesini belirlemek için 25 mgmL-1
bisbenzamide (Hoechst 33258) DNA boyaması
• RT-PCR ve qPCR için total RNA eldesi
• Partenogenetik aktiviteyi takiben in vitro kültür

24.  Gereç ve Yöntem
 Partenogenetik aktivasyon ve matür oositin in vitro kültürü
• Yalın oositler, mannitol (0.25
M) içeren 4 kuyucuk içren
hücre kültür plate - 1,5 dk
• BTX Electro Cell
Manipulator 2001 (BTX, Inc.,
San Diego, CA, USA)
• Tek bir atım 1.5 kV cm-1 -
100 ms ile aktive edildi.
(Okada et al. 2006)

25.  Gereç ve Yöntem
Partenogenetik aktivasyon ve matür oositin in vitro kültürü
• Elektroaktive edilen oositler TCM – 199 besiyeri ile yıkandı.
• 500 mL lik 4mM 6-dimethylaminopurine (6-DMAP) - diploid zigotların üremesi için
4 saat 39OC, 5% CO2, 5% O2 ve 90% N2 koşullarında kültüre edildi.
• Muhtemel diploid zigotlar yıkandı ve mineral yağlar içeren 30-uL microdrops’luk
Domuz zigot medium-3’ e aktarıldı ve 39OC, 5% CO2, 5% O2ve 90% N2 koşullarında kültür
edildi.
• İkinci günde, embriyolar değerlendirildi. Blastosit oluşumu ve yayılımı altıncı günde,
atılımı sekizinci günde tespit edildi.

26.  Gereç ve Yöntem
Blastosit kültürü
• 30 adet atılmış blastosit iki gurup : Kp içeren yada Kp içermeyen DMEM/F12*
*Ek olarak 10% (v/v) FBS (Invitrogen), 1mM glutamine (Invitrogen), 25mM NaHCO3 and 1%
(v/v) minimal essential medium (MEM) nonessential amino acid solution (Invitrogen)
• Mitomycin C uygulanmış fare embriyonik fibroblastları – besleyici hat - üzerinde
39OC nemli havada 5% CO2,ve 95% hava

27.  Gereç ve Yöntem
Total Blastosit hücre sayısı
• Atılan blastositler PBS ile yıkandı
• Nukleus 25 mgmL-1 bisbenzamide ile 1 saat , 37OC de boyandı.
• Gliserol içerisinde lamel ile kaplandı
• 346 nm eksitasyon filtesi mevcut flourasans mikroskobu- hücre sayımı
• ImageJ 1.42q software (NIH, Bethesda, MD, USA) – hücre sayımı, dijital görüntü

28.  Metarial ve Metod
Total RNA eldesi, semiquantitatif (qPCR) ve real-time qPCR
3 Küme 60 adet COC 3 Tekrar
Easy-Spin (DNA-free) Total RNA Extraction
Kit (iNtRON Biotechnology Inc., Kyunggi,
Korea)
RNA

29. cDNA
Superscript III reverse transcriptase
(Invitrogen) - Maxime PCR PreMix kit-
i-starTaq (Intron Biotech., Seoul,
Republic of Korea)
Real time qPCR
(Takara Bio Inc. guidelines )
• MOS, CCNB1, GDF9
BMP15
• BAK1 ve BCL2L1 genlerinin
GAPDH ekspresyonu ile
göreceli gen anlatım patternleri
kıyaslanması

30.  Gereç ve Yöntem
Eliza
Domuz kisspeptin ELİSA kit - 450 nm A0
(KISS1; Hölzel Diagnostika GmbH, Cologne, Germany)
Serum Foliküler Sıvı ( PFF ) IVM besiyeri

31.  Gereç ve Yöntem
COC’larda ve erken embriyolarda KISS1R immünoflourasans
isaretleme
COC ve atılmış blastosistler
• %4 parafolmaldehit + PBS 30 dakika - PBS’de yıkama - %0.1 Tritron-X 100 (v/v) içeren
PBS ile inkube
• %1’lik keçi serumu ile 1 saat RT -> +4 0C overnight
• 1:100 dilüsyonda tavşan- anti GRP54 primer antikor (%1’lik keçi serumunda hazırlanan )
ile 2 saat RT
• 1:200 dilüsyonudaki keçi anti tavşan sekonder antikoru ile 1 saat RT
• Blastosit nükleusları 40,60-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Vector Laboratories) içeren
Vectashield kapatma medium’u ile zıt boyandı.

32.  Gereç ve Yöntem
 GraphPad Prism 4.02 .(Graphpad Software Inc, San Diego, CA, USA)
 Tukey testi - tek yönlü ANOVA ile analiz
 P<0.05 yada P<0.01 ise veriler anlamı
İstatistiksel Analiz

33.  Gereç ve Yöntem
Dizayn 1: Domuz ovaryumunda Kp ve hiyearşisinin ekspresyonu
Kp ve KISS1R, domuz ovaryumunda tespit edildiği için,domuz COC
örneklerinde;
• RT-PCR araçılığı ile KP hiearşik elementleri (KISS1, KISS1R, GNRH1, GNRHR,
LHB ve LHCGR) ekspresyon seviyeleri
• Serum - domuz foliküler sıvısı ( PFF ) kıyaslanan KP seviyeleri ölçümü

34.  Gereç ve Yöntem
Dizayn 2: IVM’ de COC’larda KP hiyeraşisinin ekpresyonu
Kumulus hücrelerinde ve oositlerde ;
Ayrı ayrı ve zamana bağlı olarak (0,4,8,22,26, 30 ve 44 Saatlerde )
Kp sistemin ekspresyonu - pulsatif ekspresyon tespiti

35.  Gereç ve Yöntem
Dizayn 3: Oositin ın vitro maturasyonunda ve gelişim yeteneğinde
Kp eklenmesinin etkileri
• Homojen kulumus
yayılımını sağlayan en
düşük FSH
konsantrasyonunu

36.  Gereç ve Yöntem
Dizayn 3: Oositin ın vitro maturasyonunda ve gelişim yeteneğinde
Kp eklenmesinin etkileri
• IVM besiyerine farklı
konsantrasyonlarda Kp
eklenmesi – oosit nuklear
maturasyon etkisi

37.  Gereç ve Yöntem
Dizayn 3: Oositin ın vitro maturasyonunda ve gelişim yeteneğinde
Kp eklenmesinin etkileri
• 10-6 M Kp ye ek olarak antagonistinin -p224-eklendiği yada
eklenmediği durumdaki etkileri
 Nuklear maturasyon - ilk polar cismin atılımı
 Oosit maturasyon markerlerı olan MOS, CCNB1, GDF9 ve BMP15
gen ekspesyonları,
 Onları takip eden hiyerarşinin ekspresyonlarını (GnRHa and LHb
subunitleri),
 Bu oositlerden gelişen embriyoları

38.  Gereç ve Yöntem
Dizayn 4: FSH’ın KISS1R ekspresyonundaki etkisi
IVM’den elde edilen sonuçlar,
 FSH’ın Kp aktivasyonu için kritik rolu
 Kumulus hücreleri ile oositlerde RT-qPCR ile FSH’ın KISS1R ekspresyonu üzerine
etkilerini

39.  Gereç ve Yöntem
Dizayn 5: Kp eklenmesinin blastosist canlılığı ve gelişimide etkileri
 Partoneogenetik uyarım sonucu “expanded” hemde “hatched” domuz
blastosistlerinde KISS1R ekpresyonları
 Kp eklenmesinin ;
• Blastosit canlılığı
• Trofoektoderm gelişimine etkisi
• Erken embriyolojik gelişime etkileri

40.  Domuz ovaryumunda kisspeptin sistemi mRNA elementlerinin ekspresyonu
ve foliküler sıvıdaki seviyesi
 Bulgular
ELISA Kp seviyesi
Foliküler sıvıda.
335±22.5 pgmL-1
Serum
25±,.2 pgmL-1, P<0.05).

41.  Bulgular
IVM medium ELISA Kp seviyesi : 111±45.5 pgmL-1

42.  Bulgular
KISSR1 immünoflorans isaretleme

43. Oosit Kumulus Yorum
KISS1 IVM 26-30 saat ---
Otokrin ve parakrin etki
KISS1R IVM süresince
GNRH1 Kesikli Pulsatif salgı
GNRHR
IVM süresince
GNRH’nın doğrudan etkileri
LHB Kesikli – IVM 8.saat sonrası
GNRH bağımlı - Pulsatif
salgı
LHCGR
IVM süresince
LHB, kumulus yayılımı için
gerekli

44.  Bulgular
HİPOTEZ : Kp, GnRH’yı aktive ediyor, böylelikle oosit maturasyonunu
etkileyebilecek LH sentezi artıyor.

45.  Bulgular

46. KISS1R ekspresyonu olan hücrelerde
Kp, Ca+2 salınımını arttırdığı - oositin sitoplazmik ve nüklear olgunlaşma

47.  Bulgular

48. er
C-mos
MAPK
ERK 1- 2
Siklin - B1
Cdc – 2

49. GDF9 ve BMP15
 Fertilizasyonun düzenlenmesinde önemli rolleri bulunan bir çok
üyesi olan ”Transforming growth factor” süper ailesi üyesi
 Granüloza hücrelerinin regülasyonu
Folikülogenesis
Oosit maturasyonuda ilişkili oositten salgılanan faktörler

50.  Bulgular
Kp eklentisinin GNRH1 ve LHB
ekspresyonlarına etkisi - 22. Saat IVM

52.  Bulgular
FSH’ın KISSR1 ekspresyonuna etkisi - 11
Saat IVM

53.  Bulgular

55.  Sonuçlar

56. KP - Apoptotik etki

57. Literatüre Katkıları
 Domuz ovaryumunda ilk defa Kp hiyerarşisinin, varlığını ve
etkileşimlerini,
 Oosit maturasyonunda ve embriyo gelişim yeteğindeki otokrin-
parakrin etkileşimi arttırıcı rollerini gösterdi.
 Ancak,Kp eklentisinin, “hatched” blastositlerin gelişiminde sistemik
ya da lokal regülasyonunu yansıtan çelişkili etkileri olabilir.

58. Teşekkür Ederim …