Download to read offline
лебедева
- 1. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Технология мониторинга экспрессии клеточных геномов GE Healthcare Life Sciences “Together, we make the world healthier through imaginative science" Евгения Чакина ООО «Аламед» Официальный дистрибьютор GE Healthcare Life Sciences
- 2. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Развитие исследований: от гена до функции Genomics Proteomics Cellomics Ettan DIGE YFP-H2B in Arabidopsis thaliana protoplasts 1 2 3 3 35 8.48E10 0 D -4 D -5 D - 12 D -8 B - 10 D - 10 C - 11 C - 10 D - 11 D -6 DNA Microarray B - 11 B - 12 B-9 D -9 B-8 B-1 B-7 D -7 B-5 B-6 B-4 D -1 C- 9 D -2 B-3 B-2 D -3 C- 8 C- 3 C- 7 C- 6 C- 5 C- 4 C- 2 C - 12 Секвенирование генов, Идентификация и Исследование клеточных экспрессионный анализ, характеризация белков, функций, локализации молекул сайт‐специфический анализ их модификаций и и органелл, клеточного мутагенез и др. взаимодействий и др. фенотипа и др.
- 3. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Структурная и функциональная протеомика Задачи исследователя: • Определение структуры белка • Определение функций белка / антитела • Регуляция • Межмолекулярные взаимодействия/активность • Биофармакология Этапы: • Пробоподготовка ‐ Очистка белка • Разделение с высоким разрешением / Анализ cтруктуры • Анализ функции
- 4. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Структурная протеомика 2 разных подхода LC‐MS: смесь белков → определение пептидов в смеси • Разделение предварительно очищенного образца методом ВЭЖХ или УльтраВЭЖХ • Определение структуры методом MS 2D‐MS: один белок → определение структуры белка • Фракционирование образца методом 2D‐фореза, поиск интересующих белков (DIGE), извлечение единичных пятен – молекул белков • Определение структуры методом MS
- 5. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Функциональная протеомика Фундаментальные исследования взаимодействий: • Изучение кинетики и аффинности взаимодействий молекул • Задачи: изучение каскадов реакций, функций белков, формирования белковых комплексов Фишинг: смесь белков → «вылавливание единичной молекулы» → определение структуры • Получение фракций на FPLC • Скрининг фракций на чипе – определение взаимодействующей молекулы • Определение структуры методом MS Фармацевтические исследования и биотехнология: • Скрининг кандидатов в фармпрепараты и антител для диагностикумов • Персонализированная медицина – определение эффективности и метаболизма лекарственных средств
- 6. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Двумерный электрофорез 2D электрофорез – незаменимый классический метод в протеомных исследованиях, «входной билет в протеомику» Технология метода основана на последовательном разделении белковых образцов в двух направлениях: по изоэлектрической точке и массам молекул. Модификация метода 2D‐электрофореза – технология 2D‐DIGE (анализ дифференциально окрашенных гелей) ‐ существенно сокращает временные и финансовые затраты за счет мультиплексирования ‐ повышает точность, достоверность и воспроизводимость результатов за счет унифицированных условий эксперимента и использования внутреннего стандарта.
- 7. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. 2D‐электрофорез: этапы. MS
- 8. Двумерный электрофорез –результат? Лебедева Л., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
- 9. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. 2‐D DIGE для экспрессионной протеомики Традиционный 2D электрофорез Трудозатратный, большие вариации внутри эксперимента (одна краска для пост‐окрашивания, требуются повторные эксперименты для разделения биологических и технических вариаций) Технология DIGE Обеспечивает большую точность, воспроизводимость и существенно сокращает трудозатраты и время эксперимента: • Мультиплексирование – несколько образцов анализируются в одном геле • «Безобразно но однообразно» – ошибка оператора будет одинакова для всех образцов в геле • Внутренний стандарт – присутствует во всех гелях в одном эксперименте
- 10. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Difference gel electrophoresis (DIGE)
- 11. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Cy2 Mouse liver proteins Internal standard Cy3 Mouse proteins control Cy5 Mouse liver proteins treated Overlay Mouse liver proteins
- 12. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Традиционный 2‐D и 2‐D DIGE Традиционный 2D электрофорез (1‐цветный) 8 образцов: 8 гелей x 3 повтора = 24 геля 2D‐DIGE (3‐цветный) 8 образцов: 4 геля (без повторностей) = 4 геля
- 13. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Функциональная протеомика
- 14. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Анализ взаимодействия молекул: ‐ Без метки ‐ В режиме реального времени ‐ Кинетика взаимодействий Biacore™ ‐ биосенсоры SPR MicroCal™ ‐ калориметр
- 15. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Анализ взаимодействия различных молекул: • Белки • Нуклеиновые кислоты • Липиды и мембран‐ассоциированные молекулы • Углеводы • Низкомолекулярные соединения • Целые клетки • Вирусы/бактерии
- 16. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Biacore. SPR. Используются в ведущих академических и биотехнологических лабораториях с 1990 г. Система Программное детекции SPR обеспечение ‐ BiacoreTM Сенсорный Микрофлюид/ чип проточные ячейки
- 17. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Сенсограмма SPR Точка отсчета Форма кривой показывает кинетику взаимодействий • Специфичность • Аффинность Ответ связывания • Кинетика Базовая линия • Концентрация • Термодинамика ассоциация диссоциация буфер образец буфер
- 18. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. MicroCal™ ‐ принцип В шприце ‐ лиганд (связываемое соединение) В экспериментальной ячейке ‐ целевой белок В ячейке сравнения ‐ буфер Шприц Измеряется теплота взаимодействия Обработанные Данные данные эксперимента 0 Механизм kcal/mole of injectant -2 -4 -6 -8 Аффинность -10 Стехиометрия -12 -14 0 1 2 Molar Ratio Ячейка Экспериментальная сравнения ячейка
- 19. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Около 20 лет на рынке – более 10 000 научных публикаций • Онкология • Нейробиология • Иммунология • Инфекционные заболевания • Протеомика • Трансдукция сигнала • Разработка вакцин, фармпрепаратов и диагностикумов • Выбор и характеристика связывающих реагентов • Исследования лекарств и многое другое….
- 20. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. High Content Analysis (HCA) это… ‐ Анализ «высокого содержания» ‐ Получение большого количества разноплановых данных по одному образцу ‐ Многопараметрический анализ данных
- 21. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Эволюция клеточного анализа Деструктивный Фиксированный Динамический Интегрированный Информа‐ Тивноcть Электрофорез Трансдукция Процессы в клетке Взаимодействия сигнала
- 22. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Зачем нужен HCA? • Сложные многопараметрические эксперименты • Мультиплексность • Широкомасштабные скрининговые исследования • Быстрота получения данных • Огромное количество данных по одному образцу • Сохранение изображений и повторные анализы Исследования: • Изучение функции, локализации и кинетики в живой клетке: транслокации, активация рецепторов, фазы клеточного цикла • Тестирование воздействия внешних условий (токсинов, лекарственных средств, ингибиторов, активаторов и пр.) на живую клетку • Слежение за несколькими морфологическими параметрами • Возможность мечения нескольких мишеней
- 23. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Универсальность и возможности Ми кро ско пия Cytometry Цитофлуориметр g t in oеtз blр о tern sтро к ф We Эле
- 24. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Основные компоненты HCA Биологический Реактивы объект Флуоресцентные метки Культуры клеток Ткани Организмы Оборудование Инструмент для визуализации фиксированных и живых клеток Программное Дополнительные модули обеспечение (инкубатор, система Для получения, дозирования) для обработки и хранения прижизненного наблюдения HCA данных
- 25. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. IN Cell Analyzer 2200, 6000
- 26. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Высоко‐производительная камера Стандартная CCD-камера 1.4 Mp CoolSNAP ES2 1392 x 1040 пикс. 6.45мкм кв. пикс. 137 клеток при 10X увеличении Широкоформатная камера 4.2 Mp CoolSNAP K4; 2048 x2048 пикс. 7.40мкм кв. пикс. 635 клеток при 10X увеличении Больше клеток, больше данных, быстрее!!!
- 27. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Новейшая технология восстановления изображения (Деконволюция)
- 28. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. 3 режима проходящего света -микроскопия светлого поля -фазово-контрастная микроскопия -ДИК (дифференциально- интерференционный контраст) для анализа живых клеток Использование опции 3D/деконволюции для улучшения качества изображения 2D 2D Deconvolved 2.5D Deconvolved
- 29. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Данные от одной клетки до популяции
- 30. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Spotfire – интерактивное получение изображений Рост клеток Клеточная токсичность Движение клеток Рост клеток
- 31. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Области применения • Активация рецептора • Токсикологический ответ клетки и апоптоз • Трансдукция внутриклеточного сигнала • Анализ дифференцировки стволовых клеток • Клеточный цикл • Органеллы и внутриклеточный транспорт • Функционирование нейронов • Морфологическое и физиологическое состояние клетки
- 32. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Данные пользователей на IN Cell Analyzer NIH-3T3 fibroblasts overexpressing src causing localization of actin toward podosomes. Cells stained for DNA (blue), actin (green) and phospho-src (red). Courtesy of Evelyn Griffin, Scripps Florida Human Neuronal Stem Cells from fetal cortex. Cell stained for DNA (blue), TUJ-1 (neuronal differentiation marker, green) and GFAP (astrocyte differentiation marker, red). Courtesy of Kymmy Lorrain, Brain Cells Inc Primary Porcine Trabecular Meshwork cells stained for DNA (blue), actin (rhodamine phalloidin, red) and Paxillin in focal adhesions (green). Courtesy of Carmen Laethem, Aerie Pharma
- 33. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Данные пользователей на IN Cell Analyzer Primary pig trabecular meshwork cells stained for actin (green), DNA (blue) and paxillin focal adhesion points (red). IN Cell 1000 Courtesy of Carmen Laethem, Aerie Pharma Rat cardiac H9C2 cells stained for DNA (blue), actin (red) and tubulin (green). IN Cell 1000. Courtesy of Connla Edwards, Trinity College Dublin Human neural stem cells stained for neuronal TUJ-1 (green), astrocyte GFAP (red) and DNA (blue). IN Cell 1000. Courtesy of Kymmy Lorrain, BrainCells Inc., USA
- 34. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Качество изображений – это основа Формирование ядрышка Срезы тканей Структура цитоскелета (семенники мыши) (Актин, тубулин) До воздействия + Этопозид GFP репортеры (AKT в PM ruffles) Активация рецептора Рост нейритов (CypHer 5E)
- 35. Лебедева Л., IVВсероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г. Спасибо за внимание!