Identifikasi 23 strain bakteri asam asetat yang diisolasi di Thailand menggunakan analisis filogenetik berdasarkan sekuens gen 16S rRNA dan gen groEL. Hasilnya menunjukkan strain-strain tersebut tergolong ke dalam 10 spesies Acetobacter yang berbeda, terutama A. pasteurianus, A. orientalis, A. tropicalis, dan A. ghanensis. Analisis gen groEL lebih sensitif untuk membedakan spesies yang sangat mirip seperti A. peroxydans dan A. papayae

1. www.ugm.ac.id Locally Rooted, Globally Respected
www.ugm.ac.id Locally Rooted, Globally Respected
Identifikasi bakteri asam asetat yang
diisolasi di Thailand dan dimasukkan ke
dalam genus Acetobacter dengan analisis
urutan gen groEL
Villa Novitasari
20/461094/BI/10645
Asisten : Annisa Indriawati

2. www.ugm.ac.id Locally Rooted, Globally Respected
identifikasi tingkat spesies dari kumpulan besar strain, yang diisolasi di Thailand dan
ditugaskan ke genus Acetobacter, berdasarkan gen 16S rRNA serta analisis urutan gen groEL.
Journal Review #2
.

3. www.ugm.ac.id Locally Rooted, Globally Respected
identifikasi tingkat spesies dari kumpulan besar strain, yang diisolasi di Thailand dan
ditugaskan ke genus Acetobacter, berdasarkan gen 16S rRNA serta analisis urutan gen
groEL.
Tujuan

4. www.ugm.ac.id Locally Rooted, Globally Respected
.
Pendahuluan
• Bakteri asam asetat (AAB) milik keluarga Acetobacteraceae — Alphaproteobacteria adalah
aerobik wajib dan Gram-negatif, dan ditemukan umumnya terkait dengan berbagai jenis bahan
manis dan alkohol.
• Strain dari genus Acetobacter digunakan untuk fermentasi cuka karena kemampuannya untuk
mengoksidasi etanol menjadi asam asetat dan ketahanannya yang sangat tinggi terhadap asam
asetat yang dihasilkan
• Metode filogenetik identifikasi AAB terutama didasarkan pada analisis urutan gen 16S rRNA;
namun, penggunaan gen 16S rRNA saja tidak cukup untuk membedakan antara spesies dengan
urutan gen 16S rRNA yang sangat mirip Karena kurangnya variabilitas dalam urutan gen 16S
rRNA menghalangi identifikasi spesies atau subspesies yang terkait erat, gen rumah tangga
lainnya seperti gen recA, rpoB, dnaK, dan groEL telah digunakan sebagai alat alternatif
• Gen groEL, yang mengkode 60 kDa heat shock pro teins (GROEL), ada di mana-mana dan secara
evolusioner sangat terkonservasi di antara bakteri
• Dalam beberapa tahun terakhir, beberapa rumah tanggaprotein seperti 60 kDa heat shock protein
(HSP60) telah dianggap berguna sebagai penanda filogenetik dan telah berhasil digunakan untuk
identifikasi spesies dalam genera Bifidobacterium, Enterococcus, Rickettsia, Bacillus,
Campylobacter, Lactobacillus, Gluconacetobacter dan Acetobacter

5. www.ugm.ac.id Locally Rooted, Globally Respected
.
Metode
1. Strain bakteri, media kultur dan kondisi kultur
• 23 galur diisolasi di thailand dengan pendekatan budaya pengayaan yang semuanya adalah batang
aerob Gram-negatif
• 12 ditetapkan sebagai galur SKU dan diisolasi dengan metode dan 11 strain yang tersisa ditetapkan
sebagai strain BCC dan diisolasi dengan metode
• menghasilkan katalase tetapi bukan oksidase, menunjukkan zona bening pada pelat agar
glukosa/ekstrak ragi/pepton/etanol/kalsium karbonat, dan tumbuh pada pH 3,5, sehingga
dimasukkan ke dalam genus Acetobacter, karena mereka mengoksidasi asetat dan laktat menjadi
karbon dioksida dan air dan memiliki Q-9 sebagai kuinon utama
• Strain tipe spesies Acetobacter diperoleh sebagai strain referensi dari BCC, Thailand, NBRC,
Jepang, LMG, Belgia, dan JCM, Jepang
• Semua galur dipertahankan pada agar miring yang mengandung D-glu cose 10 g (b/v), ekstrak ragi
10 g (b/v), pepton 10 g (b/v), gliserol 20 mL (v/v), ekstrak kentang 15 mL (v/v) dalam 1 L air,
ditambah dengan 1,5 % agar (b/v)

6. www.ugm.ac.id Locally Rooted, Globally Respected
2. Amplifikasi PCR gen 16S rRNA dan groEL dari strain genus
Acetobacter
• DNA genom diekstraksi
• Urutan primer untuk amplifikasi dan sekuensing gen 16S rRNA adalah: forward primer 27f
(5ÿAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3ÿ) dan reverse primer 1525r (5ÿ-
AAAGGAGGTGATCCAGCC-3ÿ)
• Sembilan primer spesifik groEL digunakan untuk amplifikasi PCR (Tabel 1)
• menggunakan primer untuk amplifikasi PCR dan sekuensing gen groEL yang ada dirancang
berdasarkan urutan genom Acetobacter pasteurianus IFO 3283 dan Acetobacter pomorum DM001
kecuali untuk primer groEL 10-F dan groEL-11-R
• Primer FgroEL dan RgroEL memperkuat gen groEL dengan panjang hampir penuh dari hampir
semua strain, kecuali Acetobacter peroxidans, Acetobacter cerevisiae, A. pomorum, Acetobacter
aceti, Acetobacter oeni, Acetobacter estunensis, dan Acetobacter nitrogenifigens, di mana
kombinasi primer alternatif, FgroELnew / RGroELnew, FgroEL89/RgroEL89, dan groEL10-
F/groEL-11-R digunakan.
• Semua strain diamplifikasi dan diurutkan Namun, suhu annealing yang dioptimalkan diubah
menjadi 54 °C untuk semua primer.

7. www.ugm.ac.id Locally Rooted, Globally Respected
3. Analisis data sekuens dan konstruksi pohon filogenetik
• Produk PCR murni dikirim ke 1st Base Laboratory (Selangor, Malaysia) untuk pengurutan DNA
• Urutan gen 16S rRNA dan urutan gen groEL yang diperoleh diedit menggunakan program
Chromas 2.33
• Urutan DNA yang dihasilkan dari galur yang diisolasi dan galur jenis dari semua spesies yang
diketahui dari genus Acetobacter diselaraskan menggunakan CLUSTAL W versi 1.83
• Kesenjangan dalam urutan dihapus menggunakan program BioEdit
• Hubungan filogenetik antar spesies dianalisis berdasarkan sekuen gen 16S rRNA sebanyak 1.293
basa dan sekuen gen groEL sebanyak 898 basa dengan menggunakan pendekatan Neighbor
Joining (NJ) yang tercantum dalam perangkat lunak MEGA (Molecular Evolutionary Genetic
Analysis) versi 5.1
• Untuk analisis NJ, jarak antara urutan dihitung dengan menggunakan model dua parameter
Kimura
• Nilai bootstrap diperoleh untuk 1.000 pohon yang dihasilkan secara acak

8. www.ugm.ac.id Locally Rooted, Globally Respected
.
Hasil dan Pembahasan
Analisis filogenetik berdasarkan urutan gen
16S rRNA
• Dibagi kedalam 2 kelompok : kelompok A. aceti
dan kelompok A. pasteurianus
• 23 strain yang diisolasi di Thailand
didistribusikan ke dalam sepuluh kelompok
secara filogenetik (Tabel 2)
• Pada kelompok A. aceti, strain yang diisolasi
terdiri dari lima kelompok
• Kelompok 1 berisi empat galur SKU dan galur
tipe Acetobacter tropicalis dan Acetobacter
senegalensis
• Dua galur SKU dan satu galur BCC Grup 2 diidentifikasi sebagai Acetobacter indonesiensis, dua
galur BCC Grup 3 sebagai Acetobacter persici, dua galur BCC Grup 4 sebagai Acetobacter
orientalis, dan satu galur BCC Grup 5 sebagai Acetobacter cibinongensis

9. www.ugm.ac.id Locally Rooted, Globally Respected
.
• Tidak ada strain yang diisolasi yang
berhubungan dengan A. cerevisiae,
Acetobacter malorum, Acetobacter
orleanensis, Acetobacter farinalis, A. oeni, A.
nitrogenifigens, A. aceti, atau A. estunensis.
• Pada kelompok A. pasteurianus, strain yang
diisolasi terdiri dari lima kelompok. Dua galur
SKU dan satu galur BCC dari Grup 6
diidentifikasi sebagai A. pasteurianus, satu
galur BCC dari Grup 7 sebagai A. peroxydans
atau Acetobacter papayae, dua galur BCC dari
Grup 8 sebagai Acetobacter fabarum, satu
galur BCC dari Grup 9 sebagai Acetobacter
okinawensis, dan empat strain SKU dari Grup
10 sebagai Acetobacter ghanensis. Tidak ada
strain yang diisolasi yang berhubungan
dengan A. pomorum, Acetobacter lovaniensis
atau Acetobacter syzygii.

10. www.ugm.ac.id Locally Rooted, Globally Respected
.
Analisis filogenetik sekuens gen
groEL
• Pada pohon filogenetik berdasarkan
urutan gen groEL, strain yang diisolasi
dan strain tipe dari semua spesies
Acetobacter yang diketahui tidak perlu
dibagi menjadi dua kelompok, yaitu
kelompok A. aceti dan kelompok A.
pasteurianus (Gbr. 2).
• Kelompok 1 berisi empat galur SKU
dan galur tipe A. tropicalis dan A.
senegalensis; namun, keempat galur
tersebut dapat diidentifikasi sebagai A.
tropicalis, karena galur tipe A.
tropicalis memiliki cabang filogenetik
yang lebih pendek daripada A.
senegalensis

11. www.ugm.ac.id Locally Rooted, Globally Respected
.
• Dari data yang diperoleh bahwa isolat Acetobacter
Thailand sebagian besar diidentifikasi sebagai dua
spesies A. pasteurianus dan A. orientalis, bersama
dengan sejumlah kecil A. ghanensis, A. tropicalis, dan
A. syzygii.
• Dari hasil yang diperoleh dalam penelitian pada
jurnal, empat (17%), empat (17%), tiga (13%), tiga
(13%) dan dua (9%) isolat diisolasi dari buah dan
bunga Thailand, dan diidentifikasi sebagai A.
tropicalis, A. ghanensis, A. pasteurianus, A.
indonesiensis, dan A. orientalis. Isolat yang diperoleh
sama dengan penelitian sebelumnya.
• Dua isolat (9 %) diidentifikasi sebagai A. fabarum
diisolasi dari jamur. Dua isolat (9 %) diidentifikasi
sebagai A. persici diisolasi dari buah dan beras
fermentasi. Satu isolat diisolasi dari beras fermentasi
dan diidentifikasi sebagai A. cibinongensis. Isolat
yang tersisa diisolasi dari buah dan bunga,
diidentifikasi sebagai A. okinawensis dan A. papayae.
• Hasil penelitian menunjukkan bahwa spesies yang
lazim yaitu A. ghanensis, A. tropicalis, A.
pasteurianus, A. indonesiensis dan A. orientalis

12. www.ugm.ac.id Locally Rooted, Globally Respected
• Studi perbandingan mengungkapkan bahwa gen groEL menunjukkan variasi yang tinggi pada A.
peroxydans dan A. papayae (kelompok 7), yang memiliki variasi terendah (99,9-100% identitas) pada gen
16S rRNA. Jenis regangan dari Kelompok A. pasteurianus, A. Peroxydans.
• Menunjukkan posisi filogenetik yang sangat berbeda dalam dua pohon filogenetik yang disebutkan di
atas. Di pohon phylogenetic berdasarkan urutan gen 16S rRNA, itu terletak dalam kelompok A.
pasteurianus. Namun, itu merupakan cluster bersama dengan jenis strain A. tropicalis dan A. senegalensis
dalam kelompok A. aceti di pohon filogenetik berdasarkan urutan gen groEL. Fenomena seperti itu tidak
ditemukan pada jenis galur spesies lain dari genus Acetobacter.
• Terdapat beberapa galur yang memiliki cabang filogenetik panjang pada pohon filogenetik berdasarkan
sekuens gen 16S rRNA serta sekuen gen groEL. Strain ini mungkin merupakan tambahan spesies baru
dalam genus Acetobacter. Strain yang menjadi kandidat spesies baru adalah SKU 9 dan SKU 60 dari
Grup 1, strain SKU 20 dari Grup 2, dan strain SKU 76 dari Grup 6 pada pohon filogenetik sebelumnya,
dan strain BCC 15756 dari Grup 3 pada pohon filogenetik terakhir. Namun, nilai kesamaan 16S rRNA
lebih dari 99% untuk strain jenis yang terkait erat. Dalam percobaan lebih lanjut, isolate ini akan
dikonfirmasi dengan melakukan polifasik analisis dan disajikan sebagai spesies baru ditempat lain.
Kesimpulan

13. www.ugm.ac.id Locally Rooted, Globally Respected
Daftar Pustaka