Diskusi kelompok kecil membahas teknik-teknik biologi molekuler seperti PCR dan sequencing yang digunakan untuk diagnosis pasien dengan gejala demam dan bersin. Teknik-teknik tersebut digunakan untuk mendeteksi virus SARS-CoV-2 pada sampel swab pasien.

1. LAPORAN HASIL DISKUSI KELOMPOK KECIL
BLOK 7 MODUL 2
TEKNIK BIOLOGI MOLEKULER
Disusun oleh : Kelompok 3
Luly Kartika Dewi Br. Kaban 2010026006
Nabila Maulida 2010026007
Fitria Ayu Cahyani 2010026008
Gusti Novia Ramadhana 2010026009
Cici Nur Aisyah Eka Putri 2010026013
Asri Puspita Dewi 2010026017
Airvin Wika Samiaji 2010026025
Sheviola Wahyu Okta Angelia 2010026027
Richardo Filbert Kwan 2010026028
Rheznandya Asylla Aulin Eddys 2010026033
Defirst Elfani Damayanti 2010026034
Tutor :
Dr. drg. Lilies Anggarwati A, Sp. Perio
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS MULAWARMAN
SAMARINDA
2021

2. i
KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena atas
rahmat-Nya kami dapat menyelesaikan laporan yang berjudul “Teknik Biologi
Molekuler” pada waktunya. Laporan ini kami susun dari berbagai sumber ilmiah
sebagai hasil dari diskusi kelompok kecil (DKK) kami.
Kami mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu
sehingga terselesaikannya laporan ini, antara lain :
1. Dr. drg. Lilies Anggarwati A, Sp. Perio selaku tutor kelompok 3 yang telah
membimbing kami dalam menyelesaikan diskusi kelompok kecil (DKK).
2. Bapak Alhawaris, S.Si., M.Kes selaku dosen penanggung jawab kuliah modul
ini yang telah mengajar dan membimbing kami.
3. Teman-teman kelompok 3 yang telah menyampaikan pemikiran dan usulannya
sehingga Diskusi Kelompok Kecil (DKK) 1 dan 2 dapat berjalan dengan baik,
serta dapat menyelesaikan laporan hasil Diskusi Kelompok Kecil (DKK).
4. Teman-teman mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Mulawarman
angkatan 2020 dan pihak-pihak lain yang tidak dapat kami sebutkan satu per
satu.
Kami menyadari bahwa kemampuan kami dalam menyusun laporan ini sangat
terbatas. Oleh karena itu, kami mengharapkan kritik dan saran yang bersifat
membangun demi tercapainya kesempurnaan dari isi laporan hasil Diskusi Kelompok
Kecil (DKK) ini.
Samarinda, 2 September 2021
Kelompok 3

3. ii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ...................................................... .......................... i
DAFTAR ISI................................................................................................ ii
BAB I PENDAHULUAN............................................................................ 1
1.1.LATAR BELAKANG................................................................... 1
1.2.TUJUAN PEMBELAJARAN........................................................ 1
1.3.MANFAAT .................................................................................. 2
BAB II PEMBAHASAN............................................................................. 3
2.1. SKENARIO.................................................................................. 3
2.2 IDENTIFIKASI ISTILAH ASING ............................................... 4
2.3. IDENTIFIKASI MASALAH........................................................ 5
2.4. ANALISIS MASALAH ............................................................... 6
2.5. STRUKTURISASI KONSEP ....................................................... 11
2.6. LEARNING OBJECTIVE............................................................ 11
2.7. BELAJAR MANDIRI .................................................................. 12
2.8. SINTESIS..................................................................................... 12
BAB III PENUTUP .................................................................................... 31
3.1. KESIMPULAN ............................................................................ 31
3.2. SARAN ....................................................................................... 32
DAFTAR PUSTAKA................................................................................... iii

4. 1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Biologi molekuler merupakan ilmu pengetahuan multi disiplin ilmu dari biokimia,
biologisel, dan genetika yang mempelajari aktivitas biologi pada level molekular, termasuk
interaksi antara perbedaan tipe DNA, RNA, protein, dan biosintesisnya. Aktivitas atau
mekanisme apa yang terjadi pada level molekular sangat penting untuk dipelajari sehingga
dapat menunjukkan gen apa yang mempengaruhi suatu penyakit genetik, identifikasi gen,
identifikasi DNA, identifikasi DNA forensik, terapi gen dalam mengobati, dan mencegah
penyakit dan sebagainya. Istilah biologi molekuler pertama kali dikemukakan oleh William
Astbury pada tahun 1945.
Biologi molekuler juga merupakan cabang ilmu pengetahuan yang mempelajari
hubungan antara struktur dan fungsi molekul-molekul hayati serta kontribusi hubungan
tersebut terhadap pelaksanaan dan pengendalian berbagai proses kimia. Oleh karena itu,
materi kajian di dalam ilmu ini adalah makromolekul hayati, khususnya asam nukleat, serta
proses pemeliharaan, transmisi, dan ekspresi informasi hayati yang meliputi replikasi,
transkripsi, dan translasi.
Teknik biologi molekuler berperan penting dimanfaatkan terutama pada masa
pandemik COVID-19 sekarang. Teknik biologi molekuler dimanfaatkan untuk
mengidenfitikasi mutasi DNA dan banyak lagi manfaatnya. Salah satu teknik dalam biologi
molekuler adalah Polymerase Chain Reaction (PCR) yaitu suatu teknik sintesis dan
amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik lain adalah Elektroforesis dan Sekuensing DNA.
Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan
partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Sedangkan Sekuensing DNA
merupakan proses atau teknik penentuan urutan basa nukleotida pada suatu segmen
molekul DNA.
1.2 Tujuan
Adapun tujuan dari penulisan laporan kami, yaitu:
1. Mahasiswa/i mampu memahami dan menjelaskan mengenai teknik PCR meliputi:
a. Fungsi
b. Jenis
c. Komponen

5. 2
d. Tahapan (Ekstrasi, Amplifikasi, Pembacaan Hasil)
e. Elektroforesis
2. Mahasiswa/i mampu memahami dan menjelaskan mengenai teknik sequencing
meliputi:
a. Fungsi
b. Komponen
c. Tahapan
3. Mahasiswa/i mampu memahami dan menjelaskan mengenai teknik biologi molekuler
selain teknik PCR dan sequencing.
1.3 Manfaat
Setelah mempelajari modul ini, diharapkan mahasiswa dan para pembaca dapat
mengetahui dan menjelaskan mengenai hal-hal yang berhubungan dengan teknik biologi
molekuler, khususnya adalah teknik PCR (fungsi, jenis, komponen, tahapan dan
elektroforesis) dan teknik sequencing (fungsi, komponen, dan tahapan). Adapun teknik
biologi molekuler selain teknik PCR dan sequencing pun perlu diketahui.

6. 3
BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Skenario
Mahasiswa I : Gimana pengalaman jadi asisten dokter Faiz tadi malam? Boleh dong
dibagi bro…
Mahasiswa II : Tadi malam ada seorang pasien yang datang membawa keluarganya
dengan gejala demam tinggi, bersin-bersin, sakit di tenggorokan jika
menelan, dan penurunan berat tubuh. Dokter Faiz mencoba
menganalisis kemungkinan penyebab penyakit pasien tersebut.
Dugaan sementara beliau sih karena infeksi SARS-CoV-2, apalagi
daerah kita saat ini sedang pandemik COVID-19. Namun beliau
belum bisa memutuskannya sebab banyak penyakit infeksius yang
memiliki gejala yang serupa.
Mahasiswa I : Wah bahaya tuh. Jadi pasien langsung dikarantina?
Mahasiswa II : Belum lah bro…Kan dah saya bilang tadi, masih dugaan sementara
aja.
Mahasiswa I : Iya ya…Hehe… Terus bagaimana?
Mahasiswa II : Nah dokter Faiz meminta agar swab nasofaring dan orofaring pasien
tersebut diperiksa di laboratorium dengan metode PCR (Polymerase
Chain Reaction) untuk membuktikan dugaannya. Hasilnya sih kata
beliau sudah bisa dilihat atau dibaca setelah melalui pemeriksaan
dengan teknik elektroforesis. Kata beliau sih pemeriksaan PCR
tersebut sangat sensitif dan spesifik. Kalau memang positif COVID-
19, beliau juga minta sampelnya tak dibuang karena beliau berencana
memeriksa sampel tersebut dengan metode Sequencing untuk
keperluan penelitian lebih lanjut dan tugas akhir S3 beliau.
Mahasiswa I : Memangnya pemeriksaan apa sih itu semua?

7. 4
Mahasiswa II : Pemeriksaan biologi molekuler bro. Untuk lebih detailnya, apakah itu
terkait dengan komponennya, tahap-tahapnya, prosesnya, dan lainnya
sih aku masih ga tahu. Aku juga baru dengar tuh semua metode
pemeriksaan. Ayolah kita cari sama-sama referensinya. Mana tahu
kita bisa pakai untuk penelitian skripsi kita nanti. Ya kan?
Mahasiswa I : OK lah. Ayo sudah kita cari dan diskusikan sama-sama.
2.2 Identifikasi Istilah Asing
1. Biologi molekuler
 Studi biologi yang mempelajari pada tingkat molekul.
 Ilmu yang berkaitan dengan DNA, RNA, protein, mempelajari sel maupun
organelnya.
 Terdapat dua kelompok makhluk hidup, organisme uniseluler dan seluler.
2. SARS COV-2
 SARS-CoV-2 adalah virus korona yang mengakibatkan infeksi pernapasan
COVID-19.
 Jenis virus corona yang menyerang sistem pernapasan, tergolong beta corona
virus.
 Nama resmi yang diberikan taksonomi virus, adalah kepanjangan dari severe
acute respiratory syndrome coronavirus 2.
 Virus yang dapat ditularkan dari manusia ke manusia lainnya.
 SARS-CoV-2 adalah virus RNA sense positif beruntai tunggal yang terbungkus.
3. Daerah pandemic
 Daerah yang terkena wabah penyakit, dimana wabah ini terjadi serempak dan
dimana mana, meliputi daerah geografis yang luas seperti seluruh negara.
 Daerah dimana terjadi epidemic yang meluas, biasa penyakit melintasi beberapa
negara, mempengaruhi dengan tingkat infeksius tinggi.
4. Teknik elektroforesis
 Suatu meotde pemisahan yang memanfaatkan medan listrik dimana medan
listrik ini dihasilkan oleh elektroda-elektroda.
 Teknik untuk memisahkan molekul dalam cairan atau gel menggunakan medan
listrik.

8. 5
 Prinsip kerjanya berdasarkan partikel-partikela bermuatan negatif.
Elektroforesis digunakan untuk mengetahui ukuran partikel DNA, RNA dan
protein.
 Migrasi partikel yang diberikan arus listrik searah.
5. Metode sequencing
 Proses pengurutan dan penentuan basa dari nukleotida.
 Sekuensing digunakan untuk menentukan urutan nukleotida suatu fragmen
DNA tertentu (gen) atau genom. Pelaksanaannya dapat digunakan langsung dari
hasil PCR (direct sequencing) atau harus melalui proses kloning.
 Metode dimana digunakan untuk menentukan basa nitrogen pada molekul
DNA, menentukan identitas dengan membandingkan sequence sampel lainnya.
6. Penyakit infeksius
 Penyakit infeksi adalah masalah kesehatan yang disebabkan oleh organisme
seperti virus, bakteri, jamur, dan parasit.
7. Swab
 Cara mendapat sampel berupa lendir, dengan cara mengusap, dengan kapas lidi,
hasil bisa positif atau negatif.
8. Metode PCR
 Suatu teknik atau metode dalam memperbanyak atau replikasi fragmen dna
yang melibatkan beberapa tahap yang berulang dalam setiap siklusnya.
 Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi
DNA secara in vitro.
 Salah satu teknik biomolekuler untuk melipatgandakan DNA dengan
menggunakan enzim polymerase.
2.3 Identifikasi Masalah
1. Bagaimana metode swab orofaring dan nasofaring?
2. Apa fungsi dari metode PCR?
3. Apa saja jenis-jenis PCR?
4. Apa saja komponen dalam metode PCR?
5. Bagaimana tahapan dalam metode PCR?
6. Apakah ada faktor yang mempengaruhi PCR?

9. 6
7. Mengapa teknik PCR merupakan teknik yang spesifik dan identic dalam biologi
molekuler?
8. Apa fungsi dari sequencing?
9. Apa saja komponen dalam metode sequencing?
10. Bagaimana tahapan dari metode sequencing?
11. Apakah ada faktor yang mempengaruhi sequencing?
12. Apa perbedaan antara metode PCR dan sequencing?
13. Apakah ada metode lain selain PCR dan sequencing yang berhubungan dengan
biologi molekuler?
14. Apa saja komponen elektroforesis?
15. Apa saja tahapan elektroforesis?
2.4 Analisa Masalah
1. Metode swab nasofaring dan orofaring.
 Swab nasofaring; menyiapkan 1,5L media transport virus, berikan label diisi
nama pasien dan isi specimen, gunakan swab yang terbuat dari dakron dengan
tangkai plastic, jangan menggunakan swab kapas. Pastikan tidak ada hambatan
pada lubang hidung, masukkan secara perlaha lalu diputar secara perlahan.
 Pertama, untuk mengambil sampel lendir dengan cotton bud, diputar, menunggu
diagnose dengan alat. Perbedaannya hanya di letaknya saja.
2. Fungsi metode PCR adalah untuk mendeteksi keberadaan material genetik dari
bakteri, virus, dan organisme lain.
3. Jenis-jenis PCR.
 Reverse Transcriptase (RT-PCR)
Metode ini digunakan untuk isolasi atau identifikasi sekuen dari sel atau jaringan
RNA.
 Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Bertujuan untuk mendeteksi polimorfisme pada tingkat DNA.
 Kuantitif PCR
Digunakan untuk pengukuran ulang produk PCR, menentukan kuantitas DNA
maupun RNA.

10. 7
 Nested-PCR
Proses ini memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi pada produk selama
amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak diperlukan.
 PCR Konvensional
Polymerase chain reaction (PCR) konvensional adalah proses di mana tahap
perbanyakan materi genetik dan tahap deteksi produk dilakukan secara berturut-
turut, yaitu tahap deteksi dilakukan bila tahap perbanyakan materi genetik telah
selesai. Pada analisa konvensional ini, deteksi keberadaan DNA dilakukan pada
akhir reaksi dan pengamatan masih harus dilakukan dengan elektroforesis.
 Real time PCR
 Inverse PCR
Digunakan hanya satu segmen internal yang diketahui.
4. Komponen dalam metode PCR.
 Komponen-komponen yang harus ada dalam proses PCR antara lain DNA
cetakan yaitu potongan DNA yang akan dilipatgandakan, primer yaitu suatu
potongan atau sequence dari oligonukleotida pendek yang digunakan untuk
mengawali sintesis DNA, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), terdiri atas
dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan enzim DNA polimerase yaitu enzim yang
melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA, dan senyawa buffer.
 Template DNA merupakan sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek
yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan
nukleotida DNA templat; dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR;
magnesium klorida (MgCl2).
 Oligonukleotodia setidaknya mengandung guanin+citosin setidaknya 50-60%
 Buffer PCR merupakan salah satu larutan yang berperan mendukung peran
dalam metode PCR yang menyediakan lingkungan yang cocok.
 MgCl2 digunakan untuk cofactor meningkatkan interaksi primer dan templat,
mesin PCR digunakan untuk membaca hasil PCR
 Pada proses PCR menggunakan alat termosiklus. Sebuah mesin yang memiliki
kemampuan untuk memanaskan sekaligus mendinginkan tabung reaksi dan
mengatur temperatur untuk tiap tahapan reaksi.

11. 8
 Primer memiliki fungsi pembatas fragmen DNA target dan menyediakan gugus
hidroksil (-OH) pada ujung 3’. Melting temperature; 50% untai ganda DNA
terpisah, berpengaruh dalam pemilihan suhu pada proses anneling pada PCR.
5. Tahapan dalam metode PCR.
Tahapan PCR adalah pradenaturasi DNA template, denaturasi DNA template,
anneling, pemanjangan primer, pemantapan (post extension).
a) Denaturasi : Proses yang menyebabkan untai ganda menjadi untai tunggal,
dipengaruhi kandungan G dan C pada DNA dengan suhu 90-95˚ C selama 1-2
menit. Jika proses terlalu cepat maka akan membentuk DNA untai ganda lagi,
jika proses terlalu lama akan menyebabkan proses menjadi tidak sempurna.
b) Annealing/Penempelan Primer : Pendinginan hingga mencapai suhu 55- 60˚C
selama 30 detik, waktu tergantung dari panjang primer, jika lebih 22 basa waktu
bisa 1 menit. Semakin panjang primer semakin besar suhu nya
c) Extention/ pemanjangan primer : Melakukan elongasi dengan menggunakan
DNA polymerase dan bantuan dNTP . Dengan suhu 72˚C durasi 1 menit
Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalah bahwa
primer sebaiknya terdiri dari 18 – 25 basa, mengandung 50 – 60 % G+C.
6. Faktor yang mempengaruhi PCR.
 Jenis DNA polimerasinya.
 Suhu (tergantung panjang DNA template).
 Waktu (apabila proses denaturasi terlalu cepat, untaian DNA jadi tidak lengkap
sehingga dapat mengakibatkan kegagalan dalam proses PCR).
 Konsentrasi.
7. Teknik PCR merupakan teknik yang spesifik dan identik dalam biologi molekuler.
Karena sangat sensitive dan spesifik, semua pemeriksaan dilakukan secara optimal.
PCR dapat digunakan secara luas, keakuratannya tinggi sehingga mampu
menghindari kesalahan pada amplifikasi produk, dan dapat membedakan DNA serta
organisme.

12. 9
8. Fungsi metode sequencing.
a. Medeteksi gen faktor keturunan.
b. Mengidentifikasi individu tertentu.
c. Dapat dimanfaatkan untuk identitas atau fungsi gen.
d. Digunakan dalam riset dasar biologi.
e. Mengetahui bagaimana mutasi suatu gen yang diperiksa, mengetahui
bagaimana urutan basa nitrogen dari gen ataupun mikroorganisme yang
diperiksa.
9. Komponen dalam metode sequencing.
 Komponen hampir sama dengan metode PCR.
 Terdapat DdNTPs yang merupakan modifikasi dari dNTPs, berfungsi untuk
menghentikan sintesis DNA.
 Larutan pewarna untuk memperjelas gen yang diamati.
 DNA Template sebagai cetakan DNA.
 DNA Polymerase I, sebagai enzim yang mereplikasi DNA untuk
memperpanjang.
10. Tahapan metode sequencing.
 Terdapat dua macam metode yaitu metode sanger yang paling banyak
digunakan karena mudah serta efisien, dan metode degradasi kimia yang
memiliki kelehaman karena menggunakan bahan kimia yang beracun dan
berbahaya bagi peneliti.
 Perubahan DNA, untai ganda jadi tunggal. Primer menempel 5’, setelah itu
dimasukkan ke tabung reaksi, ditambahkan enzim polymerase, ditambahkan
dntps, dDntps, setiap tabung reaksi hanya ditambahkan satu, lalu akan memulai
elongasi, terhenti dan dilanjutkan dengan teknik elektroforesis, lalu pembacaan
sekuens DNA
11. Faktor yang mempengaruhi sequencing.
 Suhu.
 Waktu saat denaturasi jika terlalu lama akan merusak DNA template, terlalu
pendek denaturasi jadi tidak sempurna.

13. 10
 Konsentrasi dimana jika terlalu rendah peroleh PCR rendah, konsentrasi dNTPs
juga mempengaruhi.
 Jenis polimerasi, bergantung panjang DNA target yang akan diamplifikasi.
12. Perbedaan metode PCR dan metode sequencing.
 PCR untuk amplifikasi fragmen DNA, tidak ada dDNTP, sequencing untuk
pengurutan fragmen DNA.
 PCR bertujuan untuk memperbanyak untai DNA, sequencing untuk
mengurutkan basa DNA tersebut.
 Beberapa modifikasi yang membedakan metode sequencing dengan metode
PCR yaitu terdapat pada primer, jenis media serta jumlah DNA yang dihasilkan.
 Metode PCR menggunakan sepasang rpimer (forward dan reverse) yang dapat
membaca dua arah pembacaan (5’->3’ dan 3’->5’), sedangkan metode
sequencing menggunakan sebuah primer saja yang hanya dapat membaca stau
arah sekuens DNA (5’->3’ atau sebaliknya).
13. Metode lain selain PCR dan sequencing yang berhubungan dengan biologi
molekuler.
 Elektroforesis
 Ekstraksi asam nukleat.
 Isolasi DNA, merupakan teknik dasar dari biomolekuler yang bertujuan untuk
memisahkan DNA dari partikel lain seperti lipid.
14. Komponen elektroforesis.
a) Larutan Elektrolit, seperti larutan buffer.
b) Media pemisah, seperti kertas dan selulosa nitrat.
c) Elektroda, sebagai penghubung arus listrik.
d) Larutan Etidium Bromid (EtBr).
e) Gel Agarosa merupakan hasil ekstraksi dari rumput laut yang akan membentuk
suatu matrix gel akibat ikatan hidrogen ketika dipanaskan dengan buffer dan
kemudian dibiarkan mendingin. Keuntungannya tidak beracun dan cocok untuk
pemisahan molekul DNA yang besar.
f) Gel Poliakrilamida berasal dari ikatan silang kimiawi yang terbentuk akibat
hasil polimerisasi akrilamida dengan zat pengikat. Keuntungannya adalah
hasilnya jelas dan cocok untuk pemisahan molekul DNA yang besar.

14. 11
g) Elektroda berfungsi sebagai penghubung antar arus listrik dengan media
pemisah dan baterai atau penghubung arus listrik dengan rangkaian alat yang
digunakan sebagai sumber energi.
15. Tahapan elektroforesis dimulai dengan pembuatan gel agarosa sebagai bahan semi
padat, pemasangan perspek, menuangkan agar rosa ke dalam cetakan, perspek
diangkat dan akan membentuk sumur-sumur. Lalu menghidupkan mesin
elektroforesis, dan diatur suhu sebesar 100 Volt dengan waktu 40 menit, dinyalakan
sinar UV.
2.5 Strukturisasi Konsep
2.6 Learning Objective
1. Mahasiswa/i mampu memahami dan menjelaskan mengenai teknik PCR meliputi :
a) Fungsi
b) Jenis
c) Komponen
d) Tahapan (Ekstrasi, Amplifikasi, Pembacaan Hasil)
e) Elektroforesis
Teknik Biologi
Molekuler
Teknik Sequencing
Teknik PCR
Komponen
Tahapan
Komponen
Tahapan

15. 12
2. Mahasiswa/i mampu memahami dan menjelaskan mengenai teknik sequencing
meliputi :
a) Fungsi
b) Komponen
c) Tahapan
3. Mahasiswa/i mampu memahami dan menjelaskan mengenai teknik biologi molekuler
selain teknik PCR dan sequencing.
2.7 Belajar Mandiri
Pada step ini setiap anggota kelompok belajar secara mandiri untuk menemukan
jawaban dari learning objective yang sebelumnya sudah disepakati bersama.
2.8 Sintesis
1. Mahasiswa/i mampu memahami dan menjelaskan mengenai teknik PCR
meliputi :
a) Fungsi
b) Jenis
c) Komponen
d) Tahapan (Ekstrasi, Amplifikasi, Pembacaan Hasil)
e) Elektroforesis
PCR dikembangkan pada tahun 1984 oleh seorang biokimiawan bernama Kary
Mullis. PCR atau reaksi berantai polymerase adalah suatu metode enzimatis dalam
bidang biologi molekuler yang bertujuan untuk melipatgandakan secara eksponensial
suatu sekuen nukleotida tertentu dengan jumlah kelipatan ribuan hingga jutaan salinan
secara in vitro.4
a) Fungsi
Berikut merupakan fungsi dari PCR:
 Amplifikasi urutan nukleotida. PCR merupakan teknologi yang
berfungsi untul melipat gandakan secuplik fragmen DNA yang terdapat
dalam komplek makromolekul genom dari berbagai sumber menjadi 2n
kali lipatnya secara enzimatis.2
 Memprediksi suatu penyakti atau mengukur efektivitas suatu obat
melalui perhitungan jumlah copy gen.2

16. 13
 Menganalis keragaman gen pembawa penyakit atau analisa mutasi gen.2
 Pada bidang kedokteran forensik. Dengan jumlah DNA yang sedikit,
PCR mampu menggandakan DNA berlipat-lipat jumlahnya, sehingga
dapat divisualisasi dan selanjutnya dilakukan analisis DNA. Dengan
memperbanyak DNA jutaan sampai milyaran kali, maka
memungkinkan sampel/spesimen forensik yang jumlahnya amat minim,
dapat dianalisis contohnya analisis
kerokan kuku (cakaran korban pada pelaku), baju korban atau
pelaku, bercak sperma, puntung rokok dan sebagainya.18
 Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan DNA “finger
print”. Polymerase Chain Reaction mampu menggandakan DNA
berlipat-lipat jumlahnya untuk kemudian dilakukan analisis sidik jari
DNA nya.18
b) Jenis
Jenis-jenis PCR yaitu:
1) Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); metode ini
digunakan untuk membedakan organisme berdasarkan analisis model
derifat dari perbedaan DNA.19
Gambar. Procedures or steps of RFLP test
2) Inverse-PCR, metode ini digunakan ketika hanya satu sekuen internal
yang diketahui. Template didigesti dengan enzim restriksi yang
memotong bagian luar daerah yang akan diamplifikasi, fragmen restriksi
yang dihasilkan ditempelkan dengan ligasi dan diamplifikasi dengan
menggunakan sekuen primer yang memiliki titik ujung yang memiliki

17. 14
jarak yang jauh satu sama lain dengan segmen eksternal yang telah
tergabung. Metode ini khusus digunakan untuk mengidentifikasi
“sekuen antara” dari beragam gen.19
3) Nested-PCR, proses ini memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi
pada produk selama amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak
diperlukan. Dua set primer digunakan untuk mendukung metode ini, set
kedua mengamplifikasi target kedua selama proses pertama
berlangsung. Sekuens DNA target dari satu set primer yang disebut
primer inner disimpan di antara sekuens target set kedua dari primer
yang disebut sebagai outer primer. Pada prakteknya, reaksi pertama dari
PCR menggunakan outer primer, lalu reaksi PCR kedua dilakukan
dengan inner primer atau nested primer menggunakan hasil dari produk
reaksi yang pertama sebagai target amplifikasi. Nested primer akan
menyatu dengan produk PCR yang pertama dan menghasilkan produk
yang lebih pendek daripada produk yang pertama.19
Proses amplifikasi Gen flagelin S.typhi menggunakan teknik Nested PCR12
4) Quantitative-PCR; digunakan untuk pengukuran berulang dari hasil
produk PCR. Metode ini secara tidak langsung digunakan untuk
mengukur kuantitas, dimulai dari jumlah DNA, cDNA, atau RNA. Hasil
dari metode ini juga menampilkan copy dari sampel.19
5) Reverse Transcriptase (RT-PCR); metode ini digunakan untuk
amplifikasi, isolasi atau identifikasi sekuen dari sel atau jaringan RNA.
Metode ini dibantu oleh reverse transcriptase (mengubah RNA menjadi

18. 15
cDNA), mencakup pemetaan, menggambarkan kapan dan dimana gen
diekspresikan.19
6) Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) bertujuan untuk
mendeteksi polimorfisme pada tingkat DNA. Metode ini dikembangkan
oleh Welsh and Mc Clelland (1990) dengan cara mengkombinasikan
teknik PCR menggunakan primer – primer dengan sequens acak untuk
keperluan amplifikasi lokus acak dari genom.19
7) Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode yang
dapat digunakan untuk mengamplifikasi dua atau lebih sekuen target
secara simultan. Kelebihan Multiplex PCR adalah lebih murah dan
hemat waktu pengerjaan karena dapat mengamplifikasi dua atau lebih
sekuen target secara simultan dengan satu kali reaksi PCR sehingga
dapat menghemat alat dan reagen yang digunakan. Metode ini dapat
digunakan untuk mendeteksi penyakit pasien yang berbeda dalam
sampel yang sama.13
8) Amplification Refractory Mutation System (ARMS PCR), merupakan
PCR yang meggunakan primer spesifik. Metode ini sangat berguna
untuk identifikasi mutasi titik (mutasi yang terjadi dalam tingkatan gen
karena adanya perubahan basa nukleotida pada DNA) atau
polimorfisme.13
c) Komponen
Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama adalah :
a) DNA cetakan
DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. DNA
cetakan yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105 – 106 molekul.
Dua hal penting tentang cetakan adalah kemurnian dan kuantitas.19
Template atau DNA cetakan, dapat berupa DNA untai ganda/double
strand (dsDNA) yang telah diisolasi dari sampel melalui proses isolasi
DNA.12
b) Oligonukleotida primer
Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek
(18 – 28 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai
DNA. Dan mempunyai kandungan G + C sebesar 50 – 60%.19

19. 16
Primer oligonukleotida, berupa sekuen pendek untai tunggal DNA
(biasanya 20-30 pasang basa) yang komplemen dengan ujung 3’ untai
sense dan anti-sense dari sekuens DNA target.3
Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yang
digunakan. Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas
fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan
gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses
eksistensi DNA.12
c) Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP)
Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), terdiri dari dATP, dCTP,
dGTP, dTTP. dNTP mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah
konsentrasi efektif ion. Ini yang diperlukan untuk reaksi polimerasi.19
Nukleotida (dNTPs) merupakan suatu campuran yang terdiri atas
dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP
(deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Dalam
proses PCR, dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang
diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada
gugus–OH pada ujung 3’ dari primer dan membentuk untai baru yang
komplementer dengan untai DNA cetakan.12
d) Enzim DNA Polimerase
Enzim DNA Polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi
sintesis rantai DNA. Enzim ini diperoleh dari Eubacterium yang disebut
Thermus aquaticus, spesies ini diisolasi dari taman Yellowstone pada
tahun 1969. Enzim polimerase taq tahan terhadap pemanasan berulang-
ulang yang akan membantu melepaskan ikatan primer yang tidak tepat dan
meluruskan wilayah yang mempunyai struktur sekunder.1
DNA
polimerase, umumnya berupa enzim Taq polimerase termostabil yang
tidak cepat berubah sifat pada suhu tinggi (98o
C) dan berfungsi optimal
pada suhu sekitar 70o
C.3
Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi
polimerisasi DNA. Pada proses PCR, enzim ini diperlukan untuk tahap
ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR
diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim

20. 17
ini bersifat termostabil sampai temperatur 95⁰C. yang kemudian
digunakan dalam PCR adalah DNA polimerase yang berasal dari mikrobia
termofilik, yaitu Taq DNA polimerase yang tetap aktif meskipun
mengalami inkubasi pada suhu tinggi, spesies ini diisolasi dari taman
Yellowstone pada tahun 1969.12
e) Senyawa Buffer
Komponen pendukung lain adalah senyawa buffer. Larutan buffer
PCR umumnya mengandung 10 – 50mM Tris-HCl pH 8,3-8,8 (suhu 20o
C); 50 mM KCl; 0,1% gelatin atau BSA (Bovine Serum Albumin); Tween
20 sebanyak 0,01% atau dapat diganti dengan Triton X-100 sebanyak
0,1%; disamping itu perlu ditambahkan 1,5 mM MgCl2.19
Sistem buffer, berupa magnesium dan kalium untuk memberikan
kondisi optimal dalam proses denaturasi dan renaturasi DNA, dan penting
untuk mengaktifkan dan menstabilkan enzim polimerase.3
Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh
karena itu, untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi
buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium. Selain buffer PCR
diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari MgCl2.
MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas
DNA polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi
primer dengan templat/ cetakan yang membentuk komplek larut dengan
dNTP (senyawa antara). Dalam proses PCR konsentrasi MgCl2
berpengaruh pada spesifisitas dan perolehan proses. Umumnya buffer
PCR sudah mengandung senyawa MgCl2 yang diperlukan. Tetapi
disarankan sebaiknya antara MgCl2 dan buffer PCR dipisahkan supaya
dapat dengan mudah dilakukan variasi konsentrasi MgCl2 sesuai yang
diperlukan.12
f) PCR Thermal Cycler (Mesin PCR)
PCR Thermal Cycler merupakan suatu alat yang dipergunakan untuk
mengamplifikasi atau menggandakan untaian basa-basa DNA yang
dibatasi oleh pasangan primer pengapitnya melalui pengaturan suhu dan
penggunaan enzim tahan panas tinggi. (Maftuchah, dkk., 2014). PCR
thermal cycler pertama kali dikembangkan oleh perusahaan ‘PerkinElmer’
sebagai pemegang paten asli. Namun saat ini telah diproduksi berbagai

21. 18
macam tipe alat PCR thermal cycler ini dari berbagai perusahaan yang
bergerak dalam bioteknologi. Walaupun nama masing-masing alat itu
berbeda tetapi prinsip kerjanya sama.12
d) Tahapan
1. Ekstraksi DNA
Proses ekstraksi DNA dilakukan untuk memisahkan genom DNA dari
molekul lain di dalam suatu sel. Langkah awal dalam analisis DNA adalah
memisahkan genom DNA menjadi fragmen-fragmen spesifik yang lebih
kecil yaitu dengan cara mengekstraksi genom DNA dari darah. Ekstraksi
dilakukan berdasarkan protocol Geneaid FresfoTM Gdna Blood Kit.
Dimana pada Ekstraksi DNA yang dilakukan terdapat beberapa tahap
yaitu, Tahap Preparasi Sampel, Tahap Lisis sel, Tahap Pengikatan DNA,
Tahap Pencucian, Tahap Pemisahan DNA dari senyawa-senyawa kimia
sehingga mendapakatkan DNA murni.14
Pada tahap preparasi sampel ditambahkan RBC Buffer dan GB Buffer
untuk memisahkan atau memecahkan leukosit dalam sampel untuk
mempermudah proses lisis sel selanjutnya, suhu yang tinggi akan
membantu mempercepat terjadinya lisis sel. Selanjutnya, dilakukan
penambahan Etanol Absolut untuk mengumpulkan DNA, proses ini biasa
disebut juga DNA binding karena pada tahapan ini sampel DNA
dikumpulkan. Pada tahapan selanjutnya, dilakukan proses rehidrasi DNA
yang bertujuan untuk mencairkan atau melepaskan DNA, karena produk
DNA dalam bentuk sedimen. Rehidrasi dilakukan dengan menambahkan
larutan pre-heated Elution Buffer yang dapat melarutkan DNA. Setelah
proses rehidrasi selesai maka produk DNA yang selanjutnya akan
divisualisasi pada elektroforesis.14
Isolasi DNA merupakan teknik ekstraksi dan atau purifikasi DNA
dari suatu sel sebagai tahap awal suatu analisis genetik. Isolasi DNA
diperlukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti
protein, lemak, dan karbohidrat.
Terdapat 3 prinsip utama dalam isolasi DNA ;
1) penghancuran (lisis),

22. 19
2) esktraksi / pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan
protein,
3) pemurnian DNA.
2. Amplifikasi
a) Denaturasi untai ganda DNA
Tahap pertama pada sistem amplifikasi PCR adalah denaturasi
DNA sampel dengan menaikkan suhu dalam tabung reaksi sampai
95 derajat Celcius. Tabung reaksi ini berisi DNA target, dua primer
oligonukleotida dalam jumlah berlebih, Taq DNA polymerase yang
tahan panas, keempat deoksiribonukleotida dan bufer yang
mengandung Mg. Selama proses denaturasi yang berlangsung dalam
beberapa menit, untai ganda DNA (dsDNA) mencair dan ikatannya
terbuka sehingga terjadi pemisahan untai ganda DNA menjadi untai
tunggal DNA (ssDNA).12
Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami
renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini
dapat mengakibatkan gagalnya proses PCR.12
b) Primer Annealing
Tahap kedua pada sistem amplifikasi PCR adalah primer
annealing. Primer Annealing merupakan pengenalan (annealing)
suatu primer terhadap DNA target tergantung pada panjang untai,
banyaknya kandungan GC, dan konsentrasi primer itu sendiri.
Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45
detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi suhunya.
Kisaran suhu penempelan yang digunakan adalah antara 37 derajat
Celcius sampai dengan 60 derajat celcius. Pada tahap ini, primer
menempel pada sekuen komplementernya pada DNA target.

23. 20
Optimalisasi suhu annealing dimulai dengan menghitung Melting
Temperature (Tm) dari ikatan primer dan cetakan DNA.12
c) Ekstensi/ Elongasi
Pada tahap extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru
DNA, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa
nukleotida DNA target yang akan bergerak dari ujung 5’ menuju
ujung 3’ dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau
pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang
urutan basa nukleotida yang ditargetkan.12

24. 21
e) Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular
berdasarkan ukurannya dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada
suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini
dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul, misalnya DNA yang bermuataan negatif. Jika molekul
bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarosa,
kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub yang berlawanan muatannya, maka
molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif.20
Elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk menganalisis fragmen-
fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi. Fragmen molekul
DNA yang telah terpotong-potong dapat ditentukan ukurannya dengan cara
membuat gel agarosa (suatu bahan semi-padat berupa polisakarida yang
diekstraksi dari rumput laut). Gel ini dibuat dengan cara melarutkannya dalam
suatu buffer yang pelarutannya dibantu dengan pemanasan, misalnya
menggunakan oven gelembung mikro. Dalam keadaan panas, gel akan bewujud
cairan sehingga mudah dituang ke atas suatu lempeng (plate) yang biasanya
terbuat dari Perspex. Sebelum mendingin dan memadat, dibuat lubang-lubang
pada ujung gel dengan menggunakan lembaran Perspex tipis yang dibentuk
menyerupai sisir dan ditancapkan pada salah satu ujung gel yang masih cair. Ke
dalam lubang-lubang kecil itulah sampel DNA dimasukkan. Gel agarosa yang
sudah terbentuk kemudian dimasukkan ke dalam tanki yang berisi buffer.
Buffer dapat dibuat dengan asetat-EDTA (TAE) atau tris-borat-EDTA (TBE).
Lalu setelah DNA dimasukkan, arus listrik dialirkan.20
Kutub yang sejajar dengan lubang sampel DNA berupa kutub negatif,
sedangkan kutub lainnya positif. Karena DNA bermuatan negatif maka molekul
DNA akan bergerak ke arah kutub positif. Setelah itu gel direndam di larutan
yang mengandung etidium bromida. Etidium bromida ini akan menyisip ke
dalam DNA dan membantu visualisasi karena etidium bromida memendarkan
sinar ultraviolet. Jika gel disinari dengan ultraviolet dari bawah, maka akan
tampak citra berupa pita-pita gel. Pita-pita itu adalah molekul DNA yang
bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesis.20
Elektroforesis terdiri dari beberapa komponen utama dalam
penggunaanya. Yang pertama adalah larutan elektrolit yang berfungsi sebagai

25. 22
pembawa komponen. Umumnya berupa larutan buffer dengan pH tertentu
sesuai dengan karakteristik senyawa yang akan dipisahkan. Berikutnya media
pemisah merupakan tempat proses pemisahan terjadi. Media pemisah ini berupa
kertas (selulosa asetat, selulosa nitrat), gel kanji, gel polikrilamid, busa
poliuretan atau agar-agar. Selanjutnya yang paling penting adalah elektroda
yang berfungsi sebagai penghubung arus listrik dengan media pemisah dan
baterai atau arus listrik sebagai sumber energi (source) pada rangkaian alat.5
(Maksum, 2017)
Penggunaan Medium Pemisah
Keberhasilan dari teknik elektroforesis dipengaruhi pemilihan medium
pemisahnya. Ada dua medium yang sering digunakan dalam menggunakan
elektroforesis. Yang pertama gel Agarosa. Merupakan metode standar untuk
mengidentifikasi serta memurnikan fragmen-fragmen Deoxyribo Nucleic Acid
(DNA) dan Ribose Nucleic Acid. Senyawaan tersebut merupakan pembawa
genetika pada makhluk hidup-dilakukan pada medan listrik horizontal.
Kelebihan dari gel ini lebih mudah, sederhana dan laju pemisahannya lebih
cepat membentuk fragmenfragmen dan tidak bersifat toksik. Hanya saja
kelemahannya gel ini memiliki sensitifitas tinggi dan mudah rusak sehingga
memerlukan ketelitian dan kehati-hatian pada proses pengerjaannya. Yang
kedua gel poliakrilamida. Gel ini memiliki memiliki resolusi tinggi pada hasil
pemisahannya. Membutuhkan tegangan listrik yang tinggi pada pengerjaannya
dan dilakukan pada medan listrik vertical. Persiapan pengerjaan membutuhkan
waktu relatif lama, mahal dan memiliki laju pemisahan yang lebih lambat
dibandingkan gel Agarosa (Rita Elfianis).5

26. 23
(Yusuf, 2010)
Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Elektroforesis
Proses pemisahan dengan elektroforesis sangat dipengaruhi oleh teknik
pengerjaan dalam pengoperasian alat tersebut. Disamping medium pemisah
yang sudah dielaskan diatas, ada beberapa faktor penentu lainnya yang dapat
mempengaruhi proses pemisahan yaitu5
:
1. Sampel
Sampel yang akan dipisahkan sangat memungkinkan memberi
pengaruh laju perpindahan ditinjau dari muatan, ukuran, dan bentuk
molekul. Jumlah muatan total akan berbanding lurus dengan laju
perpindahan, konsentrasi muatan yang bermigrasi tergantung pada
pH. Untuk ukuran molekul apabila yang diperoleh lebih besar
menyebabkan perpindahan molekul menurun dan membutuhkan
energi perpindahan yang cukup besar dibandingkan dengan bentuk
molekul yang berbeda dengan ukuran yang sama.5
2. Larutan Buffer
Larutan buffer berfungsi untuk mempertahankan pH di dalam
medium pemisah, dan berfungsi sebagai media penyedia elektrolit
pada proses pergerakan aliran listrik. Larutan buffer harus memiliki
interkasi dengan molekul yang dipisahkan, dan pH yang digunakan

27. 24
menjadi perhatian sehingga kumpulan molekul dapat dipisahkan satu
sama lain tetapi tidak mengalami perubahan struktur. Larutan
penyangga harus dipilih dengan cermat, keterkaitan ion buffer dalam
berinteraksi dengan senyawa yang diteliti, pH dipilih berdasarkan
jenis campuran yang akan dipisahkan. Umumnya pemisahan dapat
dicapai pada titik isolistrik (yaitu titik ketika pH suatu makromolekul
bermuatan nol akibat bertambahnya atau kehilangan muatan), salah
satu senyawa yang dipilih sebaiknya tidak mengakibatkan perubahan
kimia atau perubahan struktur molekul yang akan diteliti. Kisaran
kekuatan ionik larutan buffer pada 0,05-0,15 mol/L dan biasanya
diambil nilai di antara kedua nilai ekstrem. Pada kekuatan ionik yang
rendah akan terjadi pergerakan molekul yang cepat dan produksi
panas yang rendah, akan tetapi terjadi difusi yang nyata. Di pihak
lain, pada kekuatan ionik yang tinggi, diperoleh pita- pita yang tajam,
namun akan terjadi produksi panas yang lebih tinggi dan terjadi
pergerakan molekul pada jarak yang pendek.5
3. Medan listrik
Sumber suatu listik yang stabil sangat diperlukan untuk
menghasilkan aliran listrik dengan tegangan yang konstan. Kekuatan
ionik medan listrik pada kisaran 2-8 V/cm sesuai pada suhu ruang.
Kekuatan medan magnet yang dihasilkan jika lebih besar dari 10
V/cm, maka dapat memberikan efek pemanasan yang dapat
menyebabkan pada media penyangga terjadi kehilangan air yang
diakibatkan proses penguapan. Hal tersebut juga mengakibatkan
pergeseran hasil fragmen-fragmen. Pemanasan merupakan salah satu
faktor yang mengakibatkan senyawa-senyawa terdenaturasi.
Disamping kekurangan dengan menggunakan tegangan yang tinggi,
keuntungan elektroforesis pada voltase tinggi mengakibatkan
pemisahan yang sangat cepat. Sehingga senyawa-senyawa dengan
berat molekul rendah akan mengalami proses difusi yang paling baik
dipisahkan dalam kondisi elektroforesis tegangan tinggi.5

28. 25
2. Mahasiswa/i mampu memahami dan menjelaskan mengenai teknik sequencing
meliputi :
a) Fungsi
b) Komponen
c) Tahapan
Sequencing merupakan tahap akhir dalam menentukan urutan nukleotida
fragmen hasil amplifikasi dengan PCR. Komponen yang terdapat pada sequencing
sama seperti yang digunakan dalam teknik PCR yang membedakan adalah
penggunaan dideoksinukleotida (ddNTPs) berlabel untuk elongasi DNA.15
a) Fungsi
1. Menentukan urutan basa nitrogen (adenin, guanin, sitosin, dan timin)
suatu sampel DNA.17
2. Mengetahui kode genetik dari molekul DNA.17
3. Menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA dengan
cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang
sudah diketahui.17
4. Dapat digunakan untuk mendiagnosis kelainan genetik dengan
mengamati perbedaan sekuens DNA yang diketahui yang berkaitan
dengan kelainan tersebut sampai identifikasi mutan pada
mikroorganisme dan tanaman.8
b) Komponen
Terdapat beberapa komponen yang dibutuhkan untuk sekuensing DNA, antara
lain sebagai berikut :
1) Template (cetakan) DNA
Untuk sequencing dibutuhkan cetakan DNA hasil PCR atau cloning
yang disintesis melalui reaksi PCR menggunakan pasangan primer
eksternal.[15][17]
2) Primer
Untuk squencing, primer yang dibutuhkan hanya satu karena hanya
untuk pembacaan saja. Primer berfungsi sebagai pembatas sekuen DNA
target yang akan diamplifikasi. Primer yang biasa digunakan dalam
proses sekuensing adalah primer eksternal, namun hanya dapat
membaca ±600 bp. Secara teori, panjang sekuen yang dapat dibaca satu
kali proses sequencing berkisar antara 1000-1500 bp. [15][17]

29. 26
Primer yang digunakan harus memiliki kriteria primer yang baik.
Kriteria tersebut meliputi seperti panjang primer serta persentase Guanin
dan Cytosin.17
3) Enzim DNA polimerase
Enzim DNA polimerase yaitu enzim yang melakukan katalisisreaksi
sintesis rantai DNA.[15][17]
4) dNTPs (deoxynucleotide triphosphates)
dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP
(deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP
(deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). [15][17]
5) ddNTP (dye terminator labeling)
ddNTP (dye terminator labeling) merupakan zat warna yang berperan
sebagai terminator polimerisasi DNA.[15][17]
c) Tahapan
Sekuensing merupakan tahap akhir dalam menentukan urutan
nukleotida fragmen hasil amplifikasi dengan PCR. Sekuensing dilakukan
dengan metode Sanger menggunakan Automatic DNA Sequencer yang
berdasarkan pada metode dye terminator labelling. Tahapan sekuensing DNA
yang dilakukan pada penelitian ini meliputi, yaitu14
:
1) Penyiapan DNA
2) Proses amplifikasi melalui PCR dengan menggunakan primer
universal
3) Pemurnian DNA
4) Elektroforesis
5) Pembacaan elektroforegam hasil sekuensing.14
Data yang diperoleh berupa elektroforegram dalam bentuk ABI file,
dimana setiap nukleoida ditunjukkan oleh warna yang berbeda. Nukleotida
Adenin (A) ditunjukkan dengan warna hijau, Guanin (G) ditunjukkan dengan
warna hitam, Timin (T) ditunjukkan dengan warna merah danSitosin (C)
ditunjukkan dengan warna biru. Analisis hasil sekuensing produk PCR
dilakukan dengan membandingkan urutan nukleotida sampel terhadap urutan
nukleotida kontrol. Urutan nukleotida sampel dan urutan nukleotida kontrol
dimasukkan pada program yang dengan otomatis akan mengurutkan nukleotida

30. 27
sampel sesuai dengan urutan danposisi nukleotida standar dan kemudian akan
menandai nukleotida tertentu yang berbeda dengan nukleotida kontrol.14
3. Mahasiswa/i mampu memahami dan menjelaskan mengenai teknik biologi
molekuler selain teknik PCR dan sequencing.
Terdapat beberapa teknik dalam biologi molekuler selain Polymerase Chain
Reaction (PCR) dan Sequencing, yaitu :
1. Isolasi DNA
Isolasi DNA merupakan suatu teknik dari biologimolekuler dan
bioteknologi yang bertujuan untuk memisahkan DNA dari partikel-partikel lain
seperti lipid, protein, dan zat lainnya.6
Isolasi DNA juga dapat digunakan
sebagai media pembelajaran genetika untuk mengetahui kelainan yang diderita
oleh seseorang serta dapat mengetahui agen penyebab infeksi.12
Isolasi DNA
dapat dilakukan pada semua makhluk hidup dan juga virus.6
Ada tiga prinsip utama dalam isolasi DNA yaitu lisis, ektraksi, dan purifikasi.12
1) Lisis (Pemecahan dinding sel DNA)
Pemecahan dinding sel DNA dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu :
a. Secara fisik : sel dipecah dengan kekuatan mekanik
b. Secara kimiawi : sel dipecah menggunakan senyawa kimia seperti:
 EDTA (Ethylen Diamnine Tetra Acetic), berfungsi untuk
menginaktivasi enzim nuclease yang merupakan enzim
pendegradasi DNA.

31. 28
 SDS (Sodium Dodecyl Sulphat), berfungsi untuk
menghancurkan membran sel.
2) Ektraksi ( Pemisahan DNA dari bahan padat)
Pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein dengan cara
sentrifugasi, suatu teknik pemisahan campuran yang dilakukan dengan
memanfaatkan gaya sentrifugal. Pada prinsip ini menggunakan beberapa
bahan seperti :
a. Fenol, berfungsi untuk membersihkan nukleotida yang terpisah
(DNA&RNA) dari protein
b. Kloroform, berfungsi membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida
dari larutan
c. CTAB (Cetyl trimetil ammoniumbromide), berfungsi untuk mengikat
DNA dan memisahkan DNA dari karbohidrat dan protein
d. Enzim RNAase, berfungsi untuk menghancurkan RNA sehingga DNA
dapat diisolasi secara utuh
3) Purifikasi (Permurniaan)
Pada prinsip ini terjadi permurniaan yang dimana DNA dicampur dengan:
a. NaCl yang bertujuan untuk memekatkan atau memisahkan DNA dari
larutan.
b. Etanol yang berfungsi untuk mengendapkan (presipitasi) DNA3.
c. Isopropanol yang berfungsi untuk melarutkan dan mengendapkan DNA.
2. Kultur Sel
Kultur sel merupakan proses penghilangan atau perpindahan sel dari
manusia, hewan, atau tanaman ke dalam medium terkontrol yang sesuai untuk
menumbuhkan sel tersebut. Pada teknik kultur, sel dapat diambil secara
langsung dari jaringan atau dengan proses enzimatik maupun mekanik, sebelum
kemudikan dikultivasi (dibiakkan). Sel dapat diisolasi dari jaringan, lalu
membiakkan kultur sel selama berhari-hari sampai berminggu-minggu. Sel
yang digunakan dapat berasal dari jaringan normal (contohnya, jaringan kulit)
ataupun jaringan yang sakit (contohnya, sel tumor hati) yang diambil selama
operasi sebagai bagian dari terapi untuk pasien.7
Sel pada kultur dapat dikategorikan menjadi 3 berdasarkan bentuknya, yaitu :
1) Sel Fibroblast7

32. 29
Sel fibroblast merupakan sel bipolar atau multipolar, memiliki bentuk
memanjang, dan tumbuh melekat pada substrat.
Gambar : Sel Fibroblast
2) Sel Epitel7
Sel epitel merupakan sel yang berbentuk poligonal dengan dimensi lebih
teratur, dan tumbuh melekat pada substrat di patch diskrit.
Gambar : Sel Epitel
3) Sel Limfoblast7
Sel limfoblast merupakan sel-sel yang berbentuk bulat dan biasanya
tumbuh di medeium suspensi tanpa melekat ke permukaan.
Gambar : Sel Limfoblast
3. Oligonukleotida Spesifik Alel (ASO)
Oligonukleotida spefisik alel adalah teknik yang memungkinkan deteksi
mutasi basa tunggal tanpa memerlukan PCR atau gel elektroforesis. Ini adalah
alat yang umum digunakan dalam pengujian genetik, forensik, dan penelitian
biologi molekuler.11
4. Hibridisasi in situ
Hibridisasi in situ adalah salah satu metode analisis DNA dengan
menggunakan probe asam nukleat dengan tujuan untuk mengidentifikasi
rangkaian DNA yang spesifik. Prinsip dalam melakukan hibridisasi in situ

33. 30
adalah mempersiapkan cetakan asam nukleat, specimen yang akan diuji, dan sel
targetnya yaitu DNA atau RNA.16

34. 31
BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
PCR atau reaksi berantai polymerase adalah suatu metode enzimatis dalam bidang
biologi molekuler yang bertujuan untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu
sekuen nukleotida tertentu dengan jumlah kelipatan ribuan hingga jutaan salinan secara in
vitro. Jenis-jenis PCR yaitu Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Inverse-
PCR, Nested-PCR, Quantitative-PCR, Reverse Transcriptase (RT-PCR), Random
Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR), dan
Amplification Refractory Mutation System (ARMS PCR). Pada proses PCR diperlukan
beberapa komponen utama yaitu DNA cetakan, oligonukleotida primer,
deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), enzim DNA polimerase, senyawa buffer, dan PCR
Thermal Cycler (mesin PCR). Tahapan dalam PCR adalah ekstraksi DNA dan amplifikasi.
Dalam tahap amplifikasi, terjadi denaturasi untai ganda DNA, primer annealing, dan
ekstensi/elongasi.
Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya
dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung
sampel yang akan dipisahkan. Elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk menganalisis
fragmen-fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi. Keberhasilan dari teknik
elektroforesis dipengaruhi pemilihan medium pemisahnya.
Sekuensing merupakan tahap akhir dalam menentukan urutan nukleotida fragmen
hasil amplifikasi dengan PCR. Komponen yang terdapat pada sequensing sama seperti yang
digunakan dalam teknik PCR yang membedakan adalah penggunaan dideoksinukleotida
(ddNTPs) berlabel untuk elongasi DNA. Sekuensing merupakan tahap akhir dalam
menentukan urutan nukleotida fragmen hasil amplifikasi dengan PCR. Sekuensing
dilakukan dengan metode Sanger menggunakan Automatic DNA Sequencer yang
berdasarkan pada metode dye terminator labelling.
Terdapat beberapa teknik dalam biologi molekuler selain Polymerase Chain Reaction
(PCR) dan Sequencing, yaitu isolasi DNA, kultur sel, Oligonukleotida Spesifik Alel
(ASO), dan hibridisasi in situ.

35. 32
3.2 Saran
Dengan disusunnya laporan ini, diharapkan pembaca dapat mengerti dan memahami
mengenai teknik biologi molekuler. Semoga laporan ini dapat bermanfaat bagi seluruh
pihak. Dalam laporan ini kami memohon maaf jika terdapat tulisan atau bahasa kami yang
kurang berkenan. Dengan demikian kami mengharapkan kritik dan saran atas laporan kami
agar dapat membangun dan memotivasi sehingga bisa membuat laporan lebih baik lagi.

36. iii
DAFTAR PUSTAKA
1. Adikara, I. J. (2016). Optimasi Suhu Annealing Tiga Regio Berbeda Isolat
Multidrug Resistance Mycobacterium Tuberculosis dengan Metode Multiplex
Polymerase Chain Reaction. Jurnal Veteriner Vol. 17 No. 4 : 535-539 pISSN:
1411-8327; eISSN: 2477-5665, 535-539.
2. Budiarto, B. R. (2015). Polymerase C(PCR) : Perkembangan dan Perannya dalam
Diagnostik Kesehatan.. BioTrends Vol.6 No.2 , 29-38.
3. Ethica, S.N. (2019). Pengantar Bioinformatika Untuk Mahasiswa Laboratorium
Medis. Yogyakarta: Penerbit Deepublish.
4. Feranisa, A. (2016). Komarasi antara Polymerase CHain Reaction (PCR) dan
Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) dalam Diagnosis Mediated
Isothermal Amplification (LAMP). ODONTO Dental Journal. Volume 3. Nomer
2, 145-151.
5. Harahap, Muhammad Ridwan. (2018). Elektroforesis: Analisis Elektronika
Terhadap Biokimia Genetika. Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro, Vol.2,
No.1, hal. 21-26.
6. Hariyadi, Slamet. dkk. (2018) Jurnal Perbandingan Metode Lisis Jaringan Hewan
dalam Proes Isolasi DNA Genom pada Organ Liver Tikus putih (Rattus
norvegicus) vol.15 no.1.
7. Khumairoh, Ika., dkk. (2016). Farmaka Kultur Sel. Vol 14 No 2.
8. Kusnadi, J., dan Arumingtyas, A.L. (2020). Polymerase Chain Reaction (PCR)
Teknik dan Fungsi. Malang: UB Press.
9. Lokapirnasari, Widya Paramita. dkk. (2017). Sekuensing 16S DNA Bakteri
Selulolitik Asal Limbah Cairan Rumen Sapi Peranakan Ongole. Jurnal Veteriner
Vol. 18 No. 1 : 76-82 pISSN: 1411-8327; eISSN: 2477-5665
10. Maksum, Iman Permana, dkk. (2017). Teknik Biologi Molekuler. Sumedang:
Alqaprint Jatinangor.
11. Mendel, Yavor. (2020). Teknik Biologi Molekuler I. Cambridge Stanford Books.
12. Nurhayati, B., Darmawati, S. (2017). Biologi Sel dan Molekuler (Bahan Ajar
Teknologi Labotarium Medis). Jakarta: Indo. Kemkes. BPPSDM.

37. iv
13. Puspitaningrum, R. C. A. (2018). Genetika Molekuler dan Aplikasinya.
Yogyakarta: Deepublish.
14. Rosana, A., Eva, J., Handayani, L. (2018). Fil DNA Gen Follice Stimulating
Hormone Reseptor (FSHR) Pada Wanita AKNE Dengan Teknik PCR Dan
Sekuensing DNA.Vol 3 No.1 (1-11): Jurnal Biologi Makassar.
15. Sogandi. (2018). Biologi Molekuler Identifikasi Bakteri Secara Molekuler. Jakarta:
Universitas 17 Agustus 1945.
16. Susilowati, Rina Priastini. (2019) Kajian Sel dan Molekuler (Hubungannya
Dengan Penyakit Pada Manusia). Jakarta: Pena Persada.
17. Vaniana, D., dan Putri, D. H. (2019). Analysis Internal Primer Of Genes 16s Rrna
Endophytic Bacteria Producing Compound Antimicrobial For Sequencing. Bio
Sains 4 (1), 54-62: Universitas Negeri Padang
18. Yudianto, A. (2020). Pemeriksaan Forensik DNA Tulang dan Gigi : Identifikasi
pada DNA Lokus STR CODIS, Y-STRs, dan mtDNA. SINTESA BOOK.
19. Yusuf, Z. K. (2010). Polymerase Chain Reaction (PCR). Jurnal Saintek, Vol. 5,
No. 6
20. Yuwono, Triwibowo. Biologi Molekular. Jakarta: Penerbit Erlangga.