Nhận viết luận văn Đại học , thạc sĩ - Zalo: 0917.193.864 Tham khảo bảng giá dịch vụ viết bài tại: vietbaocaothuctap.net Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học với đề tài: Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Pheretima modigliani (Rosa, 1889) và Pheretima rodericensis (Grube, 1879), cho các bạn làm luận văn tham khảo 50000440

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
--------
NGUYỄN THỊ THỦ
QUAN HỆ HỌ HÀNG CỦA HAI LOÀI GIUN ĐẤT
Pheretima modigliani (Rosa, 1889) VÀ Pheretima
rodericensis (Grube, 1879)
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Huế, 2017

2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
--------
NGUYỄN THỊ THỦ
QUAN HỆ HỌ HÀNG CỦA HAI LOÀI GIUN ĐẤT
Pheretima modigliani (Rosa, 1889) VÀ Pheretima
rodericensis (Grube, 1879)
Chuyên ngành: Động vật học
Mã số: 60 42 01 03
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS. NGUYỄN VĂN THUẬN
2. PGS.TS. TRẦN QUỐC DUNG
Huế, 2017

3. LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số liệu,
kết quả trong luận văn là trung thực, khách quan và nghiêm túc. Những tài tham
khảo cho luận văn có nguồn gốc rõ ràng.
Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Học viên
Nguyễn Thị Thủ

4. Trong suố t thời gian họ c tậ p và hoàn thành luậ n
vă n, tôi xin chân thành cả m ơn quý thầ y cô giáo trong
Khoa Sinh họ c, Trường Đạ i họ c Sư phạ m, Đạ i họ c Huế
đã nhiệ t tình truyề n đạ t kiế n thức cho chúng tôi. Tôi
cũ ng xin cả m ơn các thầ y cô đã tạ o mọ i điề u kiệ n
thuậ n lợi cho tôi hoàn thành luậ n vă n này.
Đặ c biệ t, tôi xin được bày tỏ lời cả m ơn chân
thành và lời cả m ơn sâu sắ c đế n thầ y giáo PGS. TS
Nguyễ n Vă n Thuậ n và thầ y giáo PGS. TS Trầ n Quố c
Dung đã tậ n tình hướng dẫ n, chỉ bả o và tạ o mọ i điề u
kiệ n thuậ n lợi nhấ t để tôi thực hiệ n luậ n vă n này.
Tôi xin gửi lời cả m ơn đế n quý thầ y cô giáo ở
Phòng thí nghiệ m Di truyề n Vi sinh và Phòng thí
nghiệ m Độ ng vậ t họ c đã giúp đỡ và chỉ dẫ n nhiệ t
tình trong quá trình nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cả m ơn đế n TS. Hoàng Tấ n Quả ng
và các anh chị công tác tạ i Bộ môn sinh họ c Phân tử,
Việ n Công nghệ sinh họ c, Đạ i họ c Huế cùng toàn bộ

5. cán bộ củ a Việ n đã giúp đỡ và chỉ dẫ n nhiệ t tình
trong quá trình nghiên cứu hoàn thành luậ n vă n.
Cuố i cùng, tôi xin bày tỏ lòng biế t ơn sâu sắ c đế n
những người thân trong gia đình, bạ n bè luôn quan
tâm, độ ng viên và giúp đỡ tôi trong suố t thời gian họ c
tậ p và nghiên cứu để hoàn thành luậ n vă n này.
Huế , tháng 10 nă m 2017
Họ c viên
Nguyễ n Thị Thủ

6. 1
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 6
I. Lý do chọn đề tài ...................................................................................... 6
II. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................ 7
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 8
1.1. Tình hình nghiên cứu giun đất.............................................................. 8
1.1.1. Về đa dạng và phân bố.................................................................... 8
1.1.2. Về phân loại .................................................................................. 10
1.1.3. Về nhân nuôi ................................................................................. 11
1.1.4. Về di truyền................................................................................... 12
1.2. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền và ứng dụng ........... 16
1.2.1. Các phương pháp .......................................................................... 16
1.2.1.1. Kỹ thuật đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD).. 16
1.2.1.2. Kỹ thuật đa hình chiều dài cắt đoạn giới hạn (RFLP) ........... 17
1.2.1.3. Kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn khuếch đại (AFLP)........... 18
1.2.1.4. Kỹ thuật SSR.......................................................................... 18
1.2.2. Ứng dụng....................................................................................... 19
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............ 22
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................. 22
2.3. Hóa chất và thiết bị ............................................................................. 23
2.4. Phương pháp nghiên cứu..................................................................... 24
2.4.1. Phương pháp thu thập mẫu ........................................................... 24
2.4.2. Phương pháp xử lý mẫu ................................................................ 26
2.4.2.1. Mẫu nghiên cứu đặc điểm hình thái....................................... 26
2.4.2.2. Mẫu nghiên cứu đặc điểm di truyền ...................................... 26
2.4.3. Phương pháp định loại .................................................................. 26
2.4.4. Phương pháp tách chiết genomic DNA ........................................ 26
2.4.5. Điện di DNA trên agarose gel....................................................... 27
2.4.6. Phương pháp PCR......................................................................... 28

7. 2
2.4.7. Phân tích kết quả RAPD bằng phần mềm TEPGA (Tool for
Populator Genetic Analysis) version 1.3 của Mark P.Miller.................. 28
2.4.8. Xây dựng giản đồ phả hệ bằng phần mềm NTSYS version 2.1... 28
2.4.9. Xử lý số liệu.................................................................................. 28
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................ 30
3.1. SỰ KHÁC BIỆT VỀ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI GIỮA HAI LOÀI
GIUN ĐẤT Ph. modigliani (Rosa, 1889) VÀ Ph. rodericensis (Grube,
1879)........................................................................................................... 30
3.1.1. Đặc điểm hình thái ngoài .............................................................. 30
3.1.2. Mối quan hệ phân loại học dựa trên đặc điểm hình thái............... 32
3.2. ĐA HÌNH RADP ................................................................................ 34
3.2.1. DNA tổng số ................................................................................. 34
3.2.2. Kết quả thực hiện RAPD - PCR.................................................... 35
3.2.2.1. Kết quả RAPD với primer OPA02 ........................................ 35
3.2.2.2. Kết quả RAPD với primer OPA04 ........................................ 36
3.2.2.3. Kết quả RAPD với primer OPA09 ........................................ 37
3.3. PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN ..................................... 38
3.3.1. Giản đồ phả hệ DNA của các cá thể giun đất nghiên cứu ............ 38
3.3.2. Mối quan hệ di truyền giữa các cá thể giun đất nghiên cứu ......... 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 41
1. KẾT LUẬN............................................................................................ 41
2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 42
PHỤ LỤC

8. 3
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AFLP Amplified fragment length polymorphism
(Đa hình độ dài các đoạn khuếch đại)
bp Base pair (cặp base nitơ)
DNA Deoxyribonucleic acid
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid
M DNA size marker (thang chuẩn kích thước của DNA)
NTSYSpc Numerical Taxonomy System for personal computer
PCI Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol
PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
PPB Percentage of polymorphic band (Tỷ lệ các băng đa hình)
PBS Phosphate buffered saline
RAPD Random amplified polymorphic DNA
(Đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên)
RFLP Restriction fragment length polymorphism
(Đa hình độ dài các đoạn cắt hạn chế)
SDS Sodium dodecylsulfate
SSR Simple sequence repeat (Sự lặp lại các trình tự đơn giản)
TAE Tris base: Acetic acid: EDTA

9. 4
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các mẫu giun đất Ph. modigliani và Ph. Rodericensis .................. 22
sử dụng trong nghiên cứu................................................................................ 22
Bảng 2.2. Trình tự của các primer ngẫu nhiên sử dụng trong nghiên cứu ..... 23
Bảng 2.3. Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu ...................... 23
Bảng 2.4. Những thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu.............................. 24
Bảng 3.1. Các tham số đặc trưng về hình thái ngoài của Ph. modigliani
(Rosa, 1889) và Ph. rodericensis (Grube, 1879) ............................................ 31
Bảng 3.1. Các đặc điểm và các tính trạng để xác định mối quan hệ phân loại
học của các loài giun đất................................................................................. 33
Bảng 3.1. Số cá thể khuếch đại và số băng khuếch đại của từng primer........ 38

10. 5
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Các địa điểm thu mẫu giun đất..................................................................25
Hình 3.1. Biểu đồ hiện trạng của hai loài giun đất dựng bằng phương pháp UPGMA.....34
Hình 3.1. DNA tổng số của một số cá thể giun đất...................................................34
Hình3.2.Hình ảnhđiệndiPCR-RAPDvớiprimerOPA02.M:Lambda/HindIIImarker.......35
Hình3.3.Hình ảnhđiệndiPCR-RAPDvớiprimerOPA04.M:Lambda/HindIIImarker.......36
Hình3.4.Hình ảnhđiệndiPCR-RAPDvớiprimerOPA09.M:Lambda/HindIIImarker.......37
Hình 3.5. Giản đồ phả hệ DNA của các cá thể giun đất nghiên cứu ........................39

11. 6
MỞ ĐẦU
I. Lý do chọn đề tài
Giun đất là một đại diện của lớp giun ít tơ (Oligochaeta) sống trên cạn thuộc
bộ Lumbricimorpha, ngành Giun đốt (Annelidae). Giun đất là một trong những
nhóm động vật đất có ý nghĩa quan trọng cả về mặt lý luận và thực tiễn.
Giun đất giữ vai trò quan trọng quyết định tính chất vật lý, hóa học, sinh học
của đất. Giun đào hang sẽ làm tăng độ thông thoáng, tơi xốp và khả năng thấm nước
cho đất. Chúng ăn rác thải hữu cơ và phân của chúng chứa những chất dinh dưỡng
cần thiết cho cây.
Giun đất cũng là nhóm thức ăn giàu đạm thích hợp cho cá, gia cầm và gia
súc. Trong y học dân gian Việt Nam, giun đất được sử dụng để chữa một số bệnh
như: đậu mùa, sốt rét, hen suyễn, động kinh, vàng da, sỏi bàng quang... Ngoài ra,
giun đất còn là sinh vật chỉ thị cho mức độ thay đổi nguồn gốc của các vùng đất
cũng như mức độ ô nhiễm của đất [1].
Cho đến nay, việc nghiên cứu giun đất ở Việt Nam phần lớn chỉ tập trung
vào các vấn đề về đặc điểm sinh học, hình thái, sinh sản, sinh thái học, phân loại
dựa vào các đặc điểm trên, ít thấy tài liệu đề cập đến các nghiên cứu về giun đất
bằng các kỹ thuật sinh học phân tử.
Trong một số loài thuộc giống Pheretima có một số cặp loài có các đặc điểm
hình thái gần nhau, nhưng sai khác rõ rệt ở vị trí của lỗ nhận tinh phía lưng hoặc
phía bụng. Trong số đó thì có loài Pheretima modigliani (Rosa, 1889) và Pheretima
rodericensis (Grube, 1879) là cặp loài giun đất có các đặc điểm hình thái (nhú phụ
sinh dục ở vùng nhận tinh, kiểu môi, số lượng túi nhận tinh, đặc điểm của manh
tràng) giống nhau nhưng sai khác ở màu sắc của cơ thể và vị trí của lỗ nhận tinh
[Ph. modigliani (Rosa, 1889) lỗ nhận tinh ở phía bụng còn Ph. rodericensis (Grube,
1879) lỗ nhận tinh ở phía lưng]. Dựa trên đặc điểm hình thái, cặp loài này vẫn được
coi là cặp loài gần gũi, nhưng liệu nhận xét này có phù hợp với bản chất di truyền
hay không?
Để làm sáng tỏ mối quan hệ cũng như làm cơ sở khoa học cho việc khai
thác, bảo tồn các loài giun đất nói chung và Ph. modigliani và Ph. rodericensis nói

12. 7
riêng, chúng tôi chọn đề tài: “Quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Pheretima
modigliani (Rosa, 1889) và Pheretima rodericensis (Grube, 1879)”.
II. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định mối quan hệ họ hàng của hai loài giun đất Ph. modigliani (Rosa,
1889) và Ph. rodericensis (Grube, 1879).

13. 8
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu giun đất
1.1.1. Về đa dạng và phân bố
Các công trình nghiên cứu về đa dạng, khu hệ giun đất đã được thực hiện ở
nhiều quốc gia và lãnh thổ trên toàn thế giới một cách rộng rãi.
Khu hệ giun đất được nhiều tác giả quan tâm và nghiên cứu hoàn chỉnh nhất
là khu hệ ở châu Âu và Bắc Mỹ, tiếp đến là khu hệ giun đất châu Úc, khu hệ giun
đất châu Á cũng được nhiều tác giả chú ý, đặc biệt là các khu hệ ở Đông Nam Á
nhưng ở châu Phi các dẫn liệu về giun đất còn ít được biết đến [34].
Ở các nước phụ cận Việt Nam, việc nghiên cứu giun đất đã được chú ý từ
lâu. Theo nghiên cứu của Samphon về khu hệ giun đất ở Lào đã thống kê được
68 loài, thuộc 8 giống, 7 họ, trong đó Pheretima là giống có số loài phong phú
nhất [23].
Về khu hệ giun đất Campuchia đã có các dẫn liệu ở các điểm xung quanh
thành phố Phnôm Pênh và một số thị trấn ở đồng bằng Campuchia. Kết quả nghiên
cứu đã giới thiệu 14 loài trong 5 giống [3].
Vào năm 1938 có các công trình nghiên cứu của Chen ở Trung Quốc đã
thống kê các loài giun đất ở Quảng Đông và đảo Hải Nam [38].
Về khu hệ giun đất ở Myanma có công trình của Gates (1972), tác giả đã
thông kê được 241 loài, thuộc 36 giống, 9 họ [42].
Khu hệ giun đất trên các đảo ở khu vực Đông Nam Á cũng không kém phần
phong phú và đa dạng, với 215 loài được phát hiện ở Indonesia, 94 loài ở Malaysia,
19 loài ở Singapore và khoảng 48 loài được tìm thấy ở Philippin [55], [57].
Các dẫn liệu đầu tiên về nghiên cứu giun đất ở Việt Nam được đề cập trong
công trình nghiên cứu giun đất ở Đông Dương của Perrier (1872), tác giả đã công
bố 1 loài mới là Perionyx excavatus trong mẫu thu ở Sài Gòn [52]. Đến năm 1875,
ông bổ sung thêm 3 loài giun đất cho đồng bằng sông Cửu Long, trong đó có 1 loài
mới là Ph. juliani và 2 loài lần đầu gặp ở Việt Nam là Ph. postkuma và Ph. houlleti.
Năm 1934, Michaelsen đã cung cấp một danh sách gồm 16 loài giun đất, trừ
Ph. tonkinensis thu được ở Phú Thọ (miền Bắc) còn lại là ở miền Nam [27].

14. 9
Trong khoảng thời gian từ 1965 đến năm 1975, do chiến tranh việc nghiên cứu
giun đất ở Việt Nam tạm thời bị gián đoạn. Trong giai đoạn này, các nhà nghiên cứu
chỉ tập trung được dẫn liệu về hình thái và sinh thái học của một vài loài giun đất phổ
biến để phục vụ cho công tác biên soạn giáo trình Động vật không xương sống [1].
Từ năm 1979, việc nghiên cứu giun đất ở Việt Nam mới được tiến hành rộng
rãi và có hệ thống nhằm phục vụ cho nhu cầu điều tra cơ bản sinh vật Bắc Việt
Nam, các dẫn liệu về thành phần loài, phân bố và địa lý động vật của giun đất được
tổng kết trong luận án tiến sĩ khoa học “Giun đất Việt Nam - Hệ thống học, khu hệ,
phân bố và địa lý động vật” của Thái Trần Bái (1983). Trong nghiên cứu này, tác
giả đã công bố được 109 loài và phân loài, thuộc 6 họ và 17 giống cho khu hệ giun
đất Việt Nam, trong số đó có 39 loài và phân loài mới cho khoa học. Ngoài ra, công
trình này còn đề cập về hệ thống phân loại học của nhóm loài Pheretima, những quy
luật tiến hóa của một số hệ cơ quan (giải phẫu so sánh hệ cơ, hệ tiêu hóa, tiến hóa
của bộ túi nhận tinh, tiến hóa của cơ quan vận chuyển của giống Pheretima).
Dựa vào thành phần loài, Thái Trần Bái đã có những nhận định về tính chất
địa động vật học của khu hệ giun đất Việt Nam, phát hiện các đặc điểm phân bố
theo các vùng cảnh quan và vùng địa lý. Giun đất nước ta phong phú các loài thuộc
giống Pheretima. Sự phân bố của các loài giun đất giữa các vùng cảnh quan sai
khác có quy luật. Vùng núi phong phú nhất về số loài trong tất cả 3 nhóm hình thái -
sinh thái. Số loài phát sinh ở vùng núi chiếm tỷ lệ cao nhất, số loài ở vùng đồi ít
hơn, còn vùng đồng bằng có số loài nghèo nhất.
Từ sau công trình nghiên cứu của Thái Trần Bái, đã có nhiều công trình khác
tiến hành điều tra khu hệ giun đất các tỉnh ở nước ta, mở đầu là công trình nghiên cứu
của Trần Thúy Mùi (1985) về khu hệ giun đất vùng đồng bằng sông Hồng [19]; tiếp
đến là công trình nghiên cứu khu hệ giun đất miền Tây Bắc của Đỗ Văn Nhượng
(1994) [21]; khu hệ giun đất Bình Trị Thiên của Nguyễn Văn Thuận (1994) [27]; khu
hệ giun đất Quảng Nam - Đà Nẵng của Phạm Thị Hồng Hà (1995) [10]; khu hệ giun
đất miền Đông Bắc của Lê Văn Triển (1995) [30]; khu hệ giun đất phía Nam miền
Trung của Huỳnh Thị Kim Hối (2005) [12]; nghiên cứu thành phần loài, phân bố và
định hướng ứng dụng của giun đất ở một số tỉnh duyên hải phía Nam miền Trung
(Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên) của Nguyễn Văn Thuận (2010) [28]; khu hệ giun
đất ở đồng bằng sông Cửu Long của Nguyễn Thanh Tùng (2013) [31].

15. 10
1.1.2. Về phân loại
Có rất nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu về hệ thống phân loại giun đất
cũng có thể nói đây là một vấn đề phức tạp và còn nhiều tranh cãi.
Nghiên cứu đầu tiên của Michaelsen (1900) đã cung cấp một hệ thống phân
loại dựa trên cơ sở của phân loại học hiện đại cho nhóm loài giun đất. Ông đã xếp
1.200 loài giun đất thành 11 họ, 152 giống [50]. Đến năm 1921, Michaelsen đã xây
dựng lại hệ thống phân loại của giun đất với 21 họ.
Đối với hệ thống phân loại của Michaelsen thì Stephenson (1930) đã đơn
giản hóa chỉ còn lại 14 họ khác nhau [58].
Trong đó, họ Megascolidae là bị tranh cãi nhiều nhất. Có nhiều quan điểm
khác nhau của các tác giả hình thành các hệ thống phân loại học khác nhau. Theo
Omodeo (1958) căn cứ vào vị trí và số lượng của tuyến canxi làm cơ sở để tách ra
thêm một họ mới từ họ này. Còn Lee (1959) cho rằng đặc điểm để phân chia là vị
trí, số lượng của lỗ đực và vị trí của vi thận. Đối với Gates (1959) dựa vào cấu trúc
của tuyến tiền liệt, hệ bài tiết và vị trí của tuyến canxi là những đặc điểm quan trọng
để phân chia Megascolidae thành 4 họ Acanthodrilidae, Megascolecidae,
Octochaetidae và Ocnerodrilidae [40], [46], [51].
Đối với các họ thuộc lớp Oligochaeta sự xác định chủng loại phát sinh và
mối quan hệ phân loại học của các taxon bậc cao đã được thực hiện bằng phương
pháp Cladistics, dựa trên 68 tính trạng của 50 đại diện trong nghiên cứu của
Jamieson (1988). Kết quả đã chia nhóm giun đất thành 4 liên họ: Ocnerodriloidea,
Eudriloidea, Lumbricoidea và Megascolecoidea [41].
Năm 1993, hệ thống phân loại giun đất mới nhất đã được Reynolds và Cook
công bố. Hệ thống này chia giun đất thành 2 bộ: Moniligastrida và Haplotaxida. Bộ
Moniligastrida gồm 1 họ Moniligastridae. Bộ Haplotaxida được chia thành 2 phân bộ
(Enchytraeina và Lumbricina), 10 liên họ (Enchytraeoidea, Alluroidoidea,
Criodriloidea, Lumbricoidea, Sparganophiloidea, Biwadriloidea, Glossoscolecoidea,
Almoidea, Megascolecoidea, Ocnerodriloidea) và 22 họ (Enchytraeidae, Propappidae,
Alluroididae, Criodrilidae, Lumbricidae, Komarekionidae, Diporochaetidae,
Ailoscolecidae, Hormogasuidae, Lobatocerebridae, Sparganophilidae, Biwadrilidae,
Glossoscolecidae, Kynotidae, Microchaetidae, Almidae, Lutodrilidae, Megascolecidae,
Acanthodrilidae, Octochaetidae, Eudrilidae, Ocnerodrilidae) [53].

16. 11
Về tình hình nghiên cứu phân loại học của nhóm loài Pheretima có các công
trình nghiên cứu như sau: Năm 1867, Kinberg đã xếp các loài thành 4 giống:
Amynthas, Nitocris, Rhodopis và Pheretima [45]. Sau đó, có nhiều tranh luận về sự
sai khác giữa các loài để xếp chúng vào giống này hay giống khác của nhiều tác giả:
Baird (1869), Vaillant (1870), Beddard (1883),...
Năm 1972, Sims và Easton sử dụng 56 tính trạng của 114 loài giun đất, ở các
holotyp, paratyp và syntyp để xác định mối quan hệ của các loài giun đất thuộc
giống Pheretima Kinberg, 1867. Hệ thống phân loại cho nhóm loài Pheretima
(Kinberg sensu Michaelsen, 1934) được xây dựng lại dựa vào tiêu chí có manh
tràng hay không có manh tràng của các taxon bậc giống và phân giống [56].
Đến năm 1979, Easton phân tích mối quan hệ của 78 loài giun đất thuộc
nhóm Pheretima không có manh tràng nhưng chỉ với 29 đặc điểm hình thái. Kết
quả, giữ nguyên các giống Archipheretima và Planapheretima, thay đổi phạm vi
của các giống Polypheretima và Metapheretima, chuyển các loài thuộc giống
Ephemitra vào giống Metapheretima, thiết lập thêm giống Pleionogaster [39].
Sau công trình nghiên cứu về hệ thống phân loại Sims & Easton (1972) và
Easton (1979) ra đời có nhiều ý kiến cho rằng đặc điểm phân chia của các giống
thật sự có cơ sở hay chưa. Đặc biệt, ở các giống của nhóm có manh tràng. Cho đến
nay, có nhiều quan điểm khác nhau về phân loại học của nhóm loài Pheretima, có
thể tạm chia thành 2 nhóm tác giả. Nhóm 1: đi theo hệ thống phân loại Sims &
Easton (1972) gồm phần lớn các tác giả như: Lee (1981), Blakemore (2002), James
(2004), Shen và Yeo (2005),... Tuy sử dụng nhưng nhiều tác giả trong nhóm này
vẫn cho rằng hệ thống trên còn nhiều điểm bất ổn, nhất là đặc điểm buồng giao
phối. Nhóm 2: chỉ chấp nhận một phần hệ thống trên như: Ishizuka (1999),
Nakamura (1999), Thái Trần Bái (1983),... vì cho rằng sử dụng đặc điểm buồng
giao phối để phân chia các taxon bậc giống là thiếu cơ sở do chúng không đặc trưng
cho nhóm chủng loại Pheretima nào và có nhiều biến đổi [1].
1.1.3. Về nhân nuôi
Giun đất là nhóm có giá trị thực tiễn cao, từ lâu đã có các nghiên cứu gây nuôi
giun đất nhằm cung cấp nguồn đạm cho chăn nuôi. Về hướng nghiên cứu này, năm
1984 Nguyễn Thị Minh Hòa đã nghiên cứu việc thử nghiệm quy trình nuôi giun đất ở

17. 12
Hà Nội [11]. Trên cơ sở nghiên cứu thăm dò kết hợp với công tác điều tra cơ bản,
Thái Trần Bái đã đề xuất các loài giun đất có triển vọng nuôi ở nước ta là Perionyx
excavatus, Pontoscolex corethrurus, Pheretima posthuma và Ph. morrisi [2].
Một số loài giun đất phổ biến được nuôi hiện nay như: Perionyx excavatus,
Eisenia festida, Eisenia andrei, Ph. asiatica,... [2]. Ở Việt Nam, cũng có nhiều tác
giả quan tâm nghiên cứu giun quế (Perionyx excavatus) để làm thức ăn cho chăn
nuôi như Đặng Vũ Bình và cộng sự đã đánh giá khả năng tăng trưởng của giun quế
(Perionyx excavatus) trên các nguồn thức ăn khác nhau [6], Phan Thị Bích Trâm và
cộng sự đã nghiên cứu sử dụng bột đạm từ trùn quế (Perionyx excavatus) làm thức
ăn cho hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) [29],... Hiện nay, giun quế được
nuôi khá phổ biến ở Việt Nam với những quy mô khác nhau và có nhiều sản phẩm
(giun khô, bột giun, giun đông lạnh, dịch giun, phân giun,...) bán trên thị trường
nước ta và xuất khẩu ra nhiều nước trên thế giới.
Gần đây có một số công trình nghiên cứu quy trình gây nuôi các loài giun đất gặp
phổ biển ở một số vùng như: Pheretima aspergillum Perier, 1872 của Hồ Đắc Khánh
Ngọc [20] và Pheretima rodericensis (Grube, 1879) của Nguyễn Thị Ý Thơ [26].
Bên cạnh nuôi giun đất làm nguồn thức ăn giàu đạm cho vật nuôi, giun đất
còn được nghiên cứu gây nuôi để góp phần cải tạo đất và xử lý rác thải. Một số
nghiên cứu gần cho thấy, Lampito mauritii ngoài việc cung cấp thêm dinh dưỡng,
loài này còn có khả năng làm giảm một số kim loại nặng như chì và kẽm trong đất
[48]. Ngoài ra, nhiều loài giun đất cũng được sử dụng như là một yếu tố để chỉ thị
cho tình trạng suy thoái của môi trường [13].
1.1.4. Về di truyền
Gần đây, với sự phát triển của các phương pháp giải trình tự và phân tích
DNA đã có tác động lớn đến việc nghiên cứu mối quan hệ phân loại học ở các loài
sinh vật nói chung cũng như các loài giun đất nói riêng. Nhiều gene được khai thác,
trong đó một số có trình tự bảo tồn cao phù hợp cho việc phân tích các mối quan hệ
phân loại học ở mức độ cao trong khi một số gene khác tiến hóa ở mức độ nhanh
hơn cho phép phát hiện sự khác biệt và tương đồng giữa các cá thể trong những đơn
vị phân loại gần gũi và trong cùng một loài.

18. 13
Qua tổng kết một vài nghiên cứu gần đây trên đối tượng giun đất của Chang
và Chen (2005), Chang (2008), Cameron (2008),… cho thấy hầu hết tập trung giải
trình tự đoạn gen cytochrome C oxidase có kích thước khoảng 648 bp trên tiểu đơn
vị I của ti thể [35], [36], [37].
Năm 2009, Meenatchi đã sử dụng kỹ thuật RAPD-PCR để phân tích các biến
thể di truyền trong sáu nòi Eudrilus eugeniae (Kinberg) thu thập từ sáu địa điểm ở
ba tiểu bang miền Nam Ấn Độ với 20 mồi ngẫu nhiên (OPA 1, OPA 2, OPA 3,
OPA 4, OPA 5, OPA 6, OPA 7, OPA 8, OPA 9, OPA 10, OPA 11, L 14, M 3, DH
2, G 9, G 10, G 11, H 1, H 8, H 11). Kết quả nghiên cứu cho thấy ở vùng địa lý
khác nhau các đặc tính phân tử có sự biến thiên. Hệ số tương đồng E. eugeniae dao
động từ 0,54 đến 0,90. Chỉ số tương đồng di truyền cao nhất 1,0 giữa các chủng
Dharwad và Bijapur (Karnataka) tiếp theo là 0,90 giữa Nagpur (Maharastra) và
Bijapur (Karnataka). Sự tương đồng di truyền thấp nhất được ghi nhận giữa các
chủng Nagpur và Bangalore, các chủng Nagpur và Coimbatore có giá trị giống nhau
về di truyền là 0,40 [49].
Sharma (2011) đã mô tả những đặc điểm hình thái, phân tử của 24 cá thể
giun đất thu thập từ bảy địa điểm của Himachal Pradesh và ba địa điểm của Delhi
để đánh giá mức độ biến đổi di truyền. Kết quả nghiên cứu cho thấy, dựa trên các
đặc điểm hình thái quan trọng thì tất cả các cá thể thu được phân thành hai loài giun
đất, đó là Eisenia fetida và Eudrilus eugeniae. Trong nghiên cứu này còn kết hợp
phân tích sự đa dạng di truyền đã được thực hiện bằng ba phương pháp đánh giá
DNA như RAPD, ISSR, và URP để xác định mối quan hệ di truyền giữa 24 cá thể
giun đất [54].
Vào năm 2013, để xác định mức biến dị di truyền và đa hình ở hai loài giun
đất đặc hữu Perionyx excavates và Perionyx ceylanensis đã được Biruntha xác định
bằng kỹ thuật RAPD. Kết quả nghiên cứu cho thấy loài P. ceylanensis đã được mô
tả về đặc tính phân tử khi nuôi cấy trong các chất nền khác nhau, trong đó DNA
không cho thấy bất kỳ thay đổi mô tả nào trong các dải băng thu được. Trọng lượng
phân tử của băng đã được tìm thấy là 13.400 bp trong tất cả các chất nền. RNA cho
thấy một số thay đổi trong các dải, trọng lượng phân tử đã được tìm thấy là 2190 bp,
2260 bp, 2275 bp và 2210 bp. Phân tích RADP đối với P. excavates được thu thập

19. 14
từ bốn địa điểm khác nhau thì giun đất thu được ở núi Sirumalai và Dindigul (S2 &
S3) có sự giống nhau về mặt phân loại hơn so với các mẫu thu thập được từ
Vadipatti (S4) [32].
Cùng năm 2013, Biradar nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các loài giun
đất thuộc 5 họ Pontoscolex corethrurus (Glossoscolecidae); Drawida spp.
(Moniligastridae); Chaetocotoides sp., Dichogaster affinis, Lennogaster sp.
(Octochaetidae); Euginae eudrillus (Eudrillidae) và Megascolex conkanensis
(Megascolecidae) từ các địa điểm khác nhau ở phía Tây Karnataka (Ấn Độ) bằng
kỹ thuật phân tử RAPD. Nghiên cứu này đã sử dụng 20 mồi khác nhau để tạo ra 263
dãy băng có tính đa hình trong tự nhiên với trung bình 13,5 amplicon trên mỗi mồi.
Số amplicon tối thiểu nằm trong phạm vi từ 5 đến 19 được quan sát thấy bằng mồi
L11 và số lượng tối đa các dải có mồi AC-13. Hệ số tương đồng dao động từ 0,11
đến 0,69. Kết quả cho thấy các dấu hiệu RAPD rất tốt cho phân tích đa dạng của
giun đất [33].
Ở Việt Nam, cho đến nay mới chỉ có ba nghiên cứu mối quan hệ phân loại
học bằng phương pháp sinh học phân tử trên đối tượng giun đất. Thái Trần Bái và
cộng sự (1996) đã sử dụng phương pháp điện di esterase isozyme để nghiên cứu 4 loài
Ph. peosthuma, Ph. modiglianii, Ph. rodericensis và Ph. morrisi. Phân tích các kết quả
thu được khi điện di EST của 4 loài Pheretima thì Ph. morrisi có tới 3 locut kiểm soát
còn Ph. posthuma, Ph. modiglianii và Ph. rodericensis có hệ thống emzym chỉ 2 locut
kiểm soát.
Ph. modigliani đặc trưng bởi locut Est-1 với 2 alen chuyển động nhanh
(Rf:l,14 và 1,11) có tổng tần số là 0,722 và không có các cấu tử chuyển động chậm
từ 0,51 đến 0,79 (không có locut Est-3).
Ph. posthuma đặc trưng bởi locut Est-3 với hai alen chuyển động chậm
(Rf:0,51 và 0,61). Loài này phân biệt với Ph. morrisi và Ph. modigliani bởi không
có các cấu tử Rf từ 0,80 đến 0,98 (Ph. posthuma không có locut Est-2). Giữa Ph.
posthuma và Ph. rodericensis có nhiều cấu tử Rf xấp xỉ bằng nhau, song chúng
phân biệt với nhau bởi Ph. rodericensis có các cấu tử chuyển động nhanh (Rf:l,05
và 1,10) với tổng tần số là 0,92 ở locut Est-1. Ở locut Est-3 Ph. rodericensis có các
cấu tử 0,79 và 0,71 với tổng tần số là 0,944. Mặc dù 2 loài này có cấu tử Rf:l,00
chung nhưng xác suất trùng nhau giữa 2 loài ở cấu tử này là rất thấp (0,03532).

20. 15
Ph. morrisi và Ph. rodericensis có nhiều cấu tử có Rf giống nhau song Ph.
morrisi có các cấu tử Rf:0,88; 0,93 và 0,98 (locut Est-2) mà Ph. rodericensis không có.
Năm 2006, Trần Thị Thanh Bình và Đặng Tất Thế đã phân tích dẫn liệu
DNA của 2 loài Ph. aspergillum và Ph. robusta. Kết quả phân tích tiến hóa trình tự
gen ty thể COI của hai loài giun đất này cho thấy giữa chúng có khoảng cách di
truyền khá lớn (13,1% - 15,0%) và có sự phân hóa rõ ràng. Giữa các trình tự thuộc
loài Ph. aspergillum có sự khác biệt di truyền khá cao, với khoảng cách di truyền
đạt tới 9,8%, nhưng sự khác biệt di truyền giữa các trình tự thuộc loài Ph. robusta
lại rất thấp dưới 0,8%. Mẫu vật mã hiệu A4 có sự khác biệt di truyền lớn so với các
mẫu vật thuộc 2 loài Ph. aspergillum và Ph. robusta với với khoảng cách di truyền
từ 15,6 - 18,0% thể hiện chúng là một loài riêng biệt [5].
Năm 2012, Nguyễn Thanh Tùng đánh giá độ đa dạng sinh học của các loài
giun đất thuộc nhóm Pheretima tại đồng bằng sông Cửu Long (Amynthas
paraalexandri, A. juliani, Metaphire posthuma, M. bahli, M. peguana, M. houlleti,
Metaphire sp.8, Polypheretima elongata và P. taprobanae) trên ba phương pháp:
phân tích hình thái, điện di protêin SDS-PAGE và giải trình tự mã vạch DNA
Barcode. Đối với phân tích hình thái học dựa trên các đặc điểm hình thái quan trọng
của các giun đất được các tác giả mô tả như Thái Trần Bái (1986), Easton (1979),
Ishizuka (1999), Sims và Easton (1972). Kết quả cho thấy, mối quan hệ được xác
định trên cơ sở hình thái giữa các loài giữa M. houlleti và Metaphire sp.8 với tỷ lệ
7,14% thấp hơn 42,86% giữa P. elongata và Metaphire sp.8, giữa P. taprobanae và
Metaphire sp.8. Đối với phân tích điện di protein SDS-PAGE thì khoảng cách trung
bình là 36,66% (SD=14,53%), cao hơn 8,86% so với tính toán hình thái học
(SD=8,98). Khoảng cách này dao động từ 92,68% (100% - 7,32%) giữa M.
posthuma và A. juliani đến mức thấp nhất là 38,89% (100% - 61.11%) giữa M.
houlleti và M. bahli. Mối quan hệ giữa các loài dựa trên dữ liệu mã vạch DNA trung
bình là 16,99%, thấp nhất là 14, 32 % giữa P. elongata và P. taprobanae, cao nhất
là 19,79% giữa M. bahli và A. paraalexandri. Cả 3 phương pháp đều cho kết quả
tương thích, chính xác để giải thích mối quan hệ giữa các loài trong nhóm loài gần
gũi và giữa tác taxon bậc cao (họ, giống). Mối quan hệ giữa 2 nhóm Pheretima
không có manh tràng và có manh tràng chỉ được thể hiện rõ khi xây dựng sơ đồ phả

21. 16
hệ dựa trên trình tự DNA Barcode. Mối quan hệ giữa các loài trong giống Amynthas
và Metaphire chưa thể hiện rõ ở phương pháp hiện trạng số và điện di protein SDS-
PAGE, có xu hướng rõ hơn khi so sánh trình tự DNA barcode. Từ kết quả nghiên
cứu cũng đã chứng minh được Metaphire sp.8 là 1 loài gần gũi với M. houlleti [59].
Tóm lại, cho đến nay chưa thấy công bố nào về mối quan hệ họ hàng của hai
loài Ph. modigliani và Ph. rodericensis.
1.2. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền và ứng dụng
1.2.1. Các phương pháp
Hiện nay trong nghiên cứu phân loại cũng như đa hình sinh vật, bên cạnh
những phương pháp phân loại truyền thống hiệu quả như đa hình hình thái, đa hình
kiểu nhân, thì phương pháp sử dụng chỉ thị DNA (những chỉ thị dựa trên bản chất
đa hình DNA) đang được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả. Các phương pháp phổ biến
hiện nay như: phân tích trình tự các đoạn nucleotide lặp lại đơn giản (SSR), đa hình
chiều dài các đoạn cắt hạn chế (RELP), đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên
(RAPD), marker DNA ty thể (mtDNA), đa hình các đoạn khuếch đại với các primer
đặc hiệu (SCAR)…[8].
1.2.1.1. Kỹ thuật đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD)
Phương pháp RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) là các phân
đoạn DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên do Williams và cs (1990) phát triển
dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR.
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào kích thước genome của một cá
thể là rất lớn từ vài trăm triệu tới vài tỷ base cho nên sẽ tồn tại nhiều trình tự từ 5
đến 12 base bắt cặp với trình tự mồi ngẫu nhiên. Ở những điều kiện PCR nhất định
sẽ cho một hay nhiều phân đoạn DNA (khác nhau) trên điện di đồ.
Các cá thể sinh vật cùng loài, giống, họ có genome giống nhau hoàn toàn thì
khi dùng mồi ngẫu nhiên chạy PCR sẽ khuếch đại các phân đoạn DNA hoàn toàn
giống nhau. Khi genome của chúng có nhiều trình tự khác nhau, với một mồi ngẫu
nhiên nào đó, các sản phẩm PCR của chúng sẽ cho một số băng DNA có kích thước
khác nhau trên điện di đồ.
Phương pháp RAPD cho phép phát hiện tính đa hình giữa các cá thể trong
một quần đàn, giữa các quần đàn trong một loài hoặc giữa các loài trong một giống,

22. 17
mà không cần biết trình tự các nucleotide sắp xếp ra sao [25].
Các bước tiến hành: tách chiết và tinh sạch DNA  PCR với mồi ngẫu nhiên
 điện di sản phẩm PCR trên gel agarose  phân tích kết quả [9].
Tuy còn nhạy cảm với các điều kiện phản ứng, RAPD vẫn được sử dụng
nhiều cùng với các chỉ thị khác vì có ưu điểm:
+ Kỹ thuật thí nghiệm đơn giản, nhanh và chi phí thấp hơn.
+ Chỉ cần một lượng nhỏ DNA khuôn, không đòi hỏi phân lập và đọc trình tự.
+ Có thể phát hiện nhiều locus cùng một lúc. Phân tích cho số lượng mẫu lớn
[9], [25].
Hạn chế của loại chỉ thị này là khó có thể chứng minh sự di truyền Mendel
của các locus và không thể phân biệt giữa đồng hợp và dị hợp. Mặt khác, sự có mặt
của các sản phẩm PCR phụ (khác với các vùng PCR có cùng chiều dài và vì vậy trở
thành một locus đơn) đã làm hạn chế việc sử dụng chỉ thị này [8].
1.2.1.2. Kỹ thuật đa hình chiều dài cắt đoạn giới hạn (RFLP)
Phương pháp RFLP (Restrition Fragment Length Polymorphism DNA) là
DNA đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, được biết đến khi Botstein
(1980) sử dụng nó để lập bản đồ gene liên quan đến bệnh ở người.
RFLP là kỹ thuật dựa trên sự khác nhau về kích thước đoạn DNA được tạo ra
khi cắt DNA hệ gen hoặc các bào quan bằng các enzyme hạn chế. Cắt DNA bằng
enzyme hạn chế có thể tạo ra các đoạn DNA có kích thước và số lượng khác nhau ở
các cá thể quần thể và loài khác nhau. Sử dụng phương pháp phân tích Southern
blot, các đoạn DNA của hệ gen được tạo thành sau khi cắt bằng enzyme hạn chế sẽ
được phân tách bằng điện di agarose gel, sau đó được chuyển lên một màng lai và
được phát hiện bởi các mẫu dò đặc hiệu [8].
Các bước tiến hành: tách chiết và tinh sạch DNA  cắt mẫu DNA bằng
enzyme giới hạn  điện di sản phẩm DNA đã cắt  chuyển DNA đã biến tính lên
màng lai  ủ màng lai với mẫu dò  rửa màng lai và đọc kết quả bằng phóng xạ tự
ghi [9].
Tuy nhiên sử dụng RFLP đơn giản, dễ thao tác nhưng không phân biệt được
nhiều giữa các quần đàn. Đối với mỗi locus đa hình phải thực hiện một thí nghiệm và
đây là một nhiệm vụ khó vượt qua với những bản đồ chi tiết với hàng trăm chỉ thị.

23. 18
1.2.1.3. Kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn khuếch đại (AFLP)
Phương pháp AFLP (Ampolified Fragement Polymorphism DNA) là DNA
đa hình phân đoạn được khuếch đại do Vos và cs tìm ra năm 1993.
AFLP là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. Giống như RFLP, cơ sở phân
tử của sự đa hình AFLP bao gồm sự mất hoặc xen các base vào giữa các trình tự cắt
hạn chế và giống như RAPD nó cũng bao gồm sự thay thế base ở các vị trí bám của
các primer PCR. Điểm khác biệt của kỹ thuật này là có gắn thêm các adaptor đã biết
trước trình tự và các đoạn DNA được cắt ra từ hệ gen. Sự xác định tính biến dị di
truyền giống như ở kỹ thuật RFLP, tuy nhiên thay vì phân tích từng locus một,
AFLP cho phép phân tích nhiều locus cùng lúc [8].
Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản các
đoạn DNA đã bị cắt bởi enzyme giới hạn. Khâu then chốt là thiết kế các đoạn mồi
đặc trưng (tạo adaptor) [9].
Các bước tiến hành: tách chiết và tinh sạch DNA  cắt DNA bằng enzyme
giới hạn  nối các đoạn DNA đã cắt với adaptor  nhân bản có chọn lọc các đoạn
nối bằng PCR  điện di sản phẩm và phân tích kết quả [9], [25].
Phương pháp này có nhiều tiềm năng to lớn trong kỹ thuật phân tích đa dạng
di truyền. Tuy vậy kỹ thuật thí nghiệm phương pháp này khá phức tạp và chi phí
cao [9].
1.2.1.4. Kỹ thuật SSR
Phương pháp SSR (Simple Sequence Repeats) là các đoạn lặp lại có trình tự
đơn giản còn được gọi là microsatellite được Litt và Luty phát triển thành một kỹ
thuật chỉ thị phân tử năm 1998.
Vùng vi vệ tinh, còn được biết như những đoạn lặp lại ngắn theo thứ tự hay là
lặp lại trình tự đơn giản, bao gồm những đơn vị lặp lại theo trình tự, mỗi một đơn vị dài
khoảng từ 1 đến 10 cặp base. Chúng được phân bố rộng rãi trên toàn bộ gen của nhóm
nhân thật và thường có độ đa hình cao do sự biến động số lượng của những đơn vị lặp
lại. Những thông tin dữ liệu di truyền tạo ra bởi các vị trí SSR và những thuận tiện mà
nguyên liệu cho phân tích SSR có thể thu được một cách tự nhiên từ những quần thể
sống tự do làm cho những chỉ thị này như một trong những công cụ chọn lựa ở mức độ
phân tử cho nhiều nghiên cứu quần thể và đa dạng sinh học [18].

24. 19
Sự biến động về kích cỡ của các sản phẩm PCR được tạo ra bởi những khác
biệt trong số lượng của các đơn vị lặp lại. Vùng vệ tinh là những chỉ thị đồng trội.
Kỹ thuật SSR là kỹ thuật dựa trên cơ sở phản ứng PCR nhằm xác định các
trình tự lặp lại đơn giản. Kỹ thuật SSR được di truyền theo kiểu Mendel, là các chỉ
thị đồng trội, có tính đa hình cao và đáng tin cậy. Một ưu điểm khác của chỉ thị vệ
tinh là sự phong phú, phân bố đều trong genome, kích thước locus nhỏ và đa hình
cao của nó. Đây là kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, đòi hỏi ít DNA khuôn mẫu và
khả năng lặp lại cao. Vì vậy, chỉ thị vệ tinh đã trở thành một loại chỉ thị phổ biến
cực kì quan trọng trong nghiên cứu đa dạng di truyền [18].
Các bước tiến hành: tách chiết và tinh sạch DNA  PCR các đoạn có trình
tự bổ sung với vùng sườn  điện di sản phẩm PCR trên gel polyacryamide  phân
tích dữ liệu [9].
Tuy nhiên, việc sử dụng các chỉ thị vệ tinh đòi hỏi nhiều thời gian và tốn
kém. Mỗi locus vi vệ tinh phải được xác định và vùng cạnh nó được sử dụng để
thiết kế mồi cho PCR. Do sao chép lỗi của enzyme polymerase trong quá trình tái
bản DNA, những sai khác nhỏ về kích thước giữa các allele của một vùng vệ tinh cụ
thể có thể xảy ra và được thu nhận qua phóng xạ huỳnh quang tự ghi hoặc lai trên
phim X-quang [18].
Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi trong lập bản đồ gen và phân tích
đa dạng di truyền. Hạn chế của phương pháp là thao tác còn phức tạp và chi phí cao.
1.2.2. Ứng dụng
Hiện nay, các phương pháp di truyền đã và đang được ứng dụng rộng rãi
trong nghiên cứu và xác định mối quan hệ di truyền của tất cả các loài sinh vật.
Kimberling và cộng sự (1996) bằng phương pháp sử dụng chỉ thị RAPD để
đánh giá cấu trúc di truyền của các quần thể ếch Rana pipens đã cách ly ở phía Nam
(Hoa Kỳ). Trong 14 primer ngẫu nhiên của 85 cá thể ếch nghiên cứu đã phát hiện 38
lucus đa hình. Có ba loại cấu trúc di truyền đã phát hiện trong nghiên cứu này: 2 quần
thể cho thấy có đa dạng di truyền thấp (D=0,1 và 0,04); 2 quần thể không thấy có sự
khác biệt di truyền và cho thấy có sự đa dạng trong quần thể cao (D=0,35) [44].
Ngô Thị Kim và cộng sự (2003) đã nghiên cứu rắn hổ mang theo quần thể
địa lý bằng phương pháp RAPD. Trong nghiên cứu tác giả sử dụng 7 primer thì có 3

25. 20
primer RF2, RF3, RF5 không cho sản phẩm nào, chỉ có 2 primer RF1 và RF4 là cho
sản phẩm tổng hợp với 9 mẫu rắn hổ mang và 1 mẫu rắn hổ mang chúa. Đối primer
RF6 và RF7 chỉ cho sản phẩm với rắn hổ mang mà không cho sản phẩm với rắn hổ
mang chúa. Kết quả nghiên cứu cho thấy rắn hổ mang Việt Nam có mối quan hệ họ
hàng rất gần gũi với nhau mặc dù phân bố ở những vùng địa lý khác nhau [16].
Trần Quốc Dung và cộng sự (2008) đã dùng chỉ thị phân tử RAPD để nhận
dạng 2 quần thể nhông cát Leiolepis Cuvier, 1928 ở Thừa Thiên Huế. Kết quả
nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng RAPD để phân biệt được 2 quần thể này. Quần
thể L. guentherpetersi và quần thể L. reevesii sử dụng (primer 428) nhận dạng được
các băng 370 bp , băng 550 bp và 700 bp, đối với (primer CLR5) nhận dạng được
các băng 370 bp , băng 580 bp và 700 bp, đối với (cặp primer 101+168) nhận dạng
được băng 490 bp. Khoảng cách di truyền của hai quần thể 0,0003 [7].
Võ Thị Lan và cộng sự (2009) đã sử dụng 5 cặp primer microsatellite đặc
hiệu và 10 primer RAPD ngẫu nhiên để đánh giá sự khác biệt giữa 4 giống gà: ác
Việt Nam, ác Trung Quốc, Lơ Go và Lương Phượng. Trong 10 primer RAPD khảo
sát đã thu được chỉ thị OPA18-500 giúp phân biệt được giống gà ác Trung Quốc với
3 giống gà còn lại. Với 5 cặp primer microsatellite đã thu được chỉ thị AP24 cho
phép phân biệt 2 giống gà ác Việt Nam và gà ác Trung Quốc với 2 giống gà Lơ Go
và Lương Phượng. Khi kết hợp chỉ thị APH 24 với OPA18-500 cho phép phân biệt
2 giống gà ác Việt Nam và gà ác Trung Quốc [17].
Đinh Thị Phòng và cộng sự (2009) đã sử dụng chỉ thị RAPD để đánh giá độ
thuần của 10 giống tằm (Bombyx mory L.). Kết quả cho thấy khi phân tích đa hình
với 10 primer ngẫu nhiên, tỉ lệ phần trăm đồng hình nằm trong phạm vi từ 68,83%
(giống GQ11) đến 91,66% (giống GQ13). Tổng số băng DNA nhân bản được của
10 giống tằm là 333. Số băng DNA nhân bản của 10 giống tằm này dao động từ 20
(OPN05) đối với giống GQ14 đến 51 (OPP19) đối với giống GQ15. Kích thước
DNA nhân bản nằm trong khoảng từ 200 - 800 bp [22].
Trần Thanh Sơn (2012) đã nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nhông
cát rivơ (Leiolepis reevesii Gray, 1831) ở miền Trung Việt Nam bằng kỹ thuật
RAPD, kết quả nghiên cứu cho thấy quần thể nhông cát L. reevesii ở miền Trung
Việt Nam có sự đa dạng di truyền cao [24].

26. 21
Đỗ Võ Anh Khoa và cộng sự (2013) sử dụng phương pháp PCR-RFLP để
đánh giá đa dạng di truyền gen IGFBP 2 (Insulin like growth factor binding protein
2) trên gà. Qua kết quả nghiên cứu đã phát hiện 3 đột biến điểm tại các vị trí
g.369>A (exon 2), g.1023>T (intron 2) và g.738>A (exon 3) nhờ sự nhận diện của
enzyme cắt giới hạn Bsh 1236I, Eco72 và Alw211. Tần số kiểu gen tại các đột biến
trên các quần thể nghiên cứu tuân theo quy luật cân bằng Hardy-Weinberg. Các
điểm đa hình này có ảnh hưởng đến các tính trạng kinh tế ở các quần thể gà khác
nhau [15].
Trần Thị Bích Hồng và cộng sự (2009) đã sử dụng các chỉ thị AFLP đặc
trưng cho 7 dòng cá rô phi nuôi ở Việt Nam, 7 dòng cá rô phi ngoại nhập từ nhiều
nước khác nhau chủ yếu thuộc 2 loài: cá rô phi xanh và cá rô phi vằn. Kết quả
nghiên cứu cho thấy với tổng số 375 băng thu được, chỉ có 64 băng đa hình trong đó
có 40 băng có thể dùng để nhận dạng cá rô phi xanh hoặc vằn và 12 băng đặc trưng
dùng để nhận dạng 7 dòng như: AF25-220, AF26-210, AF26-350, AF29-330,
AF42-180, AF42-170, AF43-170, AF43-225, AF43-250, AF43-160, AF54-125,
AF54-180. Đây là các băng đặc trưng dùng làm nguyên liệu cho các chỉ thị dùng
trong chọn giống cá rô phi [14].
Legess và cộng sự (2007) đã nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền và đánh
giá cấu trúc gen của các dòng ngô lai cận huyết bằng phương pháp SSR. Kết quả
thu được 104 allele với khoảng cách di truyền xác định được từ 0,28 - 0,73 với giá
trị PIC là 0,58 [47].

27. 22
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Các mẫu giun đất Ph. modigliani (Rosa, 1889) và Ph. rodericensis (Grube,
1879) được thu thập ở một số tỉnh thuộc miền Trung (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Các mẫu giun đất Ph. modigliani và Ph. Rodericensis
sử dụng trong nghiên cứu
STT
Số lượng
mẫu
Kí hiệu mẫu Địa điểm thu mẫu
1
1 1 MHHT1
Hương Thủy, Thừa
Thiên Huế
2 13
MQB1, MQB2, MQB3, MQB4,
MQB5, MQB6, MQB7, MQB8,
MQB9, MQB10, MQB11, MQB12,
MQB13
Quảng Ninh,
Quảng Bình
3 16
RQT1, RQT2, RQT3, RQT4, RQT5,
RQT6, RQT7, RQT8, RQT9, RQT10,
RQT11, RQT12, RQT13, RQT14,
RQT15, RQT16
Hải Lăng, Quảng
Trị
4 11
RHPĐ1, RHPĐ2, RHPĐ3, RHPĐ4,
RHPĐ5, RHPĐ6, RHPĐ7, RHPĐ8,
RHPĐ9, RHPĐ10, RHPĐ11
Phong Điền, Thừa
Thiên Huế
5 1 RHHTR1
Hương Trà, Thừa
Thiên Huế
6 9
RHH1, RHH2, RHH3, RHH4, RHH5,
RHH6, RHH7, RHH8, RHH9
TP Huế, Thừa
Thiên Huế
7 3 RHHT1, RHHT2, RHHT3
Hương Thủy, Thừa
Thiên Huế
8 1 RQN1 Quảng Ngãi

28. 23
- Các mồi ngẫu nhiên sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Trình tự của các primer ngẫu nhiên sử dụng trong nghiên cứu
STT Primer Trình tự 5’- 3’
1 OPA-04 AGTCAGCCAC
2 OPA-02 ATTCCGCTGG
3 OPA-09 GGTTGTACAC
4 OPC-05 GTTTCGCTCC
5 OPC-06 ATACCGCTCG
6 OPC-08 CCACAGCAGT
2.3. Hóa chất và thiết bị
- Hóa chất: Agarose, amonium acetate, các loại dung dịch phá tế bào (Tris,
EDTA, SDS), dung dịch PCI, các loại đệm (TE, TBE), ethanol, ethidium bromide,
proteinase K, Go Taq Green Master Mix…
- Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu
Hóa chất Thành phần, nồng độ
Agarose Agarogel 0,8% và 1,4%
Nito lỏng -196 o
C
Dung dịch phá vỡ tế bào 50 mM Tris.HCl; 25 mM EDTA
SDS 10%; pH 8,0
Protein K 20 mg/ml
NaCl 6 M
Dung dịch PCI Phenol: Chloroform: Isoamyl (25:24:1)
PBS 1X, pH 6,8
Isopropanol 100%
Ethanol 70%
Ethidium bromide 0,5 mg/ml
Đệm TAE 1X Tris base: Acetic acid: EDTA
GoTaq Green Master Mix 2X
RNase A, DNase and protease-fre 10 mg/ml
- Trang thiết bị: Hệ thống điện di, hệ thống gel-doc, máy vortex, máy ly tâm
lạnh, máy PCR, máy đo quang phổ.

29. 24
Bảng 2.4. Những thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bị Hãng sản xuất
Hệ thống điện di Biorad (Mỹ)
Máy vortex Eppendorf (Đức)
Máy spin Eppendorf (Đức)
Máy ly tâm lạnh Eppendorf (Đức)
Máy PCR Esco (Mỹ)
Máy pH tự động Hana (Đức)
Nồi hấp khử trùng APL (Nhật)
Tủ lạnh 4 o
C, - 40 o
C Sanyo (Nhật)
Cân phân tích Sartorius (Đức)
Kính hiển vi quang học Kruss MBL 2000 (Đức)
Hệ thống đọc UV trực tiếp Lanbnet (Mỹ)
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu giun đất được thu trong các sinh cảnh bằng các dụng cụ đơn giản (cuốc,
xẻng,...) ở các địa điểm thuộc miền Trung, Việt Nam (Bảng 2.1).

30. 25
Hình 2.1. Các địa điểm thu mẫu giun đất

31. 26
2.4.2. Phương pháp xử lý mẫu
2.4.2.1. Mẫu nghiên cứu đặc điểm hình thái
Mẫu vật được rửa sạch đất và các vụn hữu cơ bám bên ngoài, sau đó định
hình sơ bộ trong dung dịch formol 2% và bảo quản trong dung dịch formol 4%.
2.4.2.2. Mẫu nghiên cứu đặc điểm di truyền
Mẫu được rửa sạch và bảo quản trong cồn 900
.
2.4.3. Phương pháp định loại
Định loại giun đất theo tài liệu mô tả gốc và khóa định loại của các tác giả
Gates (1972) [42]; Thái Trần Bái [1]; Nguyễn Văn Thuận (1994) [27].
2.4.4. Phương pháp tách chiết genomic DNA
Tiến hành tách chiết DNA tổng số dựa trên nguyên tắc màng tế bào và màng
nhân được phá vỡ bằng biện pháp cơ học và các chất tẩy mạnh, genomic DNA giải
phóng được tách sạch protein nhờ enzyme protein K và hỗn hợp phenol,
chloroform, isoamyl alcohol. Cuối cùng DNA được tủa và thu lại bằng ly tâm lạnh.
Quy trình tách chiết DNA tổng số được tiến hành theo Fernando Henrique Biase và
cộng sự có cải tiến phù hợp theo đối tượng và điều kiện phòng thí nghiệm.
Các bước tiến hành
- Rửa sạch cối chày sứ, tráng nước cất, xịt cồn 70% và lau khô bằng giấy
thấm. Bọc giấy bạc quanh chày cối và khử trùng auto-clave, trong 1 giờ.
- Để chày cối nguội và đem cất ở tủ lạnh -800
C ít nhất l giờ.
- Cân 100 mg mẫu rửa sạch cồn bằng nước cất và PBS pH 6,8.
- Nghiền mịn bằng nitơ lỏng, cho vào eppendorf 1,5 ml, bổ sung 500 µl dung
dịch phá vỡ tế bào, 100 µl SDS 10%, 12 µl protein K, vortex trong 30 giây.
- Ủ 650
C trong 2 giờ.
- Bổ sung 300 µl NaCl 6 M, vortex đều, ủ -300
C trong 15 - 20 phút.
- Ly tâm 14000 vòng/15 phút/4 o
C, thu dịch nổi.
- Bổ sung PCI với thể tích tương đương, vortex cho đến khi dung dịch thành
màu trắng đục, sau đó ly tâm 14000 vòng/15 phút/40
C, thu dịch nổi.
- Bổ sung isopropanol với thể tích tương đương, đảo đều, ủ -300
C từ 1- 2 giờ.
- Ly tâm 14000 vòng/15 phút/40
C, thu tủa.
- Rửa tủa 2 lần bằng 500 µl ethanol 70% (ly tâm 14000 vòng/15 phút/40
C)

32. 27
- Thu tủa và để khô.
- Hòa tan trong 30 µl nước cất khử trùng và bảo quản DNA ở -300
C.
2.4.5. Điện di DNA trên agarose gel
Đây là một phương pháp để tách các phân đoạn DNA cho phép hình dung
hay xác định chúng.
Sau khi phân giải với enzyme cắt hạn chế hoặc khuếch bằng kỹ thuật PCR,
những phân đoạn DNA này có thể được phân tách theo kích thước bằng cách điện
di chúng trên gel agarose hay acrylamide. Để phân tách, hỗn hợp DNA được đặt
vào trong giếng tại một đầu của gel rồi đặt vào trong máy điện di. Trong quá trình
chạy điện di, những đoạn DNA dài di chuyển chậm hơn so với những đoạn ngắn.
Gel agarose (0,8 - 2,0%) là thích hợp để phân tách hầu hết các đoạn DNA từ 300 -
10.000 bp. Gel acrylamide (3,5 - 20%) là thích hợp cho những đoạn từ 20 - 1.000
bp. Sau khi chạy điện di, để thấy được các đoạn DNA, gel được nhuộm với
ethidium bromide, những phân tử chất nhuộm được chuyển vào các base của phân
tử DNA và có thể được hiện lên dưới sự chiếu sáng của đèn huỳnh quang. Độ dài
của sự dịch chuyển tỷ lệ phần trăm với logarithm số lượng base của các băng. Kích
cỡ độ dài của các đoạn DNA vì thế có thể tính toán được [18].
Dựa vào đặc tính cấu trúc các nucleic acid tích điện âm đồng đều trên khắp
bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường có điện thế và cường độ thích
hợp, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Các phân tử DNA khác
nhau về kích thước đồng thời sẽ khác nhau về điện tích và di chuyển trên gel với tốc
độ khác nhau, do đó người ta có thể phân biệt được chúng [9].
Việc chọn nồng độ gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của phân đoạn
nucleic acid cần phân tách và tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu.
Các bước tiến hành
Chuẩn bị agarose gel 0,8%: cân 0,28 g agarose cho vào 35 ml đệm TAE 1X,
đun sôi bằng lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn, để nguội khoảng
60o
C và đổ vào khuôn điện di. Sau đó để nguội cho đến khi gel đông (khoảng
30 phút).
Tra mẫu DNA vào giếng: Sau khi gel đông, tra mẫu trộn với Sample Loading
Buffer (3 µl mẫu và 1 µl Sample Loading Buffer) vào các giếng trên bản gel, chạy
với diện trường 80V trong 45 phút.

33. 28
Đọc kết quả: Sau khi kết thúc điện di, nhuộm bảng gel với ethidium bromide
(EtBr) có nồng độ 0,5 g/ml từ 10 - 15 phút, rửa lại bằng nước cất và cho vào
hệ thống máy đọc gel. Chụp ảnh và phân tích kết quả.
2.4.6. Phương pháp PCR
Phương pháp RAPD là dựa trên nguyên lý của kỹ thuật PCR. Phương pháp
RAPD không dùng cặp primer đặc hiệu để nhân đoạn ADN nhất định mà dùng các
primer đơn ngẫu nhiên để phân đoạn DNA một cách ngẫu nhiên trên các primer này
vừa là primer xuôi vừa là primer ngược [9].
Các bước chính: Tách chiết, tinh sạch, đánh giá độ tinh sạch DNA hệ gen -
Thực hiện phản ứng PCR với primer ngẫu nhiên - Điện di sản phẩm PCR trên gel
agarose - Phân tích và đánh giá kết quả [9].
Thành phần phản ứng PCR-RAPD
Thành phần Thể tích (µl)
Go Taq Green Master Mix 2X (Promega) 10
Primer (10 pmol) 2
Nước cất 6
DNA (50 ng/µl) 2
Tổng 20
2.4.7. Phân tích kết quả RAPD bằng phần mềm TEPGA (Tool for Populator
Genetic Analysis) version 1.3 của Mark P.Miller
2.4.8. Xây dựng giản đồ phả hệ bằng phần mềm NTSYS version 2.1
Xây dựng giản đồ phả hệ và phân tích cụm theo thuật toán UPGMA của
mẫu nghiên cứu được thực hiện bằng chương trình NYSYS 2.1 (Exeter Sofware,
Mỹ) dựa trên hệ số tương đồng di truyền.
2.4.9. Xử lý số liệu
Các số liệu thu được xử lý theo các tham số:
- Trung bình cộng: X =
n
1
in iX
- Phương sai: S2
=   ii nXX
n
2
1
1
 


34. 29
- Độ lệch chuẩn S
S =   

ii nXX
n
2
1
1
với n < 30
S =    ii nXX
n
21
với n > 30
- Hệ số biến thiên CV%: CV% =
Nếu CV% biến thiên từ 0 - 5% rất ổn đinh.
Nếu CV% biến thiên từ 5 - 10% ổn định.
Nếu CV% biến thiên >10% không ổn định.

35. 30
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. SỰ KHÁC BIỆT VỀ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI GIỮA HAI LOÀI GIUN
ĐẤT Ph. modigliani (Rosa, 1889) VÀ Ph. rodericensis (Grube, 1879)
Để định loại các loài trong giống Pheretima cần phải sử dụng các đặc điểm
như: manh tràng (sự xuất hiện và kiểu đơn giản hay phức tạp), lỗ sinh dục đực (vị
trí và cấu tạo), túi nhận tinh (vị trí, số lượng), nhú phụ sinh dục (hình thái, số lượng
và vị trí sắp xếp), tình trạng vách ngăn đốt (tiêu biến hay dày) [43].
Trong nghiên cứu, giun đất là nhóm có đời sống gắn liền với môi trường đất
nhiều đặc điểm hình thái được coi là ổn định ở nhiều nhóm động vật (các phần của
hệ sinh dục, cơ quan vận chuyển, hệ tiêu hóa...) thì ở giun đất có biến đổi trong
phạm vi rộng, nhất là những quần thể vượt ra ngoài vùng phân bố gốc của loài đó
hoặc những quần thể sống trong môi trường bị ô nhiễm hay môi trường đang bị biến
đổi mạnh [1].
Để so sánh các đặc điểm hình thái khi định loại Ph. modigliani và Ph.
rodericensis, chúng tôi phân tích một số đặc điểm hình thái của chúng đối với các
mẫu thu được trong các sinh cảnh khác nhau.
3.1.1. Đặc điểm hình thái ngoài
Căn cứ vào số liệu nghiên cứu các đặc điểm hình thái ngoài của loài Ph. modigliani
(Rosa, 1889) trên 14 cá thể (1cá thể ở Hương Thủy, Thừa Thiên Huế và 13 cá thể ở
Quảng Ninh, Quảng Bình) và loài Ph. rodericensis trên 41 cá thể chúng tôi thấy
các đặc điểm chiều dài cơ thể và số đốt biến thiên với nhau. Số đốt, chiều dài và
đường kính cơ thể biến đổi lớn. Các tham số đặc trưng về các đặc điểm hình thái
ngoài thể hiện ở bảng 3.1.

36. 31
Bảng 3.1. Các tham số đặc trưng về hình thái ngoài của Ph. modigliani
(Rosa, 1889) và Ph. rodericensis (Grube, 1879)
Đặc điểm nghiên cứu
Các tham số đặc trưng
Ph. modigliani Ph. rodericensis
X S2
S CV% X S2
S CV%
Chiều dài cơ thể (mm) 113,86 573,52 23,95 21,03 78,39 205,76 14,34 18,30
Số đốt cơ thể 84,29 47,14 6,87 11,06 64,20 60,74 7,79 12,14
ĐKtrướcđaisinhdục(mm) 7,75 0,16 0,40 5,18 4,45 0,16 0,40 8,95
ĐKcủađaisinhdục(mm) 7,69 0,19 0,44 5,71 4,44 0,18 0,43 9,61
ĐKsauđaisinhdục(mm) 8,04 0,16 0,40 5,02 4,77 0,19 0,43 9,07
Khi đi sâu phân tích từng đặc điểm riêng biệt ta có:
- Số đốt và chiều dài cơ thể: Những cá thể giun đất Ph. modigliani thu được
ở cùng một sinh cảnh thì có chiều dài thân không đồng đều có sự chênh lệch lớn từ
đó kéo theo số đốt biến động lớn (hệ số biến thiên 11,06%) thể hiện ở bảng phụ lục.
Số liệu của bảng này còn cho thấy hệ số biến thiên của giá trị trung bình về chiều
dài và số đốt lớn hơn 10% (21,03; 11,06). Đối với Ph. rodericensis là loài giun đất
gặp phổ biến tại các vùng đồi và một số vùng đồng bằng có chiều dài cơ thể trung
bình 78,39 mm. Các cá thể thu được ở các sinh cảnh khác nhau, có kích thước
không giống nhau (phụ lục). Chiều dài thân và số đốt có biến thiên lớn, chiều dài có
hệ số biến thiên 18,30% và số đốt cơ thể 12,14%. Vì vậy, đặc điểm số đốt và chiều
dài của cơ thể không có giá trị trong định loại của hai loài giun đất này.
- Đường kính của cơ thể: Ph. modigliani có đường kính của đai sinh dục
(7,69 mm) nhỏ hơn đường kính trước đai sinh dục (7,75 mm) và sau đai sinh dục
(8,04 mm). Các đặc điểm về đường kính của đai sinh dục có độ biến thiên ổn định
và ở mức thấp (5,18; 5,71; 5,02). Đối với Ph. rodericensis có đường kính của đai
sinh dục (4,44 mm) nhỏ hơn đường kính trước đai sinh dục (4,45 mm) và sau đai
sinh dục (4,77 mm), độ biến thiên về đường kính đai sinh đai sinh dục tương đối ổn
định. Chính vì vậy, đặc điểm này có giá trị trong định loại của hai loài này.
- Đặc điểm của đai sinh dục: Ph. modigliani ở cơ thể chưa trưởng thành thì đai
sinh dục chưa hình thành, còn các cá thể trưởng thành đai sinh dục hình thành chiếm

37. 32
3 đốt XIV - XVI. Trong 14 cá thể chúng tôi nghiên cứu đều con trưởng thành. Đai
sinh dục ổn định: đai kín, đủ, từ đốt XIV - XVI. Còn Ph. rodericensis đặc điểm đai
sinh dục ổn định: đai kín, không đủ, dạng hình nhẫn chiếm 3 đốt XIV-XVI.
- Đặc điểm phân bố của tơ: Hai loài giun đất này trên bề mặt ở các đốt của cơ
thể tơ phân bố theo kiểu perichaetine (mỗi đốt có nhiều tơ xếp thành vành), tơ phía
bụng dày hơn tơ phía lưng. Ph. modigliani số tơ đốt VI - VII khoảng 40 - 46, số tơ
đốt XX - XXX khoảng 52 - 58, số tơ giữa hai nhú đực: 10 - 12 còn Ph. rodericensis
số tơ đốt VI - VII khoảng 36 - 40 và số tơ đốt XX - XXX khoảng 40 - 48, số tơ giữa
hai nhú đực: 8 - 10.
- Màu sắc cơ thể: các cá thể Ph. modigliani thu được đều có mặt lưng đậm
hơn mặt bụng. Mặt lưng của các cá thể đang sống có màu nâu xám còn khi ngâm
bảo quản có màu nhạt hơn. Đối với Ph. rodericensis màu sắc ở mặt lưng đậm hơn ở
mặt bụng và thay đổi sau khi bảo quản nên chỉ là đặc điểm quan sát không dùng làm
đặc điểm chuẩn loại của loài giun đất này.
Như vậy, căn cứ vào phân tích về đặc điểm hình thái ngoài của hai loài giun
đất này cho thấy chúng sai khác nhau về kích thước cơ thể, màu sắc nhưng đặc điểm
này không có giá trị trong định loại. Đặc điểm về đai sinh dục tương đối ổn định có
giá trị trong việc định loại.
3.1.2. Mối quan hệ phân loại học dựa trên đặc điểm hình thái
Mức độ chính xác của biểu đồ hiện trạng (phenogram) xây dựng trên cơ sở
hình thái học phụ thuộc nhiều vào giá trị phân loại học của các đặc điểm chuẩn loại
của đối tượng nghiên cứu.

38. 33
Bảng 3.1. Các đặc điểm và các tính trạng để xác định mối quan hệ phân loại
học của các loài giun đất
Loài
Đặc điểm
Các tính trạng
1. Kích thước cơ thể 1. Lớn
2. Màu sắc giữa mặt bụng
và mặt lưng
2. Khác biệt
3. Kiểu môi 3. Không xác định
4. Lỗ lưng đầu tiên 4. 11/12 hoặc 12/13
5. Kiểu tơ 5. Kiểu perichaetin
6. Số đốt của đai 6. 3 đốt
7. Đai sinh dục 7. XIV - XVI, kín, không đủ; 8. XIV - XVI, kín, đủ
8. Lỗ sinh dục đực 9:Một đôi trên đốt XVIII, lồi; 10: Một đôi trên đốt
XVIII, lõm
9. Vách đốt 11: 5/6/7/8 dày; 12: 7/8 mỏng
10. Vị trí túi nhận tinh 13: Phía lưng; 14: Phía bụng
11. Số lượng túi nhận tinh 15: 4 đôi túi nhận tinh 5/6 - 8/9
12. Vị trí lỗ nhận tinh đầu
tiên
16: 5/6
13. Nhú phụ sinh dục 17: hình tròn; 18:hình o van
14. Manh tràng 19: Đơn giản
15. Vách 8/9 20: Mỏng
16. Vị trí tinh nang 21: XI; XII
17. Tơ VIII/ XXX 22: <1
18. Vị trí đổ 23: Trên cuống
19. Tuyến tiền liệt 24: Hình hạt đậu, gồm nhiều thùy màu trắng, nằm
dọc từ XVII- XX
Từ bảng các đặc điểm chuẩn loại (bảng 3.1) được mã hóa sang hệ thức nhị
phân (phụ lục), biểu đồ hiện trạng của hai loài giun đất được xây dựng theo phương
pháp UPGMA với phần mềm NTSYS - PC 2.1 (hình 3.1). Kết quả cho thấy, hai loài

39. 34
giun đất Ph. modigliani và Ph. rodericensis có mối quan hệ gần gũi với hệ số tương
đồng là 74%.
Hình 3.1. Biểu đồ hiện trạng của hai loài giun đất dựng bằng phương pháp
UPGMA
3.2. ĐA HÌNH RADP
3.2.1. DNA tổng số
Để đánh giá về sự di truyền của giun đất dựa trên chỉ thị RADP, bước đầu
tiên là tách chiết DNA tổng số của 55 mẫu đã thu được, trong đó có 14 cá thể Ph.
modigliani và 41 cá thể Ph. rodericensis.
DNA tổng số sau khi được tách chiết phải đủ độ tinh sạch và không được đứt gãy,
đảm bảo cho phản ứng RADP-PCR tiếp theo đạt hiệu quả tốt nhất. Vì vậy, cần nghiên
cứu và chọn lựa phương pháp tách chiết phù hợp cho đối tượng cũng được chú ý.
DNA tổng số của 55 mẫu giun đất sau khi tách chiết được điện di trên gel
agarose để kiểm tra chất lượng. Kết quả điện di được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. DNA tổng số của một số cá thể giun đất
Qua điện di đồ hình 3.1 cho thấy sản phẩm DNA tổng số thu được tập trung thành
băng rõ nét chứng tỏ DNA tổng số tách chiết được là khá sạch và rất ít bị đứt gãy.

40. 35
3.2.2. Kết quả thực hiện RAPD - PCR
Để phân tích RADP có hiệu quả, chúng tôi đã thăm dò với các primer ngẫu
nhiên trong đó có 6 primer: OPA02, OPA04, OPA09, OPC05, OPC06 và OPC08
chúng tôi đã xác định để sử dụng phân tích đa hình DNA của 55 cá thể giun đất.
3.2.2.1. Kết quả RAPD với primer OPA02
Sản phẩm điện di PCR-RAPD với primer OPA02 được trình bày ở hình 3.2.
Kết quả ở hình 3.2 cho thấy DNA tất cả các cá thể đều được khuếch đại với primer
OPA02, số băng khuếch đại là 13 băng. Hai cá thể có số băng khuếch đại nhiều nhất
với 11 băng, 7 cá thể xuất hiện 10 băng khuếch đại đều và 1 cá thể có số băng
khuếch đại ít nhất là 3 băng.
Hình3.2.HìnhảnhđiệndiPCR-RAPDvớiprimerOPA02.M:Lambda/HindIIImarker
315
1643
1447 1357
1224
972
1133
913
807
544
363
650
449
1643
315
1357
1224
972

41. 36
Khi phân tích hình ảnh điện di PCR-RAPD cho thấy các băng OPA02-544 và
OPA02-650 (xuất hiện ở tất cả cá thể), băng OPA02-363 (xuất hiện ở 53 cá thể) và
băng OPA02-1133 (xuất hiện ở 51 cá thể) là những sản phẩm chính của primer này.
3.2.2.2. Kết quả RAPD với primer OPA04
Sản phẩm điện di PCR-RAPD với primer OPA04 được trình bày ở hình 3.3.
Hình 3.3 cho thấy primer OPA04 có 44 cá thể được khuếch đại DNA với số
băng khuếch đại nhiều nhất là 21 băng. Có 2 cá thể có số băng khuếch đại nhiều nhất
với 14 băng, tiếp theo là các cá thể RHPĐ7, RHPĐ10, RPĐ12, RHPĐ15 với 13 băng
khuếch đại. Hai cá thể RQT6, RHH1 có số băng khuếch đại ít nhất (4 băng).
Hình3.3.HìnhảnhđiệndiPCR-RAPDvớiprimerOPA04.M:Lambda/HindIIImarker
Những sản phẩm chính của primer này là các băng OPA04-350 (xuất hiện ở 54
cá thể), OPA04-998 (xuất hiện ở 53 cá thể), OPA04-630 (xuất hiện ở 52 cá thể), OPA04-
887 (xuất hiện ở 45 cá thể), OPA04-278 và OPA04-523 (đều xuất hiện ở 43 cá thể).
1904
1547
1174
604
430
1355
998
887
747
630
576 523
462
350
278
2463
1547
350
278
2533
1904
1658
1441
1109
887
523581

42. 37
3.2.2.3. Kết quả RAPD với primer OPA09
Sản phẩm điện di PCR-RAPD với primer OPA09 được trình bày ở hình 3.4.
Hình3.4.HìnhảnhđiệndiPCR-RAPDvớiprimerOPA09.M:Lambda/HindIIImarker
Primer OPA09 khuếch đại được 14 băng với 43 cá thể được khuếch đại DNA
và 12 cá thể không khuếch đại. Trong đó RHPĐ15 là cá thể có nhiều băng khuếch
đại nhất với 11 băng, tiếp theo là RQT14 và RHPĐ13 với 9 băng khuếch đại và 2 cá
thể có số băng ít nhất là 4 băng (RQT6, RHH1 ).
Các sản phẩm chính của primer OPA09 là các băng OPA09-947 (xuất hiện ở 41
cá thể), OPA09-1208 (xuất hiện ở 39 cá thể) và OPA09-1095 (xuất hiện ở 38 cá thể).
Kết quả phân tích hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD được tổng hợp ở
bảng 3.1.
734
431
2276
1095
2027
1850
1487
1360
1208
1002 947
644
571
734
431
2027
1095
339

43. 38
Bảng 3.1. Số cá thể khuếch đại và số băng khuếch đại của từng primer
STT Primer
Số cá thể
khuếch
đại
Tổng số băng
DNA của từng
primer
Số băng
DNA đa
hình
Số băng
DNA duy
nhất
Tỷ lệ
đa hình
(%)
1 OPA02 55 13 11 0 84,6
2 OPA04 54 21 21 3 100
3 OPA09 43 14 14 0 100
4 OPC05 55 14 13 2 92,9
5 OPC06 51 15 15 3 100
6 OPC08 54 14 14 1 100
Tổng 91 88 9 96,7
Bảng 3.1 cho thấy tổng cộng có 91 băng DNA được tạo ra, trong đó có 88
băng đa hình, 3 băng đồng hình, 9 băng duy nhất. Primer có số băng DNA khuếch
đại nhiều nhất là OPA04 (21 băng), tiếp đến là OPC06 (15 băng), OPA09, OPC05
và OPC08 (14 băng). Primer có số băng DNA khuếch đại ít nhất là OPA02 (13
băng). Trong số 6 primer sử dụng thì primer OPA02 và OPC05 cho sản phẩm
khuếch đại ở tất cả các cá thể nghiên cứu. Primer có số cá thể khuếch đại ít nhất là
OPA09 (43/55 cá thể).
3.3. PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN
3.3.1. Giản đồ phả hệ DNA của các cá thể giun đất nghiên cứu
Kết quả điện di của 6 primer sau khi thống kê được xử lý bằng phần mềm
NTSYS 2.1 để xây dựng giản đồ phả hệ. Giản đồ phả hệ DNA của 2 quần thể giun
đất được thể hiện ở hình 3.5.
Các mẫu nghiên cứu chia làm 2 nhóm chính trên cây phả hệ, 1 nhánh là các
mẫu thuộc loài Ph. modigliani, phần còn lại là các mẫu thuộc loài Ph. rodericensis.

44. 39
Coefficient
0.07 0.30 0.53 0.77 1.00
QN10
QN1
H11
H12
QN24
QB3
H2
H14
DN4
DN3
QN19
QN18
QN2
QN8
QN11
QN4
QN10
QN6
QN7
QN5
QN14
H10
QN13
QN17
H4
H8
QN16
H5
H7
QN26
QT1
H9
QT4
DN5
QT2
QT5
QB4
QN20
QN23
QN21
QN22
QT6
QB2
QB5
QN3
QN9
QN12
H3
QT3
H13
QN25
DN1
DN2
DN6
QB1
H6
QN15
H1
Hình 3.5. Giản đồ phả hệ DNA của các cá thể giun đất nghiên cứu

45. 40
3.3.2. Mối quan hệ di truyền giữa các cá thể giun đất nghiên cứu
Trong nghiên cứu hiện tại, các thông số hình thái khác nhau được sử dụng để
xác định các cá thể giun đất thu được từ các vùng địa lý đa dạng. Dựa trên các đặc
điểm hình thái quan trọng Ph. modigliani và Ph. rodericensis có mối quan hệ gần
gũi với nhau với hệ số tương đồng 74%.
Tuy nhiên, các dấu hiệu hình thái thường bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi
trường, giai đoạn tuổi và giai đoạn phát triển của cá thể, cũng như môi trường sống
của nó. Do đó, các kỹ thuật di truyền phân tử được coi là mạnh nhất có thể được sử
dụng có hiệu quả trong đặc tính biến đổi gen ở các loài khác nhau. Trong nghiên
cứu này, phân tích sự đa dạng di truyền đã được thực hiện bằng phương pháp
RAPD là một phương pháp đáng tin cậy và hiệu quả để đánh giá biến đổi di truyền
giữa hai loài giun đất được thu từ các địa điểm khác nhau. Qua kết quả RADP cho
thấy hệ số tương đồng giữa các cá thể của hai loài thấp (7% - 53%) chứng tỏ mức
độ sai khác về di truyền lớn.

46. 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
Trên cơ sở phân tích sự sai khác hình thái và di truyền của 2 loài giun đất Ph.
modigliani và Ph. rodericensis thu được ở các địa điểm khác nhau thuộc các huyện,
tỉnh khác nhau chúng tôi rút ra kết luận sau:
1. Những đặc điểm ổn định có giá trị định loại 2 loài giun đất trên là vị trí và
đặc điểm của đai sinh dục; số lượng và vị trí lỗ nhận tinh, nhú phụ sinh dục
đực của Ph. modigliani và Ph. rodericensis. Những đặc điểm không có giá trị
trong định loại là màu sắc, số đốt và chiều dài của cơ thể; kiểu môi và vị trí
lỗ lưng đầu tiên. Sự sai khác về đặc điểm hình thái quan trọng của Ph.
modigliani và Ph. rodericensis là 74%.
2. Các chỉ thị mồi RADP cho thấy hệ số tương đồng giữa các cá thể của hai
loài thấp (7% - 53%) chứng tỏ mức độ sai khác về di truyền lớn (khác biệt: 47% -
93%). Vì vậy, Ph. modigliani và Ph. rodericensis không phải cặp loài gần gũi.
2. KIẾN NGHỊ
Cần mở rộng phạm vi, vùng nghiên cứu và kết hợp với các chỉ thị phân tử
khác trong nghiên cứu nhằm xác định rõ hơn mối quan hệ di truyền của các loài
giun đất ở Việt Nam.

47. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Thái Trần Bái (1983), Giun đất Việt Nam (Hệ thống học, khu hệ, phân bố và
địa lý động vật học), Luận án Tiến sĩ Khoa học Sinh học, Trường Đại học
Quốc gia Lomonosov (Tiếng Việt).
2. Thái Trần Bái (1989), Giá trị thực tiễn của giun đất, Tạp chí Sinh học, 11 (l),
tr. 39-43.
3. Thái Trần Bái, Đỗ Văn Nhượng (1989), Nhận xét về khu hệ giun đất
Pnômpênh và các khu vực lân cận, Thông báo khoa học, Trường Đại học Sư
phạm Hà Nội, tr. 76-78.
4. Thái Trần Bái, Tào Minh Tuấn, Trịnh Đình Đạt (1996), Điện di so sánh các
isozim esteraza của bốn loài giun đất trong giống Pheretima
(Megascolecidae), Thông báo Khoa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội (1),
tr. 33-37.
5. Trần Thị Thanh Bình, Đặng Tất Thế (2006), Dẫn liệu DNA của hai loài giun
đất Ph. aspergillum và Ph. robusta, Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Sư
phạm Hà Nội (4), tr. 130-135.
6. Đặng Vũ Bình, Vũ Đình Tôn, Nguyễn Đinh Linh (2008), Đánh giá khả năng
tăng trưởng của giun quế (Perionyx excavatus) trên các nguồn thức ăn khác
nhau, Tạp chí khoa học và Phát triển, VI (4), tr. 321-325.
7. Trần Quốc Dung, Trần Văn Thiện, Ngô Đắc Chứng, Quyền Đình Thi, Đào Thị
Tuyết (2008), Nhận dạng hai quần thể nhông cát Leiolepis Cuvier, 1928 ở
Thừa Thiên Huế bằng chỉ thị RAPD, Báo cáo hội nghị Sinh học toàn quốc lần
thứ IV Hóa sinh và Sinh học phân tử phục vụ Nông, Sinh, Y học và Công
nghiệp thực phẩm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 687-700.
8. Trần Quốc Dung (2009), Một số kỹ thuật DNA marker ứng dụng trong nghiên
cứu Lưỡng cư và Bò sát, Báo cáo khoa học Hội thảo Quốc gia về Lưỡng cư và
Bò sát ở Việt Nam, Lần thứ nhất, 28/11/2009, NXB Đại học Huế, tr. 314-326.
9. Trịnh Đình Đạt (2006), Công nghệ sinh học - Công nghệ Di truyền (t4), NXB
Giáo dục.

48. 43
10. Phạm Thị Hồng Hà (1995), Khu hệ giun đất Quảng Nam – Đà Nẵng, Luận án Phó
Tiến sĩ Khoa học Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
11. Nguyễn Thị Minh Hòa (1984), Thử nghiệm quy trình nuôi giun đất ở Hà Nội,
Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
12. Huỳnh Thị Kim Hối (2005), Khu hệ của giun đất trong nhóm Mesofauna và vấn đề sử
dụng chúng ở phía Nam miền Trung Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội.
13. Huỳnh Thị Kim Hối, Vương Tấn Tú, Nguyễn Cảnh Tiến Trình (2007), Ảnh
hưởng của một số tính chất lý, hoá học của đất đến thành phần và phân bố của
giun đất tại Vườn Quốc gia Tam Đảo, Tạp chí Sinh học, 29 (2), tr. 26-34.
14. Trần Thị Bích Hồng, Ngô Thị Tố Nga, Quyền Đình Thi, Nguyễn Hữu Ninh,
Phạm Anh Tuấn (2009), Xác định các chỉ thị AFLP đặc trưng cho bảy dòng cá
rô phi nuôi ở Việt Nam, Tạp chí Công nghệ sinh học, 7(4), tr. 455-462.
15. Đỗ Võ Anh Khoa, Nguyễn Thị Kim Khang, Nguyễn Minh Thông, Bùi Xuân
Mến (2013), Đa dạng di truyền gen insulin-like growth factor binding protein
2 trên gà, Tạp chí Khoa học và Phát triển 11(1), tr. 36-40.
16. Ngô Thị Kim, Đặng Thị Thanh Hà, Đặng Tất Thế (2003), Bước đầu nghiên
cứu rắn hổ mang theo quần thể địa lý bằng kỹ thuật RAPD, Những vấn đề
nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học hội nghị toàn
quốc lần thứ hai, Nghiên cứu cơ bản trong Sinh học, Nông nghiệp, Y học,
NXB Khoa học và Kỹ thuật.
17. Võ Thị Phương Lan, Ngô Thị Hà, Phạm Anh Thùy Dương, Nguyễn Mộng
Hùng (2009), Đánh giá sự khác biệt của các giống gà bằng chỉ thị DNA, Báo
cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Công nghệ sinh học phục vụ
Nông nghiệp-Lâm nghiệp, Thủy sản, Công nghiệp, Y dược và Bảo vệ môi
trường, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
18. Nguyễn Thị Thu Liên, Hoàng Tấn Quảng (2015), Giáo trình Chỉ thị phân tử,
NXB Đại học Huế.
19. Trần Thuý Mùi (1985), Khu hệ giun đất vùng đồng bằng sông Hồng, Luận án
Phó Tiến Sĩ khoa học Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
20. Hồ Đắc Khánh Ngọc (2012), Nghiên cứu một số đặc điểm phân bố và nuôi thử
nghiệm loài giun khoang (Ph. aspergillum) ở thành phố Huế, Luận văn Thạc sĩ
Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Huế.

49. 44
21. Đỗ Văn Nhượng (1994), Khu hệ giun đất miền Tây Bắc Việt Nam, Luận án
phó Tiến sĩ Khoa học Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
22. Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Đảm (2009), Đánh giá độ thuần 10 giống tằm
(Bombyx mory L.) bằng chỉ thị RAPD, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 7(5),
tr. 620-627.
23. Samphon (1990), Khu hệ giun đất nước Cộng hòa dân chủ nhân dân Lào, Luận
án phó Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
24. Trần Thanh Sơn (2012), Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể nhông cát
rivơ (Leiolepis reevesii Gray, 1831) ở miền Trung Việt Nam, Luận văn Thạc sĩ
Sinh học, Trường Đại học Khoa học Huế.
25. Khuất Hữu Thanh (2005), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, NXB Khoa
học và Kỹ thuật.
26. Nguyễn Thị Thơ (2014), Nghiên cứu đặc điểm phân bố và nuôi thử nghiệm
loài giun đất Pheretima rodericensis (Grube, 1879) ở thành phố Huế, Luận
văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Huế.
27. Nguyễn Văn Thuận (1994), Khu hệ giun đất Bình Trị Thiên, Luận án phó Tiến
sĩ Khoa học Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
28. Nguyễn Văn Thuận (2010), Nghiên cứu thành phần loài, phân bố và định
hướng ứng dụng của giun đất ở một số tỉnh duyên hải phía nam miền Trung
(Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên), Báo cáo tình hình thực hiện nhiệm vụ
nghiên cứu cơ bản cấp nhà nước, Trường Đại học Sư pham Huế, tr. 8-9.
29. Phan Thị Bích Trâm, Phạm Thị Quỳnh Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà
Thanh Toàn (2009), Nghiên cứu sử dụng bột đàm từ trùn quế (Perionyx
excavatus) làm thức ăn cho hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon), Tạp chí
Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 11, tr. 9-17.
30. Lê Văn Triển (1995), Khu hệ giun đất miền Đông Bắc Việt Nam, Luận án phó
Tiến sĩ Khoa học Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
31. Nguyễn Thanh Tùng (2013), Khu hệ giun đất ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt
Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.

50. 45
Tiếng Anh
32. Biruntha M., Paul J. A. J., and Mariappan P. (2013), Vermicultural and
molecular characterization of composting endemic earthworms, American
Journal of Research Communication, Vol. 1 (3), pp. 168-180.
33. Biradar M. D., Suresh B., Siddaraju M., Sreepada K., Paliwal R., Giraddi R.
S., and Gai P. B. (2013), Genetic diversity of earthworms from westwrn ghats
of Karnataka (india) using rapd based molecular markers, Biochem. Cell.
Arch., Vol. 13, No. 2, pp. 237-242.
34. Blakemore R. J. (2002), Cosmopolitan Earthworms-an Eco-Taxonomic Guide
to the Peregrine Species of the World, Published by VermEcology, Australia,
pp. 62-237.
35. Cameron E. K., Bayne E. M., Coltman D. W. (2008), Genetic structure of
invasive earthworms Dendtobaena octaedrain the boreal forest of Alberta:
insights into introduction mechanisms, Mol. Ecol.,17, pp. 1189-1197.
36. Chang C. H., Chen J. H. (2005), Taxonomic status and intraspecific
phylogeography of two sibling species of Metaphire (Oligochaeta:
Megascolecidae) in Taiwan, Pedobiologia, 49, pp. 591-600.
37. Chang C. H., Lin. M., Chen J. H. (2008), Molecular systematics and
phylogeography of the gigantic earthworms of the Pheretima formosae species
group (Clitellata, Megascolecidae), Molecular Phylogenetics and Evolution,
49 (3), pp. 958-968.
38. Chen Y. (1938), Oligochaeta from Hainan, Kwangtung, Contrib. Biol. Lab.
Sci. Soc. China, Zool., 12, pp. 375-427.
39. Easton E. G. (1979), A revision of the 'acaecate' earthworms of the Pheretima
group (Megascolecidae: Oligochaeta): Archipheretima, Metapheretima,
Planapheretima, Pleionogaster and Polypheretima, Bull Br. Mus. Nat. Hist.
Zool., 35, pp. 1-126.
40. Gates G. E. (1959), On a taxonomic puzzle and the classification of the
earthworms, Bulletin of the Museum of Comparative Zoology, 121, pp. 229-261.
41. Jamieson B. G. M. (1988), On the phylogeny and higher classification of the
Oligochaeta, Cladistics, 4, pp. 367-410.

51. 46
42. Gates G. E. (1972), Burmese earthworms an introduction to the systematic and
biology megadrile Oligochaetes with special reference to Southeast Asia,
Amer. Phil. Soc., 62(7).
43. Ishizuka K. (1999), A review of the genus Pheretimas Iat. (Megascolecidae)
from Japan, Edaphologia, 62, pp. 55-60.
44. Kimberling DN, Ferreira AR, Shuster SM, Keim P (1996), RAPD marker
estimation of genetic structure among isolated nothern leopard frogs
populations in the South western USA, Molecular Ecology, 5, pp. 521-529.
45. Kinberg J. G. H. (1867), Annulata nova, Ofves. K. Vetensk Acad. Förch
Stockh, 23. Quoted in Sims R. W., Easton E. G. (1972), A numerical revision
of the earthworm genus Pheretima auct. (Megascolecidae: Oligochaeta) with
the recognition of new genera and an appendix on the earthworms collected by
the Royal Society North Borneo Expedition, Biological Journal of the Linnean
Society, 4, pp. 169-268.
46. Lee K. E. (1959), A Key for the identification of New Zealand earthworms,
Tuatara, 8, pp. 13-60.
47. Legesse B. W., Myburg A. A., Pixley K. V., Botha A. M. (2007), Genetic
diversity of African maize inbred lines revealed by SSR markers, Hereditas,
144(1), pp. 10-17.
48. Maity S., Padhy P. K., Chaudhury S. (2008), The role of earthworm Lampito
mauritii (Kinberg) in amending lead and zinc treated soil, Bioresource
Technology, 99 (15), pp. 7291-7298.
49. Meenatchi R., Giraddi R. S., and Biradar D. P., (2009), Assessment of genetic
variability among strains of earthworm, Eudrilus eugeniae (Kinberg) using
PCR-RAPD technique, Karnataka J. Agric. Sci., 22(5), pp. 942-945.
50. Michaelsen J. W. (1900), Das Tierreich 10, Oligochaeta. Berlin: R.
Friedländer und Sohn.
51. Omodeo P. (1958), La reserve naturelle integrale du Mont Nimba. I.
Oligochaetes, Mem. inst. Fr. Afr. Noire., 53, pp. 9-10.
52. Perrier E. (1872), Recherches pour servir a I’histoire des Lumbriciens
terrestres-nouv. Archis. Mus. Hist. Nat. Paris. V.81, pp. 1043-1046.

52. 47
53. Reynolds R. W., Cook D. C. (1993), Nomenclatura Oligochaetologica
Supplementum Tertium, New Brunswick Museum Monograph, 9. Quoted in
Edwards C. A. and Bohlen P. J. (1996), Biology and Ecology of Earthworms,
3rd, Chapman and Hall, London.
54. Sharma A., Sonah H., Deshmukh R. K., Gupta N. K., Singh N. K., and
Sharma T. K. (2011), Analysis of Genetic Diversity in Earthworms using
DNA Markers, Zoological Science, 28(1), pp. 25-31.
55. Shen H. P., Yeo D. C. J. (2005), Terrestrial earthworms (Oligochaeta) from
Singapore, The Raffles Bulletin of Zoology, 53 (1), pp. 13-33.
56. Sims R. W., Easton E. G. (1972), A numerical revision of the earthworm
genus Pheretima auct. (Megascolecidae: Oligochaeta) with the recognition of
new genera and an appendix on the earthworms collected by the Royal Society
North Borneo Expedition, Biological Journal of the Linnean Society, 4, pp.
169-268.
57. Somniyam P. (2008), The population dynamics and distribution of terrestrial
earthworms at Sakaerat Environmental Research Station and adjacent areas,
NaJchon Ratchasima Province, Ph. D. Thesis in Environmental Biology,
Suranaree University of Technology, Thailand.
58. Stephenson J. (1930), The Oligochaeta, Oxford University Press, London.
59. Nguyen Thanh Tung, Tran Nhan Dung, Pham Minh Tu (2012), Testing on
three determining methods of genetic diversity on earthworm species
belonging to the Pheretima species group in the Mekong Delta, Journal of
biology, 34(1), pp. 6-14.

53. PHỤ MỤC

54. P1
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Các tham số đặc trưng về hình thái ngoài của Ph. rodericensis và Ph. modigliani
Bảng 1.1. Các tham số đặc trưng về hình thái ngoài của Ph. modigliani (Rosa, 1889) thu được ở Quảng Bình (1- 13), Hương
Thủy (14)
STT
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Đặc điểm
Chiều dài cơ thể
122 130 129 149 136 105 108 121 80 97 79 73 133 132
Số đốt cơ thể
87 90 88 95 77 82 82 86 77 67 70 67 89 90
Đường kính trước
đai sinh dục (mm)
7,3 7,6 8 8,3 7,9 8,2 8 8 7,3 8 7 7,3 8 7,5
Đường kính của
đai sinh dục (mm)
7,3 7,5 8,1 8,2 7,9 8,1 8 8,1 7,2 7,9 7 7 8 7,4
Đường kính sau
đai sinh dục (mm)
7,7 8 8,3 8,7 8 8,4 8 8,3 7,8 8,5 7,3 7,5 8,3 7,7
Bảng 1.2. Các tham số đặc trưng về hình thái ngoài của Ph. rodericensis (Grube, 1879) thu được ở Thủy Biều
STT
Đặc điểm
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Chiều dài cơ thể 90 118 78 90 89 91 90 79 80
Số đốt cơ thể 72 76 67 70 70 72 68 68 68
Đường kính trước đai sinh dục (mm) 4,7 5 4,8 5 5,2 5 5,4 4,5 4,9
Đường kính của đai sinh dục (mm) 5 5 4,7 5 5,1 5 5,2 4,5 5
Đường kính sau đai sinh dục (mm) 5,2 5,1 5 5,2 5,7 5,5 5,5 5,1 5,3

55. P2
Bảng 1.3. Các tham số đặc trưng về hình thái ngoài của Ph. rodericensis (Grube, 1879) thu được ở Phong Điền
STT
Đặc điểm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Chiều dài cơ thể 92 60 81 62 84 66 68 72 71 82 80
Số đốt cơ thể 72 56 67 58 67 60 59 67 65 70 70
Đường kính trước đai sinh
dục (mm)
5 4,5 5 4 5,1 4 4,8 4,5 4 4,8 4,5
Đường kính của đai sinh
dục (mm)
5,5 4,2 5 4,1 5 4 4,6 4,7 4 4,7 4,5
Đường kính sau đai sinh
dục (mm)
5,6 4,7 5,2 4,2 5,2 4,5 5 5 4,2 5 5
Bảng 1.4. Các tham số đặc trưng về hình thái ngoài của Ph. rodericensis (Grube, 1879) thu được ở Quảng Trị
STT
Đặc điểm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Chiều dài cơ thể 83 89 91 83 96 80 78 78 70 91 98 79 88 71 67 85
Số đốt cơ thể 70 72 74 70 79 71 67 68 56 70 78 68 70 59 55 65
Đường kính trước
đai sinh dục (mm)
5 5 4,5 4,7 5 4,7 4,3 4,5 5,5 4,8 5 4,5 4,5 4,5 4,3 5
Đường kính của đai
sinh dục (mm)
4,8 5 4,7 4,7 5,1 4,6 4,7 4,1 5,5 4,5 5 4,5 4,7 4,6 4,3 5,2
Đường kính sau đai
sinh dục (mm)
5,5 5,3 4,8 5 5,5 5 4,5 4,5 5,7 5 5,3 5,5 5,2 4,5 4,5 5,5

56. P3
Bảng 1.5. Các tham số đặc trưng về hình thái ngoài của Ph. rodericensis (Grube, 1879) thu được ở Hương Thủy (1 -3), Hương
Trà (4), Quảng Ngãi (5)
STT
Đặc điểm
1 2 3 4 5
Chiều dài cơ thể 90 87 80 102 140
Số đốt cơ thể 70 72 69 79 101
Đường kính trước đai sinh dục (mm) 5 4,5 4,5 5,2 5,9
Đường kính của đai sinh dục (mm) 5 4,5 4,3 5 6,1
Đường kính sau đai sinh dục (mm) 5,2 5 5,2 5,5 6,3

57. P4
Phụ lục 2: Đặc điểm hình thái của Ph. rodericensis và Ph. modigliani
Bảng 2.1. Sự sai khác một số đặc điểm hình thái của Ph. rodericensis và Ph.
modigliani
Loài
Đặc điểm
Ph. rodericensis (1) Ph. modigliani (2)
1. Kích thước cơ thể Lớn Lớn
2. Màu sắc giữa mặt bụng và
mặt lưng
Khác biệt Khác biệt
3. Kiểu môi Không xác định Không xác định
4. Lỗ lưng đầu tiên 11/12 hoặc 12/13 11/12 hoặc 12/13
5. Kiểu tơ Kiểu perichaetin Kiểu perichaetin
6. Số đốt của đai 3 đốt 3 đốt
7. Đai sinh dục XIV - XVI, kín, không đủ XIV - XVI, kín, đủ
8. Lỗ sinh dục đực Một đôi trên đốt XVIII, lồi Một đôi trên đốt XVIII, lõm
9. Vách đốt 5/6/7/8 dày 7/8 mỏng
10. Vị trí túi nhận tinh Phía lưng Phía bụng
11. Số lượng túi nhận tinh 4 đôi túi nhận tinh 5/6 - 8/9 4 đôi túi nhận tinh 5/6 - 8/9
12. Vị trí lỗ nhận tinh đầu tiên 5/6 5/6
13. Nhú phụ sinh dục hình tròn hình o van
14. Manh tràng Đơn giản Đơn giản
15. Vách 8/9 Mỏng Mỏng
16. Vị trí tinh nang XI; XII XI; XII
17. Tơ VIII/ XXX <1 <1
18. Vị trí đổ Trên cuống Trên cuống
19. Tuyến tiền liệt Hình hạt đậu, gồm nhiều
thùy màu trắng, nằm dọc từ
XVII- XX
Hình hạt đậu, nằm dọc từ
XVII- XX

58. P5
Bảng 2.2. Bảng chuyển đổi đặc điểm của hai loài giun đất sang hệ nhị phân
Đặc điểm Tính trạng
Mã
số
Các loài
1 2
Kích thước cơ thể Lớn 1 1 1
Màu sắc giữa mặt bụng và mặt lưng Khác biệt 2 1 1
Kiểu môi Không xác định 3 1 1
Lỗ lưng đầu tiên 11/12 hoặc 12/13 4 1 1
Kiểu tơ Kiểu perichaetin 5 1 1
Số đốt của đai 3 đốt 6 1 1
Đai sinh dục
XIV - XVI, kín, không đủ 7 1 0
XIV - XVI, kín, đủ 8 0 1
Lỗ sinh dục đực
Một đôi trên đốt XVIII, lồi 9 1 0
Một đôi trên đốt XVIII, lõm 10 0 1
Vách đốt
5/6/7/8 dày 11 1 0
7/8 mỏng 12 0 1
Vị trí túi nhận tinh
Phía lưng 13 1 0
Phía bụng 14 0 1
Số lượng túi nhận tinh 4 đôi túi nhận tinh 5/6 - 8/9 15 1 1
Vị trí lỗ nhận tinh đầu tiên 5/6 16 1 1
Nhú phụ sinh dục
hình tròn 17 1 0
hình o van 18 0 1
Manh tràng Đơn giản 19 1 1
Vách 8/9 Mỏng 20 1 1
Vị trí tinh nang XI; XII 21 1 1
Tơ VIII/ XXX <1 22 1 1
Vị trí đổ Trên cuống 23 1 1
Tuyến tiền liệt
Hình hạt đậu, gồm nhiều
thùy màu trắng, nằm dọc từ
XVII- XX
24 1 1