sac ky GC LC IC

TỔNG QUÁT VỀ SẮC KÝ
Động học của quá trình sắc ký:
Mỗi một phân tử chất trong quá trình sắc ký không ngừng chuyển từ pha
động vào pha tĩnh và ngược lại. Khi phân tử bị hấp phụ nó sẽ nằm lại. Còn khi
được giải hấp phụ nó sẽ di chuyển cùng tốc độ với pha động. Quá trình hấp phụ –
giải hấp phụ được lặp đi lặp lại đối với mọi phân tử một cách ngẫu nhiên. Do đó có
một số phân tử chuyển động với tốc độ nhanh hơn tốc độ trung bình, còn một số
khác chuyển động với tốc độ chậm hơn và kết quả của sự chuyển động hỗn loạn đó
làm cho vùng giãn rộng.
Tốc độ dòng lớn quá hoặc bé quá đều giảm độ hiệu năng của cột.
Có nhiều cách phân loại và gọi tên các phương pháp sắc ký. Ví dụ:
– Theo cơ chế của quá trình phân tách: sắc ký hấp phụ (TLC, sắc ký giấy), sắc ký
phân bố (GC, HPLC), sắc ký trao đổi ion (IC), sắc ký rây phân tử (lọc gel hay
thấm gel), sắc ký ái lực và điện di mao quản (CE).
– Theo pha động, người ta phân thành: sắc ký lỏng (liquid chromatography, LC),
sắc ký khí (gas chromatography, GC), sắc ký lỏng quá tới hạn (super – critical fluid
chromatograyphy, SFC).
– Theo hình dạng của pha tĩnh người ta xếp các phương pháp sắc ký vào 2 nhóm
chính là sắc ký mặt phẳng (palar chromatography, PC) gồm sắc ký giấy, sắc ký lớp
mỏng…; và sắc ký cột (columm chromatography, CC) gồm sắc ký cột cổ điển, sắc
ký lỏng cao áp, sắc ký khí…
– Theo phương pháp khai triển sắc ký, người ta phân ra phương pháp phân tích
tuyến, phương pháp thế chỗ và phân tích rửa giải.
– Trên thực tế, người ta thương gọi tên các phương pháp sắc ký theo thói quen
chứ không gọi theo một cách thống nhất.
Ba loại sắc ký phổ biến hiện nay gồm TLC, HPLC, GC.

Phân loại sắc ký dựa trên cơ chế cân bằng:
 Sắc ký hấp phụ (Adsorption): pha tĩnh là một chất rắn có khả năng hấp phụ
giữ trên bề mặt, thường là chất vô cơ (SiO2 , Al2O3 , than hoạt tính…). Pha
động là lỏng hoặc khí.
 Sắc ký phân bố (Distribution): pha tĩnh là chất lỏng không hoà lẫn được
với pha động, chất lỏng này được bao trên bề mặt của một chất rắn gọi là giá
hay chất mang và phải là chất trơ, không tham gia vào sắc ký. Đây là dạng
sắc ký phổ biến nhất gồm 2 loại: pha động là dạng lỏng (HPLC) hoặc khí
(GC).
Một số tài liệu xếp chung hấp phụ và phân bố chung trong nhóm Sắc ký phân
cực (Polarity)
 Sắc ký rây phân tử SEC (Size Exclusion) gồm GPC (Gel Permeation) với
pha động là nước và GFC (Gel Filtration) với pha động là dung môi hữu cơ:
tách dựa trên kích thước phân tử, những phân tử kích thước lớn hơn kích
thước lỗ của pha tĩnh không khuếch tán, tương tác pha tĩnh sẽ ra khỏi cột.
Thường dùng cho giai đoạn clean-up mẫu sinh học sau khi chiết, giúp giảm
cản nhiễu và bảo vệ cột.

 Sắc ký ion IC: trao đổi (exchange), ghép cặp (pair), lùi ion hoá (exclusion).
Được áp dụng phổ biến nhất cho xác định các anion. Việc xác định cation
chỉ giới hạn cho kim loại kiềm, kiềm thổ, NH4
+ tuy nhiên cũng không nhạy
bằng phương pháp khác (ICP-AES, GF-AAS,...)
Các thông số sắc ký :
* Độ phân giải Rs (resolution): đánh giá khoảng cách giữa 2 pic.
Rs = 2(t2 - t1)/(Wb1 + Wb2)
Rs ≥1.5 là đạt yêu cầu, nếu Rs quá lớn cũng không tốt vì thời gian phân tích lâu
* Hệ số dung lượng K’ (retention / capacity factor):

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong
hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và
lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.
K’ = ( tR - t0)/ t0
Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu K’ lớn thì pic bị doãng.
Trong thực tế K’ từ 1- 5 là tối ưu.
* Độ chọn lọc α (selectivity):
α = K’1/ K’2
* Số đĩa lý thuyết (theoretical plate) hay đánh giá hiệu năng cột qua giá trị bề rộng
pic, độ nhọn.
N = 5,54(t/Wb)2
t : thời gian lưu (giây) ; Wb bề rộng pic tại phân nửa chiều cao pic (giây)
Với cùng chất liệu nhồi cột, đường kính thì N càng lớn khi cột càng dài,
đường kính hạt nhồi nhỏ.
+ Sắc ký lỏng : N < 20.000
+ Sắc ký khí : N vài trăm ngàn tới 1 triệu
* Hệ số kéo đuôi (tailing) hay đối xứng (assymetry factor):
T=B/A
B, A : khoảng cách từ (đường thẳng từ đỉnh pic vuông góc với đáy) đến 2
bên sườn pic ở độ cao 1/10 của pic. Trong thực tế có thể chấp nhận T=0,8-1,2.
* Chiều cao tương đương với đĩa lý thuyết
HETP =L/N =0,1-1 mm với L: chiều dài cột

Phân chia các loại cột sắc ký:
1. Sắc ký GC có hai loại là:
- Cột nhồi (packed): pha tĩnh được nhồi vào trong cột, cột có đường kính trong 2-
4mm và chiều dài vài m, chủ yếu dùng trong sắc ký điều chế.
- Cột mao quản (capillary, open tubular): pha tĩnh được phủ lớp mỏng mặt trong
(loại WCOT), cột có đường kính trong 0.1-0.5mm, độ dày film 0.1-5µm và chiều
dài 10-100m.
Cột mao quản được chia thành nhiều loại theo đường kính trong (id): narrow-
bore (ống hẹp), wide-bore (ống rộng),…
Đường kính trong id: phổ biến là loại 0.25mm. Đối với kỹ thuật GC-MS
thường ưu tiên dùng id nhỏ hơn (0.1-0.2mm) kết hợp tiêm chia dòng.
Độ dày film df: phổ biến từ 0.1-0.25µm phù hợp cho phân tích chất có nhiệt
độ sôi>300 hoặc hàm lượng vết như thuốc BVTV, PCB, FAME, phthalate ester,
còn df từ 1-5µm phù hợp cho phân tích chất dễ bay hơi VOC, các khí.
Chiều dài cột L: phổ biến 30m là vừa đủ đạt độ phân giải cần thiết, thời gian
phân tích nhanh. Nếu mẫu có nhiều thành phần phức tạp, sử dụng cột dài 60m. Hai
cột sau có hiệu năng như nhau: 30m x 0.53mm x 0.50μm và 30m x 0.25mm x
0.25μm
Hiệu năng phân tách của cột tỷ lệ thuận với chiều dài, tỷ lệ nghịch với đường
kính trong.
Cột nhồi (GC) Cột mao quản (GC)
Cấu tạo Thủy tinh hoặc thép
không rỉ
Silica nung chảy
(polyamid phủ mặt ngoài)
id 2 – 4 mm 0.18 – 0.53 mm
L vài cm – vài m 10 – 100 m
dp 90 - 250 µm
df 0.1 – 5 µm

2. Sắc ký HPLC chủ yếu là loại cột nhồi :
+ chiều dài 10-30cm đối với HPLC, 3-5cm đối với HPLC-MS
+ id~4-5mm (2-3 mm đối với HPLC-MS do tốc độ dòng cho đầu dò MS nhỏ
nên phải dùng cột có id nhỏ)
+ cỡ hạt 5µm đối với HPLC, 7-12µm đối với IC, SEC.
Việc phân loại theo id trong HPLC khác với GC. Loại cột mao quản cho
HPLC (id<1mm), dài tương đương cột thường, đặc biệt phù hợp cho đầu dò MS.
Trong kỹ thuật HPLC thường dùng cột có id là 4.6mm, chiều dài 25cm. Việc
lụa chọn id còn phụ thuộc vào loại đầu dò sử dụng : Đầu dò UV thường dùng cột id
4.6 mm. Đầu dò MS dùng cột id 2 - 3 mm. Đầu dò huỳnh quang dùng cột id 1 - 2
mm. Còn trong kỹ thuật UHPLC nói riêng, sử dụng cột có id là 2.1mm
Đường kính hạt nhồi (dp) càng bé thì khả năng tách pic càng tốt, có thể chạy
với áp suất cao, tốc độ dòng pha động lớn nên thời gian chạy rút ngắn.

Tóm lại:
Cột có đường kính trong (id) càng nhỏ thì độ nhạy càng tốt, pic càng tách rõ,
tiêu tốn ít dung môi và khí, thời gian phân tích càng nhanh ; nhưng chỉ cho phép
tiêm một lượng thể tích nhỏ. Loại cột dài thường cho khả năng tách pic và độ nhạy
tốt hơn tuy nhiên lại có thời gian lưu dài hơn và cần áp suất lớn hơn.
Cột có id >10mm dùng để tinh sạch hỗn hợp trong sắc ký điều chế;

Cột có id 4.6mm là loại thường được sử dụng nhất trong hai máy HPLC, IC.
Cột có id từ 1 - 2mm thường dùng trong các ứng dụng cần độ nhạy cao
Cột có id <0.53mm thuộc dạng mao quản thường dùng trong máy GC, với
cột id<0.2mm phải dùng kỹ thuật tiêm chia dòng để không làm quá tải cột.
Các bước tiến hành chung trong giai đoạn chuẩn bị mẫu:
Phương pháp xác định hàm lượng chất hữu cơ bằng sắc ký khí phải dùng các
phương pháp chiết (extraction) do :
+ Nhiều cột sắc ký không tương thích, bị mất hoạt tính với nước.
+ Việc tiêm mẫu có chứa chất rắn không bay hơi sẽ làm nghẽn, giảm tuổi
thọ cột
+ Giúp tách riêng chất phân tích, do đó giảm các cản trở, phân tích dễ dàng,
tăng tuổi thọ cột.
+ Làm giàu chất phân tích, hạ thấp GHPH.
Nếu mẫu sau khi chiết vẫn còn nhiều chất cản trở cần tiến hành thêm giai
đoạn làm sạch (clean-up). Cần lưu ý chọn loại dung môi phù hợp với detectơ. Với
FID, không được dùng ether dầu hỏa hay hexan. Với ECD, không dùng dung môi
chứa Clo, Oxi nên thường dùng hexan hay ether dầu hỏa. Nếu dung môi sau khi
chiết không phù hợp phải làm như sau: làm bay hơi dịch chiết đến khô bằng máy cô
quay chân không, sau đó hoà tan bằng dung môi thích hợp.
Bước 1: Chuẩn bị sơ bộ
Mẫu nước: lọc mẫu nếu cần
Mẫu đất: rây qua sàn 2 mm, ngâm với dung dịch nước cất hay NH4Cl.
Mẫu cá: bỏ đầu, nội tạng, da rồi nghiền trộn với cát, Na2SO4 trong cối sứ.
Bước 2: Tách chiết, làm sạch
Các phương pháp sau dùng cho thuốc BVTV không ion, độ tan < 50 g/l nước:
a) Phương pháp truyền thống là chiết lỏng-lỏng (LLE) có hạn chế như
độc hại, tiêu tốn nhiều dung môi. Hai dung môi thường dùng là ethylacetate,
dichloromethan trong đó ethylacetat ít độc hơn, tan trong nước nhiều hơn, thích hợp
hơn cho chất phân cực. Hiệu suất chiết được điều chỉnh bằng pH và lực ion. Hiệu
quả của một dung môi chiết phụ thuộc chủ yếu vào ái lực của chất tan với dung môi
chiết (KD), tỷ số pha (V) và số lần chiết (n).

Có thể tác động giá trị KD mong muốn bằng cách:
+ điều chỉnh pH để ngăn chặn sự ion hóa các axit/bazơ
+ hoặc thêm các muối trung tính vào pha nước để giảm độ hòa tan của chất hữu cơ.
+ hoặc tạo phức kỵ nước với ion kim loại.
Mẫu sau khí chiết lỏng-lỏng, cần thêm công đoạn làm sạch (clean-up),
thông thường bằng SPE hoặc SPME
Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE): tiêu tốn ít dung môi và ít độc hại. Nguyên
tắc là cho mẫu đi qua cột sắc ký với pha tĩnh là Silica biến tính RP-C18 hay RP-C8
cartridge hay disk, sau đó rửa giải bằng một dung môi thích hợp. Vì mẫu phải lọc
trước khi qua cột nên sẽ không chiết được phần trong chất rắn lơ lửng. SPE ra đời
vào giữa những năm 1970, vừa mới ra đời kỹ thuật này đã bộc lộ những tính năng
ưu việt hơn LLE.
Kĩ thuật vi chiết pha rắn (SPME):
Phưong pháp lấy mẫu hiện đại (năm 1990) để tách và làm giàu các hơp chất hữu cơ
từ nền mẫu mà không cần đến dung môi.
Nguyên tắc: Pha rắn dạng sợi được nhúng trực tiếp vào dung dịch mẫu phân tích
hoặc đặt ở khoảng không gian ngay trên bề mặt dung dịch phân tích, xảy ra quá
trình hấp phụ của các chất hữu cơ cần phân tích từ pha lỏng hoặc pha khí lên trên
sợi chiết (màng pha tĩnh phủ trên sợi nhỏ). Quá trình phân bố chất tan lên pha rắn
được trợ giúp bằng cách khuấy trộn dung dịch. Khi cân bằng phân bố chất tan được
thiết lập xong, các sợi pha rắn được rút ra khỏi dung dịch, làm khô, đưa trực tiếp
vào buồng bay hơi injector của máy sắc ký khí và xác định bởi các detector khác
nhau, trong đódetector khối phổ (MS) thường được dùng nhất.
Ưu điểm: So với phưong pháp truyền thống là mẫu đi nhanh, trực tiếp vào cột tách
và không tốn dung môi. So với chiết pha rắn thì phần lớn chất phân tích được tách
ra (>90%) nhưng chỉ 1-2% được bơm vào máy sắc ký, còn phưong pháp SPME tuy

tách được lượng nhỏ chất phân tích (khoảng 1-10%) nhưng toàn bộ chúng được đưa
vào máy sắc ký
Dụng cụ SPME bao gồm hai phần:
- Sợi chiết: một đoạn sợi silica dài khoảng 1 cm, đường kính ngoài cỡ 0,11 µm
được phủ một lớp pha tĩnh polymer kị nước, thường là PDME, PMPS, PA,
polyethylenglycol, hay có thể trộn thêm với các chất hấp phụ khác như
divinyldiclomethan, nhựa chịu nhiệt hoặc than xốp tùy theo từng đối tượng chất
nghiên cứu.
- Các bộ phận phu trợ: được bố trí theo kiểu xilanh.
Clean-up:
a) Gel Permeation Chromatography (GPC) (gel có lỗ xốp): pha tĩnh là polystyren
hay dextrane gel với đặc tính kỵ nước. Các hợp chất tách ra theo thứ tự KLPT. Đây
là cách làm sạch phổ biến nhất để loại pigment, axit humic, polymer, protein, lipid,
steroid, viruses, natural resin, và các hợp chất cao phân tử khác.
b) Sắc ký hấp phụ: pha tĩnh là silica gel, alumina, florisil (magie silicat). Các
hợp chất tách ra theo thứ tự phân cực.
c) Axit H2SO4 đậm đặc: phân huỷ hầu hết các chất hữu cơ, không phân huỷ
thuốc trừ sâu họ Clo, PCBs ngoại trừ dieldrin, andrin.
KOH: thuỷ phân các chất béo, phương pháp chủ yếu dùng cho dieldrin,
andrin.
Phương pháp Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD) thích hợp cho mẫu cá.
b) Kỹ thuật Kỹ thuật QuEChERS:
Viết tắt của thuật ngữ Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe là kỹ
thuật chuẩn bị mẫu hiện đại được thiết kế cho phân tích đa cấu tử thuốc bảo vệ thực
vật trong nông sản. Phương pháp này tối thiểu hóa các bước chuẩn bị mẫu, giảm sử
dụng dung môi hóa chất độc hại, đồng thời giảm chi phí thử nghiệm. Kỹ thuật

QuEChERS hiện nay là cơ sở cho các phương pháp thử được thừa nhận rộng rãi
trên thế giới như AOAC 2010 (2001.07), EN 15662 và đang được các PTN lớn,
hiện đại ở nước ta áp dụng. Kể từ khi thiết lập QuEChers vào năm 2003, phương
pháp này đã được cải tiến liên tục.
Nguyên tắc:
Phương pháp QuEChERS dựa trên chiết một lần bằng axetonitril đã được đệm hóa
và tách khỏi nước có trong mẫu bằng phân bố lỏng lỏng nhờ muối magie sulfat
(MgSO4). Quá trình làm sạch bằng chiết pha rắn phân tán (dSPE) được dùng để loại
các axit hữu cơ, nước còn dư và các thành phần khác nhờ phối hợp chất hấp phụ
amin bậc 1 và bậc 2 (Primary secondary amine - PSA) và MgSO4
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Bước 2: Cho mẫu vào ống 50ml.
Bước 3: Thêm dung môi chiết vào ống nghiệm và lắc đều
Bước 4: Thêm muối đệm và ly tâm
Bước 5: Hút lớp trên cho vào cột làm sạch dSPE và lắc
Bước 6: Ly tâm
Bước 7: Lấy dịch chiết cuối cùng vào vial
Bước 1: Đồng nhất và cân mẫu

Hình 1: Mẫu đã được động nhất. Hình 2: Cân mẫu vào ống ly tâm 50ml
 Mẫu thức ăn (táo) được đồng nhất để tăng diện tích bề mặt có sẵn để tăng hiệu suất
chiết và để đảm bảo tính đại diện của một mẫu.
 Quá trình đồng nhất sẽ sinh nhiệt có thể phân hủy các thuốc trừ sâu được quan tâm
và làm giảm hiệu suất phân tích. Để giảm thiểu tình trạng này, mẫu thường được
đồng nhất trong điều kiện lạnh.
 Thông thường 10-15 gram mẫu đồng nhất được chuyển vào một ống ly tâm 50 mL.
Đối với các mẫu khô, đặc biệt là những mẫu có chứa hàm lượng nước <25% (ví dụ
như bột, trái cây sấy khô, gia vị), có thể cần phải giảm khối lượng mẫu và thêm
nước trước khi đồng nhất.
Bước 2: Thêm dung môi chiết
Hình 3: Thêm dung môi chiết
 Dung môi chiết xuất được thêm vào ống ly tâm. Nên sử dụng Acetonitrile bởi vì nó
có thể dễ dàng tách ra khỏi nước. Vì hầu hết các mẫu thực phẩm thường chứa 80-
95% nước, việc tách mẫu ra khỏi nước rất quan trọng đối với ứng dụng này. Thông
thường 10-15 mL dung môi chiết được thêm vào ống ly tâm.
 Dung dịch nội chuẩn (Internal Standard) có thể được thêm vào ở bước này để theo
dõi hiệu suất chiết và hỗ trợ định lượng các chất cần phân tích.
Bước 3: Chiết lỏng

Hình 4: Lắc trong vòng 1 phút
Sau khi dung môi đã được thêm vào ống, ống được lắc mạnh trong 1 phút.
Bước 4: Thêm đệm và làm khô
Hình 6: Thêm muối
Ba phương pháp được công nhận khác nhau một chút về lượng muối và loại chất đệm được
sử dụng. Thông thường lượng Magnesium Sulphate được thêm vào sẽ vượt quá điểm bão
hoà, trong khi Natri Chloride kiểm soát độ phân cực của dung môi chiết.
 Phương pháp gốc: MgSO4 – Magnesium Sulphate và NaCl – Sodium Chloride
 AOAC 2007.01: MgSO4 – Magnesium Sulphate và NaOAc – Sodium Acetate
 EN 15662.2008: MgSO4 – Magnesium Sulphate, Trisodium Citrate Dehydrate, và
Disodium Hydrogen Sesquihydrate.
Cần chú ý là khi thêm Muối vào hỗn hợp, do tính háo nước của MgSO4 nên khi hút nước
trong mẫu nó sẽ sinh nhiệt rất mạnh, có thể phân hủy một vài hợp chất cần phân tích. Do
đó sau khi lắc ở Bước 3 nên để ống ly tâm chứa mẫu vào -180C trong 30 phút trước khi
thêm Muối.
Bước 5: Lắc chiết

Hình 7: Lắc trong 1 phút
Sau khi muối chiết xuất được thêm vào mẫu, lắc mạnh ống trong 1 phút.
Lưu ý: Một số loại thuốc trừ sâu proton hóa mạnh ở pH thấp do đó đệm cần phải được điều
chỉnh pH đến 2-7 trước khi chiết (ví dụ: Sử dụng đệm chiết 1% Acetic trong ACN).
Bước 6: Tách
Hình 8: Ly tâm ống 50ml Hình 9: Mẫu sau ly tâm
Ống được ly tâm để tách riêng lớp hữu cơ khỏi mẫu.
Bước 7: Tách cặn và làm sạch với dSPE ( Dispersive SPE)
Hình 10: Hút lớp trên vào ống ly tâm 15ml
Hình 11: Lắc 30s
 Hút một phần của lớp hữu cơ (lớp trên) đưa vào một ống ly tâm 15 mL để làm sạch
bằng bột dSPE.

 Lắc mạnh trong 30 giây.
Chú ý: Bước này cho phép loại bỏ các hợp chất trong nền mẫu (chất béo, protein, chất màu
– chlorophyll…) trước khi phân tích. PSA và MgSO4 – Magnesium Sulphate là chất làm
sạch thông dụng nhất được sử dụng cho dSPE. Đối với các mẫu chất béo cao, C18 sẽ được
thêm vào dSPE, nhưng đối với các mẫu chlorophyll cao và carotinoids, Graphitized
Carbon Black (GCB) được thêm vào dSPE. Như vậy, ngoài PSA và MgSO4 là 2 thành
phần chính, trong ống dSPE còn có thêm GCB và C18.
Bước 8: Tách lớp
Hình 12: Ly tâm ống 15ml. Hình 13: Sau ly tâm dung dịch sẽ tách lớp.
Ống 15 ml được ly tâm để tách lớp trên bề mặt từ môi trường dSPE.
Bước 9: Hút lớp trên vào vial
Hình 14: Hút lớp trên vào Vial
Lớp hữu cơ phía trên được hút vào một lọ mẫu GC / LC 2 mL.
Tùy thuộc vào chương trình và thiết bị phân tích được sử dụng và các giới hạn phát hiện
mong muốn, dung dịch này có thể được pha loãng hoặc cô đặc 2-10X để đạt được độ nhạy
cần thiết.
Bước 10: Bảo quản và phân tích
 Lớp trên có thể được thêm vào 0,1% Acetic Acid, hoặc 5% Formic Acid như một
chất bảo quản để đảm bảo sự ổn định của thuốc trừ sâu (đặc biệt là các thuốc trừ
sâu nhạy cảm với ba-zơ).

 Thông thường sẽ thêm chất bảo vệ phân tích như Sorbetol, Gulonolactone hoặc
Ethylglycerol vào trên cùng trong Vial 2ml chứa dịch sau chiết để cách ly với môi
trường.
c) Kỹ thuật sục khí và bẫy lạnh (purge and trap): chiết các chất dễ bay
hơi bằng cách sục một dòng khí qua mẫu, các chất bay hơi này được hấp thu (bẫy)
vào một ống chứa vật liệu hấp thu hay N2 lỏng. Sau đó nung nóng nhanh 1800C, các
chất này sẽ được giải phóng vào cột sắc ký. Đồng thới quá trình này cũng cô đặc,
làm giàu chất phân tích. Kỹ thuật này được dùng trong phương pháp GC-MS phân
tích benzen, toluen, styren, toluen, carbon tetrachloride, dichloroethene,
dichloropropene
d) Kỹ thuật không gian hơi (headspace)
Trong kỹ thuật này, sự cân bằng được tạo ra giữa pha hơi và pha lỏng có chứa mẫu
trong một bình cầu được gia nhiệt và khuấy ở một chế độ nhất định để tạo ra nồng
độ của cấu tử trong không gian hơi phía trên pha lỏng. Nhờ một hệ thống chuyển
hoặc bằng cách dung xylanh, hơi ở phần không gian trên được rút ra để đưa vào cột
tách. Phương pháp này được áp dụng có hiệu quả khi xác định các loại khí hoặc các
chất dễ bay hơi hòa tan trong dung dịch lỏng (VOC) như nhóm BTEX. Hiệu quả
của quá trình bay hoi được tăng lên bằng cách:
• Gia nhiệt
• Thêm muối
• Thay đổi pH
• Giảm áp suất trên phần không gian hơi mẫu
e) Kỹ thuật nhiệt phân (pyrolysis)
Kỹ thuật này nhiệt phân trong môi trường khí trơ để chuyển hóa các hợp chất
khó bay hơi trong mẫu rắn thành các chất có phân tử lượng nhỏ hơn, dễ bay hơi hơn
Pyrolysis xảy ra ở khoảng nhiệt độ trên 3000C, thường ở giữa 500 - 8000C, tối đa
10500C. Nó có thể được sử dụng để phân tích các vật liệu polymer như polymer
tổng hợp, cao su, dược liệu...Mỗi loại vật liệu khi phân hủy ở một nhiệt độ nhất định
sẽ tạo thành một hỗn hợp các sản phẩm đặc trưng có thể sử dụng như dấu vân tay để
định danh vật liệu ấy.
Ví dụ : Khoảng 30 mg bột sâm khô được nhiệt phân ở 500-5500C. Sản phẩm
khí sinh ra được dòng khí Argon thổi trực tiếp vào hệ thống GC-FID. Đặc biệt là kết
hợp với phương pháp thống kê (như phân tích dữ liệu đa biến) để xử lý số liệu phân
tích giúp việc phân biệt độ tuổi và giống cây của các loại dược liệu quý được dễ

dàng hơn (nhân sâm, trầm hương,…) : mỗi mẫu lựa chọn 40 pic đặc trưng trong sắc
ký đồ và sử dụng thuật toán chemometrics để giải quyết bài toán phân loại

SẮC KÍ KHÍ (GC)
Gas-liquid chromatography hay gas chromatography phân tích các chất lỏng
hay khí tương đối dễ bay hơi (tS
0<3500C, KLPT<500) và bền nhiệt như
hydrocacbon, thuốc trừ sâu họ Phospho hữu cơ, họ Clo hữu cơ, PCB, dioxin,
cholesteron, cloramphenicol.
- Pha động là một khí mang (carrier gas)
- Pha tĩnh là một lớp mỏng chất lỏng nằm trên chất rắn trơ, tất cả nằm trong
một ống thuỷ tinh hay kim loại.

Vách ngăn mà kim
tiêm xuyên qua
(septum)
Đệm cho cột sắc ký
khí (ferrule)
Rắc-co dùng để nối
2 đầu ống lại
(fitting, reducing
union)
Ống nối với cột
tách (glass insert,
liner)
- Điều chỉnh áp suất trên bình khí nén (two stage pressure regulator)
- Điều khiển lưu lượng dòng khí (flow controller)
 Điều khiển áp suất dòng khí bằng điện tử số - EPC (Electronic Pneumatic
Control)
- Bộ phận tiêm mẫu tự động (autosampler)
- Bộ phận nạp mẫu/ buồng tiêm (heated injector) có nút bịt bằng cao su (septum)
- Bộ phận hóa hơi (headspace)
- Lò ổn nhiệt (thermostating oven) chứa cột tách và injector
Với mẫu dạng lỏng, mẫu được hòa tan trong một dung môi có nhiệt độ sôi
thấp hơn nằm trong khoảng từ nhiệt độ phòng tới 100oC (càng thấp càng tốt). Phần
mẫu này được tiêm vào phần đầu vào của một cột tách. Các khí mang có tính trơ
như N2, He, H2, Ar áp suất 6-10 kg/cm2 đóng vai trò là pha động sẽ mang các phân
tử sẽ đi vào cột và bị giữ lại bởi pha tĩnh. Nhiệt độ cột được tăng dần theo chương
trình cài đặt tối đa là 300oC, nhằm đưa các chất có nhiệt độ sôi cao vào pha động đi
qua cột.
Lúc này xảy ra hiện tượng hấp phụ hay phân bố, thiết lập cân bằng về nồng
độ, kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển với một tốc độ riêng ra khỏi cột, chủ

yếu theo thứ tự nhiệt độ sôi, phân tử lượng. Sau khi ra khỏi cột, các chất sẽ đi qua
một đầu dò.
Nhiệt độ, tốc độ dòng khí mang đều ảnh hưởng đến quá trình tách, thời gian
phân tích: nhiệt độ thấp, tốc độ dòng khí mang nhỏ sẽ làm cho quá trình phân tách
các chất tốt nhất nhưng thời gian phân tích sẽ kéo dài. Vì vậy cần thiết lập chương
trình tốc độ dòng khí mang và chương trình nhiệt độ tối ưu để dung hoà giữa 2 mục
tiêu này. Hiệu suất tách lớn hơn và thời gian phân tích ngắn hơn là ưu điểm của
hydro, khi tăng tốc độ dòng lớn hơn nhiều tốc độ dòng tối ưu nhưng hiệu suất
(chiều cao đĩa lý thuyết) giảm rất ít. Tuy nhiên dùng khí mang hydro khá nguy hiểm
vì hydro có thể gây nổ khi tiếp xúc với oxy không khí, không dùng được cho đầu dò
MS và là tác nhân phản ứng với các hợp chất không bão hòa trên bề mặt kim loại.
 Ưu và nhược điểm của sắc ký khí:
 Ưu điểm:
- Khí mang có độ nhớt rất thấp nên có thể dùng cột sắc ký rất dài (L lên đến
30m), có số đĩa lý thuyết N rất lớn (N có thể lên đến 1 triệu đĩa) nên khả năng phân
tách rất mạnh.
- Không tốn dung môi (kinh tế, không độc hại).
- Có thể làm lại thí nghiệm mà không cần chờ cột sắc ký ổn định.
 Nhược điểm:
- Chỉ áp dụng cho các chất có thể hóa hơi mà không bị phân hủy.
- Khí mang chỉ đóng vai trò cơ học, không có lực tương tác gì đặc biệt với
chất tan. Khả năng tách chỉ còn tùy thuộc pha tĩnh.
 Lưu ý khi vận hành máy:
- Không nên mở buồng cột (oven) khi nhiệt độ trong buồng cột > 500C vì
chênh lệch nhiệt độ làm cột dễ hỏng,
- Nhiệt độ của inlet và của detector bao giờ cũng phải cao hơn nhiệt độ trong
buồng cột, như vậy mẫu mới được chuyển hết sang dạng khí và kết quả chính
xác
- Trước khi sử dụng một cột phân tích mới phải luyện cột, thường thì đặt tốc
độ dòng khí mang vừa phải (khoảng vài ml/phút đối với cột đường kính
trung bình 0.53mm) và nhiệt độ cao dần (nhưng thấp hơn nhiệt độ maximum
của cột) trong thời gian vài tiếng tùy chiều dài cột để luyện cột

- Không bao giờ để cột không có khí mang qua cột!
Hiện nay đã có 1 số máy thế hệ mới có tới 3 buồng tiêm mẫu, 4 đầu dò (03
đầu dò thường + 01 khối phổ)
 Đặc điểm cột mao quản (id=0.1-0.5mm):
Các cột phổ quát là: DB-17, DB-1701, DB-1/ DB-5, DB-WAX.
Để phân tích thuốc trừ sâu, người ta thường dùng các cột Supelco Equity
1701, Agilent DB-5, Supelco SLB-5ms.
L (m) id (mm) Độ dày
film/df (µm)
Max Temp (oC) Giá
(USD)
Equity 1701 30 - 60 0.25 - 0.53 0.25 - 1 id ≤0.32mm: 2800C
id≤0.53mm: 2800C
480 - 920
DB-5 5 - 60 0.15 - 0.32 0.1 - 1.5 df<1.2µm: 300/3200C
isothermal/program
df=1.2µm: 325/3500C
isothermal/program
SLB-5ms 15 - 60 0.1 - 0.53 0.1 - 1 id≤0.32mm: 340/3600C
isothermal/program
id≤0.53mm: 330/3400C
isothermal/program
350 - 980
Lưu ý: trong Max temp 340/3600C thì số trước có thể duy trì lâu vô hạn, số sau có
thể duy trì tối đa 15 phút.
Vật liệu nhồi cột phổ biến là Polysiloxane, kế tiếp là Polyethylene glycol
(wax) loại này kém bền hơn với các yếu tố nhiệt độ, oxygen.
Không được để khí oxy, nước, chất có tính axit, bazơ mạnh đi vào cột.
Khi cột hỏng có các dấu hiệu sau: pic có chiều cao giảm hay mất hẳn, đáy
dãn rộng, đuôi kéo dài, đường nền cao.
 Các loại khí mang thường sử dụng
Các tạp chất có trong khí mang như các hydrocarbon, oxy, nước... không chỉ
làm tăng tín hiệu nhiễu đường nền mà còn ảnh hưởng đến detector và tương tác với
pha tĩnh làm hỏng cột, do đó khí mang cần phải qua các bộ lọc để loại bỏ oxy, nước
và vết các chất hữu cơ trước khi vào cột tách. Độ tinh khiết của khí mang tốt nhất
phải lớn hơn 99,995% dưới các tên gọi khác nhau như "Zero Grade","Ultra-High

Purity (UHP) Grade", "4.5 Grade". Hydro và Nitơ là 2 loại khí mang thường
dùng.
a. Khí Hydro: Các ống dẫn khí hydro phải dầy, tốt nhất là dùng ống kim loại nhỏ
vừa kín vừa tiết kiệm khí. Tuy có hiều ưu điểm nhất nhưng trong thực tế người ta ít
sử dụng loại khí này vì nó dễ gây cháy nổ. Có thể mua máy sinh khí Hydro thay vì
dùng bình khí.
b. Khí Heli: Là khí trơ hóa học rất thích hợp cho sắc ký khí ở nhiệt độ cao. Đây là
khí mang tốt nhất với ưu điểm không cháy nổ như khí Hydro, khoảng tốc độ tối ưu
cho tốc độ thẳng u (cm/s) rộng hơn của khí Nitơ (sao cho HETP nhỏ nhất, số đĩa lý
thuyết lớn nhất). Nhược điểm là giá thành cao và khó làm tinh khiết.
c. Khí Nitơ: Do không nguy hiểm, giá rẻ và dễ dàng làm tinh khiết nên Nitơ sử
dụng rất nhiều trong sắc khí. Có thể mua máy sinh khí Nitơ thay vì dùng bình khí.
Detector Hydrogen Helium Argon Nitrogen Methane /
Argon Mixture
Synthetic Air
FID C/D C/M C/M D
ECD C C C/M C/M
NPD D C/M C/M D
TCD C/M C/M C C/M
FPD C/D C C C/M D
PID C/M C/M C/M
Chú ý: C: Carrier gas; D: Detector (Fuel) gas; M: Make up gas (khí bổ trợ)

Bẫy hydrocacbon, hơi nước
cho khí mang (molecular sieve
- Shimadzu)
Bẫy loại Oxy (Shimadzu) Bẫy loại ẩm (Shimadzu)
Gas Filter Kit /
Gas Cartridge Filter
Bẫy chỉ thị Oxy (Restek) Bẫy chỉ thị ẩm (Restek)
 Khí bổ trợ (make-up):
Chỉ dùng với cột mao quản vì thực tế khi chạy, tốc độ dòng khí mang trong
cột mao quản thấp, nếu đi vào đầu dò FID đang cháy bởi dòng khí H2 và
không khí sẽ tạo ra dòng chảy rối, sinh ra nhiễu (noise) lớn, giảm độ nhạy
của thiết bị, pic bị dãn rộng. Dòng khí bổ trợ này ngoài việc giảm dòng chảy
rối còn có tác dụng pha loãng chất phân tích, đưa nồng độ chất phân tích phù
hợp với khoảng làm việc của máy.
Một số loại đầu dò như FID, NPD, µECD thuộc loại mass flow responding
không chịu ảnh hưởng khi thay đổi dòng khí bổ trợ. Ngược lại, đầu dò TCD
tuộc loại concentration responding thì tín hiệu suy giảm do dòng khí bổ trợ
làm pha loãng, do đó cần giảm thiểu tối đa khí bổ trợ.
 Buồng tiêm và kỹ thuật tiêm mẫu

Bộ phận tiêm mẫu tự động (autosamper) cho mẫu lỏng, có thể có thêm các
bộ phận hóa hơi (headspace), vi chiết pha rắn (SPME): một bơm tiêm mẫu vi
lượng (microsyringe) sẽ tiêm một mẫu lỏng hoặc khí qua một đệm cao su silicon
chịu nhiệt (septum) vào một buồng tiêm (injector). Đối với 2 loại cột nhồi và
cột mao quản, cấu tạo của chúng khác nhau chủ yếu về liner trong buồng tiêm..
Với cột nhồi, sử dụng buồng tiêm trực tiếp, nó có cấu tạo khá đơn giản: mẫu
được tiêm qua septum vào buồng tiêm, mà cụ thể hơn là liner. Ở đây mẫu phân tích
được làm nóng, hóa hơi và “cuốn theo” dòng khí mang liên tục, đi thẳng vào cột.
Với cột mao quản, buồng tiêm có thể phân loại dựa trên các kỹ thuật tiêm chia
dòng (split), không chia dòng (splitless) và tiêm trên cột (on-column):
* Tiêm chia dòng/không chia dòng (Split/Splitless)
Tiêm chia dòng là kỹ thuật tiêm thích hợp nhất dùng cho cột mao quản nhằm
làm giảm lượng mẫu đưa vào cột, đặc biệt cần thiết với những cột có đường kính
trong quá nhỏ như GC-MS. Thông thường tiêm chia dòng được áp dụng khi nồng
độ chất phân tích trong mẫu >0,1%, tiêm không chia dòng thích hợp trong phân tích
lượng vết, nồng độ các chất <0,01%.
Ưu điểm:
- Do mẫu được đưa vào cột rất nhanh nên các mũi sắc ký sẽ hẹp và vì thế độ
phân giải của phương pháp sẽ cao
- Giảm nguy cơ làm dơ đầu cột
- Tránh quá tải cột.
Ở chế độ tiêm chia dòng, mẫu sau khi vào buồng tiêm được chia ra và chỉ 1
phần nhỏ đi vào cột, phần còn lại qua van chia dòng thoát ra ngoài. Thông số quan
trọng nhất cần chú ý của buồng tiêm chia dòng là tỷ lệ chia dòng, tỷ lệ này thường
từ 1:10 đến 1:100 phụ thuộc vào nồng độ của mẫu phân tích và tính chất cột tách
(tối đa tới 1:7500). Với mẫu phân tích có nồng độ lớn, hoặc/và cột tách có đường
kính trong, độ dày lớp pha tĩnh nhỏ thì tỷ lệ chia dòng lớn; và ngược lại.

Cấu tạo injector chia dòng gồm có :
- 1 đường khí mang vào injector
- 1 đường septum purge đi ra injector: là đường khí mang thổi qua septum để
loại trừ tạp chất hấp phụ tại mặt trong của septum sau mỗi lần tiêm mẫu. Dòng khí
thổi septum giúp tránh các pic ma.
- 1 đường split đi ra injector: được đóng mở bằng một van từ có nhiệm vụ
thải một phần mẫu theo khí mang ra ngoài.
- phần còn lại sẽ vào cột phân tích
Ví dụ với tỉ lệ chia dòng (sr – split ratio) 99 có nghĩa là: 1 phần mẫu sẽ vào
cột và 99 phần mẫu sẽ theo đường split ra ngoài
Dòng tổng sẽ bao gồm : Vtổng = Vpurge + Vcột + Vsplit = Vpurge + (sr +1).Vcột
trong đó dòng purge thường trong khoảng 2-4 ml/phút

Ở chế độ tiêm không chia dòng, van chia dòng đóng lại trong một khoảng
thời gian xác định sau khi tiêm, mẫu đi thẳng vào cột và chỉ thoát ra ngoài khi van
chia dòng mở. Đối với tiêm không chia dòng, cần thiết phải tối ưu hóa thời gian
đóng mở van chia dòng (purge delay time) để giảm hiện tượng píc dung môi kéo
đuôi, giảm sự phân biệt của các chất nhưng không làm giảm độ nhạy của quá trình
phân tích. Không chia dòng rất dễ làm dơ cột. Do đó sau 1 khoảng thời gian người
ta phải cắt phần đầu cột loại bỏ phần dơ này.
* Tiêm trên cột (on-column)
Tiêm trên cột có thể dùng cho cột wide-bore (đường kính trong 0,53 mm). Mẫu
phân tích được tiêm trực tiếp vào cột mà không có sự hóa hơi ở buồng tiêm, do đó
thành phần của mẫu vào cột ít thay đổi so với mẫu ban đầu và độ lặp lại cao. Tiêm
trên cột hạn chế tối đa sự phân hủy và sự phân biệt các thành phần trong mẫu, nên
được áp dụng cho phân tích các hợp chất không bền nhiệt, dễ bị phân hủy ở gần
nhiệt độ sôi của nó và mẫu đa thành phần có khoảng nhiệt độ sôi lớn.

Tuy nhiên việc tiêm toàn bộ mẫu có thể gây quá tải cột, làm giảm hoạt tính của
pha tĩnh và gây nhiễm bẩn cột do sự tích lũy của các hợp chất ít bay hơi, vì vậy
không thích hợp với mẫu chứa các hợp chất có nhiệt độ sôi cao. Một hạn chế khác
là tiêm trên cột yêu cầu loại bơm tiêm chuyên dụng với đầu kim nhỏ để có thể đưa
vào cột, buồng tiêm mẫu cũng phải được thiết kế đặc biệt, phải dùng cột có đường
kính trong tương đối lớn. Dùng tiền cột không chỉ bảo vệ cột tách mà còn giúp cho
việc tiêm mẫu dễ dàng hơn, tránh cho mẫu bị ngưng tụ trong cột, do đó làm giảm độ
rộng của píc sắc ký.
Khi buồng tiêm được đặt ở nhiệt độ cao (vaporizing inlet), mẫu bay hơi nhanh
và di chuyển đến cột, do đó thường gây ra độ lệch tương đối lớn về thể tích mẫu vào
cột. Dù nhiệt độ cao của buồng tiêm giúp bảo vệ cột, tuy nhiên nó có thể làm phân
hủy các chất kém bền nhiệt, phân biệt các chất có điểm sôi khác nhau trong mẫu,
gây mất mẫu hay quá tải cột tách.
Khi nhiệt độ của buồng tiêm được giữ dưới nhiệt độ sôi của dung môi khi tiêm
mẫu (cool inlet), sau đó tăng dần và bắt đầu quá trình sắc ký sẽ làm giảm tối thiểu
sự phân hủy, giảm sự phân biệt đối xử giữa các chất có mức độ hóa hơi khác nhau
trong mẫu phân tích, đồng thời làm tăng độ nhạy và độ lặp lại của quá trình sắc ký
khí.
* Buồng tiêm PTV
Hiện nay, buồng tiêm PTV (Programmable Temperature Vaporizing) là buồng
tiêm lý tưởng với sự kết hợp của cả tiêm chia dòng/không chia dòng và tiêm trên
cột. Buồng tiêm cho phép chương trình hóa nhiệt độ injector, tỉ lệ chia dòng do đó
cho phép đưa những nhóm hợp chất có nhiệt độ bay hơi khác nhau vào cột ở những
tỉ lệ khác nhau. Tuy nhiên cấu tạo, chương trình điều khiển khá phức tạp và phải tối
ưu hóa nhiều thông số.
- Thường dùng liner bằng quarzt, bằng thép hoặc hợp kim. Các loại vật liệu này
cho phép thay đổi nhiệt độ với tốc độ rất nhanh mà không gây biến dạng hay nứt –
gãy
- Tốc độ tăng nhiệt của injector có thể lên đến trên 2000C/phút
- Injector được trang bị rất nhiều quạt làm lạnh nên cho phép giảm nhiệt độ rất
nhanh, có thể lên đến 400C/phút
 Nhược điểm :
- giá thành của injector khá cao

- đòi hỏi phải thiết lập chương trình nhiệt độ và chia dòng đúng nếu không sẽ
dẫn đến mất mẫu
- thời gian tiêu tốn đạt đến cân bằng sau mỗi lần chạy thường lâu do ở gần nhiệt
độ phòng tốc độ giảm nhiệt độ của injector rất chậm
- do phải sử dụng nhiểu quạt làm lạnh nên việc tháo ráp bảo trì khá phức tạp.
 Các loại đầu dò (detectơ) thông dụng trong sắc ký khí
Các loại detectơ thông dụng là: FID, ECD, NPD/FTD/TSD, MS, ngoài ra còn có
FPD, TCD, FTIR. Bốn loại TCD, FID, MS, IR là đầu dò phổ quát, có thể áp dụng
cho mọi loại hợp chất phân tích.
Độ nhay tăng dần: TCD<FTIR<FID<ECD,NPD<MS
Đầu dò Phát hiện
TCD Mọi hợp chất
FPD Hợp chất S, P
FID Hợp chất C
NPD/FTD/TSD Hợp chất N, P
MS Mọi hợp chất
ECD Hợp chất halogen, oxygen
Có thể phân chia đầu dò theo nguyên lý đo đạc như sau:
- Nhiệt: TCD
- Ion hóa (điện tích): FID, NPD/FTD, ECD
- Quang học (phát xạ): FPD, AED
- Điện hóa (độ dẫn điện): ELCD
Để phân tích thuốc BVTV thường dùng ECD+NPD hay ECD+FPD hay MS.

 Detectơ dẫn nhiệt (Thermal Conductivity Detector, TCD)
 Nguyên tắc hoạt động:
Dựa vào sự khác biệt về độ dẫn nhiệt giữa khí mang và khí mang + chất phân
tích.
Khi ở cả 2 kênh mẫu và kênh so sánh đều là khí mang  không có dòng.
Khi chất phân tích + khí mang vào kênh mẫu  độ dẫn nhiệt của môi trường
thay đổi  nhiệt độ và điện trở của dây dẫn thay đổi  xuất hiện dòng  ghi nhận
ở Recorder.
 Đặc điểm:
- Rẻ tiền, đơn giản.
- Độ nhạy kém: H2 , He cho độ nhạy gấp 6 lần Ne, Ar.
- Khoảng tuyến tính không rộng < 103
- Thường sử dụng để phân tích mẫu khí.
 Detectơ ion hóa ngọn lửa (Flame Ionisation Detector, FID)
Dưới tác dụng của các gốc tự do ở nhiệt độ cao (ngọn lửa H2 – không khí), các chất
hữu cơ phân hủy thành ion. Ion di chuyển về điện cực tạo thành dòng điện. Dòng
điện được khuyếch đại và chuyển đến Recorder.
Có 3 đường khí đi vào đầu dò FID:
1) Hydrogen (nếu lấy từ bộ sinh khí Hydrogen thì phải loại ẩm)

2) Không khí (tốt nhất phải cho qua bộ Zero air để loại bỏ các hợp chất nhiễm bẩn)
3) Khí bổ trợ cho đầu dò (make-up gas)
Về nguyên tắc dòng khí hydrogen cung cấp cho detector FID phải có tốc độ
bằng một nửa tốc độ khí mang, và tốc độ khí oxygen phải bằng khoảng 5 đến 10 lần
tốc độ khí hydrogen.
 Đặc điểm:
- Rẻ, ổn định và là detector phổ biến nhất.
- Độ nhạy của detectơ FID cao hơn rất nhiều so với độ nhạy của detectơ
TCD (khoảng 100 – 1000 lần).
- Khoảng tuyến tính rất dài: 107
- Cho tín hiệu nhạy nhất đối với hydrocarbon (tăng theo số nguyên tử C
trong phân tử). Các nguyên tố N, S, Halogen làm giảm độ nhạy.
 Detectơ cộng kết điện tử (Electron Capture Detector, ECD)
Các phân tử khí mang bị bắn phá bởi tia (phát ra từ 63Ni ) tạo nên các ion
dương và electron có động năng lớn.
N2  N2
+ + e
Các electron di chuyển về anod tạo dòng điện ion hóa.
Khi các phân tử có khả năng bắt giữ điện tử xuất hiện (trong dòng khí mang)
-> số e giảm -> cường độ dòng điện giảm -> tín hiệu giảm.
AM + e  AM-
AM- + N2
+  AM + N2

 Đặc điểm:
- Rất nhạy đối với hợp chất chứa các nguyên tố có độ âm điện lớn như
halogen, sulfur, hoặc nhóm chức có độ âm điện lớn như NO2, CN, hợp chất thơm
đa vòng….
- Ứng dụng rất lớn trong phân tích lượng vết các loại thuốc BVTV họ Clo
hữu cơ, pyrethoid, hóa chất công nghiệp (PCB), chất diệt cỏ như 2,4-D; 2,4,5-T.
- Khoảng tuyến tính hẹp: 102
 Detectơ quang kế ngọn lửa (Flame Photometric Detector, FPD)
Dựa vào sự phát xạ các tia sáng đặc trưng cho S (392 nm) và P (526 nm) khi các
hợp chất chứa 2 nguyên tố này bị kích thích bởi ngọn lửa.
- Ngọn lửa thấp: giàu H2, phân hủy tất cả các hợp chất về trạng thái khử cao
(H2S, H2O, CH4…).
- Ngọn lửa cao: các sản phẩm có chứa S, P sẽ được kích thích và phát xạ.
 Đặc điểm:
- Nhạy và chọn lọc đối với lưu huỳnh, phốtpho.
- Dùng nhiều cho phân tích môi trường (thuốc bảo vệ thực vật, hóa chất công
nghiệp).
- Khoảng tuyến tính không rộng. Khoảng tuyến tính của FPD cho phốtpho là
103 -105 .
 Detectơ ion hóa phát xạ ngọn lửa (FTD – flame thermionic detertor) hay
còn gọi là Detectơ nitơ-phospho (NPD – Nitrogen Phosphorus Detector)
Dựa vào một dòng nhỏ sinh ra bởi sự di chuyển của các ion đặc biệt từ
plasma đến một bộ góp tích điện, các ion này được sinh ra do các hợp chất trong
phân tử có chứa nitơ hoặc phốtpho phản ứng ở lớp viền khí xung quanh bề mặt bi
rubidium. Sau đó, dòng điện này được đo và chuyển thành tín hiệu của đầu dò.
Trong đầu dò NPD, bộ góp và vòi phun được áp một thế. Bi rubidium được áp một
dòng điện để nung nóng từ khoảng 600-8000C tạo nên một plasma. Vùng plasma

này được nuôi bởi dòng hyđrô và không khí, tốc độ dòng khí hydro khoảng 2-6
mL/phút và với không khí khoảng 60-200 mL/phút.
Cấu tạo tương tự như FID nhưng khác ở chỗ :
- Có thêm 1 hạt muối kim loại kiềm, thường là RbCl đặt phía trên ngọn lửa.
Việc giữ muối RbCl khô rất quan trọng vì nếu muối này bị ẩm sẽ ảnh hưởng đến tín
hiệu nền rất nhiều.
- Tốc độ dòng khí H2 và không khí nhỏ
Lưu ý: Detector NPD không nhạy với các thành phần không chứa N hoặc P. Vì
thế, cột mao quản có thể tắc với các hợp chất bay hơi thấp, mặc dù đường nền của
sắc ký ổn định. Do đó, cột phải được luyện thường xuyên. Luyện qua đêm (dòng
khí mang theo hướng ngược ở 1800C) được thực hiện sau khoảng mỗi đợt 15 mẫu.
 Đặc điểm:
a) Nhạy với các hợp chất trong phân tử có chứa nitơ và phốtpho, độ nhạy của
NPD gấp FID khoảng 10.000 lần.
b) NPD bị ảnh hưởng rất lớn bởi nhiệt độ, nên NPD thường được vận hành ở
khoảng 275-325oC.
c) Độ chọn lọc của NPD cho nitơ trên cacbon là 103 -105 và cho phốtpho trên
cacbon là 104 -105,5
d) Có thể phát hiện các hợp chất chứa phốtpho ở mức 0,1-5 pg và 0,5-1 pg cho
các hợp chất chứa nitơ.
e) Độ nhạy phụ thuộc chủ yếu vào cấu trúc của hợp chất, tốc độ dòng khí và
nhiệt độ của đầu dò.
f) Dải tuyến tính của đầu dò NPD khoảng 104 -105. Dải này phụ thuộc vào hợp
chất được phân tích, dòng khí và nhiệt độ đầu dò.
g) Một tính chất nữa là không tạo thành ngọn lửa trong đầu dò NPD, do đó quá
trình ion hóa hyđrô cacbon không xảy ra như trong đầu dò FID. Vậy NPD rất
chọn lọc cho các hợp chất có chứa nitơ hoặc phốtpho nhưng cho tín hiệu rất
kém với các hợp chất khác như hydocacbon.

 Detectơ khối phổ (Mass Spectrometer, MS)
 Nguyên tắc hoạt động :
Các phân tử hữu cơ bị ion hóa và cắt mạch bởi các electron có năng lượng
lớn (70 eV) trong môi trường chân không. Hầu hết các mảnh ion có điện tích là +1.
Bằng cách thay đổi từ trường làm tách ra các ion, ta có thể đo lần lượt các ion có
m/z khác nhau (thời gian đo mỗi amu siêu nhanh 10-20ms). Về bản chất, đầu dò MS
như bộ lọc (tách) các ion theo khối lượng.
Phương pháp phổ khối dựa trên việc đo trực tiếp tỷ số m/z, được trình
bàv dưới dạng đơn vị khối lượng nguyên tử:
amu = dalton (Da) = 1/12 khối lượng của 12C = khối lượng ng.tử Hydro
Về bản chất, có thể coi khối phổ là một loại detector đặc biệt vì ngoài vai trò
phát hiện thông qua các mảnh ion đặc trưng, khối phổ còn có khả năng tách các chất
đồng rửa giải dựa trên sự khác nhau về khối lượng của chúng.
Đầu tiên, mẫu được hóa hơi (nếu ở trạng thái lỏng sau khi ra khỏi cột HPLC)
và tại buồng ion hóa, bắn phá bằng nguồn năng lượng lớn tạo thành ion phân tử hay
các mảnh ion con. Năng lượng bắn phá quyết định sự phân mảnh ở giai đoạn ion
hóa hay bẻ gãy liên kết trong phân tử. Các phổ khối tiêu chuẩn trong thư viện khối

phổ được thực hiện ở 70eV bởi vì chúng có thể đạt được độ lặp lại và độ tái lặp lại
cao nhất. Sau đó, chúng được gia tốc và tách riêng nhờ thay đổi từ trường của bộ
phân tách khối trước khi đến đầu dò phát hiện.
Đây là một phương pháp có những đặc điểm sau :
 Độ phát hiện nhạy nhất trong các loại đầu dò, có thể thấp tới 10-13 gram ở
chế độ SIM.
 Công cụ định danh: cho biết KLPT và một số thông tin cấu trúc (dị nguyên
tử như Cl, Br, S; các nhóm ankyl, nhóm ancol, vòng benzen,..).
 Một lợi điểm quan trọng khác là cho phép định lượng trong trường hợp
có sự trùng lặp một phần hoặc toàn phần của các pic.
Kỹ thuật MS/MS (2 lần) giúp định danh tốt hơn 20 lần, đồng thời tăng thêm
độ nhạy.
Điểm “mâu thuẫn” duy nhất giữa GC và MS là áp suất làm việc khác nhau,
áp suất ở lối ra cột GC là áp suất khí quyển còn áp suất trong buồng ion hóa lại là áp
suất thấp (10-5 – 10-6 Torr) . Nhược điểm này đã được khắc phục bằng kỹ thuật sử
dụng bơm chân không hiệu suất cao vào và các cột sắc ký mao quản nhỏ hơn.
Sự kết hợp sắc ký với khối phổ (GC/MS) được thực hiện vào những năm
1960 còn sự kết hợp sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS) được tiến hành vào nhưng năm
1970. Tiếp theo là MS/MS và kết hợp ICP-MS vào thập niên 80. HRGC/HRMS là
sắc ký khí ghép khối phổ với độ phân giải cao (>10.000), chủ yếu là 2 loại Q-TOF
(ra mắt năm 1995), Orbitrap (ra mắt năm 2005) có thể xác định KLPT chính xác
tới 3-4 số lẻ, từ đó giúp phân biệt các isobar (đồng khối), thậm chí các đồng phân.
Ứng dụng chủ yếu như phân tích dioxin ở mức LOD 0,01ppt (17 đồng phân
PCDD/PCDF), proteomics and metabolomic (protein và chuyển hóa). Hiện tại, tại
VN có các đơn vị sau có: Viện Hàn lâm KHCN VN, TTQTMT miền Bắc, Trung
tâm Dịch vụ Phân tích thí nghiệm TP.HCM

Hiện nay, có 5 kiểu đầu dò khối phổ chính đang được sử dụng bao gồm (3 loại đầu
phổ biến hơn cả):
 Đầu dò khối phổ tứ cực (Quadrupole, QMS) có 4 nam châm điện
 Đầu dò khối phổ bẫy ion (Ion Trap, QIT)
 Đầu dò khối phổ thời gian bay (Time-of-Flight, TOF-MS)
 Đầu dò khối phổ cộng hưởng cyclotron sử dụng phép biến đổi Fourier (Fourier
Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry, FTICR hay FT-MS).
 Cung từ (Magnetic Sector)
Trong đó các phương pháp định lượng đều yêu cầu sử dụng máy ba tứ cực như
là một phương pháp khẳng định (confirmation) với khả năng định lượng tốt hơn
bẫy ion. Về MS tứ cực thì có loại cho GC và LC, hầu như là riêng biệt không
kết hợp một MS kết nối với cả GC và LC. Kỹ thuật TOF phân tích định tính tốt
nhất nhưng lại rất khó sử dụng routine. Còn cung từ và FTMS tuy độ phân giải
rất cao (khoảng 60.000) nhưng giá thành quá đắt.
Chúng rất khác nhau về thiết kế và thao tác, với những ưu và nhược điểm riêng.
Đối với loại bẫy ion, các ion trước hết được bắt hoặc “mắc bẫy” trong một khoảng thời
gian nhất định rồi được phân tích bằng MS hoặc MS/MS. Loại máy này được sử dụng
khá rộng rãi (xét theo những công bố khoa học). Tuy nhiên, chúng có độ chính xác

không cao do chỉ có một số lượng khá hạn chế các ion có thể tích lũy vào tâm điểm
trước khi được tích điện trong không gian, do vậy có thể phản ánh sai lệch sự phân bố
và phép đo. Người ta cũng đã tiến hành cải tiến kỹ thuật trên bằng sự phát triển các bẫy
ion “tuyến tính” hoặc “hai chiều” khi những ion được tập hợp trong một thể tích hình
ống lớn hơn bẫy ion ba chiều truyền thống, cho phép làm tăng độ nhạy, độ phân giải và
độ chính xác.
FT-MS bản chất cũng là một loại khối phổ bẫy ion, cho phép bắt những ion dưới độ
chân không sâu trong một từ trường cao. Do được cải tiến và kết hợp cả hai loại máy
nên FT-MS có độ nhạy, độ chính xác và phân giải cao. Tuy nhiên, do vận hành phức
tạp và giá thành quá cao nên chúng ít được sử dụng trong phân tích dư lượng.
Đối với đầu dò khối phổ thời gian bay, tất cả các ion đơn điện tích nào chịu một sai
biệt về thế năng V sẽ đạt một năng lượng chuyển hóa eV (electron volt) như nhau. Vì
vậy, những ion có khối lượng lớn hơn sẽ có vận tốc nhỏ hơn nên mất nhiều thời gian
hơn để bay qua cùng một quãng đường dài trong một ống không có từ trường (field-
free flight tube). Các ion, sau khi được tăng tốc, bay ngang qua vùng không trường, nơi
đây chúng sẽ được tách riêng nhau ra tùy theo giá trị m/z của chúng, và được tập trung
tại bộ phận thu nhận tín hiệu. Do thời gian đến đích của các ion chỉ cách nhau rất ngắn,
10-7 giây, nên máy cần có hệ thống điện tử cực nhạy để có thể phân biệt được các ion.
Đầu dò Tứ cực (Quadrupole): Hiện có 2 loại: Single-Quad là Tứ cực đơn (chỉ làm đến
MS 1 lần) và Triple-Quad (QQQ) là Ba tứ cực, còn gọi là tandem MS hay MS/MS (có
thể làm MS 2 lần). Hiện nay các phương pháp định lượng đều yêu cầu sử dụng đầu dò
khối phổ ba tứ cực như là một phương pháp khẳng định. Đầu dò có độ nhạy cao trong
phân tích định lượng một chất đã biết, tạo được nhiều phân mảnh trong chế độ
MS/MS, có thể làm được kiểu đo mất phân tử trung hòa (neutral loss), thích hợp cho
phân tích vi lượng các chất đã biết trước cấu trúc. Tuy nhiên, đầu dò tứ cực khó giải
thích cơ chế phân mảnh MS/MS, định tính không tốt. Đầu dò MS/MS nhạy hơn MS từ
2-20 lần, nâng cao độ nhạy, độ chọn lọc và giảm các bước xử lý làm sạch mẫu
Giá của máy GC-MS loại Single-Quad là 75.000$ (1.7 tỷ) còn TOF là 375.000$ (8.7
tỷ).
Giá của máy GC-MS/MS loại QQQ là 175.000$ (4 tỷ).
Tóm tắt:
*Về độ phân giải: MS<QIT<TOF <MS/MS< Q-TOF< Orbitrap< Magneticsector <

FT-ICR
*Về giá thành: MS,QIT< MS/MS,TOF< Q-TOF< Orbitrap < Magneticsector< FT-
ICR
*Về độ phổ biến: TOF > Orbitrap > FT-ICR
Orbitrap gần giống với ion trap nhưng nâng cấp hơn (đã được mua lại và đăng kí bản
quyển bởi Thermo Fisher) có nhiều ưu điểm, nhưng có 2 cái drawback so với TOF là
đắt gấp đôi và phân tích chậm hơn.
Giới hạn của đầu dò khối phổ 3 tứ cực MS/MS: không thể nhận danh được hóa chất
hoàn toàn không biết (unknown target), chỉ phù hợp phân tích thành phần nhắm đến,
đã biết (target). Còn Q-TOF nhờ độ phân giải rất cao (40.000) nên rất mạnh cho định
tính, thường dùng cho các chất có KLPT lớn đến vài trăm ngàn đơn vị. Orbitrap với độ
phân giải cao hơn nữa (450.000) cho phép nhận danh hóa chất tốt hơn nữa
Tùy theo mục đích, các nhà nghiên cứu sẽ chọn các kỹ thuật ứng với các máy khối phổ
thích hợp.
Ngoài ra, để phát huy những ưu điểm cũng như khắc phục các hạn chế của từng loại
đầu dò, người ta còn kết hợp các kỹ thuật với nhau, ví dụ như các hệ MS/MS sau:
+ hệ thống kết hợp giữa ion trap và QQQ, trong đó tứ cực thứ ba của hệ ba tứ cực
được thay bằng bẫy ion
+ hệ thống kết hợp giữa TOF và QQQ, trong đó tứ cực thứ ba của hệ ba tứ cực được
thay bằng TOF, gọi là hệ QTOF, đắt gấp đôi TOF hoặc QQQ
Các hãng Agilent (US), Thermo Fisher (US), Waters (US), SCIEX (US), Bruker (US),
PerkinElmer (US), JEOL (Japan), Analytik Jena (Germany), Hiden Analytical (UK),
Rigaku (Japan), LECO (US), DANI Instruments (Italy)

Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò MS
- Chế độ quét toàn dải full SCAN / TIC (định tính)
Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho
khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường
dùng để nhận danh (hoặc định lượng khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn). Ví dụ:
scan m/z 50-300 có nghĩa là quét tất cả các khối từ 50-300. Sau đó có thể định tính
bằng cách so với thư viện phổ để tìm ra chất tương ứng. Đối với đầu dò khối phổ
MS/MS, chế độ SCAN thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ (ion sơ cấp,
precursor ion).

- Chế độ quét chọn lọc ion SIM (định lượng)
Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng
cho chất cần xác định. SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó,
do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn. Chế độ
SIM được dùng để định lượng. Ví dụ trong khoảng khối từ 50-300 như trên, mảnh
ion 150 là đặc trưng và cao nhất thì có thể chỉ chọn riêng m/z 150 ra để định lượng.
Có thể chọn được nhiều ion một lần, và càng nhiều ion thì càng tốt về độ nhạy và độ
chính xác. Vì mỗi ion được chọn được đo trong một thời gian dài hơn, khoảng 50
ms thay vì 50µs nên nhiễu hóa học được giảm xuống (S/N tăng lên), điều này cho
phép phát hiện chất phân tích thấp hơn vài lần đến vài chục lần so với chế độ
SCAN.
Phổ TIC (FullScan) hay SIM đều có hai dạng cơ bản từ phổ 3 chiều:
1/ Dạng theo RT: Trục tung là cường độ tuyệt đối hoặc tương đối (chọn pic có
cường độ mạnh nhất được coi là pic cơ bản coi là 100) (relative/normalized
abundance/intensity), trục hoành là trị số thời gian lưu RT, tương tự sắc ký đồ bình
thường nhưng chiều cao mỗi pic là tổng số hàm lượng của các m/z khác nhau của 1
hay nhiều chất tại thời điểm RT đó
2/ Ứng với mỗi thời điểm RT có 1 sắc ký đồ dạng theo m/z: Tương tự nhưng
trục hoành là m/z, chiều cao pic là hàm lượng của các mảnh ion có m/z khác nhau

Đối với đầu dò khối phổ MS/MS, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo
sát năng lượng phân mảnh ion mẹ (tiền ion, ion gốc, precusor ion) ra ion con (ion
sản phẩm, ion thứ cấp, product ion).
Tuy nhiên, sự phát triển của kỹ thuật hiện nay cũng đã cho phép tích hợp hai
kiểu quét này thành một nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho các nhà nghiên cứu,
đặc biệt là MS/MS, tuy nhiên thường độ nhạy không cao bằng từng kiểu quét riêng
lẻ.
- Ngoài ra đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp
(MS/MS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và
MRM
SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion
sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện (sắc ký
đồ chỉ có 1 pic). Việc điều chỉnh năng lượng và khí va chạm được máy tự động tối
ưu sao ở mức vừa phải. Không nên lựa chọn các ion liền kề (mất H2O hoặc mất
NH3) mà nên chọn ion phân mảnh có KLPT lớn nhất.
MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên
các ion con cần quan tâm thường từ 2 ion trở lên (do các chất đồng phân khi phân

mảnh đều sẽ tạo 1 ion con mảnh lớn giống nhau) , do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM
thông dụng hơn SRM.
 Chương trình nhiệt độ trong sắc ký khí:
1. Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Nhiệt độ giảm, áp suất hơi giảm, chất ra chậm hơn.
Hạ nhiệt độ tương đương với hạ năng suất rửa giải trong sắc ký lỏng.
2. Chương trình hóa nhiệt độ:
Chương trình hóa nhiệt độ tương đương với phương pháp gradien rửa giải trong sắc
ký lỏng.
Ưu điểm của chương trình hóa nhiệt độ:
- Rút ngắn thời gian xác định đối với các mẫu có khoảng điểm sôi rộng.
- Tỷ lệ giữa chiều cao pic và chiều rộng pic luôn ổn định vì thế thuận lợi cho
định lượng.
- Thông thường các mẫu hợp chất thiên nhiên phức tạp nên người ta không
thể bằng một chương trình tuyến tính thu được kết quả mong muốn mà phải sử dụng
đa chương trình nghĩa là ở khoảng nhiệt độ giữa chừng cột có thể giữ đẳng nhiệt
một thời gian thích ứng rồi lại tăng tiếp với tốc độ mong muốn. Trước và sau
chương trình có thể được giữ ở nhiệt độ cố định.
Chương trình nhiệt độ tiêu biểu gồm hai giai đọan: giai đoạn đầu tăng 10-25
oC /phút, giai đoạn sau tăng 3-6 oC/phút. Tốc độ gia nhiệt giai đoạn đầu thường
chọn 20oC/phút, giai đoạn sau giảm còn 3oC/phút. Thông thường nhiệt độ của đầu
dò luôn được chỉnh cao hơn trong lò cột để chất phân tích của bạn không bám lại
trong đầu dò. Tổng thời gian là 40-50 phút.
 Kỹ thuật Fast GC: cho kết quả nhanh từ 3-10 lần so với bình thường, bằng việc
sử dụng cột ngắn hơn, đường kính nhỏ hơn (0.15 hoặc 0.18mm), khí mang H2, tăng
nhiệt độ nhanh
 Các phụ kiện đi kèm một máy GC:
- Máy nén khí không dầu (Oil-free air compressor)
- Máy sinh khí Hydro: 120 - 220ml/phút
- Máy sinh khí Nitơ

- Bộ chiết pha rắn 20 vị trí
- Bộ lưu điện online (UPS) công suất: ≥ 10kVA/7,0 kW.
- Bẫy hơi nước hoặc chỉ thị hơi nước
- Bẫy Ôxi hoặc chỉ thị Ôxi
- Bẫy hydrocacbon
- Bẫy đa năng (hydrocacbon, Ôxi, hơi nước)
- Xy lanh tiêu chuẩn: 1, 2, 5, 10, 25, 50 và 100µl (option: 250 & 500µl)
Thể tích bơm mẫu nhỏ nhất: 0.01 µl (với 1 µl xy lanh)
Thể tích bơm mẫu lớn nhất: 50µl (với 100 µl xy lanh)
Tham khảo hệ thống sắc ký khí online (trạm tự động): Đầu dò GC-FID phân
tích các hợp chất hữu cơ bay hơi BTEX (benzene, toluene, ethylbenzene (m/p/o)
xylene), tích hợp máy sinh khí H2, zero air (không khí có hyrocacbon<0.1 ppm)
Ví dụ : phân tích thuốc trừ sâu gốc clo hữu cơ và Poly Clorua Biphenyl (PCB)
a1. Mẫu nước chiết lỏng-lỏng: Cho vào NaCl 100g/ 1lit nước mẫu. Chiết lần thứ
nhất lắc mạnh 2 phút với 120 ml ethylacetat/ 1 lit nước mẫu. Chiết lần thứ hai với
60 ml ethylacetat/ 1 lit nước mẫu. Chuyển tất cả ethylacetat vào E-flask rồi loại
nước bằng 15-20g Na2SO4 khan.
a2. Mẫu thực phẩm sau khi chiết bằng pentan:
- Làm sạch bằng cột florisil (chiết pha rắn SPE) rửa giải với
diclometan và pentan theo tỷ lệ về thể tích là 2 : 8.

Cột tách chiết pha rắn SPE ( C18, CN, NH2, Florisil, ..)
- Tách riêng làm 2 phân đoạn trên cột silicagel: Cho từ từ X ml
pentan ( đã xác định trước thể tích X cần để rửa giải hết p,p'-DDE.
Giá trị X chỉ đúng với cùng một lô silicagel và pentan. Thông
thường giá trị X nằm trong khoảng từ 60 đến 90 ml) qua cột thu
được dung dịch chứa các PCB (trừ CB3), HCB, aldrin, isodrine,
heptaclo và p,p'-DDE. Sau đó, cho tiếp 100,0 ml hỗn hợp ete dietyl
và pentan theo tỉ lệ về thể tích là 1 : 9 đi qua cột thu được dung
dịch rửa giải CB3, p,p' DDE và các thuốc trừ sâu gốc clo còn lại.
c. Ðiều kiện phân tích
+ Cột sắc ký
Cột mao quản không phân cực SPB-608 hãng Supelco (cột methylsilicon có khả
năng tách thuốc trừ sâu theo nhiệt độ sôi) hoặc cột DB-5 hãng Agilent JW
Scientific, nhiệt độ tối đa 3600C, chiều dài 30 m, bán kính trong 0,32 mm, bán kính
ngoài 0,50 mm, chiều dày lớp phủ 0,25 m. Đối với nhóm clo hữu cơ khi phân tích
trên cột SPB-1701 đã cải thiện được độ phân giải giữa các cấu tử, thời gian phân
tích ngắn hơn so với phân tích trên cột SPB-1.
+ Chế độ nhiệt của hệ thống GC-ECD: Nhiệt độ của buồng tiêm là 2500C;
nhiệt độ đầu dò là 3000C.
Do hỗn hợp thuốc trừ sâu phân tích có nhiều chất có nhiệt độ sôi cao trên
2500C nên nhiệt độ buồng tiêm được đặt ở 2500C nhằm đảm bảo hoá hơi toàn bộ
mẫu. Đầu dò ECD chịu được nhiệt độ cao từ 250- 4000C và để cho đầu dò hoạt
động ổn định thì nhiệt độ áp đặt thường cao hơn nhiệt độ cao nhất của chương trình
nhiệt lò cột từ 20- 250C.

Chương trình nhiệt độ cụ thể là:
- Duy trì ở nhiệt độ 1500C trong 1 phút.
- Tăng nhiệt độ 20C/phút lên tới nhiệt độ 2200C.
- Tăng nhiệt độ 200C/phút lên tới nhiệt độ 2400C.
- Duy trì ở nhiệt độ 2400C trong 13 phút.
- Tổng thời gian là 51 phút.
+ Chế độ chia dòng: 1:10 hoặc không chia dòng.
+ Nội chuẩn: Pentachloronitrobenzene: 10 µL nồng độ 5000 mg/l thêm vào 1 mL
dịch chiết. Có thể dùng 1-bromo-2-nitrobenzene thay thế, đồng thời cũng là chất nội
chuẩn của họ Phospho.
+ Tốc độ dòng khí mang N2 5 ml/phút hoặc dùng He 0.5-1.5 ml/phút (1.3 ml/phút
tương ứng 7.06 psi)
+ Thể tích tiêm mẫu: 1-5 µL

SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) phát
triển rất nhanh từ những năm 1970. Việc sử dụng các chất nhồi có kích thước nhỏ (5
– 10 m) và áp suất cao 100bar (10Mpa) làm cho hiệu quả tách của phương pháp
này tốt hơn mà thời gian phân tích vẫn nhanh. Mỗi cột chứa khoảng 40.000-60.000
đĩa lý thuyết/ mét.
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết, người ta chia HPLC thành 4 loại:
Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).
Sắc ký phân bố (partition chromatography).
Sắc ký ion (ion chromatography).
Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).
Trong đó, sắc ký phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được
những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion
có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000).
Sắc ký phân bố được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa
pha tĩnh và pha động:
# Pha thuận: Pha tĩnh chất rắn (silica gel) phân cực hơn pha động
(hydrocacbon)
# Pha đảo: ngược lại. Loại sắc ký pha đảo được áp dụng rất thành công
để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không
phân cực, phân cực yếu hay trung bình. Hiện nay chúng ta đang sử dụng chỉ có loại
sắc ký này mà thôi
Phương pháp HPLC áp dụng cho khoảng 15% tổng số các hợp chất mà
không thể phân tích bằng GC do kém bền nhiệt, không bền, hoặc không bay hơi như
các hợp chất cao phân tử và ion thuộc các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm. Các
hợp chất trên gồm: axit hữu cơ, axit nucleic, protein, enzyme (xúc tác sinh học có
thành phần cơ bản là protein), axit amin (thành phần cấu tạo nên protein), peptid
(chuỗi ngắn của các axit amin), nucleotid (đơn vị cấu trúc của DNA tích trữ thông
tin di truyền và RNA liên quan đến sự hình thành các protein), đường, polisacarit,
sắc tố thực vật, lipit không phân cực và phân cực, peoxit, steroid (chủ yếu là các
hóc môn và một số ít tiền chất vitamin), alkaloid (chất hữu cơ có chứa nitơ có tác
động dược lý với động vật), polime tổng hợp, chất chống oxi hóa, chất an thần, chất

màu, dược phẩm, vitamin, kháng sinh, hóc môn tăng trưởng, chất nổ
nitroaromatics…
Trong lĩnh vực môi trường, HPLC phân tích nhóm các nhóm phân cực chứa
hydroxyl (-OH), carbonyl (-C=O), amin (-N-C) như các nhóm trừ sâu carbamat, trừ
cỏ triazine, phenylurea, glyphosate, paraquat, 2,4-D, ngoài ra hydrocacbon thơm đa
vòng (PAH), phenol, chất hoạt động bề mặt.
Dữ kiện Sắc ký lỏng (HPLC) Sắc ký khí (GC)
Độ bay hơi
Không yêu cầu bay hơi, mẫu phải tan
được trong pha động
Mẫu phải bay hơi được
Độ phân cực
Tách được cả hai loại hợp chất phân
cực và không phân cực
Mẫu phân cực và không phân
cực
Độ bền nhiệt
Phép phân tích được thực hiện tại
nhiệt độ thấp (nhiệt độ phòng hay
thấp hơn)
Mẫu buộc phải tồn tại ở nhiệt
độ cao (nhiệt độ tách của cột
và buồng tiêm mẫu)
Khối lượng phân tử
Không có giới hạn trên về mặt lý
thuyết, trên thực tế độ hòa tan là giới
hạn.
Đặc trưng < 500 amu
Chuẩn bị mẫu
Mẫu mẫu phải tan được trong pha
động và có tính chất giống với pha
động
Dung môi phải bay hơi và có
nhiệt độ sôi thấp hơn các chất
phân tích
Chuẩn bị mẫu phức tạp, tốn
thời gian, đôi khi phải tạo dẫn
xuất
Lượng mẫu
Lượng mẫu phụ thuộc vào đường
kính trong của cột 5-5000l, thường
là vài chục l
Thường từ 1-5l
Cơ chế tách
Thực hiện ở cả hai pha động và tĩnh Chỉ có pha động là mang mẫu
Độ nhay, khá năng tách tốt
hơn
Đầu dò
Đa số thuộc dạng không phá hủy (trừ
MS) UV-VIS, PDA (DAD), RID, FLD,
CD
Đa số thuộc dạng phá hủy (trừ
TCD) ECD, FPD, NPD / FTD,
FID, MS
Pic bè rộng hơn, thời gian phân tích
lâu hơn
Kỹ thuật phân tích GC thích hợp với những hợp chất có khối lượng phân tử
thấp có khả năng hóa hơi và phải bền nhiệt. Còn với HPLC thì dù cho chúng không
dễ hóa hơi hoặc kém bền nhiệt, vẫn có thể phân tích được. Nói cách khác, LC-MS
có lợi thế phân tích được đa dạng mẫu hơn.
Hệ thống HPLC còn được ghép nối với hệ ICP-OES hoặc HG-AFS để xác
định kim loại ở nhiều dạng hóa trị (vô cơ), hữu cơ riêng biệt
HPLC pha đảo (RP-HPLC) bao gồm:

- Pha tĩnh không phân cực là silicagel xử lý với RMe2SiCl { R: alkyl mạch
thẳng : C18H37 (octadecyl silane, ODS) hay C8H17 }. Kích thước hạt silica
khoảng 2 - 10 m, phổ biến là 5m, nhỏ hơn của cột chiết pha rắn SPE.
- Pha động phân cực, thường có hai phần chính: dung môi hữu cơ
(acetonitril hoặc methanol) và nước/đệm. Khi phân tách hỗn hợp có chứa các
axit hoặc bazơ như các amin, cần kiểm soát độ pH của pha động bằng dung
dịch đệm phù hợp để thu được kết quả có độ lặp lại cao vì độ pH sẽ quyết
định cân bằng giữa 2 dạng ion và phi ion của một chất. Về mặt lý thuyết,
LC/MS cần các loại đệm dễ bay hơi vì nó sẽ không tạo cặn ở trong côn và
nguồn (của máy khối phổ): acetat, format, citrat. Nồng độ đệm càng cao thì
rửa giải càng sớm. Với đầu dò UV, còn thường dùng đệm phosphat, acetat.
Pha động ít nhất phải có 5% dung môi hữu cơ như methanol hoặc
acetonitril. Sau khi kết thúc phân tích, chọn chương trình rửa tăng dần tỉ lệ
acetonitril từ 95 % nước : 5 % acetonitril (methanol cũng được sử dụng nhưng ít
phổ biến hơn) đến 100 % acetonitril, tức là giảm dần độ phân cực -> tăng dần khả
năng rửa giải. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng
kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và
tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất.
Dung môi động càng phân cực, năng suất rửa giải càng yếu. Nước là dung
môi rửa giải yếu nhất trong SKPBPĐ. Khi thêm một dung môi hữu cơ vào nước, độ
phân cực của pha động giảm, năng suất rửa giải tăng, đẩy chất ra khỏi cột sớm.
Ngoài ra gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất cột

Pha động gồm chủ yếu là nước, do đó mẫu nước có thể tiêm trực tiếp vào
máy. Tất cả dung môi dùng cho sắc ký lỏng cao áp phải được làm sạch hết khí vì
khí hoà tan trong dung môi sẽ tạo bọt khí trong detectơ và gây nhiễu.
Pha tĩnh có độ phân cực thấp hơn pha động: PS < PM
Chất càng phân cực càng ít bị giữ lại.
Chuẩn bị pha động: hóa chất và dung môi dùng trong pha động phải sạch
và có độ tinh khiết nhất định để có thể áp dụng được đầu dò, dung môi và đệm cần
lọc qua màng lọc 0,45 m và đuổi khí pha động; hạn chế dùng đệm, nếu có dùng thì
dùng đệm acetat tốt hơn là đệm phosphat. Nếu sử dụng dung môi là nước thì cần
phải cẩn thận vì trong môi trường nước vi khuẩn có thể sinh sản và cần thường
xuyên thay nước (phòng tránh các hạt gây ra hỏng máy hay tắc đầu cột), có thể
dùng sodium azid 0,02% làm chất diệt khuẩn trong nước.
Dung môi chuyên dụng cho HLPC có những ưu điểm sau: khi sử dụng không
cần phải lọc, không dùng chất ổn định trong dung môi (vì chất ổn định thường tạo
tạp), không chứa clo trong dung môi (vì nếu có clo dưới tác dụng của ánh sáng sẽ

xảy ra phản ứng làm hỏng cột). Nếu sử dụng dung môi có chất lượng thấp khi chạy
máy sẽ xuất hiện những pic lạ và có thể làm nghẹt cột hoặc hỏng máy, vì vậy đối
với pha động phải sử dụng dung môi thật sạch và có độ tinh khiết cao.
Máy HPLC thường có 2-4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép
chúng ta sử dụng 2-4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong
muốn. Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha
động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, ổn định.
Lưu ý: không bao giờ cho dung dịch có tính baz vào cột vì sẽ phá hủy cột.
Danh sách các hãng: Shimadzu, Agilent, Dionex (Thermo), Waters, Hitachi.
1. Các bộ phận trong máy HPLC

Pulse damper: bộ ổn định dòng nằm ngay sau bơm, giúp kiểm soát áp suất để
giảm thiểu tối đa sự nhiễu tín hiệu đường nền lên sắc ký đồ (baseline noise).
Check valve: van chỉ cho dòng chảy theo 1 chiều nhất định, thường đặt 1 cái
trước bơm (inlet) và 1 cái sau bơm (outlet).
Prime/Purge valve: van rửa kênh dung môi và mồi bơm. Van này nằm sau
bơm.
Back-pressure regulator (BPR): đặt sau đầu dò, nhằm giữ bọt khí nếu đuổi
khí vẫn còn sót, giúp nền ổn định.
Trong sắc ký IC còn có Bộ triệt nhiễu nền (Supressor) trước đầu dò giúp tăng
độ phát hiện các chất.
1.1 Bộ đuổi khí (degasser)
Tránh xảy ra một số hiện tượng có thể có như sau:

 Bơm cao áp có thể không hút được dung môi, Tỷ lệ pha động của các đường
dung môi khi đó ảnh hưởng đến áp suất, sai lệch tốc độ dòng, kết quả là
thay đổi thời gian lưu, pic doãn rộng và trôi nền.
 Nếu như mà có oxy hòa tan trong dung môi thì có thể hấp thu khu vực UV,
nó còn có thể dập tắt sự phát huỳnh quang,…Bên cạnh đó, oxy hòa tan có thể
gây giảm tuổi thọ của cột, nó có thể oxy hóa pha động, rồi phản ứng với pha
tĩnh làm thay đổi độ phân cực của pha tĩnh.
Có 3 cách để degas đối với HPLC đó là: chân không, sục khí helium và đánh
siêu âm. Dùng khí helium thì loại bỏ đến 80% lượng khí hòa tan, do helium
có khả năng hòa tan vào nước rất thấp, đây cách các bộ degas theo máy
HPLC hoạt động. Đối với xử lý bằng phương pháp chân không, chỉ có thể
làm giảm hơn 60%. Sử dụng bể siêu âm chỉ có thể loại bỏ 30% mà thôi.
Có thể kết hợp: hút chân không + khuấy từ, hút chân không+ đánh sóng siêu
âm. Một cách thủ công là đun cách đun sôi nước cất trong 10-15 phút và để
nguội trong điều kiện đậy kín.
Bộ modul degasser của Agilent/HP Bộ modul degasser của
Shimadzu
Bộ degasser độc lập của
Perkin Elmrr

Các bể rửa siêu âm để bàn (<30L) thường có tần số từ 25kHz đến 40kHz
để không gây tiếng ồn lớn khi hoạt động, phổ biến nhất là 37kHz.
+ Chế độ Degas: chuyên dùng cho khử khí (phải loại khí trước để quá trình
làm sạch có hiệu quả vì khí bị hòa tan hoặc ở trong dung dịch sẽ ngăn quá trình tạo
bóng chân không, tức là ngăn quá trình làm sạch. )
+ Auto Degas để thực hiện khử khí tự động theo chu kỳ, tự động chuyển đổi
giữa hai tần số siêu âm: 37kHz và 80kHz (80kHz lý tưởng để làm sạch các lỗ mao
quản, dùng cho các quy trình làm sạch kéo dài và trong môi trường làm việc yên
tĩnh)
+ Chế độ Pulse: tăng cường độ làm sạch, tăng công suất siêu âm thêm 20%
+ Chế độ Sweep: quét tần số siêu âm liên tục quanh giá trị trung tâm, ví dụ
40kHz ± 3kHz, nhằm phân bố đồng đều sóng siêu âm
Ngoài ra, bể rửa siêu âm còn có các chức năng khác như thay đổi công suất
siêu âm, gia nhiệt đến 900C, ). Công suất quá lớn có thể làm hỏng các bộ phận điện
tử, bề mặt vật liệu (kim loại như nhôm…). Rổ rửa hay khay đựng là dụng cụ cần
thiết trong bể rửa siêu âm để cách ly khỏi đáy bể, tạo hiệu quả cho quá trình làm
siêu âm cũng như kéo dài tuổi thọ của bể.
1.2 Bơm cao áp
Trong HPLC, bơm cao áp là bộ phận quan trọng quan trọng thứ hai sau cột
tách. Bơm phải đạt được áp suất cao khỏang 400-600bar (5800-8700psi) (40-
60Mpa) và tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút, thông thường
khoảng 1ml/phút. Cáy dây hút kênh pha động đều có cục lọc phía đầu vào (inlet
solvent filter) loại bỏ chất lơ lửng, cấu tạo từ inox 316 có nhiều kích thước lỗ như 2
µm (tối đa 10ml/phút), 10 µm (tối đa 40ml/phút).
- Hệ bơm nhị phân (binary): 02 đầu hút cho 02 kênh pha động, gồm 02 bơm
(chương trình dung môi áp suất cao - High pressure gradient proportioning)

Hệ bơm tứ phân (quaternary): 04 đầu hút cho 04 kênh pha động, gồm 01 bơm
với van chia proportioning valve (chương trình dung môi áp suất thấp - Low
pressure gradient proportioning)
- Kiểu bơm một piston: điều chỉnh bằng hệ thống tâm sai, lưu lượng không đổi, ÁP
SUẤT ĐỔI
Kiểu bơm hai piston nối tiếp: lưu lượng điều chỉnh bởi motor, lưu lượng không
đổi, ÁP SUẤT KHÔNG ĐỔI. Bơm có 2 piston thay phiên nhau hút đẩy dung môi
liên tục (twin-headed reciprocating pump)(dual head)): 1 piston hút pha động vào
bơm, 1 piston đẩy pha động từ bơm vào cột (thuận nghịch)(đẩy hút luân phiên)(bơm
kép kéo đẩy)
- Bơm đẳng áp suất: dùng cho công tác nhồi cột
Bơm đẳng dòng: dùng cho công tác phân tích
1.3 Bộ tiền lọc (pre-filter)
Cấu tạo là lưới lọc frit kích thước lỗ 2µm (inline filter) gắn trước injector,
nhằm loại bỏ cặn có trong pha động. Một số máy có thêm 1 filter sau cổng injector
nhằm loại bỏ cặn trong mẫu (precolumn filter). Có nhiều kích thước lỗ như
0.5/1.0/2.0 µm.

1.4 Bộ tiêm mẫu tự động (autosampler)
Là một loop tiêm mẫu có thể chứa được 100 l mẫu. Khi làm việc với áp
suất cao mẫu được đưa vào cột tách bằng PP ngừng dòng, ở đây mẫu được đưa vào
cột tách khi dòng dung môi ngừng lại không chịu áp suất, sau khi mẫu đưa vào cột
tách dung môi lại tiếp tục được bơm. Sau một thời gian ngắn áp suất mới đạt được
cân bằng.
Dung tích bơm mẫu: 0,1–100 µL ± 0,1 µL
1.5 Cột bảo vệ (guard column)
Lọc hay loại bỏ: 1) các hạt lơ lửng làm nghẽn cột, tăng áp suất, giảm hiệu
năng, 2) các hợp chất, ion gây trôi đường nền, giảm độ phân tách, độ nhạy, tạo các
pic ma, 3) hợp chất gây kết tủa với pha động hay pha tĩnh, 4) các hợp chất ra cùng
lúc với chất phân tích gây khó khăn trong định tính, định lượng. Cần phải thay cột
bảo vệ theo chu kỳ để đảm bảo chất lượng phân tích.
Cột bảo vệ gắn ngay trước cột tách, cấu tạo từ các hạt nhồi loại tương tự của
cột tách nhưng có đường kính id bằng hoặc nhỏ hơn, ngắn hơn, hạt lớn hơn. Có 2
dạng cột bảo vệ: dạng pre-column catridge (lõi thay thế được) và dạng pre-column
(cột đóng sẵn như cột tách)
Dạng cartridge (1-2cm) Dạng cột (1-5cm)
1.6 Cột phân tách (colum)
Pha tĩnh không phân cực (các hạt có đường kính 5 -10 m) được nhồi trong
cột thép không rỉ dài 15-30 cm, đường kính trong 4 - 8 mm. Cột thường có vỏ bằng
thép không rỉ, một số rất ít bằng nhựa PEEK cho phân tích các chất sinh học, anion

tạo phức kim loại như phosphat. Đối với các phương pháp mà thời gian lưu của pic
bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ như dung dịch có độ nhớt cao, cần đặt cột trong lò ổn
nhiệt 5-800C, còn lại trong đa số trường hợp thì việc sử dụng là không cần thiết.
Trong sắc ký điều chế, người ta sử dụng cột dài 25 cm, đường kính trong lớn
gấp 5-10 lần, từ 20 - 50 mm. Khi dùng cột kích thước lớn thì tốc độ dòng của pha
động cần phải tăng lên và do đó rất tốn dung môi.
Sắc ký điều chế (preparative chromatography) là một kỹ thuật phân tách tiên tiến
được ứng dụng để tách hoặc làm tinh khiết các cấu tử có giá trị cao, hoặc các cặp
đồng phân quang học khó tách bằng các phương pháp cổ điển như kết tinh phân
đoạn, chưng cất phân đoạn v.v....
Phân biệt sắc ký phân tích và sắc ký điều chế: Nếu như người ta dùng sắc ký phân
tích (analytical chromatography) để định tính và định lượng các cấu tử có trong mẫu
phân tích thì sắc ký điều chế giúp ta phân lập và tinh chế các cấu tử từ hỗn hợp ban
đầu. Đối với sắc ký phân tích các tiêu chí như độ nhạy, độ chính xác của phương
pháp là các chỉ tiêu đánh giá hiệu năng của phương pháp thì độ tinh khiết của sản
phẩm, tỷ lệ thu hồi dung môi cao, tiêu hao dung môi tối thiểu là các tiêu chí đánh
giá hiệu quả của phương pháp sắc ký điều chế.
Có thể phân loại sắc ký điều chế thành 3 loại như sau:
1. Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative Thin layer Chromatography);
2. Sắc ký cột điều chế (Preparative Column Chromatography);
3. HPLC điều chế (Preparative High Perfornace Liquid Chromatography)

Có nhiều loại detector để phát hiện trong HPLC điều chế, phổ biến nhất là UV và
RI.
1.7 Buồng đo (cuvet)
Buồng đo là là hệ 2 chùm tia bao gồm 2 cuvet động (flowcell ống hình trụ
d=1mm, L=10mm)
1.8 Đầu dò (detector)
Có thể chia thành 2 loại:
- Phố quát: chỉ số khúc xạ (RI) , tán xạ bay hợi (ELSD), độ dẫn điện (CD) tuy
đa năng nhưng kém về độ nhạy, khoảng tuyến tính
- Chuyên biệt: UV, huỳnh quang (FL), điện hoá (ED), MS
a) Đầu dò hấp phụ tử ngoại (UV): Là đầu dò thông dụng nhất. Chỉ áp dụng
cho các hợp chất có khả năng hấp phụ trong vùng tử ngoại và pha động phải
trong suốt trong vùng bước sóng cần đo. So với detectơ huỳnh quang thì kém
chọn lọc hơn, GHPH cao hơn.
Hiện nay, các máy HPLC đều đã chuyển sang dùng đầu dò đa kênh DAD
(Diod Array Detector): mỗi kênh hấp thụ 1 bước sóng. Đầu dò này cho khả
năng quét chồng phổ (phổ hấp thu, sắc ký đồ) tạo nên phổ 3 chiều: độ hấp
thu, thời gian, bước sóng, nhờ đó có thể định lượng cùng một lúc các chất
có thời gian lưu giống nhau. Các hãng khác nhau thì đặt tên khác nhau:
Shimadzu, Hitachi,... gọi là PDA. Còn Agilent, Water,... thì gọi là DAD. Đầu
dò này phù hợp nghiên cứu, xác định hợp chất chưa biết, tạp chất có mặt
trong mẫu.

Nguồn phát xạ là đèn D2/W hoặc chỉ D2, có kính lọc Holmium hoặc đèn Hg
kiểm tra bước sóng
Tuy nhiên, đầu dò UV có nhược điểm là không áp dụng cho các chất không
hấp thu UV hoặc không đủ nhạy. Lúc này, đầu dò MS tỏ ra có nhiều ưu thế.
a) Đầu dò huỳnh quang (FLD): Không thể dùng cho các dung môi là các
hợp chất chứa oxi vì nó làm tắt huỳnh quang. Độ nhạy của đầu dò này lớn
hơn, nhưng khoảng tuyến tính hẹp hơn 102 so với đầu dò UV. Tuy nhiên,
đa số hợp chất không phát quang mà phải qua bước tạo dẫn xuất trước (pre-
column) hoặc sau khi ra khỏi cột (post-column).
Ví dụ sử dụng đầu dò huỳnh quang là: họ benzoylurea, họ cúc, carbamate,
alflatoxin, mycotoxin, amino acid. Ngoài ra, trên hệ thống sắc ký ghép cặp
ion hoặc trao đổi ion với đầu dò này còn áp dụng cho xác định một số kim
loại như Hg, As, Se, Sb với ưu điểm độ nhạy cao tương đương ICP-MS, có
thể xác định nhiều dạng vô cơ, hữu cơ riêng biệt; tuy nhiên cần có thêm bộ
phận nguyên tử hóa như hóa hơi lạnh hoặc tạo hydrua-phân hủy nhiệt.
b) Đầu dò khối phổ (MS): Do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi
mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất phải ở trạng thái khí, vận
tốc dòng chảy nhỏ (lượng mẫu ít), trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp
suất cao với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp,
các chất phân tích ở thể lỏng. Điều này gây rất nhiều khó khăn trong việc
tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa hệ thống HPLC và đầu dò
MS. Để khắc phục những khó khăn trên, cần phải có một kỹ thuật trung
gian gọi là ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure
Ionization – API), là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu
trúc của hợp chất cần phân tích, nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử.
Có ba kiểu hình thành ion: Phun mù điện tử (ESI), Ion hóa hóa học tại áp
suất khí quyển (APCI), Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (APPI).
Trong đó, hai kỹ thuật APCI và đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều hơn cả.
Hiện nay đã có 1 số máy thế hệ mới có tới 4 nguồn ion gồm ESI, APCI,
APPI và MMI.
Một số quy trình như xác định N-methylcarbamates, hexavalent chromium,
glyphosate thì sau khi ra khỏi cột, cần thêm giai đoạn phản ứng với thuốc thử để tạo
thành các hợp chất hấp thu UV/Vis hay có khả năng phát huỳnh quang và phát hiện
trên đầu dò phù hợp.

Thứ tự độ nhạy tốt dần: RI, ELSD < UV(DAD), MS < FLD, MS/MS
1.8 Phụ kiện và tính năng option:
- Bộ phận phản ứng sau cột HPLC post column: bơm, vòng (cuộn dây) phản ứng,
bộ gia nhiệt
- Hệ thống thu phân đoạn cho HPLC điều chế.

- Suppressor (dùng trong sắc ký ion)
- Buồng điều nhiệt:
Hệ thống ổn nhiệt thiết kế hai vùng, vùng trên cho detector, bộ triệt nền,
vùng dưới cho cột phân tích và bảo vệ cột.
+ Khoảng nhiệt độ vùng phía trên: từ 100C đến 400C (tối thiểu dưới nhiệt
độ môi trường -15oC, tối đa trên nhiệt độ môi trường +200C).
+ Khoảng nhiệt độ vùng phía dưới: từ 100C đến 700C (tối thiểu dưới nhiệt
độ môi trường -150C, tối đa trên nhiệt độ môi trường +500C).
Lưu ý:
- Đừng bao giờ bơm không khí vào hệ thống (do hết pha động). Nếu thấy có bọt khí
trong ống dẫn pha động thì mở valve purge để mồi lại bơm.
- Loại kim tiêm dùng trong HPLC là loại mũi bằng (flat, blunt) không phải là loại
mũi nhọn dùng trong GC (long/short bevel: vát nhọn nhiều/ít)).
2. Kỹ thuật tăng tốc độ trong HPLC
2.1 Chương trình dung môi
Chương trình dung môi hay còn gọi là rửa giải gradient trong HPLC có thể
so sánh với kỹ thuật chương trình nhiệt độ trong sắc ký khí.
Sử dụng chương trình dung môi sẽ giúp rút ngắn đáng kể thời gian phân tích,
pic nhọn hơn hoặc các pic tách ra tốt hơn. Trong HPLC, chương trình dung môi đòi
hỏi độ phân cực của pha động tăng lên theo thời gian rửa giải.

2.2 Chương trình tốc độ dòng
Để thực hiện chương trình tốc độ dòng, người ta thường áp đặt tốc độ dòng
thấp ở giai đoạn đầu của quá trình tách và tăng tốc độ ở phần sau. Sự thay đổi này
có thể thực hiện từng nấc hoặc liên tục. Cách này làm cho độ phân giải tăng lên ở
phần đầu của sắc ký đồ và giảm đi ở phần sau (thường không cần thiết).
Ưu điểm của kỹ thuật này là làm giảm thời gian phân tích mà không ảnh
hưởng đến độ phân giải, không cần tái sinh cột tách như trong chương trình dung
môi, có thể áp dụng cho các hệ sắc ký lỏng không thể chạy theo chương trình dung
môi.

Các biểu hiện của cột sắc ký HPLC bị bẩn:
1. Áp suất phân tích tăng cao (quá áp).
2. Thời gian lưu bị thay đổi.
3. Các pic bị giãn hoặc chẻ pic (broad and tailing).
4. Cột mất hoặc giảm khả năng tách (resolution).
Nếu áp suất cao, chúng ta thử gỡ cột ra và thay thế bằng ống mao quản và
theo dõi áp suất của hệ thống. Nếu sau khi gỡ cột ra mà áp suất hệ thống vẫn cao thì
có thể là hệ thống đường ống đã bị nghẹt. Nếu áp suất thấp hơn so với bình thường:
đây cũng là 1 vấn đề thường gặp ở các phòng kiểm nghiệm (dù ít khi gặp hơn). Vấn
đề này có 2 nguyên nhân chính: thứ nhất là do lỗi của kiểm nghiệm viên – thiết lập
bơm không đúng như quy trình; thứ hai là do hệ thống bị rò rỉ ở đâu đó thì phải
kiểm tra trên phần mềm của máy xem có báo rò rỉ ở đâu module nào không – ở các
dòng máy của Hitachi đều có trang bị tính năng này.
Tái sinh cột sắc ký pha đảo
Tháo cột ra khỏi hệ thống, đảo chiều cột và kết nối lại cột vào hệ thống HPLC
(dòng chảy đẩy ngược lại so với hướng thông thường). Nếu sau khi đảo đầu cột mà
áp suất vẫn cao, chứng tỏ cột của bạn đã bị nhiễm bẩn (do tủa của mẫu hoặc pha
động bên trong cột, do các hợp chất hấp thụ quá sâu vào trong cột,…). Chúng ta tiến
hành rửa cột với các pha động theo thứ tự giảm dần độ phân cực (độ mạnh từ thấp
đến cao). Nên sử dụng MeOH thay cho ACN để rửa cột.
Bơm rửa (flush) với 25ml muối/ đệm (pha động thường dùng cho cột đó) ở tốc độ
dòng 1 ml/min
Rửa tiếp với 25ml iso-propanol
Rửa tiếp với 25ml methylene chloride (CH2Cl2)
Rửa tiếp với 25ml hexane
Rửa lại với 25ml methylene chloride (CH2Cl2)
Rửa lại với 25ml iso-propanol
Tháo cột ra và lắp lại theo đúng chiều dòng chảy, rửa với pha động không chứa
đệm (vd H2O) sau đó tăng dần tỷ lệ đệm trong pha động lên (chạy gradient)
Chạy cân bằng cột với 25-50 ml pha động

Kỹ thuật phòng chống hiện tượng nghẹt cột – rẻ mà hữu hiệu:
1. Sử dụng bảo vệ cột: bao gồm hệ thống lọc dây pha động, bộ bảo vệ cột.
2. Lọc mẫu cho mỗi lần phân tích.
3. Lọc pha động cho mỗi lần phân tích.
Đây là những biện pháp dễ dàng, rẻ nhưng vô cùng tiện lợi giúp hạn chế tối đa hiện
tượng nghẹt cột trong hệ thống HPLC.
Đĩa lọc cho mẫu (syringe filter)

Đầu lọc dung môi
Những khác biệt giữa HPLC và UHPLC
HPLC bắt đầu phát triển từ những năm 1960s. Đến năm 2004, Waters là
hãng đầu tiên công bố sắc kí lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performance LC) và đăng
ký tên gọi độc quyền này. Còn các hãng khác gọi là siêu cao áp hay siêu hiệu năng
(Ultra High Performance LC)
Về bản chất, cả HPLC và UHPLC đều được dùng để tách một hỗn hợp ra
thành nhiều thành phần khác nhau, bằng việc sử dụng áp suất cao đẩy các dung môi
qua cột, còn sau đây 2 đặc điểm chính phân biệt giữa chúng:
- HPLC có áp suất bơm tối đa khoảng 400-600 bar, hệ thống UHPLC có áp
suất bơm 1000-1200 bar (15.000 – 18.000 psi), gấp khoảng 1,5-3 lần.
- HPLC sử dụng cột có hạt nhồi đường kính >2µm, trong khí UHPLC là
>2µm.
Sự khác biệt chủ yếu giữa HPLC và UHPLC nằm ở chỗ UHPLC có nhiều ưu
điểm hơn so với HPLC. Nhờ áp suất vận hành cao hơn, UHPLC giảm được thời
gian phân tích mẫu còn vài phút, giảm chi phí dung môi tới 90% cũng như tín hiệu
trên detector của chất phân tích cao hơn. Bên cạnh đó kỹ thuật UHPLC sẽ tăng được

sac ky GC LC IC

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to sac ky GC LC IC

Similar to sac ky GC LC IC (20)

sac ky GC LC IC