Nhận viết luận văn Đại học , thạc sĩ - Zalo: 0917.193.864 Tham khảo bảng giá dịch vụ viết bài tại: vietbaocaothuctap.net Download luận văn với đề tài: Nghiên cứu tần suất alen của một số locus gen ở người Việt, cho các bạn có thể tham khảo làm đề tài nghiên cứu

1. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
1
MỞ ĐẦU
Khoa học công nghệ đã phát triển vượt bậc ngay từ những năm đầu của thế
kỷ 21 với những nghiên cứu đột phá nhằm khám phá toàn bộ hệ gen của con người.
Con người như những cuốn sách được khám phá tới trang cuối cùng, được nghiên
cứu ở mức độ phân tử nhằm hiểu rõ hơn, làm sáng tỏ nhiều vấn đề trước con mắt
của các nhà khoa học.
Xã hội càng phát triển thì loài người càng phải đối mặt với những nguy cơ
mới đầy thách thức về mặt an toàn. Mỗi năm trên thế giới có hàng ngàn vụ thảm
họa thiên tai, hàng triệu vụ án mạng, mất tích, khủng bố quy mô rộng. Trong bất kỳ
một trường hợp nào, ở bất cứ quốc gia nào thì việc xác định rõ tung tích nạn nhân là
vấn đề đầu tiên đặt ra cần giải quyết. Khoa học hiện đại với công nghệ DNA làm
mũi nhọn đã tiến tới khả năng nhận biết truy nguyên đến mức độ cá thể bằng chính
những thông tin được mã hóa trong hệ gen của mỗi người. Trong vài năm gần đây,
thế giới đã chứng kiến những vụ thảm họa lớn xảy ra như vụ khủng bố vào tòa tháp
đôi ở Trung tâm thương mại thế giới tại New York ngày 11 tháng 9, vụ thảm họa
sóng thần ở khu vực Đông Nam Á, động đất ở Haiti, những vụ tai nạn máy bay,
những vụ đánh bom liều chết cướp đi sinh mạng của hàng trăm người…Tất cả đều
được trả lời dưới con mắt của khoa học và sự ra đời của hàng loạt những công nghệ
mới, và trong rất nhiều trường hợp DNA được coi như là dấu vết và bằng chứng
đưa đến những kết luận cuối cùng.
Việc ứng dụng kỹ thuật phân tích DNA đã giúp ích rất nhiều cho việc điều
tra phá án, đồng thời cho phép truy nguyên cá thể với độ chính xác cao hơn hẳn các
phương pháp nhận dạng truyền thống. Dấu vết sinh phẩm thu được ở hiện trường
của các vụ án thường là rất ít hoặc bị phân hủy nghiêm trọng nhưng thông qua phân
tích DNA có thể cho chúng ta những chứng cứ quan trọng giúp truy nguyên thủ
phạm của vụ án hoặc truy tìm tung tích nạn nhân một cách chính xác [25].
Một marker chỉ thị, hay một locus DNA nhân mang tính khoa học được sử
dụng (được coi là đặc trưng cá thể) nếu nó có nhiều alen khác nhau trong quần thể
(nhiều hơn 5 alen) và kiểu gen dị hợp của các cá thể trong quần thể lớn hơn 70%
[25, 26]. Do đó, càng nhiều vị trí DNA (locus DNA) được phân tích để tìm đặc

2. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
2
trưng DNA, thì khả năng xác định mẫu sinh học nào đó của một người càng cao. Vì
thế, việc xác định đặc trưng cá thể về phương diện DNA giữa mẫu sinh phẩm thu
được và mẫu sinh phẩm đối chứng của một cá thể nghi ngờ hoặc với ngân hàng dữ
liệu DNA (nếu có) là cực kỳ quan trọng.
Hiện nay, trên thế giới công tác giám định pháp y, đặc biệt là trong khoa học
hình sự chủ yếu sử dụng các marker STR (Short Tandem Repeat), đây là các đoạn
DNA có cấu trúc lặp lại từ 2-6bp, có tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ
và mang tính đặc trưng cá thể. Một locus STR được sử dụng cho mục đích nhận
dạng và xác định cá thể phải có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao, có kích thước
ngắn từ 100-500bp và phải có tính di truyền độc lập. Trên thực tế, tần suất xuất hiện
các locus STR trong quần thể ở các nước khác nhau, các tộc người khác nhau cũng
có sự khác biệt. Có những locus chỉ thấy xuất hiện ở tộc người này nhưng lại không
thấy xuất hiện ở tộc người khác hoặc rất hiếm gặp. Vì thế, việc nghiên cứu tần suất
alen của các tộc người khác nhau có ý nghĩa quan trọng trong việc đánh giá và áp
dụng có hiệu quả thông qua phân tích các locus STR, giúp truy nguyên cá thể một
cách nhanh chóng, chính xác [22, 25, 26, 27].
Ở Việt Nam, Viện Khoa học Hình sự – Bộ Công an đang sử dụng bộ kit nhân
gen AmpFlSTR®
Identifiler®
PCR Amplification Kit của hãng Applied Biosystems
trong công tác giám định pháp y và Khoa học Hình sự. Đây là bộ kit nhân đồng thời
16 locus STR có độ chính xác cao đáp ứng các tiêu chuẩn hiện hành của Cộng đồng
hình sự Châu Âu và FBI. Tuy nhiên, để đánh giá chính xác độ chính xác hay mức
độ tin cậy của phương pháp này ở Việt Nam cần có các thống kê cụ thể về tần suất
alen, tần suất dị hợp tử của từng locus STR đối với người Việt Nam. Từ đó tính toán
khả năng phân biệt của từng locus, độ chính xác cũng như độ tin cậy của phép phân
tích. Trong những trường hợp cụ thể, DNA thu được ở hiện trường vụ án bị đứt gãy
hoặc biến tính dẫn đến không thể nhân được tất cả 16 locus STR, khi đó độ chính
xác của xét nghiệm được tính dựa trên các locus xuất hiện. Vì vậy việc thống kê tần
suất alen, tần suất dị hợp tử, khả năng phân biệt của từng locus STR có vai trò quan
trọng giúp đánh giá đúng mức độ tin cậy của phép phân tích trong từng trường hợp

3. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
3
cụ thể. Trước thực tế đó, chúng tôi đã chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu tần
suất alen của một số locus gen ở người Việt”, với các mục tiêu sau:
1. Hoàn thiện quy trình tổng thể bao gồm: tách chiết DNA, phân tích, xử lý
số liệu, tính toán tần suất alen dựa trên bộ kit nhân gen Identifiler của
hãng Applied Biosystems.
2. Xác định tần suất tương đối của các alen ở người Việt, so sánh với tần
suất tương ứng ở một số nước trong khu vực và trên thế giới. Đánh giá
khả năng phân biệt của chúng trong nhận dạng cá thể.

4. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Các phương pháp kinh điển trong nhận dạng pháp y và khoa học hình sự
Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định cá thể người, các phương pháp
này khác nhau chủ yếu ở khả năng phân biệt cá thể và thời gian thu nhận kết quả.
Việc giám định nhận dạng đóng vai trò rất quan trọng, kết quả của nó có ý nghĩa to
lớn trong điều tra xét hỏi, có khi đóng vai trò quyết định. Nội dung cơ bản của công
tác nhận dạng là nhằm xác định chính xác các mẫu sinh phẩm thu được trên hiện
trường vụ án hay của những người mất tích thuộc về một cá thể xác định nào đó. Để
làm được việc này, ngoài trình độ chuyên môn của giám định viên, các trang thiết bị
hỗ trợ, phương pháp mà người giám định viên áp dụng, còn phụ thuộc vào đặc
điểm, tính chất, số lượng, thời gian và cách bảo quản của mỗi mẫu sinh phẩm thu
được.
1.1.1. Nhận dạng người bằng phương pháp hình thái
1.1.1.1. Nhận dạng thông qua mô tả
Việc nhận dạng người được tiến hành từ rất sớm. Trải qua thời gian các
phương pháp nhận dạng người bằng hình thái được sử dụng từ đơn giản đến phức
tạp, từ mô tả đến các đặc điểm đo đạc, từ thô sơ đến nhận dạng có phương tiện hỗ
trợ.
Đặc điểm nhân trắc của vùng đầu mặt được ứng dụng trong nhận dạng người
đã được áp dụng từ cuối thế kỷ XIX. Người đầu tiên tiến hành có tính chuyên
nghiệp và hệ thống là A. Bertillon (một cảnh sát người Pháp) đã áp dụng phương
pháp chụp ảnh can phạm để lưu giữ hình ảnh nhận dạng nhằm xác định các trường
hợp tái phạm. Ông còn đo đạc một số chỉ số sinh học như chiều cao cơ thể, chiều
dài các chi, chiều dài và chiều rộng của đầu, vòng ngực…Thông qua phương pháp
Bertillon đã giúp cho cảnh sát Pháp xác định chính xác các trường hợp tái phạm
đồng thời truy tìm tung tích tội phạm bỏ trốn khỏi nơi giam giữ hoặc giúp cho việc
quản lý các trường hợp đã từng gây án. Thời bấy giờ, phương pháp này được nhiều
nước châu Âu áp dụng và thu được nhiều kết quả [15].

5. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
5
1.1.1.2. Phương pháp vẽ lại đối tượng qua mô tả
Đây là phương pháp thể hiện một hình hình ảnh chân dung của đối tượng nào
đó bằng cách vẽ lại thông qua lời kể của nhân chứng. Quá trình nhận dạng này tốn
rất nhiều thời gian và công sức. Mặt khác để làm được điều đó những nhà chuyên
môn cần phải có cả trình độ về mặt hình thái và trình độ về mặt mỹ thuật để có thể
thể hiện hình thái khuôn mặt một cách gần giống nhất với khuôn mặt của đối tượng
qua mô tả. Phương pháp này phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố chủ quan của người mô
tả cũng như trình độ thể hiện của người vẽ. Thông thường phương pháp vẽ lại đối
tượng qua mô tả phải chỉnh sửa rất nhiều lần và rất khó để thực hiện các nét chi tiết
phức tạp do trình độ mô tả và cách thể hiện nét vẽ. Phương pháp này đã được W.
Arnolt tiến hành và trình bày khá chi tiết trong cuốn “Hình ảnh tội phạm qua nhân
chứng”.
1.1.1.3. Phương pháp ghép ảnh
* Phương pháp ghép ảnh Identikit
Nhằm khắc phục nhược điểm của việc vẽ lại chân dung đối tượng qua mô tả,
Rolf Friedermann đưa ra một phương pháp khác mang tên là phương pháp “Ghép
ảnh Identikit”. Nội dung của phương pháp này là thành lập album có sẵn gồm các
mẫu vẽ về khuôn mặt, kiểu trán, kiểu mắt, kiểu lông mày, miệng, cằm, tai, kiểu
tóc…Mỗi ảnh được vẽ trên một tờ giấy bóng kính với các kích thước và vị trí xác
định, được phân loại và đánh dấu theo ký hiệu. Qua mô tả của nạn nhân và nhân
chứng, các chuyên gia bắt đầu tìm trong album những loại hình phù hợp rồi ghép
chúng lại với nhau để thành khuôn mặt hoàn chỉnh. Thứ tự ghép các phần theo trật
tự nhất định ban đầu là khuôn mặt, rồi kiểu tóc, tiếp đến các phần khác của khuôn
mặt như lông mày, mắt, mũi, môi…
* Phương pháp ghép ảnh Photofit
Phương pháp này được áp dụng bởi cảnh sát Anh, Mỹ, Canada vào những
năm 70 của thế kỷ XX. Nội dung của phương pháp này là: Các chuyên gia hình sự
tiến hành chụp ảnh của một lượng lớn ảnh chân dung ở tư thế thẳng, sau đó chọn lọc

6. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
6
các loại hình khuôn mặt và các bộ phận trên khuôn mặt đại diện cho các kiểu theo
phân loại. Đặc điểm khuôn mặt bao gồm các phần như sau:
1. Hình dạng khuôn mặt chung khi nhìn thẳng gồm: Hình vuông, hình
thang, hình tròn, hình oval, hình thoi, hình tam giác.
2. Hình dạng trán: Trán thấp, trán cao, trán rộng, trán hẹp, trán trung bình.
3. Hình mắt: Hình oval, hình tròn, hình bán nguyệt, hình tam giác, hình khe.
4. Chiều hướng của mắt: xiên trong, xiên ngoài, nằm ngang.
5. Dạng mắt: một mí, hai mí
6. Hình mũi: Mũi to, nhỏ, trung bình; Đầu mũi chúc xuống, đầu mũi ngang,
đầu mũi hếch.
7. Môi và miệng: miệng rộng, miệng nhỏ, trung bình; Môi mím, môi hở,
môi trễ; Hai môi dày, hai môi mỏng, dày mỏng môi trên hoặc môi dưới.
8. Hình dạng cằm: Cằm tròn, vuông, nhọn, oval.
Các phần này được phân loại chi tiết hơn nữa và được đánh dấu theo ký hiệu
riêng. Thông qua mô tả của nhân chứng và nạn nhân, các chuyên gia tiến hành chọn
các phần tương ứng và ghép thành một ảnh phù hợp.
* Phương pháp ghép ảnh bằng đồ họa vi tính
Nhờ có tiến bộ về công nghệ thông tin và việc áp dụng kỹ thuật số hóa trong
hình sự, cảnh sát nhiều nước trên thế giới đã áp dụng thành tựu này vào công tác
nhận dạng hình thái người. Các đặc điểm đầu mặt được phân loại theo từng nhóm
một cách chi tiết, được mã hóa và lưu trữ dưới dạng cở sở dữ liệu. Phần mềm nhận
dạng được viết thành chương trình riêng rất đơn giản trong thao tác và dễ dàng sử
dụng.
Phương pháp này cũng dựa trên nguyên lý ghép ảnh. Hình thái khuôn mặt
được chia thành các phần tương tự như những phương pháp nêu trên, chỉ khác là
được nhập vào máy tính: Dạng khuôn mặt, trán, tóc, mắt, lông mày, mũi, cằm
miệng nhưng chi tiết hơn nhiều và sự chi tiết này được nhận biết bằng hệ thống xử
lý dữ liệu vi tính. Phương pháp này có nhiều ưu điểm nên ngày nay nó đã thay thế
hoàn toàn phương pháp thủ công trước đây.

7. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
7
1.1.1.4. Phương pháp phục chế khuôn mặt từ xương hộp sọ
Đây là một phương pháp có ý nghĩa rất quan trọng trong việc phục chế lại
hình ảnh khuôn mặt của người trước lúc chết giúp cho các nhà khoa học có thể xác
định được tung tích nạn nhân. Ngoài việc phục chế ảnh chân dung nạn nhân, xương
hộp sọ còn có thể cho ta biết các thông tin như độ tuổi, giới tính, chủng
tộc…Phương pháp phục chế khuôn mặt từ xương hộp sọ lần đầu tiên được sử dụng
trong khảo cổ đó là tái tạo khuôn mặt từ sọ người cổ đại Neanderthal và Cro-
Magnon, tiếp đó là tái tạo khuôn mặt của các xương sọ người đã hóa thạch. Ở Việt
Nam một số tác giả cũng đã nghiên cứu các đặc điểm nhân trắc trên người Việt như
P.Huard và Đỗ Xuân Hợp [15], Nguyễn Quang Quyền, Nguyễn Đình Khoa [5], Lê
Hữu Hưng [15], Vũ Xuân Khôi [7]…Gần đây Nguyễn Việt Vùng đã nghiên cứu
một số lượng lớn đặc điểm nhân trắc bằng đo đạc và mô tả trên 5.957 người Việt
Nam (trong đó 3.428 nam và 2.529 nữ) ứng dụng trong công tác nhận dạng pháp y.
Những nghiên cứu này đóng góp nhiều cho công tác nhận dạng cá thể từ hộp sọ.
Thông qua các đặc điểm này giúp cho giám định viên sàng lọc được những thông
tin cần thiết trong giám định. Phương pháp này bao gồm:
* Phương pháp nặn tượng
Phương pháp nặn tượng hay còn gọi là phương pháp đắp mặt trên nền xương
sọ do Geraximov tiến hành vào năm 1955. Giám định viên thông qua đặc điểm hình
thái xương sọ, đặc biệt là sọ mặt, các chỉ số, các mối tương quan giữa xương sọ và
phần mềm mà phục chế lại khuôn mặt trên nền xương sọ và xương mặt bằng các
chất liệu như đất sét, thạch cao, matit…Phương pháp này không chỉ được áp dụng
trong hình sự mà nó còn được áp dụng trong khảo cổ bởi vì nó giúp chúng ta phục
chế lại hình ảnh khuôn mặt của người hiện đại và cả khuôn mặt của những xương sọ
cổ đại.
* Phương pháp lồng phim
Căn cứ vào mối tương quan giữa phần mềm và sọ mặt, các chỉ số sọ,
mặt…các chuyên gia hình sự pháp y sẽ định hướng hình ảnh của một khuôn mặt

8. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
8
tương ứng với một hộp sọ. Dựa vào các đặc điểm này người ta đã đưa ra phương
pháp nhận dạng hộp sọ qua lồng phim, các bước tiến hành như sau:
Sử dụng một ảnh chân dung rõ nét nhất và phóng to lên. Sau đó đánh dấu các
điểm mốc tương ứng trên xương sọ mặt như lông mày tương ứng là cung mày của
sọ mặt, khóe ngoài của mắt tương ứng với góc ngoài ổ mắt, nhân trung, ụ trán, gò
má, điểm giữa cằm, góc hàm…Sau đó chụp lại ảnh bằng phim âm bản với một
khoảng cách nhất định nhưng độ mở ống kính khác nhau. Rồi rửa trên các tấm phim
có kích thước khác nhau 10x15cm, 12x18cm, 20x30cm…Trong trường hợp nạn
nhân có nhiều ảnh ở các tư thế khác nhau có thể tiến hành chụp nhiều ảnh để tăng
hiệu quả nhận dạng.
Đối với xương sọ, người ta cũng đánh dấu các vị trí tương ứng như trên rồi
đặt sọ phù hợp với tư thế ảnh chụp. Tiến hành chụp ảnh sọ trên phim âm bản với
cùng khoảng cách và độ mở ống kính khác nhau như với ảnh chân dung, rồi rửa
phim giống như trên. Sau khi thu được một loạt các phim với các kích cỡ khác nhau
của ảnh chân dung nạn nhân và hộp sọ, tiến hành lồng các phim với nhau theo các
mốc đã đánh dấu.
* Phương pháp nhận dạng bằng lồng ảnh qua gương bán mạ
Đây là phương pháp nhận dạng được sử dụng trong trường hợp xương sọ còn
nguyên vẹn và người mất tích có ảnh chân dung. Đây là phương pháp áp dụng có
nhiều điểm thuận lợi như so sánh đối chiếu trực tiếp, lồng ảnh và xương sọ khá dễ
dàng do việc điều chỉnh kích thước và tư thế của sọ theo ảnh chân dung [15].
Phương pháp này được tiến hành như sau:
1. Dùng ảnh chân dung phóng to lên kích thước 20x30cm, dán ảnh lên một
chiếc giá đỡ có thể quay và di chuyển lên xuống.
2. Đặt xương sọ vào một chiếc giá đỡ đặc biệt có trục quay ở các góc độ và
di chuyển cao thấp.
3. Đặt một máy ảnh thẳng trục với xương sọ và nhìn xương sọ qua gương
bán mạ

9. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
9
4. Đặt một gương phẳng hướng nhìn ảnh chân dung và phản chiếu lên
gương bán mạ.
Tiến hành đánh dấu các điểm trên xương hộp sọ: Nhân trung, lỗ ống tai
ngoài, cung mày, hai hốc mũi, góc xương hàm…Điều chỉnh xương sọ và ảnh chân
dung sao cho các điểm đánh dấu trùng khớp với nhau giữa ảnh và xương sọ bằng
cách quan sát gương bán mạ. Điểm chú ý cần quan tâm là hệ thống đèn chiếu phải
phù hợp sao cho nổi bật hình ảnh chân dung và xương sọ. Đồng thời sử dụng một
máy ảnh đặt thẳng hướng và nhìn thấy xương sọ qua gương bán mạ để có thể chụp
được những hình ảnh lồng ghép.
* Phương pháp phục chế khuôn mặt từ hộp sọ bằng kỹ thuật vi tính
Công nghệ thông tin đã và đang hỗ trợ rất đắc lực trong hầu hết các lĩnh vực
của khoa học và đời sống xã hội trong đó có khoa học nhận dạng. Từ những năm
cuối thập niên 80 của thế kỷ XX, việc ứng dụng công nghệ thông tin nhằm phục chế
khuôn mặt từ hộp sọ đã được tiến hành. Trước khi đưa vào phục chế, các giám định
viên phải xác định tuổi, giới tính, chủng tộc, nghiên cứu các mốc tương quan, các
chỉ số phần mềm trên khuôn mặt của một lớp cá thể đặc trưng quần thể, phân loại
theo tứng lớp, lưu trữ trong máy tính, xây dựng phần mềm chuyên dụng…
Ứng dụng công nghệ này cảnh sát Úc đã sử dụng hệ thống nhận dạng tự
động có tên F.A.C.E.S (Facial Automated Composition And Editing System) để
phục chế lại hình ảnh khuôn mặt hoàn chỉnh một cách rất nhanh chóng và chính xác
đáp ứng tốt yêu cầu nhận dạng hình sự. Cảnh sát Canada sử dụng hệ thống nhận
dạng có tên C.A.R.E.S (Computer Assisted Recovery Enhancement System) cũng
đem lại kết quả rất khả quan [15]. Hiện nay trên thế giới có rất nhiều nước đã mua
các phần mềm nhận dạng F.A.C.E.S với các phiên bản mới được nâng cấp làm tăng
khả năng nhận dạng và đơn giản hóa trong sử dụng.
1.1.2. Phương pháp nhận dạng qua răng
Nguyên lý của phương pháp này dựa trên sự so sánh đối chiếu các đặc điểm
răng của cá thể được lưu giữ trong hồ sơ sức khỏe với đặc điểm răng hiện tại của
người cần nhận dạng hoặc với các nạn nhân đã chết dựa trên số lượng các răng, tình

10. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
10
trạng của răng: sâu, hàn răng, các đặc điểm đặc biệt khác như răng khểnh, răng mọc
lệch, răng bị gãy… để nhận dạng. Giá trị truy nguyên của phương pháp này rất cao,
tuy nhiên yêu cầu phải có hồ sơ răng lưu trữ - điều này không dễ thực hiện nếu
không có ý thức thu thập và lưu giữ hồ sơ của từng cá thể vì những đặc điểm này rất
dễ bỏ qua. Phương pháp này đã được ủy ban giám định hỗn hợp Việt Mỹ tiến hành
thường xuyên trong giám định MIA tại Việt Nam và đem lại kết quả rất cao.
1.1.3. Nhận dạng bằng vân da
Đường vân da bàn tay xuất hiện sớm trong thời kỳ phôi thai. Ở người, đường
vân đầu tiên hình thành từ tháng thứ 3 của quá trình phát triển phôi thai, nhưng vào
khoảng tuần thứ 17-18 đường vân mới xuất hiện đầy đủ. Sự hình thành đường vân
liên quan đến các u nệm lòng bàn. U nệm lòng bàn là nơi lòng bàn tay dày lên bởi tổ
chức liên kết và mô mỡ dưới da. Nệm bắt đầu xuất hiện ở đầu ngón tay ở tuần thứ
6-7 của thời kỳ phát triển phôi. Trên bàn tay có 11 nệm lòng bàn chia thành 3 nhóm:
5 nệm đầu ngón tay, 4 nệm gian ngón, 2 nệm lớn ở vùng ô mô cái và ô mô út [8,
29]. Những nệm này không phát triển một lúc trong quá trình phôi thai. Các nệm
gian ngón II, III, IV hình thành đầu tiên và nổi rõ, rồi đến nệm gian ngón I, tiếp đó
là các nệm ô mô cái và ô mô út hình thành, các ngón tay dài dần và xuất hiện nệm
đầu ngón tay theo trình tự từ ngón cái đến ngón út. Chúng phát triển nhanh thành
những u tròn và choán hết cả phần đầu ngón (đốt 3). Sau đó nệm giảm dần kích
thước một cách tương đối so với kích thước lòng bàn, có trường hợp nó thoái hóa
gần như không còn thấy dấu tích vào tháng thứ 6. Đường vân hình thành khắp lòng
bàn tay và trên các nệm vẽ lên những hình đặc biệt gọi là hoa vân [8].

11. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
11
Hình 1.1. Vân da đầu ngón tay
Một số tác giả D.A.Dell và CS [8, 29]; S.Kimura và CS cho rằng vân da có
đặc tính không thay đổi về hình dạng, chỉ tăng về kích thước theo kích thước phát
triển của bàn tay trong suốt đời sống của cá thể. Vân da được quy định không phải
do một gen mà do một hệ đa gen di truyền. Mặt khác, vân da được hình thành trong
quá trình phát triển đời sống cá thể là kết quả của sự kết hợp các yếu tố đa gen di
truyền và không di truyền trong quá trình phát triển của bào thai. Vì vậy, ngay cả
hai anh em sinh đôi cùng trứng cũng có thể khác nhau. Điều này không gặp trong
xét nghiệm DNA bởi vì hai anh em sinh đôi cùng trứng có cấu trúc di truyền giống
hệt nhau. Căn cứ vào đặc điểm đặc trưng về các dạng (kiểu) di truyền dấu vân da
(như số lượng xác định đường vân và các chi tiết rất nhỏ về đường vân được phân
tích…) mà người ta ứng dụng trong nhận dạng, giám định hình sự.
Trải qua lịch sử hàng nghìn năm cho đến ngày nay đã chứng minh vị trí quan
trọng của vân da trong nhận dạng cá thể. Ngay từ thế kỷ thứ VII, người Trung Hoa
đã biết dùng ngón tay điểm chỉ vào các văn kiện mang tính chất hành chính, điều đó
chứng tỏ rằng lúc đó người ta đã nhận thức được sự khác biệt giữa các dấu vân tay
của mỗi người. Tuy nhiên, việc nghiên cứu dấu tay một cách khoa học thì mãi đến
cuối thế kỷ thứ XIX mới được thực hiện một cách nghiêm túc [10, 11, 12]. Vân da
được mô tả một cách có hệ thống đầu tiên vào đầu những năm 1900, nó được xem
là một trong những đặc tính không biến đổi của mỗi cá thể. Năm 1987, một viên

12. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
12
chức người Anh làm việc tại Ấn Độ đã lấy dấu vân tay của nhiều người thuộc các
thành phần xã hội khác nhau và đã phát hiện được những trường hợp man trá. Năm
1889, Hăng-Ri-Phon, một bác sỹ người Anh đã nghiên cứu dấu vân tay của nhiều
người và đi đến kết luận: “Dấu tay không có sự thay đổi trong suốt cuộc đời con
người” [10, 11]. Đến cuối thế kỷ thứ XIX, những nghiên cứu của Galton với hai
cuốn sách “Về các dấu tay” và “Cách sắp xếp và sử dụng dấu tay” [8] đã khẳng định
vị trí khoa học của vân tay với tư cách là một khoa học hình thái và vân tay học
trong vòng hàng trăm năm qua đã là trợ thủ đắc lực của ngành hình sự trên toàn thế
giới.
Ngày nay mọi người đều quen với khái niệm nhận dạng cá thể bằng vân da
và thừa nhận khả năng nhận dạng của chúng. Trong số các kỹ thuật nhận dạng các
cá thể, vân da thường được áp dụng rất có hiệu quả. Đây là phương pháp mà tất cả
các cơ quan cảnh sát hình sự trên thế giới cũng như ở Việt Nam vẫn đang sử dụng
[3]. Tính đa dạng của con người thể hiện một phần qua những vân tay riêng, cho
phép xác định từng người một cách chính xác. Trong lĩnh vực hình sự, việc nhận
dạng và xác định chính xác cá thể trở nên dễ dàng khi khi chúng ta có đầy đủ dấu
vân da của tất cả mười ngón tay và ngón chân. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có
những nhược điểm của nó là mất rất nhiều thời gian do phải tìm ra một người trong
hệ thống lưu giữ hàng triệu cá thể.
Ở Việt Nam, năm 1996 Bộ Công an đã nhập hệ thống nhận dạng vân da
“Morpho VAFIS” của Pháp, đến năm 2005 sản phẩm công nghệ nhận dạng dấu vân
da của Tổng cục kỹ thuật – Bộ Công an nghiên cứu và phát triển mang tên C@FRIS
ra đời đã thực sự giúp cho công việc so sánh vân da trở nên nhanh chóng và dễ dàng
hơn. Tốc độ tra cứu vân tay 10 ngón của một đối tượng chỉ mất khoảng 30 giây [3].
1.1.4. Nhận dạng cá thể bằng các yếu tố di truyền có bản chất Protein
Với dấu vết máu tìm thấy trên hiện trường vụ án thì điều quan trọng nhất
phải trả lời đó là vết máu của hung thủ hay của nạn nhân. Nếu dấu vết được tìm
thấy trên kẻ tình nghi thì điều quan trọng phải xác định đó có phải là máu của nạn
nhân không và dấu vết máu trên người nạn nhân có phải từ kẻ tình nghi hay không.
Vì vậy, trong xét nghiệm dấu vết sinh học phải tìm ra sự phù hợp giữa bằng chứng

13. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
13
ở hiện trường vụ án với một người trong nhóm đối tượng tình nghi. Sự phù hợp sinh
học giữa mẫu sinh phẩm ở hiện trường vụ án và mẫu sinh phẩm lấy của đối tượng
tình nghi sẽ thiết lập một mối quan hệ thông qua việc xác định những đặc điểm di
truyền nổi bật về mặt sinh học giữa người này và người khác trong quần thể.
1.1.4.1. Xác định nhóm máu
Xác định nhóm máu thông thường trong lĩnh vực hình sự được sử dụng để
trả lời phần lớn các câu hỏi thường gặp trong giám định các mẫu sinh học, đó là
mẫu máu này thuộc về ai trong số đối tượng nghi ngờ? Việc ứng dụng hệ thống
nhóm máu trong nhận dạng cá thể dựa trên sự khác biệt về hệ thống nhóm máu giữa
cá thể này so với cá thể khác. Năm 1900, Landsteiner đã phát hiện ra hệ thống
nhóm máu ABO. Đây là hệ thống nhóm máu cơ bản nhất trong lĩnh vực xét nghiệm
nhận dạng dấu vết sinh học.
Trên cơ sở phân tích hiện tượng ngưng kết của máu người khi trộn lẫn với
nhau, người ta đã xác định được sự tồn tại của các nhóm chất đặc hiệu trên màng
hồng cầu (ngưng kết nguyên) và những ngưng kết tố (agglutinin) nằm ở huyết thanh
của những người có nhóm máu khác nhau. Trong hệ nhóm máu ABO, có bốn kiểu
hình là A, B, O và AB. Trong huyết thanh của người mang nhóm máu A có ngưng
kết tố là β – làm ngưng kết hồng cầu nhóm B và ngược lại, ngưng kết tố nằm trong
huyết thanh của người mang nhóm máu B là α – làm ngưng kết hồng cầu nhóm máu
A. Những người mang nhóm máu O, trong huyết thanh của họ có cả hai loại ngưng
kết tố α và β làm ngưng kết cả hồng cầu nhóm A và hồng cầu nhóm B. Còn những
người mang nhóm máu AB, trong huyết thanh của họ không có ngưng kết tố [18,
20].
Kháng nguyên nhóm máu A, B hay O đó là những hợp chất đặc hiệu
glycoprotein tồn tại trên màng hồng cầu. Người ta cũng nhận thấy rằng di truyền
nhóm máu hệ ABO mang tính độc lập và không bị ảnh hưởng bởi môi trường. Gen
quy định nhóm máu ở người được truyền từ cha mẹ sang con ngay từ khi hình thành
hợp tử và nó bền vững trong suốt cả cuộc đời. Tỷ lệ xuất hiện mỗi nhóm máu trong
các quần thể khác nhau là khác nhau. Ví dụ người Anh ở Luân Đôn, tỷ lệ nhóm máu
O chiếm 44.4%, nhóm A chiếm 42.8%, nhóm B chiếm 9.6% và nhóm AB chiếm

14. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
14
3.2%. Người Bắc Kinh, Trung Quốc nhóm máu O chiếm 30.7%, nhóm A chiếm
25.1%, nhóm B chiếm 34.2% và nhóm AB chiếm 10% [18].
Sau khi phát hiện ra hệ nhóm máu ABO, các nhà khoa học còn tìm được
nhiều hệ nhóm máu khác như Rh, MN, Lewis, Duffy, hệ thống P… Các yếu tố di
truyền này được sử dụng trong xác định quan hệ huyết thống với 15 đến 17 chỉ tiêu
về máu hoặc trong hình sự nhằm phân tích loại trừ các cá thể liên quan giúp ích rất
nhiều trong công tác điều tra, phá án, xác định tội phạm trong một thời gian dài và
cho đến tận ngày nay.
1.1.4.2. Xác định một số nhóm protein trong huyết thanh
Sau khi phát hiện ra nhóm máu ABO, các nhóm máu khác cũng lần lượt
được tìm ra. Người ta cũng biết rằng yếu tố nhóm máu không chỉ có trong huyết
thanh mà còn có trong các tế bào khác của cơ thể và có trong dịch thể như nước bọt,
tinh dịch…và qua đó đã cho chúng ta những khái niệm rộng hơn về sự khác biệt cá
thể có tính di truyền nằm trong huyết thanh, trên tế bào máu (hồng cầu), trên các tế
bào trong các cơ quan và trong các chất tiết.
Trong số những protein trong huyết thanh của người, có một số loại từ lâu
người ta vẫn coi là giống nhau ở mọi cá thể. Nhưng từ sau năm 1955, nhờ sử dụng
kỹ thuật điện di trên gel tinh bột, Smithies đã mở rộng thêm khái niệm về nhóm đối
với protein trong huyết thanh. Bằng phương pháp điện di của Smithies, người ta đã
phát hiện ra rằng có những loại protein biểu hiện dưới cấu trúc đa dạng trong cùng
một loài, đặc tính này cho phép phân loại các cá thể theo những nhóm huyết thanh
khác nhau. Những marker nhóm huyết thanh đã được phát hiện bằng điện di trên gel
tinh bột đó là hệ thống haptoglobin (Hp), hệ thống transferrin, hệ thống α2 globulin,
hệ thống Group Specific.
Bên cạnh các nhóm huyết thanh được phát hiện bằng kỹ thuật điện di còn có
những hệ thống nhóm huyết thanh khác được phát hiện bằng kỹ thuật kết tủa trên
thạch với huyết thanh miễn dịch đặc hiệu như hệ thống nhóm γ-globulin, hệ thống
nhóm β-lipoprotein… Hệ thống nhóm máu cũng như hệ thống các marker enzyme
và protein được tìm ra đã trở thành công cụ hữu ích cho công tác nhận dạng dấu vết
sinh học.

15. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
15
1.1.4.3. Xác định nhóm enzyme
Enzyme có trong mọi tế bào sống, có bản chất protein, xúc tác cho hầu hết
các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, nó còn được gọi là chất xúc tác sinh
học. Những thành tựu đạt được trong nghiên cứu về enzyme đã cho phép người ta
xác định được tính đa hình của chúng và nhận thấy enzyme đa hình không những có
vai trò lớn trong chẩn đoán và điều trị bệnh tật mà nó còn có giá trị trong nhận dạng.
Các enzyme có giá trị trong nhận dạng có thể kể đến như: Gen mã hóa cho
phosphatase acid trên màng hồng cầu gồm 3 alen khác nhau với số cá thể dị hợp tử
chiếm tới 98%, hay các enzyme như adenylate kinase (AK), lactatdehydrogenase, 6-
phosphoglucomutase (PGM) cũng là những enzyme được sử dụng thông qua kỹ
thuật điện di để xác định cá thể. Cũng giống như hệ thống nhóm máu hay hệ thống
protein huyết thanh, các enzyme cũng có tần suất phân bố nhất định trong quần thể.
Những tần suất này mang tính đặc trưng quần thể.
1.2. DNA trong nhận dạng pháp y, khoa học hình sự
Vai trò của DNA (vật chất di truyền) được ứng dụng ngày một nhiều trên các
lĩnh vực trong đó có điều tra hình sự, giám định pháp y. DNA đã thực sự là công cụ
không thể thiếu được trong điều tra phá án. Ứng dụng cụ thể của nó trong việc truy
nguyên thủ phạm của một vụ án thông qua các dấu vết thu được ở hiện trường, nhận
dạng nạn nhân trong mất tích, thảm họa hay xác định mối quan hệ huyết thống…
Các phòng thí nghiệm sử dụng kỹ thuật DNA trong nhận dạng đều thông qua các
đặc điểm đặc trưng của DNA như tính đa hình về chiều dài của các đoạn DNA nhân
hay tính đa hình về trình tự D-loop của DNA ty thể.
1.2.1. Cơ sở khoa học của phân tích DNA nhân trong nhận dạng cá thể
Người đầu tiên đặt nền móng cho ngành di truyền học là Mendel. Ông là
người đầu tiên phát hiện ra các quy luật di truyền. Mendel đã gọi những đặc điểm
được truyền từ thế hệ này qua thế hệ khác là “nhân tố di truyền”, mà sau này được
gọi là gen. Các công bố của ông thể hiện ở bài viết “Các thí nghiệm lai ở thực vật”
năm 1865. Ngược với những quan điểm trước đây, người ta cho rằng các đặc điểm
của bố mẹ hòa lẫn với nhau ở đời con [4].

16. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
16
Đối với tế bào của người, DNA nằm trên những nhiễm sắc thể trong nhân
(gọi là DNA nhân). Bộ gen của con nguời có 23 cặp NST trong đó có 22 cặp NST
thường và 1 cặp NST giới tính. Nam giới có cặp NST giới tính XY liên kết với
nhau, còn ở nữ giới là XX. Xét nghiệm nhận dạng cá thể người chủ yếu được thực
hiện bằng cách sử dụng các marker DNA nằm trên các NST trong nhân tế bào và
trên NST Y (di truyền theo dòng cha). Còn xác định giới tính bằng cách sử dụng các
marker trên NST giới tính. Các gen trên DNA trong cặp NST quy định các tính
trạng khác nhau của cơ thể. Nó được duy trì trong mỗi thế hệ và được di truyền từ
thế hệ này sang thế hệ khác. Con cái bao giờ cũng thừa hưởng các đặc tính di truyền
thông qua 23 NST từ tinh trùng của bố và 23 NST từ tế bào trứng của mẹ [25, 26].
Đó là cơ sở để xác định quan hệ huyết thống ở người.
Ngày nay, các nhà khoa học đã tìm thấy sự khác biệt trên phân tử DNA dùng
để phân biệt người này với người khác (xác định đặc trưng cá thể). Phương pháp
“dấu ấn điểm chỉ DNA” (DNA fingerprinting) đầu tiên được phát triển bởi Alec
Jeffreys, ông đã tiến hành kiểm tra rất nhiều vùng DNA của bộ gen người cùng một
lúc. Kết quả thu được là dạng DNA có rất nhiều băng. Sự phức tạp và đa dạng của
nó làm người ta liên tưởng đến một dấu ấn điểm chỉ và nó chỉ có thể duy nhất đối
với một cá thể (trừ hai anh em sinh đôi cùng trứng). Vì tính phức tạp của các băng
DNA, người ta đã quyết định chỉ tiến hành xét nghiệm theo các vùng (locus) di
truyền nhất định.
1.2.2. Đa hình trong trình tự DNA
Trình tự DNA có hai loại đa hình [2, 25, 27]:
* Đa hình theo trình tự: Các gốc nucleotide trong đoạn DNA được sắp xếp
một cách ngẫu nhiên không theo quy luật.
Ví dụ: tại locus A ta có trình tự:
Ở cá thể thứ nhất: - AGACTGCTAG -
Ở cá thể thứ hai: - AGCCTGCGAG -
Tại vị trí số 3 và vị trí số 8 của hai cá thể có sự khác nhau.
* Đa hình theo chiều dài:

17. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
17
- Đa hình theo chiều dài do khác nhau số lần lặp lại: Một số gốc nucleotide
được lặp đi lặp lại nhiều lần trên chiều dài của đoạn DNA (Variable number tandem
repeat – VNTRs). Ví dụ:
Cá thể thứ nhất: - ATAT ATAT ATAT - à 3 đoạn lặp ATAT.
Cá thể thứ hai: - ATAT ATAT ATAT ATAT - à 4 đoạn lặp ATAT.
- Đa hình theo chiều dài do khác nhau vị trí cắt bởi enzyme giới hạn
(Restriction fragment length polymorphism – RFLP): Các enzyme giới hạn cắt
DNA tại các vị trí nhận biết đặc trưng nhất định. Các vị trí này là các trình tự
nucleotide đặc trưng, thường từ 4 – 8 nucleotide. Điểm đặc biệt của trình tự nhận
biết là hoàn toàn giống nhau trên hai sợi bổ sung khi chúng được đọc theo chiều 5’-
3’. Việc cắt bằng các enzyme giới hạn tạo ra các đoạn dài ngắn khác nhau và được
phân tích thông qua kỹ thuật RFLP.
Những trạng thái khác nhau của mỗi gen hoặc mỗi locus được gọi là alen.
Mỗi cá thể lưỡng bội đều nhận được 2 alen, một alen từ bố và một alen từ mẹ. Tuy
nhiên, trong quá trình hình thành và phát triển của loài và cá thể, sự biến đổi trình tự
nucleotide trên sợi kép DNA đã xảy ra, do vậy đối với mỗi locus gen người ta đã
xác định được rất nhiều alen [4, 9, 21, 22, 23]. Công thức chung để tính số lượng
kiểu gen trong quần thể như sau:
X =
n(n+1)
2
X: số kiểu gen có trong quần thể; n: số lượng alen của locus.
Đối với locus có 10 alen, số lượng kiểu gen của các cá thể theo lý thuyết là:
10(10+1)/2 = 55. Trong đó có 10 kiểu gen đồng hợp tử và 45 kiểu gen dị hợp tử,
Tổ hợp của 2 locus gen có 7 alen và 10 alen, số lượng kiểu gen thu được là:
- Locus 7 alen, số kiểu gen: X1 = 7x8/2 = 28
- Locus 10 alen, số kiểu gen: X2 = 10x11/2 = 55
- Tổ hợp 2 locus X1 x X2 = 28 x 55 = 1540 kiểu gen.
Theo cách tính toán như trên, tổ hợp của 10 locus, khả năng hàng tỷ cá thể
mới có hai cá thể có kiểu gen giống nhau. Chính cơ sở của sự khác nhau trong trình

18. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
18
tự nucleotide của các alen trong cùng locus của các phân tử DNA trên các NST là
cơ sở cho giám định gen hình sự để truy nguyên cá thể và giám định huyết thống.
1.2.3. Phương pháp phân tích DNA trong nhận dạng pháp y
1.2.3.1. Phương pháp lai DNA – DNA
Đây là phương pháp mà đoạn DNA trong mẫu xét nghiệm có thể được nhận
biết bằng đoạn DNA nhân tạo gọi là đầu dò DNA (DNA probe) có trình tự bổ sung.
Thông thường đoạn đầu dò có chiều dài 30-100bp. DNA sợi kép của mẫu cần xét
nghiệm được biến tính thành hai sợi đơn bằng nhiệt hoặc kiềm – liên kết hydro bị
đứt nhưng các liên kết phosphodiester của khung DNA không bị ảnh hưởng. Mẫu
sau khi biến tính được làm lạnh nhanh để phân tử DNA không hồi tính mà vẫn giữ ở
trạng thái sợi đơn. DNA này được gắn vào màng (màng nitrocellulose hoặc nylon) ở
nhiệt độ cao. Sau đó, mẫu được ủ với đầu dò DNA đã biết trình tự và được đánh dấu
phóng xạ hoặc huỳnh quang. Nếu trình tự nucleotide của DNA của mẫu cần xét
nghiệm bổ sung với trình tự của đầu dò thì chúng sẽ liên kết với nhau. Sản phẩm lai
có thể được phát hiện bằng máy chụp X – quang hoặc có thể nhìn thấy trực tiếp qua
film [1, 2, 25].
1.2.3.2. Phương pháp RFLP
Những nghiên cứu trong lĩnh vực di truyền cá thể đã chứng minh rằng, phân
tử DNA có các đoạn trình tự nucleotide mang tính đặc trưng cá thể. Khi sử dụng
enzyme giới hạn cắt DNA của từng cá thể thành những đoạn có kích thước phân tử
nhỏ hơn, sau đó so sánh chúng với nhau trên gel điện di người ta thấy rằng những cá
thể khác nhau thu được những băng dài ngắn khác nhau [23]. Sản phẩm DNA sau
điện di được chuyển lên màng nylon và lai với các đầu dò khác nhau, kết quả lai
được hiện lên trên film cho thấy những đặc trưng của mỗi cá thể khác nhau. Phương
pháp này được gọi là phân tích đa hình độ dài đoạn DNA được cắt bằng enzyme
giới hạn – RFLP.
Năm 1975, Southern E.M. [2] là người đầu tiên đã chuyển DNA từ gel lên
màng lai nitrocellulose từ đó có thể nhận biết các đoạn DNA khác nhau của bộ gen
được cắt bởi các enzyme giới hạn. Năm 1980, Wyman và White đã phát hiện ra các

19. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
19
đoạn lặp và đến những năm 1990 của thế kỷ XX người ta đã phát hiện ra trên 3000
đoạn DNA đa hình trong bộ gen của người. Một số đoạn DNA đa hình trong số đó
đã được sử dụng cho khoa học hình sự để xác định huyết thống và nhận dạng cá thể
người. Phương pháp RFLP lần đầu tiên được áp dụng thành công trong lĩnh vực
hình sự vào năm 1983 ở Anh để phân tích mẫu DNA tinh dịch của tội phạm trong
một vụ án [23].
Tuy nhiên, phương pháp này có những hạn chế khi áp dụng trong lĩnh vực
khoa học hình sự do:
1. Phương pháp RFLP đòi hỏi mẫu DNA phải nguyên vẹn với một lượng
mẫu lớn (ít nhất là 50ng)
2. Phóng xạ là một yếu tố độc hại mà không phải bất kỳ một phòng thí
nghiệm nào cũng có đủ cơ sở vật chất để tiến hành.
3. Phân tích RFLP rất phức tạp và mất nhiều thời gian (từ 4 – 8 tuần mới
đọc được kết quả của 4 locus gen VNTR khác nhau).
4. Phương pháp RFLP không phân tích được toàn bộ các alen của các locus
gen VNTR.
1.2.3.3. Các phương pháp phân tích DNA dựa trên kỹ thuật PCR
Phương pháp AFLP:
Phương pháp AFLP [2, 25] là một kỹ thuật sử dụng enzyme giới hạn cắt sản
phẩm PCR thành các đoạn dài, ngắn khác nhau, sau đó điện di trên gel agarose và
nhuộm bằng ethidium bromide, sự khác biệt về kích thước các đoạn DNA của hệ
gen được phát hiện một cách dễ dàng hơn. Phương pháp này khắc phục được nhược
điểm của phương pháp RFLP bởi vì chỉ cần một lượng DNA rất nhỏ ban đầu
(nanogram) chúng ta có thể xác định đa hình bằng cách nhân bội đoạn đó lên bằng
PCR sau đó cắt bằng các enzyme giới hạn thích hợp. Sử dụng phương pháp này,
người ta đã xác định một cách dễ dàng 6 kiểu gen trong hệ thống nhóm máu ABO
là: AA, AB, OO, AO, BO, BB [25].
Kỹ thuật giải trình tự gen: Có hai phương pháp giải trình tự gen:
- Giải trình tự theo phương pháp hóa học

20. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
20
Năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu tiên phát minh phương pháp giải trình
tự DNA theo phương pháp hóa học [2]. Nguyên lý của phương pháp dựa trên sự
biến tính DNA thành các mạch đơn và xử lý bằng các hóa chất hóa học nhằm phân
hủy đặc trưng một loại nucleotide của mạch DNA đã đánh dấu bằng đồng vị phóng
xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau một nucleotide. Sau đó,
các đoạn này được phát hiện bằng cách điện di trên gel polyacrylamide, đọc kết quả
điện di bằng máy đọc phóng xạ.
- Giải trình tự theo phương pháp enzyme
Cũng vào năm 1977, Sanger và cs đã công bố phương pháp giải trình tự
DNA khác với phương pháp của Maxam và Gilbert. Đó là phương pháp sử dụng
enzyme hay phương pháp dideoxynucleotide [2]. Đặc trưng của phương pháp này là
sử dụng dideoxynucleotide để làm ngừng tổng hợp các mạch đơn DNA một cách
ngẫu nhiên. Trong phản ứng sử dụng các thành phần như PCR bình thường nhưng
có bổ sung khoảng 1% một trong bốn loại dideoxynucleotide – ddNTP (ddATP,
ddGTP, ddCTP, ddTTP) cho mỗi loại phản ứng. Các dideoxynucleotide mất nhóm
OH ở vị trí 3’, do đó khi mạch đơn DNA đang tổng hợp được gắn một ddNTP
không có gốc oxy ở vị trí 3’ sẽ làm cho mạch DNA đang tổng hợp bị ngừng lại.
Mỗi loại phản ứng được thực hiện trong một ống riêng rẽ. Tỷ lệ giữa hàm
lượng dNTP và ddNTP làm cho quá trình tổng hợp DNA thỉnh thoảng mới có 1
ddNTP được sử dụng ngẫu nhiên, làm phản ứng tổng hợp đoạn DNA đó bị dừng lại.
Kết quả đã tạo ra các đoạn oligonucleotide hơn kém nhau 1 nucleotide và được
phát hiện trên gel polyacrylamide [2].
1.3. STR sử dụng trong nhận dạng cá thể người
1.3.1. Khái niệm các đoạn lặp và STR
Khi nghiên cứu về cấu trúc DNA, người ta phát hiện thấy nhiều gen của sinh
vật nhân chuẩn và một số sinh vật nhân sơ mang các đoạn không mã hóa xen giữa
các đoạn mã hóa. Đoạn mã hóa được gọi là exon, đoạn không mã hóa được gọi là
intron. Thông thường, các đoạn intron chứa các trình tự lặp lại. Các trình tự DNA
lặp lại này khác nhau về kích thước và mang tính đặc trưng về chiều dài các đơn vị

21. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
21
lặp lại, số lượng các đơn vị lặp lại liên tục hoặc trên toàn bộ chiều dài của vùng lặp
[2, 25]. Các trình tự lặp này được chia làm 3 loại:
1. Các trình tự lặp lại nhiều lần chiếm 10 – 15% bộ gen người. Đó là những
trình tự lặp lại có kích thước khoảng 10 – 20kb, thường tập trung ở vùng
tâm động hoặc ở đầu NST.
2. Các trình tự có số lần lặp lại trung bình chiếm khoảng 25 – 40% bộ gen
người. Chúng có kích thước lớn hơn (100 – 1000kb) và đa dạng hơn
những trình tự lặp lại nhiều lần, các trình tự này không tập trung mà phân
tán trên toàn bộ hệ gen.
3. Các trình tự duy nhất: Đó là các trình tự mã hóa cho các protein, có trình
tự đặc trưng cho từng gen.
Các đoạn DNA có cấu trúc lặp lại từ 2 – 6bp được gọi là các đoạn lặp lại
ngắn (STR). Các cấu trúc VNTR hay STR đều mang tính bảo thủ cao, được di
truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cá thể. Đó là nền tảng cho giám định
DNA hình sự. Các marker DNA STR rất đa dạng và có thể được nhân bội dễ dàng
bằng phản ứng PCR. Số lần các đoạn lặp có thể khác nhau rất nhiều giữa các cá thể
khác nhau, điều này làm cho chúng có giá trị cao trong công tác nhận dạng cá thể.
Theo nghiên cứu của Broman [21, 22] và trung tâm nghiên cứu y học Marshfield
[25] đã thu được dữ liệu kiểu gen của 8.000 STR trên khắp 23 cặp NST người với
mục đích để lập bản đồ di truyền người.
Tuy nhiên, để một locus STR được sử dụng cho mục đích nhận dạng và xác
định cá thể thì nó phải thỏa mãn những yêu cầu bắt buộc sau [22, 25, 26, 27]: Thứ
nhất, locus STR phải có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao, điều này giúp các nhà
phân tích sử dụng một hệ thống STR có thể phân biệt cá thể một cách tốt nhất. Thứ
hai, các STR có kích thước ngắn từ 100 – 500bp, do các đoạn DNA ngắn có tính
bền vững cao hơn, ít bị đứt gãy hơn khi có tác động của điều kiện tự nhiên và quá
trình nhân gen PCR có thể được thực hiện dễ dàng và hiệu quả hơn. Đối với những
đoạn DNA có tính đa hình cao nhưng kích thước lớn, trong thực tế chỉ có thể thực
hiện phản ứng PCR với những mẫu sinh phẩm còn tươi, mới hoặc được bảo quản
trong những điều kiện tốt. Thứ 3, các locus dùng trong hình sự phải có tính di

22. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
22
truyền độc lập. Như vậy chúng phải nằm trên các NST khác nhau, điều này đảm bảo
cho tính độc lập của từng locus.
Vì những lý do trên, những trình tự lặp lại chứa các đơn vị lặp lại gồm 4
nucleotide, ví dụ (AGTA)n được ứng dụng nhiều hơn so với các đoạn lặp hình thành
từ hai hoặc ba nucleotide, ví dụ (CAA)n, (CA)n hoặc những đoạn đa hình hình thành
từ các đoạn lặp chứa các đơn vị lặp lại gồm 5 nucleotide ví dụ (CCAAG)n hoặc 6
nucleotide như (CCAACA)n. Ngày nay, nhiều đoạn đa hình có trình tự lặp lại bộ 4
đã được nghiên cứu và ứng dụng trong nhận dạng do nó đáp ứng được những yêu
cầu của ngành hình sự [23].
Theo Gill và CS (1996), Carracedo và Lareu (1998) [27] các STR ứng dụng
trong nhận dạng cá thể người phải đáp ứng được những tiêu chuẩn như sau:
1. Khả năng phân biệt cao (thường lớn hơn 0,9) và các dạng dị hợp tử quan
sát được lớn hơn 70%
2. Nằm trên vùng nhiễm sắc thể riêng biệt và không lựa chọn những vị trí
liên kết gần
3. Dễ dàng nhân bội bằng phản ứng PCR
4. Đặc tính Stutter thấp
5. Chiều dài đoạn (locus) DNA được nhân bội trong khoảng 90 – 500bp, với
kích thước đoạn DNA ngắn phù hợp cho việc phân tích những mẫu sinh
phẩm bị suy giảm chất lượng thường gặp trong lĩnh vực hình sự.
1.3.2. Danh pháp đối với marker DNA
Tên các locus marker DNA được đặt theo tên của gen nếu locus này nằm một
phần hoặc nằm toàn bộ trong gen [25]. Ví dụ marker STR TH01 từ gen tyrosine
hydroxylase của người nằm trên NST số 11. Chữ “TH” xuất phát từ chữ cái đầu
tyrosine hydroxylase. Phần “01” của ký hiệu “TH01” xuất phát từ vùng intron 1
(vùng không mã hóa protein) của gen tyrosine hydroxylase. Đôi khi tiếp đầu ngữ
HUM được thêm vào đầu danh pháp của marker này để xác định đó là từ bộ gen
người (Human). Vì vậy, locus STR này sẽ được gọi chính là HUM TH01 hay TH01.
Các marker DNA mà nằm ngoài vùng gen thì được xác định bởi vị trí của
chúng trên NST. Ví dụ, STR locus D5S818 và DYS19 đó là những marker không

23. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
23
nằm trong vùng gen. Trong trường hợp này chữ D có nghĩa là DNA. Con số tiếp
theo là số thứ tự của NST. Chữ “S” thực chất là trình tự đơn lẻ của DNA marker.
Con số cuối cùng là vị trí marker nằm trên mỗi NST riêng biệt. Con số này là duy
nhất đối với marker DNA nhận dạng cá thể. Ví dụ, marker DNA D16S539 có nghĩa
là D: DNA, 16: chromosome số 16, S: single copy sequence, 539: vị trí thứ 539 xác
định trên NST số 16.
Hình 1.2. Một số locus đa hình sử dụng trong nhận dạng cá thể
Các số thứ tự 1 – 22 và các chữ cái X, Y là ký hiệu của các NST; các locus được trình bày
trên các NST tương ứng.
1.4. Các bộ kit thương mại sử dụng locus STR trong nhận dạng cá thể người
Các marker STR đầu tiên được sử dụng và phát triển trong labo của tiến sỹ
Thomas Laskey tại Đại học Y khoa Baylor và Ttrung tâm Khoa học Hình sự của
Anh (Forensic Science Service). Từ những locus này, nhiều công ty đã tiến hành
thương mại hóa các marker tiêu chuẩn đồng thời phát triển thêm một số các marker
mới. Hệ thống locus STR hình sự được chia làm bốn loại sau:
- Loại thứ nhất: Trình tự lặp lại đơn giản gồm một loại trình tự lặp, ví dụ:
TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D16S539
- Loại thứ hai: Trình tự lặp lại đơn giản nhưng số alen không thực sự đồng
nhất, ví dụ: TH01, D18S51, D7S820

24. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
24
- Loại thứ 3: Trình tự lặp lại kết hợp với các alen không đồng nhất, ví dụ:
vWA, FGA, D3S1358, D8S1179
- Loại thứ tư: Trình tự lặp lại phức tạp, ví dụ: D21S11, LPL
Năm 1993, Hãng Promega đưa ra bộ kit đầu tiên gồm 3 locus STR là
CSF1PO, TPOX, TH01 (thường được gọi là CTT) phát hiện bằng nhuộm bạc. Bộ
CTT cho xác suất trùng lặp là 1/500 song rất dễ sử dụng nên được dùng nhiều tại
Mỹ và nhiều nước khác trên thể giới.
Bộ STR phục vụ cho ngành pháp lý được đánh dấu huỳnh quang đầu tiên là:
TH01, FES/FPS, vWA và F13A01. Đây là bộ đánh dấu thế hệ thứ nhất, xác suất hai
cá thể trùng nhau khi sử dụng bốn locus này khoảng 1/10000. Bộ kit thế hệ thứ hai
gồm có 6 locus là TH01, vWA, FGA, D8S1179, D18S51 và D21S11 với xác suất
hai cá thể trùng nhau là 1/5000000. Những locus nêu trên đều sử dụng các phương
pháp huỳnh quang để phát hiện nên đòi hỏi kinh phí và trang bị tương đối lớn và
đồng bộ.
Ngày nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều công ty thương mại
đã phát triển các bộ kít nhận dạng có thể phân tích hàng chục locus trong một phản
ứng giúp cho việc nhận dạng cá thể có độ chính xác gần như tuyệt đối [25].
Bảng 1.1 Các bộ kit thương mại và các marker STR phổ biến [25]
Tên kit Hãng sản
xuất
Năm Sản
xuất
Các loci STR
TH01, TPOX, CSF1PO
Monoplexes (silver stain)
Promega 1993 TH01, TPOX, CSF1PO
AmpFlSTR®
Blue Applied
Biosystems
1996 D3S1358, VWA, FGA
AmpFlSTR®
Green I Applied
Biosystems
1997 Amelogenin, TH01, TPOX, CSF1PO
CTTv Promega 1997 CSF1PO, TPOX, TH01, VWA (vWF)
FFFL Promega 1997 F13A1, FES/FPS, F13B, LPL
GammaSTR Promega 1997 D16S539, D13S317, D7S820, D5S818
PowerPlexTM
(version 1.1 and 1.2 later)
Promega 1997
1998
CSF1PO, TPOX, TH01, VWA,
D16S539, D13S317, D7S820, D5S818
AmpFlSTR®
ProfilerTM
Applied
Biosystems
1997 D3S1358, VWA, FGA, Amelogenin,
TH01, TPOX, CSF1PO, D5S818,
D13S317, D7S820
AmpFlSTR®
Profiler Applied 1997 D3S1358, VWA, FGA, Amelogenin,

25. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
25
PlusTM
Biosystems D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818,
D13S317, D7S820
AmpFlSTR®
COfilerTM
Applied
Biosystems
1998 D3S1358, D16S539, Amelogenin,
TH01, TPOX, CSF1PO, D7S820
AmpFlSTR®
SGM PlusTM
Applied
Biosystems
1999 D3S1358, VWA, D16S539,
Amelogenin, D8S1179, D21S11,
D18S51, D19S433, TH01, FGA
PowerPlex®
2.1
(for Hitachi FMBIO users)
Promega 1999 D3S1358, TH01, D21S11, D18S51,
VWA, D8S1179, TPOX, FGA, Penta E
PowerPlex®
16 Promega 2000 CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA,
D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179,
D13S317, D16S539, D18S51, D21S11,
Penta D, Penta E, Amelogenin
PowerPlex®
16 BIO
(for Hitachi FMBIO users)
Promega 2001 CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA,
D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179,
D13S317, D16S539, D18S51, D21S11,
Penta D, Penta E, Amelogenin
AmpFlSTR®
IdentifilerTM
Applied
Biosystems
2001 CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA,
D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179,
D13S317, D16S539, D18S51, D21S11,
D2S1338, D19S433, Amelogenin
AmpFlSTR®
Profiler
PlusTM
ID
(extra unlabeled D8-R
primer)
Applied
Biosystems
2001 D3S1358, VWA, FGA, Amelogenin,
D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818,
D13S317, D7S820
PowerPlex®
ES Promega 2002 FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179,
D18S51, D21S11, SE33, Amelogenin
AmpFlSTR®
SEfilerTM
Applied
Biosystems
2002 FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179,
D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338,
D19S433, SE33, Amelogenin
Hiện nay, các bộ kit thương mại ngày càng được cải tiến cho kết quả chính
xác hơn gấp nhiều lần so với trước kia. Đồng thời quy trình phân tích và thời gian
thu nhận kết quả cũng được rút ngắn đi rất nhiều. Hai bộ kit được sử dụng phổ biến
nhất trên thế giới là PowerPlex®
16 của hãng Promega và AmpFlSTR®
IdentifilerTM
của hãng Applied Biosystems, hai bộ kit này đều nhân đồng thời 16 locus trong một
phản ứng vì vậy độ chính xác cao [41, 43].

26. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
26
Hình 1.3. Hai bộ kit sử dụng phổ biến trong nhận dạng pháp y

27. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
27
Bảng 1.2. So sánh các alen có trong một số bộ kit thương mại phổ biến [25]
Loci/Kit
Promega Corporation STR Kits Applied Biosystems AmpFlSTR Kits
PP1.1
Alleles #
PP2.1
Alleles #
PP16
Alleles #
PP ES
Alleles #
ProfilerPlus
Alleles #
COfiler
Alleles #
SGM Plus
Alleles #
Identifiler
Alleles #
SEfiler
Alleles #
CSF1PO 6-15 10 6-15 10 6-15 10 6-15 10
FGA 17-46.2 19 16-46.2 28 16-46.2 28 17-30 14 17-51.2 28 17-51.2 28 17-51.2 28
TH01 5-11 7 4-13.3 10 4-13.3 10 4-13.3 10 5-9.3,10 7 4-13.3 10 4-13.3 10 4-13.3 10
TPOX 6-13 8 6-13 8 6-13 8 6-13 8 6-13 8
VWA 10-22 13 10-22 13 10-22 13 10-22 13 11-21 11 11-24 14 11-24 14 11-24 14
D3S138 12-20 9 12-20 9 12-20 9 12-19 8 12-19 8 12-19 8 12-19 8 12-19 8
D5S818 7-15 9 7-16 10 7-16 10 7-16 10
D7S820 6-14 9 6-14 9 6-15 10 6-15 10 6-15 10
D8S1179 7-18 12 7-18 12 7-18 12 8-19 12 8-19 12 8-19 12 8-19 12
D13S317 7-15 9 7-15 9 8-15 8 8-15 8
D16S539 5.8-15 9 5.8-15 9 5.8-15 9 5.8-15 9 5.8-15 9 5.8-15 9
D18S51 8-27 22 8-27 22 8-27 22 9-26 21 7.9-27 23 7.9-27 23 7.9-27 23
D21S11 24-38 24 24-38 24 24-38 24 24.2-38 22 24-38 24 24-38 24 24-38 24
D2S1338 15-28 14 15-28 14 15-28 14
D19S433 9-17.2 15 9-17.2 15 9-17.2 15
Penta D 2.2-17 14
Penta E 5-24 20 5-24 20

28. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
28
SE33 4.2-37 35 4.2-37 35
Amelogenin X,Y 2 X,Y 2 X,Y 2 X,Y 2 X,Y 2 X,Y 2 X,Y 2 X,Y 2 X,Y 2
Total Alleles 76 137 209 155 118 54 159 205 194

29. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
29
1.5. Bộ kit nhận dạng AmpFlSTR®
Identifiler®
PCR Amplification Kit
Hiện nay, đa số các phòng thí nghiệm trên thế giới đều sử dụng bộ kít
AmpFlSTR®
Identifiler®
PCR Amplification Kit của hãng Applied Biosystems –
Mỹ cho mục đích xét nghiệm huyết thống, khoa học hình sự. Đây là bộ kit chuyên
dụng cho nhận dạng cá thể sử dụng 15 locus STR và một marker xác định giới tính
gồm có: CSF1PO, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539,
D18S51, D21S11, FGA, TH01, TPOX, VWA và 2 locus gen dạng tetranucleotide:
D2S1338 và D19S433 (13 locus gen tiêu chuẩn theo hệ thống CODIS và 2 locus
đặc trưng bổ sung: D2S1338 và D19S433) [41]. Bộ kit phân tích sử dụng kỹ thuật
huỳnh quang 5 màu, tương thích hoàn toàn với phần mềm phân tích STR chuyên
dụng GeneMapper ID, đồng thời có thể tự động hóa toàn bộ quá trình từ chuẩn bị
mẫu đến phân tích kết quả vì vậy cho kết quả phân tích chính xác và nhanh hơn rất
nhiều so với các phương pháp khác. Ở Việt Nam, các trung tâm xét nghiệm hàng
đầu như Học viện Quân Y, Viện Khoa học Hình sự… cũng đã và đang sử dụng bộ
kit này phục vụ công tác giám định gen, nhận dạng pháp y. Viện Khoa học Hình sự
cũng đang bắt đầu triển khai hệ thống robot tách chiết tự động (3 hệ thống robot của
hãng Tecan – Thụy Sỹ) kết hợp với sử dụng bộ kit Identifiler nhằm nâng cao hiệu
quả giám định gen pháp y.
Hình 1.4. Bộ kit thương mại Identifiler của hãng Applied Biosystems

30. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
30
Một bộ AmpFlSTR®
Identifiler®
PCR Amplification Kit (200 phản ứng) bao
gồm:
- AmpFlSTR PCR Reaction Mix: gồm có 2 ống MgCl2, deoxynucleotide
triphosphates, và bovine serum albumin in buffer with 0.05% sodium azide,
dung tích: 1.1 ml/tube
- AmpFlSTR Identifiler™ Primer Set: Bộ primer chuẩn gồm 01 ống dung tích
1.1 ml chứa các primer gắn huỳnh quang và các primer không gắn huỳnh
quang (fluorescently labeled primers and non-labeled primers).
- AmpliTaq Gold DNA Polymerase: Enzyme sử dụng nhân bộ DNA trong bộ
kit là 02 lọ AmpliTaq Gold DNA Polymerase với nồng độ 5 U/µl, thể tích:
50 µL/lọ
- AmpFlSTR Control DNA 9947A: 01 ống chứa 0.10 ng/µl human female cell
line DNA in 0.05% sodium azide and buffer , 0.3 ml
- AmpFlSTR Identifiler™ Allelic Ladder: Bộ thang DNA chuẩn gồm 01 ống
dung tích 50µl chứa AmpFlSTR Identifiler Allelic Ladder của các amplified
alleles.
Bảng 1.3. Vị trí các locus trên NST và Dye label tương ứng [25]
Locus Vị trí trên NST Genbank Dye label
CSF1PO 5q33.1
c-fms proto-oncogene, 6th
intron
X14720
6-FAMD8S1179 8q24.13 G08710
D21S11 21q21.1 AP000433
D7S820 7q21.11 G08616
D3S1358 3p21.31 NT_005997
VIC
TH01 11p15.5
Tyrosine hydroxylase, 1st
intron
D00269
D13S317 13q31.1 G09017
D16S539 16q24.1 G07925
D2S1338 2q35-37.1 G08202

31. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
31
D19S433 19q12-13.1 G08036
NED
VWA 12p13.31
Von Willebrand Factor, 40th
intron
M25858
TPOX 2p25.3
Thyroid peroxidase, 10th
intron
M68651
D18S51 18q21.33 L18333
D5S818 5q23.2 G08446
PET
FGA 4q31.3
Alpha fibrinogen, 3rd
intron
M64982
Amelogenin X: p22.1-22.3/ Y: p11.2
Sử dụng bộ kít AmpFlSTR®
Identifiler®
PCR Amplification Kit cho kết quả có
độ chính xác rất cao, khả năng phân biệt giữa các cá thể khác nhau được thể hiện rõ
như trong hình 1.5.
Hình 1.5. Khả năng phân biệt của các loci trong bộ kit Identifiler

32. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
32
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu DNA khuôn: Chúng tôi sử dụng mẫu DNA khuôn được tách chiết từ
nhiều nguồn khác nhau như máu, tóc, mô, niêm mạc miệng… của 402 đối tượng
thuộc dân tộc Kinh. Trong đó có 350 mẫu máu lấy vào thẻ FTA, 10 mẫu niêm mạc
miệng, 10 mẫu nước bọt, 13 mẫu móng tay, 8 mẫu tóc có chân và 21 mẫu máu tổng
số (có đối tượng lấy nhiều loại mẫu).
2.1.2. Hóa chất
Nhóm hóa chất dùng cho tách chiết DNA
Ø Chelex® 100 Resin (Bio-rad/Mỹ)
Ø PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit (P/N 4392852)
Ø QIAamp DNA Investigator Kit (50) (QIAGEN – Mỹ)
Ø FTA card và FTA purification kit
Nhóm hóa chất dùng cho PCR
Ø Đệm enzyme Taq polymerase 10X
Ø MgCl2 25mM
Ø dNTPs 5mM
Ø Taq polymerase 5U/µl
Ø Nước cất khử ion và khử trùng
Nhóm hóa chất dùng cho điện di
Ø Agarose
Ø Đệm TBE
Ø Ethidium bromide
Nhóm hóa chất dùng cho phản ứng nhân gen và phân tích gen

33. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
33
Ø AmpFℓSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit (P/N 4322288)
Ø GeneScan™ 500 LIZ® Size Standard (P/N 4322682)
Ø POP-4™ Polymer (P/N 4352755)
Ø Hi-DiTM
Formamide (P/N 4311320)
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị
Ø Máy ly tâm (Mikro 200 – Hittich/Đức)
Ø Máy PCR 9700 (ABI – Mỹ)
Ø Máy PCR iCycler (Biorad – Mỹ)
Ø Bộ điện di Agarose: Nguồn 300V, bể điện di (biorad – Mỹ)
Ø Lò vi sóng
Ø Tủ hút
Ø Buồng thao tác PCR
Ø Block gia nhiệt
Ø Máy khuấy từ
Ø Máy cất nước 2 lần
Ø Máy định lượng acid nucleic: Nanodrop
Ø Máy điện di mao quản: sequnencer 3130XL
Dụng cụ
Ø Pipet các loại
Ø Ống Eppendorf các loại
Ø Plate 96 giếng
Ø Đầu côn các loại
Ø Găng tay cao su

34. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
34
2.2. Phương pháp nghiên cứu
(1) Thu mẫu (máu, tóc, mô…)
(2) Tách chiết DNA
(3) Định lượng DNA bằng máy quang phổ, Nanodrop
(4) PCR nhân gen bằng bộ kít Indentifiler
(5) Chạy Fragment trên máy ABI 3130XL
(6) Phân tích kết quả và xử lý số liệu
Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp tách chiết DNA
2.2.1.1. Phương pháp tách DNA bằng Chelex
Chelex® 100 Resin có khả năng loại bỏ các chất ức chế kim loại mà không
làm thay đổi nồng độ các ion không kim loại của dung dịch tinh sạch. Resin được
tạo thành bởi hai polymer styrene và divinylbenzene chứa các liên kết imino vì vậy
có khả năng bám các kim loại cao. Phương pháp tách DNA bằng chelex 100 đơn
giản, cho hiệu quả cao và có thể áp dụng với nhiều đối tượng mẫu khác nhau.
Chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết DNA bằng chelex 100 để tách DNA trên
các mẫu máu thu bằng thẻ thu mẫu FTA card.
Quy trình tách chiết bằng chelex 100 như sau:
1. Cắt khoảng 3x3 mm mẫu trên thẻ FTA card cho vào ống ly tâm 1,5 ml
2. Cho 1 ml nước tinh khiết đã khử ion vào ống
3. Trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 15 – 30 phút để rửa mẫu
4. Chuẩn bị dung dịch chelex 100 5% bằng cách pha 5 g chelex vào 100 ml
nước khử ion
5. Ly tâm mẫu với tốc độ 12000 vòng/phút trong khoảng 3 phút
6. Hút loại bỏ toàn bộ dịch nổi
7. Thêm 200 µl dung dịch chelex 5% vào ống đựng mẫu
8. Ủ hỗn hợp ở 56o
C trong vòng 30 phút
9. Trộn bằng vortex trong 5 giây
10.Ủ hỗn hợp ở 100o
C trong khoảng 8 phút
11.Trộn bằng vortex trong 5 giây

35. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
35
12.Ly tâm mẫu với tốc độ 12000 vòng/phút trong 3 phút
13.Thu dịch nổi cho sang ống mới.
2.2.1.2. Phương pháp tách chiết bằng PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit
PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit là bộ kit chuyên dụng, dùng để
tách các mẫu khó thu DNA hoặc các mẫu có hàm lượng DNA thấp như mẫu tóc,
mẫu nước bọt, mẫu kẹo cao su, mẫu móng chân, móng tay…Một bộ kít hoàn chỉnh
(100 phản ứng) bao gồm các thành phần như sau [40, 42]:
PrepFiler TM
Lysis Buffer 50 ml
PrepFiler TM
Isopropanol Chai 60 ml
PrepFiler TM
Magnetic
Particles
1.5 ml
PrepFiler TM
Wash Buffer
Concentrate
2x26 ml
PrepFiler TM
Elution Buffer 12.5 ml
PrepFiler TM
Filter Columns 100
PrepFiler TM
Spin Tubes 300
Hình 2.2. Bộ kít tách DNA PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit
Quy trình tách chiết DNA bằng DNA PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit gồm
các bước cơ bản sau:
Hình 2.3. Quy trình tách chiết DNA bằng PrepFiler extraction kit

36. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
36
Đầu tiên các mẫu được ủ với dung dịch PrepFiler Lysis buffer để phá vỡ màng
tế bào giải phóng DNA ra ngoài môi trường. Tiếp theo tiến hành loại bỏ xác tế bào
và thêm hạt từ tính, isopropanol vào dung dịch. Các DNA sẽ bị tủa và bám vào hạt
từ tính bằng lực hút tĩnh điện. Tiến hành rửa nhiều lần bằng PrepFiler Wash buffer,
sau đó thêm PrepFiler Elution buffer để tách DNA ra khỏi hạt từ tính. Cuối cùng là
bước tinh sạch và thu DNA.
Tùy theo từng loại mẫu khác nhau mà chúng ta có thể tăng hoặc giảm thể tích
Lysis buffer cũng như thời gian ủ thích hợp. Đối với các mẫu thông thường như
mẫu máu, mẫu tóc…thì thời gian ủ thường từ 30 – 60 phút. Với các mẫu đặc biệt
như mẫu răng, xương…thì đòi hỏi thời gian ử lâu hơn, có thể lên đến 12-18 tiếng.
2.2.1.3. Phương pháp tách chiết DNA bằng QIAamp DNA Investigator Kit
Bộ QIAamp DNA Investigator kit (50 phản ứng) bao gồm [44]:
QIAamp MinElute®
Columns
50
Collection Tubes (2 ml) 200
Buffer ALT 50 ml
Buffer AL 33 ml
Buffer AW1 19 ml
Buffer AW2 13 ml
Buffer ATE 12 ml
Carrier RNA (red cap) 310 µg
Proteinase K 1.25 ml
Hình 2.4. Thành phần và các bước tách DNA cơ bản của bộ QIAamp DNA Investigator kit

37. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
37
Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu, nước bọt, tóc, móng tay:
Chuẩn bị buffer AW1 và AW2
- Thêm 25 ml ethanol (96 – 100%) vào ống chứa 19 ml Buffer AW1
- Thêm 30 ml ethanol (96 – 100%) vào ống chứa 13 ml Buffer AW2
Quy trình tách chiết mẫu máu, nước bọt:
1. Hút 50 µl máu tổng số hoặc nước bọt vào ống ly tâm 1.5ml
2. Thêm 50 µl buffer ALT
3. Thêm 10 µl proteinase K
4. Thêm 100 µl buffer AL, đóng nắp và lắc nhẹ trong vòng 15 giây
5. Ủ và lắc nhẹ ở 56o
C trong vòng 10 phút
6. Ly tâm nhẹ để loại bỏ dung dịch dính trên nắp ống
7. Thêm 50 µl ethanol (96-100%), đóng nắp và lắc đều trong vòng 15 giây. Ủ ở
nhiệt độ phòng trong 3 phút
8. Ly tâm nhẹ để loại bỏ dung dịch dính trên nắp ống
9. Đặt ống QIAamp MinElute vào trong ống 2 ml collection tube, chuyển toàn
bộ dung dịch trong ống ly tâm 1.5 ml sang ống MinElute, đóng nắp và ly tâm
ở 8000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Loại bỏ ống collection đã dùng và dung
dịch trong đó, đặt ống QIAamp MinElute vào ống collection mới.
10.Cẩn thận mở nắp ống QIAamp MinElute và thêm 500 µl buffer AW1. Đóng
nắp và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Loại bỏ ống collection đã
dùng và dung dịch trong đó, đặt ống QIAamp MinElute vào ống collection
mới.
11.Cẩn thận mở nắp ống QIAamp MinElute và thêm 700 µl buffer AW2. Đóng
nắp và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Loại bỏ ống collection đã
dùng và dung dịch trong đó, đặt ống QIAamp MinElute vào ống collection
mới.
12.Cẩn thận mở nắp ống QIAamp MinElute và thêm 700 µl ethanol (96-100%).
Đóng nắp và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Loại bỏ ống

38. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
38
collection đã dùng và dung dịch trong đó, đặt ống QIAamp MinElute vào
ống collection mới.
13.Ly tâm ở tốc độ tối đa 14000 vòng/phút trong vòng 3 phút để làm khô và loại
bỏ hoàn toàn ethanol
14.Đặt ống QIAamp MinElute vào ống ly tâm 1.5 ml sạch, cẩn thận mở nắp và
để ở nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút hoặc ủ ở 56o
C trong vòng 3 phút.
15.Thêm 40 µl buffer ATE hoặc nước cất vào giữa màng của ống QIAamp
MinElute
16.Đóng nắp và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm ở 14000 vòng/phút
trong vòng 1 phút.
2.2.1.4. Quy trình tách chiết bằng hạt từ tính
Hạt từ tính có gắn Sitica tích điện (+) trên bề mặt sẽ gắn với DNA và một số
thành phần tích điện (-) nên tách được DNA ra khỏi các tạp chất tích điện (+) khác.
Sau khi thu được phức hợp "hạt từ tính - thành phần mang điện tích (-)”, sử
dụng Wash Buffer rửa nhiều lần, để lại phức hợp "hạt từ tính - DNA".
Cụ thể các bước như sau:
+ Bước 1: Cắt nhỏ phần chân tóc cho vào ống nghiệm.
+ Bước 2: Thêm Lysis Buffer, ủ 70o
C trong 30 phút để hoà tan mẫu.
+ Bước 3: Ly tâm để loại bỏ bớt tạp chất.
+ Bước 4: Thêm hạt từ tính để tạo phức hợp "hạt từ tính-thành phần tích điện
(-)".
+ Bước 5: Đặt ống nghiệm vào giá từ tính để lọc lấy phức hợp.
+ Bước 6: Rửa nhiều lần bằng Wash Buffer để thu phức hợp "hạt từ tính -
DNA"
+ Bước 7: Để khô ở nhiệt độ phòng để loại bớt nước.
+ Bước 8: Thêm Elution Buffer và ủ ở 650
C trong 5 phút để tách DNA ra khỏi
hạt từ tính.
+ Bước 9: Thu dung dịch DNA.

39. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
39
Sau khi thu được mẫu DNA, chúng tôi tiến hành định lượng và kiểm tra độ
tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp định lượng trên máy đo quang phổ
Nanodrop.
2.2.2. Phương pháp định lượng DNA
Sản phẩm DNA thu được sau quá trình tách chiết được định lượng trên máy
Nanodrop ở bước sóng 260 và 280 nm để định lượng và kiểm tra độ tinh sạch.
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào sự hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm
của các base purin và pyrimidin. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm của các
mẫu cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu đo. Độ tinh sạch của dung dịch
dựa vào tỷ số OD 260nm/280nm. Một dung dịch axit nucleic được coi là sạch khi tỷ
số OD là 1,8-2,0.
Cách tiến hành
- Lấy 1µl nước cất cho vào mắt đọc của máy để chuẩn máy trước khi đo DNA
- Sau đó lấy 1µl dung dịch có chứa DNA đã được tách chiết cho vào mắt đọc
và đo ở các bước sóng 260nm và 280nm. Đọc kết quả trên màn hiển thị nồng độ
DNA tính bằng ng/µl và giá trị OD (260/280).
2.2.3. Phương pháp PCR
Đại cương về phương pháp PCR.
Kỹ thuật PCR do Karry Mullis phát minh vào năm 1985 đã đánh dấu những
bước đột phá trong công nghệ sinh học bởi khả năng áp dụng của nó trong phân tích
DNA. Nhờ có PCR người ta có thể nhân một đoạn DNA đích ban đầu lên hàng triệu
bản sao chỉ trong vài giờ. Lượng DNA sau nhân bội đủ lớn để có thể phát hiện được
bằng các phương pháp thông thường. Với những ưu điểm nổi bật, PCR đã nhanh
chóng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vực khoa học hình sự.
Kỹ thuật này đã thay thế kỹ thuật RFLP vì những lý do sau:
1. Độ nhạy và tính đặc hiệu cao
2. Tiết kiệm thời gian và dễ dàng trong công tác giám định

40. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
40
3. Có thể xác định được đối với cả những mẫu có số lượng ít, chất lượng bị
suy giảm
4. Có thể đồng thời xác định được nhiều locus khác nhau và tự động hóa
được quy trình phân tích
Thành phần và điều kiện PCR bao gồm:
Đoạn DNA khuôn
Đó là các đoạn DNA sau tách chiết từ các mẫu xét nghiệm. DNA mạch đơn
hay mạch đôi đều có thể sử dụng được trong phản ứng PCR. Nguồn DNA khuôn có
thể được lấy từ các mô hoặc các tổ chức khác nhau của cơ thể., hàm lượng DNA
nhân thu được sau tách cũng khác nhau tùy thuộc vào từng mô, tổ chức cụ thể.
Bảng 2.1. Hàm lượng DNA trong các loại mô khác nhau [25]
Dạng mẫu Hàm lượng DNA/ số lượng mẫu
Nhung mao màng đệm (phôi) 1-3 µg/ 5 mg
Mẫu dịch âm đạo sau khi giao hợp 10 – 3000 ng/mẫu
Tế bào niêm mạc miệng 0.5 – 1 µg/ 1 lần súc miệng
Tóc bị đứt còn chân 1 – 750 ng/ chân tóc
Tóc rụng còn chân 1 – 10 ng/ chân tóc
Máu toàn phần 20000 – 40000 ng/ml
Vết máu 250 – 500 ng/cm2
Tinh dịch 150000 – 300000 ng/ml
Nước bọt 1000 – 10000 ng/ml
Nước tiểu 1 – 20 ng/mg
Xương 3 – 10 ng/mg
Mảnh tổ chức 50 – 500 ng/mg
Một phản ứng PCR thông thường sử dụng lượng DNA khuôn trong khoảng
từ 10ng đến 1µg
Mồi (primer)
Mồi là những đoạn oligonucleotide mạch đơn dài 15 – 30bp có trình tự bổ
sung với trình tự bazơ của hai đầu đoạn (locus) DNA để khởi đầu quá trình tổng

41. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
41
hợp DNA. Mồi được thiết kế để chỉ gắn vào vị trí duy nhất trên DNA. Mồi càng dài
thì khả năng tổng hợp chính xác đoạn DNA đích càng lớn.
Các nucleotide (dNTPs)
dNTPs là nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA. Chúng gồm hỗn hợp của
bốn loại nu dATP, dTTP, dCTP và dGTP. Ngoài bốn loại nêu trên người ta có thể
sử dụng một số nucleotide được gắn thêm biotin hoặc dioxygenin tùy theo mục đích
sử dụng và nghiên cứu. Nồng độ dNTPs thường dùng cho phản ứng PCR cơ bản từ
10 - 200µM cho mỗi loại nucleotide.
Taq – DNA polymerase
Taq-DNA polymerase là enzyme chịu nhiệt được chiết xuất từ vi khuẩn suối
nước nóng có tên khoa học là Thermus aquaticus. Đặc điểm nổi bật của loại enzyme
này là không bị bất hoạt ở nhiệt độ cao và có khả năng xúc tác phản ứng tổng hợp
DNA. Taq-DNA polymerase có trọng lượng phân tử 94kDa, có hoạt tính 5’-3’
exonuclease và hoạt động tốt nhất ở 70 – 80o
C. Tốc độ tổng hợp trung bình đạt 75
nucleotide trong 1 giây. Nồng độ Taq- DNA polymerase trong phản ứng PCR cơ
bản là 1 – 1.5UI.
Dung dịch đệm (buffer)
Thành phần dung dịch đệm thay đổi tùy theo loại enzyme được sử dụng
trong phản ứng PCR, nhưng quan trọng nhất là ion Mg2+
. Bởi vì, ion Mg2+
rất cần
thiết cho quá trình liên kết các dNTPs và hoạt tính enzyme Taq-DNA polymerase.
Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng PCR cơ bản thay đổi từ 0.5 – 5.0mM.
Một quá trình PCR đặc trưng bao gồm một số chu kỳ để nhân bội một trình tự
DNA đặc hiệu. Trước chu kỳ đầu tiên thường có một bước khởi động nóng ở 94o
C
trong vòng 4 – 5 phút để làm biến tính hoàn toàn DNA khuôn. Mỗi chu kỳ gồm 3
bước lặp lại sau:
1. Bước 1 (biến tính): DNA sợi khuôn được biến tính ở nhiệt độ 94 – 95oC
trong khoảng 30 giây – 1 phút. Khi đó các liên kết Hydro trong phân tử bị bẻ gãy và
DNA sợi kép bị tách thành hai sợi đơn.

42. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
42
2. Bước 2 (gắn mồi): Mồi là các đoạn oligonucleotide dài từ 15 – 30 nucluotide
có trình tự bổ sung với DNA khuôn. Nhiệt độ gắn mồi khoảng 40 – 70o
C (tùy
thuộc Tm của mồi) và kéo dài khoảng 1 phút.
3.Bước 3 (kéo dài chuỗi): Nhiệt độ được tăng lên đến 72o
C là nhiệt độ thích hợp
để cho DNA polymerase kéo dài chuỗi. Thời gian phản ứng tùy thuộc độ dài của
đoạn DNA cần nhân bản, thường kéo dài khoảng 30 giây đến vài phút.
Sau khi thu được các mẫu DNA đạt tiêu chuẩn, chúng tôi tiến hành phản ứng
PCR khuếch đại các mẫu bằng bộ kit AmpFlSTR®
Identifiler®
PCR Amplification
Kit. Đây là bộ kit đặc hiệu nhân cùng lúc 15 locus STR và 1 marker giới tính, thành
phần của mỗi một phản ứng theo gồm có:
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR
Thành phần Thể tích
AmpFlSTR PCR Reaction Mix 5,25 µl
AmpliTaq Gold DNA Polymarase 0,25 µl
AmpFlSTR Identifiler Primer Set 2,75 µl
Mẫu -
Nước -
Tổng 12,5 µl
Hỗn hợp phản ứng được chạy trên máy PCR 9700 với chu trình nhiệt như sau:
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
95o
C 11 phút 1 chu kỳ
94o
C 1 phút
28 chu kỳ59o
C 1 phút
72o
C 1 phút
60o
C 60 phút 1 chu kỳ
4o
C ∞ 1 chu kỳ

43. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
43
2.2.4. Phương pháp điện di huỳnh quang
Sau khi thu được sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành xác định kiểu gen của
các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp điện di huỳnh quang (hay còn gọi là điện di
mao quản) trên máy giải trình tự gen 3130XL của hãng Applied Biosystems. Các
cặp mồi được đánh dấu bằng các chất nhuộm huỳnh quang khác nhau vì vậy sau
quá trình PCR sẽ tạo ra các locus được gắn các chất nhuộm huỳnh quang tương
ứng. Các locus này sau đó được xác định bằng kỹ thuật hiện màu huỳnh quang.
Màu xanh (blue), xanh lá cây (green), vàng (yellow), đỏ (red) và cam (orange)
tương ứng với các dye 6-FAM, VIC, NED, PET và LIZ. Nguyên tắc của kỹ thuật
dựa trên sự hấp thụ và phát xạ ánh sáng của chất nhuộm màu huỳnh quang. Các hạt
huỳnh quang hấp thụ năng lượng từ nguồn sáng laser sau đó phát xạ ánh sáng ở
mức năng lượng thấp hơn (bước sóng cao hơn). Một màng lọc sáng được sử dụng
để lọc ánh sáng ở những bước sóng xác định hoặc một khoảng bước sóng nào đó.
Bảng 2.3. Đặc điểm của các chất nhuộm màu huỳnh quang sử dụng trong bộ kit Identifiler
Dye Chemical name Excitation
Maximum nm
Emission
Maximum nm
6-FAM 6-carboxy fluorescein 493 522
VIC Proprietary to Applied Biosystems 538 554
NED Proprietary to Applied Biosystems 546 575
PET Proprietary to Applied Biosystems 558 595
LIZ Proprietary to Applied Biosystems 638 655
Các dye VIC, NED, PET, LIZ là các dye được đăng ký độc quyền của hãng
Applied Biosystems.

44. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
44
Hình 2.5. Các dye trong kỹ thuật điện di huỳnh quang 5 màu
Với kỹ thuật điện di huỳnh quang 5 màu, các băng có kích thước tương tự
nhau được chia ra ở các màu khác nhau vì vậy có thể dễ dàng xác định được kích
thước chính xác của từng locus sau quá trình hiện băng. Các băng màu xanh (blue)
gồm các locus D8S1179, D21S11, D7S820 và CSF1PO phát xạ mạnh nhất ở bước
sóng 522nm. Băng màu xanh (green) gồm các locus D3S1358, TH01, D13S317,
D16S539 và D2S1338 phát xạ mạnh nhất ở bước sóng 554nm. Băng màu vàng gồm
các locus D19S433, vWA, TPOX và D18S51 phát xạ mạnh nhất ở bước sóng
575nm. Băng màu đỏ gồm 2 locus D5S818, FGA và một marker giới tính
Amelogenin được đo ở bước sóng 595nm. Còn lại các băng màu cam là đại diện
cho thang alen chuẩn phát xạ mạnh nhất ở bước sóng 655nm.
Hình 2.6. Các locus tương ứng với các màu trong kỹ thuật điện di huỳnh quang

45. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
45
Sau quá trình điện di, các kết quả thu được được xử lý bằng phần mềm
Genemapper ID 3.2 để xác định các alen của mỗi locus.
Chuẩn bị mẫu trước khi điện di: Ngoài các mẫu nghiên cứu, chúng tôi chuẩn
bị thêm hỗn hợp phản ứng cho thang alen chuẩn. Thành phần và tỷ lệ thể tích từng
hỗn hợp phản ứng như sau:
Thành phần Thể tích
Hi-DiTM
Formamide 8,7 µl
GeneScan™ 500 LIZ® 0,3 µl
Mẫu (Thang alen) 1,5 µl
Tổng 10,5 µl
Hỗn hợp phản ứng được biến tính trên máy PCR 9700 ở 95o
C trong vòng 4 –
5 phút, sau đó lấy ra và ủ ngay vào đá lạnh trong 3 phút. Quá trình biến tính và làm
lạnh đột ngột này đảm bảo hầu hết DNA từ dạng mạch đôi sẽ chuyển sang dạng
mạch đơn hoàn toàn.
2.2.5. Phương pháp phân tích và tính tần suất alen
2.2.5.1. Phương pháp phân tích alen
Sau quá trình điện di huỳnh quang, chúng tôi thu được các băng DNA khác
nhau. Để xác định chính xác kiểu gen của mỗi locus chúng tôi tiến hành so sánh
băng thu được với băng chuẩn của thang alen AmpFlSTR Identifiler™ Allelic
Ladder . Thang alen chuẩn này chứa toàn bộ các alen chuẩn của từng locus như trên
hình 11.

46. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
46
Hình 2.7. Các alen trong thang alen chuẩn AmpFlSTR Identifiler™ Allelic Ladder
Có 3 trường hợp sau:
1. Nếu locus nghiên cứu thu được hai băng khác nhau thì kiểu gen của locus đó
là dị hợp tử
2. Nếu locus nghiên cứu thu được một băng duy nhất thì kiểu gen của locus đó
là đồng hợp tử
3. Trường hợp băng thu được không có trong thang alen chuẩn, có thể đó là
alen hiếm gặp trong quần thể. Khi đó việc xác định kiểu gen của locus sẽ dựa
vào kích thước băng thu được, các alen hiếm sẽ được gọi tên theo kích thước
của chúng.
2.2.5.2. Phương pháp tính tần suất alen
Sau khi thu được kiểu gen của từng locus, chúng tôi tiến hành tính toán tần
suất alen, tần số dị hợp tử thực tế, tần số dị hợp tử lý thuyết và khả năng phân biệt
của từng locus theo các công thức sau:
Tần số dị hợp tử quan sát (Observed Heterozygosity)

47. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
47
Tần số dị hợp tử quan sát H(ob) là tổng tần số các kiểu gen dị hợp tử quan sát
được trong toàn bộ mẫu nghiên cứu. Tần số này được tính theo công thức:
H(ob) =
Số cá thể dị hợp tử
Tổng số cá thể quan sát
Tần số dị hợp tử lý thuyết (Expected Heterozygosity)
Tần số dị hợp tử lý thuyết H(ex) được tính theo công thức:
H(ex) = 1 - å
i=1
k
P2
i
Trong đó: k là tổng số alen nghiên cứu
Pi là tần số của alen thứ i trong k alen
Khả năng phân biệt (Power of Discrimination)
Khả năng phân biệt Pd được tính theo công thức:
Pd = 1 – Pi
Trong đó: Pi là khả năng trùng lặp (Power of Inclusion), nghĩa là khả năng nếu
2 cá thể được chọn một cách ngẫu nhiên trong quần thể sẽ có cùng một kiểu gen. Pi
được tính bằng tổng bình phương tần số các kiểu gen theo lý thuyết trong quần thể.
Ví dụ: Quần thể A có tần số các kiểu gen như sau:
Genotype Expected Frenquency
AA 0.053
AB 0.136
AC 0.218
BB 0.087
BC 0.280
CC 0.226
Xác xuất để hai cá thể được lấy ngẫu nhiên từ quần thể A có kiểu gen giống
nhau là:

48. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
48
Pi = (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của AA)2
+ (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của AB)2
+ (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của AC)2
+ (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của BB)2
+
(Tần suất dị hợp tử lý thuyết của AC)2
+ (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của CC)2
= (0,053)2
+ (0,136)2
+ (0,218)2
+ (0,087)2
+ (0,280)2
+ (0,226)2
= 0,206
Khả năng phân biệt: Pd = 1 - Pi = 1 – 0,206 = 0,794
Tần số Pi càng thấp thì tần số Pd càng cao, chứng tỏ khả năng phân biệt các cá
thể khác nhau trong quần thể càng lớn.

49. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
49
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Với mục đích nghiên cứu đa hình các locus STR ở người Việt Nam, chúng
tôi tiến hành thu mẫu và tách DNA của 402 mẫu nghiên cứu, trong đó có 350 mẫu
máu khô được bảo quản bằng thẻ thu mẫu FTA card, 10 mẫu niêm mạc miệng, 10
mẫu nước bọt, 8 mẫu tóc, 8 mẫu xương, 5 mẫu móng tay, còn lại là 21 mẫu máu
tổng số thu trực tiếp từ đối tượng. Với mỗi một loại mẫu khác nhau, chúng tôi sử
dụng các phương pháp tách chiết DNA khác nhau, phù hợp với từng đối tượng cụ
thể. Sau khi thu được DNA, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch của DNA
bằng cách đo nồng độ DNA trên máy Nanodrop, các mẫu DNA đạt tiêu chuẩn được
dùng làm khuôn cho phản ứng PCR multiplex nhân đồng thời 16 locus STR bằng
bộ kít AmpFlSTR®
Identifiler®
PCR Amplification Kit. Sản phẩm sau PCR tiếp tục
phân tích bằng phương pháp điện di huỳnh quang trên máy 3130xl. Các kết quả
cuối cùng được thu nhận và xử lý bằng phần mềm Genemapper ID 3.2.
Bằng cách áp dụng các phương pháp đã trình bày ở chương 2, chúng tôi thu
được một số kết quả sau:
3.1. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu nghiên cứu
Hầu hết các nghiên cứu sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc tách chiết và
tinh sạch một lượng DNA đủ lớn và ở trạng thái tương đối nguyên vẹn. Trong quá
trình tách chiết các phân tử DNA có thể bị phân hủy hay đứt gãy do các tác nhân cơ
học (nghiền, lắc mạnh) hoặc hóa học (bị thủy phân bởi các enzyme phân giải thoát
ra môi trường khi phá vỡ màng tế bào). Vì vậy việc lựa chọn một phương pháp tách
chiết có nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng.
Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi phân tích một lượng mẫu khá lớn, các mẫu
được lấy từ nhiều nguồn khác nhau (mẫu máu, niêm mạc, chân tóc…) vì vậy để đạt
hiệu quả cao nhất, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA bằng nhiều phương pháp
khác nhau. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, phù hợp với từng
loại mẫu, từng loại đối tượng cụ thể.
Sau khi tách chiết thành công DNA, nồng độ của dung dịch axit nucleic được
xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 260nm (A260) tương đương với

50. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
50
nồng độ 50µg/ml của DNA. Nếu giá trị hấp thụ bước sóng 280nm (A280) được xác
định là bước sóng ở đó có các protein có mức hấp thụ cao nhất, thì tỷ số A260/A280 là
chỉ số cho thấy độ nhiễm của các chất như phenol hoặc protein. Tỷ lệ A260/A280 là
1,8 - 2,0 là DNA đạt độ tinh khiết theo tiêu chuẩn quốc tế (Lê Đình Lương, 2004).
3.1.1. Phương pháp tách chiết bằng Chelex
Phương pháp tách bằng Chelex 100 resin là phương pháp đơn giản, có hiệu
quả cao và được áp dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm giám định gen. Chúng
tôi sử dụng phương pháp này để tách toàn bộ 350 mẫu máu khô trên thẻ FTA. Ưu
điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản, ít bước vì vậy rút ngắn được thời
gian tách mẫu cũng như hạn chế được tối đa các chất ức chế hoặc sai sót trong quá
trình thao tác. Những ion kim loại trong chelex 100 đóng vai trò xúc tác trong quá
trình phá vỡ màng tế bào và làm biến tính DNA trong dung dịch có nồng độ ion
thấp ở nhiệt độ cao. Ngoài ra chelex 100 còn có tác dụng bảo vệ mẫu ở nhiệt độ cao,
nếu không có sự có mặt của chelex 100 thì các DNA khi được đun sôi ở nhiệt độ
100o
C sẽ bị bất hoạt trong phản ứng PCR. Sauk hi tách được DNA chúng tôi tiến
hành kiểm tra nồng độ trên máy đo quang phổ, DNA thu được đều đảm bảo nồng độ
và độ sạch cho các công đoạn tiếp theo.
Hình 3.1. Ảnh kiểm tra nồng độ DNA tách bằng Chelex 100 trên máy quang phổ
3.1.2. Phương pháp tách DNA bằng PrepFilerTM
Forensic DNA Extraction Kit
Phương pháp tách DNA bằng bộ kít PrepFilerTM
Forensic DNA Extraction
Kit có ưu điểm nổi bật là khả năng tách tốt DNA từ các mẫu khó như mẫu máu trên

51. Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ
K17 – Sinh học
51
vải, mẫu răng, mẫu kẹo cao su…Chúng tôi sử dụng phương pháp này để tách 13
mẫu móng tay khác nhau. Các mẫu này có hàm lượng DNA thấp và thường chứa
nhiều tạp chất cũng như các chất ức chế khác. Nguyên tắc của phương pháp này dựa
trên sự bám dính của các hạt DNA vào hạt từ tĩnh điện. Ban đầu, các mẫu được ủ
với dung dịch lysis có tác dụng phá vỡ màng tế bào, giải phóng DNA vào môi
trường. Bổ sung thêm một lượng hạt từ vào dung dịch, các phân tử DNA sẽ bám
vào hạt từ. Hỗn hợp phản ứng sau đó được đưa vào một giá từ trường có tác dụng
làm cho các hạt từ có bám DNA tập trung tại một vị trí cố định trên ống nghiệm.
Tiếp theo là bước loại bỏ các chất ức chế PCR ra khỏi dung dịch. Cuối cùng là bước
rửa và tinh sạch DNA. Phương pháp này cho hiệu quả tách DNA rất cao và loại
được hầu hết các chất ức chế vì vậy nó được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực Khoa
học Hình sự, đặc biệt là để phân tích các mẫu thu được ở hiện trường vụ án có hàm
lượng DNA thấp. Một đặc điểm nổi bật nữa của phương pháp này là khả năng tự
động hóa, toàn bộ quá trình tách chiết từ sau bước lysis có thể được thực hiện tự
động hoàn toàn bằng robot cho khả năng tách chiết nhiều mẫu khác nhau cùng một
lúc, có ý nghĩa trong công tác xây dựng tàng thư gen. Sản phẩm thu được chúng tôi
tiến hành kiểm tra nồng độ bằng cách đo nồng độ DNA trên máy quang phổ.
Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra nồng độ DNA của 8 mẫu nghiên cứu được tách bằng bộ
PrepFilerTM
Forensic DNA Extraction Kit
Mẫu
Nồng độ DNA
(ng/µL)
A260/A280 Mẫu
Nồng độ DNA
(ng/µL)
A260/A280
1 17,42 1,82 5 15,51 2,0
2 25,62 1,80 6 14,1 1,91
3 19,49 1,87 7 20,98 1,95
4 21,02 1,98 8 15,32 2,0
Nồng độ DNA chúng tôi thu được nằm trong khoảng từ 14,1 đến 25,62 ng/µl
và tỷ lệ A260/A280 từ 1,80 đến 2,0. Như vậy có thể khẳng định các DNA chúng tôi
thu được đều đạt tiêu chuẩn để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo.