Luận văn: Dẫn xuất nitrile của 2 auronol alphitonin và maesopsin

I H QU GI H N I
TRƢ NG I HỌ HO HỌ T NHI N
--------
NGUYỄN THỊ HUẾ
NGHI N ỨU TỔNG HỢP
MỘT SỐ DẪN XUẤT NITRIL Ủ H I AURONOL
ALPHITONIN VÀ MAESOPSIN VÀ HO T TÍNH
SINH HỌ Ủ HÚNG
LU N V N TH S KHO H
H N i – 2015

I H QU GI H N I
TRƢ NG I HỌ HO HỌ T NHI N
--------
NGUYỄN THỊ HUẾ
NGHI N ỨU TỔNG HỢP
MỘT SỐ DẪN XUẤT NITRIL Ủ H I URONOL
ALPHITONIN VÀ MAESOPSIN VÀ HO T TÍNH
SINH HỌ Ủ HÚNG
huy n ng nh: Ho hữu cơ
M s : 60440114
LU N V N TH S KHO H
NG I H NG N KHO H
TS. Nguyễn Quốc Vƣợng
GS.TS. Nguyễn ình Thành
H N i – 2015

Lời cảm ơn
Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kinh phí thực hiện từ đề tài thuộc Quỹ Nafosted,
Mã số đề tài 104.01-010.10 (34- Hóa).
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS.
Nguyễn Quốc Vượng người Thầy đã giao đề tài, chỉ dẫn và hết lòng giúp đỡ em
trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn GS. TS. Nguyễn Đình Thành đã hướng dẫn, động
viên và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn các anh, chị và các bạn trong Phòng Công nghệ
hóa dược, Viện Hóa sinh biển đã giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận
văn.
Em xin chân thành cảm ơn các Thầy (Cô) trong Khoa Hóa – Trường
ĐHKHTN, các Thầy (Cô) bộ môn Hóa Hữu Cơ đã tạo điều kiện và giúp đỡ em hoàn
thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn các anh chị, các bạn học viên lớp K24 – Cao học Hóa, các
bạn học viên chuyên ngành Hóa hữu cơ, các em sinh viên phòng Tổng Hợp Hữu Cơ
I đã trao đổi, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện
luận văn.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình tôi, các bạn tôi - những người đã luôn
bên cạnh tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này.
Học viên
Nguyễn Thị Huế

Nguyễn Thị Huế Luận văn Thạc sĩ khoa học
i
MỤ LỤ
MỞ ẦU................................................................................................................1
HƢƠNG 1 - TỔNG QUAN ................................................................................3
1.1. CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID...................................................................3
1.1.1. Giới thiệu về các hợp chất flavonoid...........................................................3
1.1.2. Cấu trúc của flavonoid ................................................................................3
1.1.3. Phân loại flavonoid ......................................................................................5
1.1.3.1. Major flavonoids.................................................................................5
1.1.3.2. Isoflavonoids.......................................................................................8
1.1.3.3. Neoflavonoids ...................................................................................10
1.1.3.4. Minor flavonoids...............................................................................11
1.2. CÁC HỢP CHÁT AURONOL.....................................................................12
1.2.1. Giới thiệu về aurone và auronol................................................................12
1.2.1.1. Aurone ..............................................................................................12
1.2.1.2. Auronol.............................................................................................15
1.2.2. ác phƣơng pháp tổng hợp auronol .........................................................17
1.2.3. Hoạt tính sinh học của auronol .................................................................20
1.2.3.1. Kháng ký sinh trùng ..........................................................................20
1.2.3.2. Kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm ..............................................22
1.2.3.3. Hệ miễn dịch và ảnh hưởng của thực vật đối với hệ miễn dịch ..........23
1.3. HỢP CHẤT CHỨ NITRILE TRONG HÓ DƢỢ VÀ PHƢƠNG
PHÁP TỔNG HỢP DẪN XUẤT NITRILE .......................................................23
HƢƠNG 2 – ỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................25
2.1. ỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ......................................................................25
2.2. MỤC TIÊU....................................................................................................25
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHI N ỨU ................................................................25
2.3.1. Phương ph p phân lập các hợp chất.............................................................25
2.3.2. Phương ph p tổng hợp và tinh chế sản phẩm ...............................................26

ii
2.3.3. Phương ph p x c định cấu trúc hóa học.......................................................26
2.4. KHẢO SÁT HO T TÍNH KÍCH THÍCH TẾ BÀO LYMPHO VÀ HO T
TÍNH ỘC TẾ BÀO CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP ƢỢC............ ..............27
2.4.1. Hoạt tính kích thích tế bào lympo.........................................................27
2.4.2. Hoạt tính đ c tế bào .............................................................................28
HƢƠNG 3 - TH C NGHIỆM .........................................................................30
3.1. TỔNG HỢP HAI AURONOL ALPHITONIN VÀ MAESOPSIN.............30
3.1.1. Bán tổng hợp Alphitonin..............................................................................30
3.1.2. iều chế maesopsin .....................................................................................33
3.2. TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT NITRILE CỦA HAI AURONOL
ALPHITONIN VÀ MAESOPSIN.......................................................................35
3.2.1. Tổng hợp dẫn xuất nitrile m t nhóm thế của Alphitonin và Maesopsin ........36
3.2.2. Tổng hợp dẫn xuất nitrile hai nhóm thế của Alphitonin và Maesopsin .........37
3.3. THỬ HO T TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN XUẤT NITRILE Ã
TỔNG HỢP ƢỢC.............................................................................................38
3.3.1. Hoạt tính kích thích lympho bào ..................................................................38
3.3.2. Hoạt tính đ c tế bào.....................................................................................40
HƢƠNG 4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................42
4.1. TỔNG HỢP HAI AURONOL ALPHITONIN VÀ MAESOPSIN.............42
4.1.1. Bán tổng hợp auronol alphitonin..................................................................42
4.1.2. iều chế Maesopsin.....................................................................................49
4.2. TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT NITRILE CỦA HAI AURONOL
ALPHITONIN VÀ MAESOPSIN.......................................................................52
4.3. HO T TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN XUẤT NITRILE Ã TỔNG
HỢP ƢỢC.........................................................................................................68
4.3.1. Hoạt tính kích thích tế bào lympho ..............................................................70
4.3.2. Hoạt tính đ c tế bào.....................................................................................71
KẾT LUẬN..........................................................................................................73
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................75

iii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. M t s flavonoids thu c lớp Major flavonoids.........................................5
Bảng 1.2. M t s flavonoids thu c lớp Isoflavonoids ..............................................8
Bảng 1.3. M t s flavonoids thu c lớp Neoflavonoids...........................................11
Bảng 1.4. M t s flavonoids thu c lớp Minor flavonoids ......................................11
Bảng 4.1. Nghiên cứu c c điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng tổng hợp
dẫn xuất nitrile m t nhóm thế của hai auronol 82 và 98.........................................54
Bảng 4.2 Nghiên cứu c c điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng tổng hợp dẫn
xuất nitrile hai nhóm thế của hai auronol 3 và 4.....................................................61
Bảng 4.3. anh s ch ký hiệu, t n v cấu tạo hóa học của c c mẫu thử...................68
Bảng 4.4. Hoạt tính kích thích tế bào lympho của các mẫu thử..............................70
Bảng 4.5. Hoạt tính đ c tế bào của các mẫu thử trên tế b o thường NIH/3T3 và 4
dòng tế bào ung thư MCF7, LU-1, KB, HepG2 .....................................................71

iv
DANH MỤC CÁC HÌNH
H nh Khung cơ bản của flavonoids ..................................................................4
H nh Khung cơ bản của hợp chất chalcone .......................................................4
H nh c dạng của dị vòng C ...........................................................................4
H nh ấu trúc chung của flavonoids .................................................................5
H nh Khung của Aurones..................................................................................5
H nh 6 Hai đồng phân (Z)-, (E)-Aurone.............................................................13
Hình 1.7. Hydroxyaurones.....................................................................................14
Hình 1.8. Methoxyaurones ....................................................................................14
Hình 1.9. Aurones glycoside..................................................................................15
Hình 1.10. Aurones dimer .....................................................................................15
Hình 1.11. Cấu trúc của auronol ............................................................................16
Hình 1.12. Auronol aglycone.................................................................................16
Hình 1.13. Auronol glycoside................................................................................17
Hình 1.14 Sơ đồ tổng hợp auronol của I. G. Sweeny.............................................17
Hình 1.15 Sơ đồ tổng hợp auronol của Kiehlmann and Li.....................................18
H nh 6 Sơ đồ tổng hợp auronol của Reik Löser................................................18
H nh 7 Sơ đồ tổng hợp auronol theo Srikrishna và Mathews............................19
H nh 8 Sơ đồ bán tổng hợp auronol theo GS. Trần Văn sung...........................20
Hình 1.19 . M t s aurone và auronol hoạt đ ng ức chế kí sinh trùng....................21
Hình 1.20. Các aurone và auronol có khả năng ch ng viêm...................................23
H nh Sơ đồ tổng quát bán tổng hợp alphitonin (3)...........................................30
H nh Phản ứng thủy phân astilbin ( ) điều chế taxifolin (2) ............................31

v
H nh Sơ đồ bán tổng hợp alphitonin (3) từ taxifolin (2) ..................................32
H nh Sơ đồ điều chế maesopsin (4).................................................................33
H nh Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất nitrile của chất 3 và 4................................35
H nh Sơ đồ tổng quát bán tổng hợp alphitonin................................................42
H nh Phổ 1
H-NMR giãn của chất 2 (CD3OD) .................................................44
H nh Phổ 13
C-NMR của chất 2 (CD3OD)........................................................44
H nh Sơ đồ phản ứng đồng phân hóa taxifolin tổng hợp alphitonin.................45
H nh Sơ đồ cơ chế phản ứng đồng phân hóa taxifolin .....................................45
H nh 6 Phổ ESI-MS của chất 3 ..........................................................................47
H nh 7 Phổ 1
H-NMR của chất 3 (acetone- d6)....................................................47
H nh 8 Phổ 13
C-NMR của chất 3 (acetone- d6)...................................................48
H nh 9 Phổ HMBC của chất 3 (acetone- d6).......................................................49
H nh Phổ 1
H-NMR của chất 4 (CD3OD).......................................................51
H nh Phổ 13
C-NMR của chất 4 (CD3OD)......................................................51
H nh Sơ đồ chung điều chế dẫn xuất nitrile của hai auronol 3 và 4................52
H nh Phổ ESI-MS của chất 5 ........................................................................55
H nh Phổ 1
H-NMR của chất 5 (DMSO- d6)...................................................57
H nh Phổ 13
C-NMR của chất 5 (DMSO- d6)..................................................57
H nh 6 Phổ HMBC của chất 5 (DMSO- d6) .....................................................58
H nh 7 Phổ 13
C-NMR của chất 6 (DMSO- d6)..................................................60
H nh 8 Phổ HMBC của chất 6 (DMSO- d6) .....................................................60
H nh 9 Phổ ESI-MS của chất 7 ........................................................................63
H nh Phổ 1
H-NMR của chất 7 (CD3OD).......................................................64

vi
H nh Phổ HMBC của chất 7 (CD3OD)..........................................................64
H nh Phổ 13
C-NMR của chất 8 (CD3OD)......................................................67
H nh Phổ HMBC của chất 8 (CD3OD)..........................................................67

vii
Á Ý HIỆU VIẾT TẮT
13
C NMR : 13
C-Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
carbon-13)
1
H NMR : 1
H-Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
proton)
1
H-1
H COSY : 1
H-1
H Correlated Spectroscopy (Phổ tương quan 1
H-1
H)
DMSO-d6 : imethyl sulfoxyd được deuteri hóa
nc : iểm nóng chảy
s : iểm sôi
ESI-MS : Electrospray Ionization - Mass Spectrometry (Phổ khối lượng sử
dụng phương pháp ion hóa phun mù electron)
HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Coherence (Phổ tương tác xa 13
C-1
H)
HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation (Phổ tương tác gần 13
C-
1
H)
MS : Mass Spectrometry (Phổ khối lượng)
δ : chuyển dịch hóa học
Ag-TAT2 : Maesopsin
Ag-TAT6 : Alphitonin
DMF : N,N-Dimethylformamit
TAT2 : Maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside
TAT6 : Alphitonin-4-O- β-D- glucopyranoside
TPL : Thổ phục linh

1
MỞ ẦU
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung và hoá học nói riêng,
việc t m kiếm, ph t hiện v nghi n cứu tổng hợp c c hợp chất có nguồn g c thi n
nhi n có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng trong y dược l m t trong những nhiệm
vụ quan trọng đ v đang được c c nh khoa học trong nước v qu c tế hết sức
quan tâm. Các hợp chất này ngày càng trở n n có ý nghĩa quan trọng khi được áp
dụng v o lĩnh vực y học chữa trị c c căn bệnh hiểm nghèo nhằm nâng cao sức khỏe
cho con người.
Hai hợp chất alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (TAT6) và maesopsin-4-
O-β-D-glucopyranoside (TAT2) đ được nhóm của GS Trần Văn Sung phân lập từ
dịch chiết butanol của lá cây Chay Bắc b (Artocarpus tonkinensis A. Chev.) có
hoạt tính ức chế miễn dịch t t. Hoạt tính ức chế miễn dịch của hai hợp chất n y đ
được so s nh với cyclosporin tuy yếu hơn cyclosporin nhưng không gây t c
dụng phụ yclosporin l m t loại thu c ức chế miễn dịch đang được sử dụng
phổ biến trong c c ca phẫu thuật cấy ghép, mặc dù gi th nh rất cao v có rất nhiều
t c dụng phụ như có thể gây đ c cho c c cơ quan n i tạng, gan, thận, ti u hóa, thần
kinh… .Hoạt tính của auronol glucoside được giả thiết do phần đường trong phân
tử có khả năng thấm qua màng tế b o ph t huy được tác dụng của các aglycone.
Phát hiện về hoạt tính t c đ ng đến hệ miễn dịch của của 2 hợp chất TAT6 và TAT2
đ mở ra định hướng cho các nghiên cứu về tổng hợp các dẫn xuất của các hợp chất
auronol có hoạt tính đ i với hệ miễn dịch. Mặt khác, các hoạt chất dược chứa nhóm
nitrile đ v đang được quan tâm nghiên cứu và ngày càng có nhiều thu c được đưa
vào sử dụng lâm sàng. Tương tự phần đường trong các auronol glucoside, nhóm
nitrile trong các phân tử có khả năng tạo liên kết hydro với các protein hay các axit
amin phát huy tác dụng của phân tử. Với mục tiêu tìm kiếm các hợp chất có hoạt
tính đ i với hệ miễn dịch.
Chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất nitrile của
hai auronol alphitonin và maesopsin và hoạt tính sinh học của chúng”.

2
Mục tiêu của luận văn là:
Tổng hợp m t s dẫn xuất nitrile của hai auronol alphitonin và maesopsin, và hoạt
tính sinh học của chúng
N i dung của luận văn:
* Tổng hợp hai auronol alphitonin và maesopsin
* Tổng hợp m t s dẫn xuất nitrile của hai auronol alphitonin và maesopsin
* X c định cấu trúc phân tử c c chất tổng hợp được bằng phương ph p phổ
hiện đại như phổ c ng hưởng từ hạt nhân (1
H NMR và 13
C NMR) kết hợp kĩ thuật
phổ hai chiều ( OSY, HSQ v HMB ) v phổ MS.
* Thử hoạt tính kích thích tế bào lympho và hoạt tính đ c tế bào của các chất
đ tổng hợp được.

3
HƢƠNG 1 - TỔNG QU N
1.1. Á HỢP HẤT FL VONOID
1.1.1. Giới thiệu về các hợp chất flavonoid
Flavonoid là m t trong những hợp chất phong phú v đa dạng nhất trong
thiên nhiên. ũng gi ng vitamin , c c flavonoid được khám phá bởi nhà sinh hóa
nổi tiếng nhất của thế kỷ XX, ông Albert Szent-Gyorgyi (1893- 986), người
Hungary. Ông nhận giải Nobel Y học năm 9 7 với những khám phá quan trọng về
quá trình oxi hóa sinh học có li n quan đến vitamin C và xúc tác acid fumaric.
Trong quá trình phân lập vitamin , năm 9 6 Szent-Gyorgyi và người c ng
sự đ phân lập được m t "yếu t " từ nước chanh làm giảm tính thấm v tăng sức đề
kháng của thành mao mạch Lúc đầu, phân tích hóa học cho thấy yếu t này là m t
hợp chất flavonoid duy nhất v ông đặt t n l " itrin", sau đổi thành "vitamin P‖,
do khả năng l m giảm tính thấm thành mạch của nó. Tuy nhiên vì flavonoid không
có đầy đủ các tính chất của m t vitamin nên sau này cái t n ―vitamin P‖ cũng bỏ đi
Người ta thấy trong giới thực vật có nhiều hợp chất thứ sinh có đặc tính tương tự
vitamin P v đặt cho chúng m t tên chung là flavonoid. [65,15]
Flavonoid (hoặc bioflavonoid) (bắt nguồn từ Latin flavus nghĩa l màu
vàng, màu của flavonoid trong tự nhiên) là nhóm hợp chất phenolic đa vòng, được
tìm thấy r ng rãi trong thực vật, chúng là loại chất chuyển hóa trung gian của thực
vật. Tuy nhiên m t s flavonoid có m u xanh, tím đỏ v cũng có m t s khác lại
không có màu. Trong thực vật cũng có m t s nhóm hợp chất khác không thu c
flavonoid nhưng lại có m u v ng như carotenoid, anthranoid, xanthone có thể gây
nhầm lẫn.
1.1.2. ấu trúc của flavonoid
Về cấu trúc hoá học[34, 18, 58, 71], flavonoid có khung cơ bản 15 nguyên tử
carbon gồm 2 vòng phenyl A và B n i với nhau qua m t mạch 3 carbon theo kiểu
C6-C3-C6(H nh1.1)

4
.
Hình 1. 1. Khung cơ bản của flavonoids
Trong đa s trường hợp ở m t đầu mạch 3 carbon có m t nhóm chức
carbonyl, chúng được xem là dẫn xuất 1,3-diphenylpropan-1-one, hợp chất này
được gọi là dihydrochalcone (H nh 1.2) (được phân lập từ nấm Stinkhorn bởi List
và Freund 1968)
Hình 1.2. Khung cơ bản của hợp chất chalcone
Hay carbon đóng vòng với vòng A và tạo nên dị vòng có oxi (vòng C), dị
vòng C có thể là: (H nh 1.3)
Hình 1.3. Các dạng của dị vòng C
Như vậy, flavonoids có cấu trúc chung cơ bản C6-C3-C6 phenyl-benzopyran
với vòng aryl (vòng B) có thể ở các vị trí 2,3 hoặc 4 của vòng benzopyran (H nh
1.4)

5
Hình 1.4. Cấu trúc chung của flavonoids
Trong m t s trường hợp, dị vòng 6 cạnh còn được thay thế bằng dị vòng 5
cạnh (furran) (H nh 1.5):
Hình 1.5. Khung của Aurones
1.1.3. Phân loại flavonoid
Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của g c aryl (vòng B) và các mức
đ oxi hóa của mạch 3C [46, 59] Người ta chia ra làm 4 loại chính sau [25]:
1.1.3.1. Major flavonoids
Là các flavonoid có g c aryl ở vị trí C-2 (Bảng 1.1)
Bảng 1.1. M t s flavonoids thu c lớp Major flavonoids
Hợp chất Cấu trúc
chung
Flavonoids Kiểu thay thế
(-OH, -OMe)
Flavonols Auranetin
Betuletol
Datiscetin
Europetin
Exoticin
Fisetin
Galangin
,6,7,8, ‘-OMe
3,5,7-OH, 6, ‘-OMe
, ,7, ‘-OH
, , ‘, ‘, ‘-OH, 7-OMe
, ,6,7,8, ‘, ‘, ‘-OMe
,7, ‘, ‘-OH
3,5,7-OH

6
Gossypetin
Herbacetin
Hibiscetin
Isorhamnetin
Kaempferol
Laricitrin
Melanoxetin
Morin
Myricetin
Natsudaidain
Ombuin
Pratoletin
Quercetagetin
Quercetin
Robinetin
Rhynchosin
Tamarixetin
Viscidulin I
, ,7,8, ‘, ‘-OH
, ,7,8, ‘-OH
, ,7,8, ‘, ‘, ‘-OH
, ,7, ‘-OH, ‘-OMe
, ,7, ‘-OH
, ,7, ‘, ‘-OH, ‘-OMe
,7,8, ‘, ‘-OH
, ,7, ‘, ‘-OH
, ,7, ‘, ‘, ‘-OH
3-OH, ,6,7,8, ‘, ‘-OMe
, , ‘-OH, 7, ‘-OMe
, ,8, ‘-OH
, ,6,7, ‘, ‘-OH
, ,7, ‘, ‘-OH
,7, ‘, ‘, ‘-OH
,6,7, ‘, ‘-OH
, ,7, ‘-OH, 4‘-OMe
, ,7, ‘,6‘-OH
Flavones Apigenin
Acacetin
Baicalein
Chrysin
Chrysoeriol
Diosmetin
Echioidinin
Farnisin
Genkwanin
Geraldone
Hypolaetin
,7, ‘-OH
5,7-OH- ‘-OMe
5,6,7-OH
5,7-OH
,7, ‘-OH, ‘-OMe
,7, ‘-OH, ‘-OMe
, ‘-OH, 7-OMe
7, ‘-OH, ‘-OMe
, ‘-OH, 7-OMe
7, ‘-OH, ‘-OMe
,7,8, ‘, ‘-OH

7
Isoetin
Isoscutellarein
Luteolin
Negletein
Norartocarpetin
Norwightin
Norwogonin
Oroxylin
Pedalitin
Primetin
Primuletin
Scutellarein
Takakin
Tangeretin
Tricetin
Tricin
Zapotin
,7, ‘, ‘, ‘-OH
,7,8, ‘-OH
,7, ‘, ‘-OH
5,6-OH, 7-OMe
,7, ‘ ‘-OH
,7,8, ‘, ‘-OH
5,7,8-OH
5,7-OH, 6-OMe
,6, ‘, ‘-OH, 7-Ome
5,8-diOH
5-OH
,6,7, ‘-OH
5,7,8-OH, ‘-OMe
,6,7,8, ‘-OMe
,7, ‘, ‘, ‘-OH
,7, ‘-OH, ‘, ‘-OMe
,6, ‘,6‘-OMe
Flavanon
es
Butin
Dihydrofisetin
Dihydrokaempferol
Dihydromyricetin
Dioclein
Eriodictyol
Hesperetin
Isosakuratein
Liquiritigenin
Naringenin
Pinocembrin
Sakauranetin
7, ‘, ‘-OH
,7, ‘, ‘-OH
, ,7, ‘-OH
, ,7, ‘, ‘, ‘-OH
, ‘, ‘-OH-6,7-OMe
,7, ‘, ‘-OH
,7, ‘-OH, ‘-OMe
5,7-OH, ‘-OMe
7, ‘-OH
,7, ‘-OH
5,7-OH
, ‘-OH-7-OMe

8
Taxifolin , ,7, ‘, ‘-OH
Flavanols (+)-Catechin
(-)-Epicatechin
Epiafzelechin
Epigallocatechin
Fisetinidol
Guibourtinidol
Mesquitol
Ortin
Robinetinidol
Luteoforol
Apiforol
Leucocyanidin
Leucofisetinidin
Leucorobinetinidin
, ,7, ‘, ‘-OH
, ,7, ‘, ‘-OH
, ,7, ‘-OH
, ,7, ‘, ‘, ‘-OH
,7, ‘, ‘-OH
,7, ‘-OH
,7,8, ‘, ‘-OH
,7,8, ‘-OH
,7, ‘, ‘, ‘-OH
, ,7, ‘, ‘-OH
, ,7, ‘-OH
, , ,7, ‘, ‘-OH
, ,7, ‘, ‘-OH
, ,7, ‘, ‘, ‘-OH
Anthocyan
idin
Cyanidin
Delphinidin
Malvidin
Pelargonidin
Peonidin
Petunidin
, ,7, ‘, ‘-OH
, ,7, ‘, ‘, ‘-OH
, ,7, ‘-OH, ‘, ‘-OMe
, ,7, ‘-OH
, ,7 , ‘-OH, ‘-OMe
, ,7, ‘, ‘-OH, ‘-OMe
1.1.3.2. Isoflavonoids
Bảng 1.2. M t s flavonoids thu c lớp Isoflavonoids
Hợp chất Cấu trúc chung Flavonoids Kiểu thay thế
(-OH, -OMe)

9
Isoflavones Biochanin A
Baptigenin
Cajanin
Daidzein
Demethyltexasi
n
Fomononetin
Genistein
Gliricidin
Glycitein
Kakkatin
Koparin
Orobol
Pratensein
Prunetin
Retusin
Santal
Tectorigenin
Texasin
Theralin
5,7-OH, ‘-OMe
7, ‘, ‘, ‘-OH
, ‘, ‘-OH,7-OMe
7, ‘-OH
6,7, ‘-OH
7-OH, ‘-OMe
,7, ‘-OH
7, ‘, ‘-OH, ‘-OMe
7, ‘-OH,6-OMe
6, ‘-OH,7-OMe
7, ‘, ‘-OH, ‘-OMe
,7, ‘, ‘-OH
,7, ‘-OH, ‘-OMe
, ‘-OH,7-OMe
7,8-OH, ‘-OMe
, ‘, ‘-OH,7-OMe
,7, ‘-OH,6-OMe
6,7-OH, ‘-OMe
7, ‘-OH, ‘-OMe
Isoflavanones Cajanol
Dihydrocajanin
Dihydrodaidzei
, ‘-OH,7, ‘-OMe
, ‘, ‘-OH,7-OMe
7, ‘-OH

10
n
Eryvarin M
Ferreirin
Isoferreirin
Homoferreirin
Kenusanone G
Lespedol C
Lespedol D
Vestitone
Violanone
7, ‘-OH, ‘, ‘-OMe
,7, ‘-OH, ‘-OMe
,7, ‘-OH, ‘-OMe
5,7-OH, ‘, ‘-OMe
,7, ‘-OH, ‘-OMe
7, ‘-OH, ;, ‘-OMe
7, ‘, ‘-OH, ‘-OMe
7, ‘-OH, ‘-OMe
7, ‘-OH, ‘, ;-OMe
Isoflavanols 7, ‘-
dihydroxyl- ‘-
Methoxyisoflav
anol
7, ‘-OH, ‘-OMe
Isoflavanes Demethylvestit
ol
Equol
Isovestitol
Mucronulatol
Neovestitol
Sphaeroisin
Vestitol
7, ‘, ‘-OH
7, ‘-OH
7, ‘-OH, ‘-OMe
7, ‘-OH, ‘, ‘-OMe
‘, ‘-OH,7-OMe
7, ‘-OH, ‘, ‘-OMe
7, ‘-OH, ‘-OMe
1.1.3.3. Neoflavonoids

11
Bảng 1.3. M t s flavonoids thu c lớp Neoflavonoids
(-OH, -OMe)
4-Arylcoumarin Allo-dalbergin
Contareagenin
Dalbergin
Isodalbergin
Methyldalbergin
Nordalbergin
6-OH,5-OMe
, ‘, ‘-OH,7-
OMe
6-OH,7-OMe
7-OH,6-OMe
6,7-OMe
6,7-OH
Neoflavenes Dalbergichrome
ne
6-Hydroxyl-2,7-
dimethoxyneofla
vene
6-OH,7-OMe
1.1.3.4. Minor flavonoids
Minor flavonoids là các flavonoids mà ở dị vòng 6- cạnh (vòng C) hoặc là
mở, như trong chalcone, hoặc thay thế bằng m t dị vòng 5-cạnh, như trong aurones
(aurones và auronols) (Bảng 1.4)
Bảng 1.4. M t s flavonoids thu c lớp Minor flavonoids
(-OH, -OMe)
Aurones Aureusidin
Bracteatin
,6, ‘, ‘-OH
,6, ‘, ‘, ‘-OH

12
Hamiltrone
Hispidol
Leptosidin
Sulfuretin
‘, ‘-OH,4,5,6-OMe
6, ‘-OH
6, ‘, ‘-OH,7-OMe
6, ‘, ‘-OH
Auronols Amaronol A
Amaronol B
Maesopsin
Alphitonin
,6, ‘, ‘, ‘-OH
,6, ‘, ‘-OH, ‘Ome
,6, ‘-OH
,6, ‘, ‘-OH
Chalcones Butein
Calythropstrin
Heliannone
Isoliquiritigenin
Naringeninchalcon
e
Tepanone
, , ‘, ‘ -OH
, , ‘-OH, ‘-OMe
, ‘-OH, ‘, ‘-OMe
, ‘, ‘-OH
, ‘, ‘,6‘-OH
2-OH,3,4,6-OMe
1.2. Á HỢP HÁT URONOL
1.2.1. Giới thiệu về aurone và auronol
1.2.1.1. Aurone
Các aurone với khung phân tử [2-benzylidenebenzofuran-3(2H)-ones] là các
hợp chất thu c họ flavonoids. Trong tự nhi n, c c aurone được tìm thấy ở thực vật,
chúng đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành sắc t của hoa và rau, quả.
Phần lớn các aurone ở cấu hình bền là dạng Z nhưng cấu hình dạnh E cũng được
tìm thấy trong m t s loài [17, 23, 69].

13
Hình 1.6. Hai đồng phân (Z)-, (E)-Aurone
So với các flavone thì aurone là hợp chất ít gặp trong tự nhi n Ng y nay đ có
khoảng tr n aurones đ được tìm thấy từ các nguồn tự nhiên, chủ yếu là thực
vật có hoa, m t v i lo i dương xỉ, rêu và tảo nâu biển ặc biệt là các dẫn xuất có
chứa nhiều nhóm hydroxyl (-OH) như aureusidin, sulfuretin, maritimetin v
bracteatin [11, 30, 48] Ngo i ra, cũng có ít aurone trong tự nhiên mang nhóm thế
methoxy, glycoside hoặc biaurone. Ví dụ c c methoxyaurrone như (Z)-6, ‘-
dihydroxy-4-methoxyaurone được phân lập từ Veratrum schindleri (họ
Melanthiaceae) [48], 5-hydroxy- ,6, ‘-trimethoxyaurone từ hoa của Helianthus
annuus [9], Hamiltrone ( ‘, ‘-dihydroxy-4,5,6-trimethoxyaurone) được phân lập từ
Uvaria hamiltonii [40] ; c aurone glycoside như almaisione được phân lập từ
Polygala dalmaisiana [63], Bidenoside được phân lập từ Bidens bipinnata [41] ;
c biaurone (aurone dimer) như dimer aurone–aurone: Aulacomniumbiaureusidin
được phân lập từ hai loài Aulacomnium [29] hoặc dimer aurone-flavanone:
Campylopusaurone phân lập từ rêu Campylopus clavatus and Campylopus
holomitrium [28]

14
Hình 1.7. Hydroxyaurones
Hình 1.8. Methoxyaurones

15
Hình 1.9. Aurones glycoside
Hình 1.10. Aurones dimer
1.2.1.2. Auronol
uronol l c c aurone đ được hydrate là chất hiếm gặp trong tự nhiên và ít
được nghiên cứu, có cấu trúc khung C6-C3-C6 tương ứng với các vòng A-C-B, bao
gồm hệ vòng benzofuranone liên kết với vòng benzylidene tại C-2 của vòng 5
furanone

16
Hình 1.11. Cấu trúc của auronol
So với aurone thì các auronol và cả auronol glycoside còn rất hiếm gặp trong
thi n nhi n hơn M t v i auronol aglycone đ được phân lập: alphitonin được phân
lập từ cây Alphitonia excelsa [7], hai auronol mới được phân lập từ vỏ cây
Pseudolarix amabilis (Pinaceae), đó l amaronols v B [73]. Ngoài xuất hiện ở
thực vật, auronol cũng có mặt ở tảo nâu biển Spatoglossum variabile, ‘-chloro-2-
hydroxyaurone, đây l dẫn xuất halogenated aurone đầu ti n được mô tả từ m t
nguồn tự nhiên . Bên cạnh, các auronol glycoside: Hovetrichosides C và D lần đầu
ti n cũng được phân lập từ vỏ cây Hovenia trichocarea cùng với maesopsin,
neolignan và phenylpropanoid glycosides [60, 36] i với các auronol dimer còn
hiếm gặp hơn, chúng cũng được phát hiện ở cây gỗ quý ở Nam Phi Berchemia
zeyheri (Rhamnaceae) .
Hình 1.12. Auronol aglycone

17
Hình 1.13. Auronol glycoside
1.2.2. ác phƣơng pháp tổng hợp auronol
Mặc dù là các hợp chất hiếm gặp v ít được nghiên cứu nhưng đ có m t s
các công b về tổng hợp toàn phần và bán tổng hợp các auronol như phương ph p
tổng hợp auronol theo I.G. Sweeny [32], phương ph p tổng hợp auronol theo
Kiehlmann and Li[22], Phương pháp tổng hợp auronol theo Reik Löser[61],
Phương ph p bán tổng hợp auronol theo Srikrishna và Mathews[6] của nhóm
nghiên cứu GS. Trần Văn Sung [70].
1.2.2.1. Phƣơng pháp tổng hợp auronol theo I.G. Sweeny
Theo I. G. Sweeny [32], tổng hợp auronol được thực hiện bằng phương ph p
khử hóa flavonol
Hình 1.14. Sơ đồ tổng hợp auronol của I. G. Sweeny
ầu tiên Na/NH3 khử hợp chất flavonol 76 tạo hợp chất 77, tại đây xuất hiện sự liên
hợp v được khử tiếp tục h nh th nh α-hydroxychalcone 78, hợp chất n y được
tautomer tạo thành trung gian 1,2-diketon 79 và thuận lợi đóng vòng (do có nhóm
carbonyl dương điện) tạo sản phẩm auronol 80.

18
1.2.2.2. Phƣơng pháp tổng hợp auronol theo Kiehlmann and Li
Phương ph p n y chủ yếu dùng để tổng hợp auronol l alphitonin, đi từ taxifolin
đun nóng trong môi trường acid hoặc kiềm [22]
Hình 1.15. Sơ đồ tổng hợp auronol của Kiehlmann and Li
Kiehlmann đ thực hiện phản ứng đồng phân hóa trực tiếp với taxifolin trong H2O ở
nhiệt đ cao thu được alphitonin với hiệu suất khá cao 78%. Như vậy, phương ph p
này hiệu quả hơn v có thể triển khai với lượng tác nhân lớn.
1.2.2.3. Phƣơng pháp tổng hợp auronol theo Reik Löser
Từ phản ứng ngưng tụ của benzofuranone với benzandehit tạo aurone Sau đó
aurone được tiến h nh qua c c bước oxi hóa và khử hóa cho sản phẩm có chứa 2-
Benzyl-2-hydroxybenzofuran-3(2H)-one [61], thể hiện qua sơ đồ Hình 1.16.
Hình 1.16. Sơ đồ tổng hợp auronol của Reik Löser
Phương ph p n y cho nhiều sản phẩm phụ o đó, bước chuyển hóa từ aurone
thành auronol vẫn l b i to n chưa được giải quyết.
1.2.2.4. Phƣơng pháp tổng hợp auronol theo Srikrishna và Mathews

19
Hình 1.17. Sơ đồ tổng hợp auronol theo Srikrishna và Mathews
Năm 9, Srikrishna v Mathews [- ] đ công b phương ph p tổng hợp
to n phần của auronol dimethylethermaesopsin 93 T c giả cũng đi từ hợp chất ban
đầu l phloroglucinol tổng hợp n n dẫn xuất methoxy benzofuranone, sau đó ngưng
tụ với dẫn xuất của benzaldehyde 89 tạo n n aurone Từ dẫn xuất aurone n y, t c
giả không tiến h nh oxy hóa trực tiếp m đi theo con đường vòng để chuyển hóa
aurone 90 thành auronol.
1.2.2.5. Phƣơng pháp bán tổng hợp auronol của nhóm nghiên cứu GS. Trần
Văn Sung
Năm , nhóm nghi n cứu của GS. Trần Văn Sung đ công b trên tạp chí
Phamazie về việc tách hai auronol glucoside có hoạt tính ức chế miễn dịch từ dịch
chiết n-butanol của lá cây Chay là maesopsin 4-O-glucoside (TAT2) và chất mới
alphitonin-4-O-glucoside (TAT6). Ngay sau khi phát hiện hoạt tính ức chế miễn

20
dịch của hai auronol glucoside TAT2 và TAT6 , nhóm của GS. Trần Văn Sung đ
nghiên cứu bán tổng hợp hai auronol: aglycone TAT2 (Ag-TAT2) và aglycone
TAT6 (Ag-TAT6) [70]. Những chất đầu sử dụng được tách từ rễ của cây thổ phục
linh là dihydrokaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside và astilbin.
Hình 1.18. Sơ đồ bán tổng hợp auronol theo GS. Trần Văn sung
Tác giả đ tiến hành phản ứng trong DMF sử dụng các tác nhân BnCl và K2CO3 ở
nhiệt đ cao thu được các auronol Ag-TAT2 và Ag-TAT6 với hiệu suất thấp và chỉ
dừng lại ở lượng nghiên cứu.
1.2.3. Hoạt tính sinh học của auronol
1.2.3.1. Kháng ký sinh trùng
Tổ chức y tế thế giới ước tính có khoảng 350 triệu người s ng có nguy cơ bị
nhiễm ký sinh trùng Leishmania. Tỷ lệ h ng năm của bệnh nhiễm trùng mới là 1,5 -
2 triệu cho Leishmaniasis da ( L) v hơn bệnh Leishmaniasis n i tạng
(VL). Gần đây có sự gia tăng rõ rệt trong sự trùng hợp giữa Leishmaniasis n i tạng
(VL) và nhiễm HIV do lây lan của đại dịch I S ồng nhiễm Leishmania / HIV
được coi là m t bệnh nổi c m. Trong các nghiên cứu trước đây về loại thu c mới
antiprotozoal (thu c điều trị bệnh nhiễm trùng đơn b o) đ t m thấy các sản phẩm
có nguồn g c tự nhiên có khả năng ức chế Leishmania. Hoạt đ ng của m t s
aurone v auronol như l thu c mới antiprotozoal có nguồn g c thực vật. Hầu hết
các aurone và auronol cho thấy ức chế hoạt đ ng của ti thể Leishmania major

21
fumarate reductase (FRD) ở nồng đ 25 µM hoặc cao hơn c aurone có hoạt đ ng
mạnh hơn c c auronol ụ thể 6-methoxyaurone; 4,6-dihydroxy aurone và 4,6,4′-
trihydroxy-3′-methoxyaurone ức chế ti thể FRD ở nồng đ 25 µM tương ứng là
97,4, 95.4 và 96.3%, còn auronol 6-Benzoyl-2-[phenylhydroxymethylene]-3(2H)-
benzofuran-3-ol là 83,6% và 4,6-Dihydroxy-2-[phenylhydroxymethylene]-3(2H)-
benzofuran-3-ol là 79,8% [56]
Oliver Kayser và c ng sự lần đầu tiên báo cáo về aurone như thu c tiềm
năng cho c c bệnh nhiễm trùng Leishmania v đ được x c định in vitro cho cả khả
năng gây đ c trực tiếp ch ng lại promastigotes ngoại bào của Leishmania donovani,
L. infantum, L. enriettii, và L. major, và amastigote n i bào của L. donovani cư trú
trong c c đại thực bào chu t. Aurone hoạt đ ng nhất 6-hydroxyaurone [53] có EC50
ở ngoại bào 0,45 µg/mL và EC50 1,40 µg/mL ở n i bào[53].
Hình 1.19 . Một số aurone và auronol hoạt động ức chế kí sinh trùng
Ngoài ra, m t loạt các aurone trong tự nhi n đ được tổng hợp và thử nghiệm
in vitro về khả năng ức chế giai đoạn hồng cầu của các chủng Plasmodium
falciparum, đây l chủng gây bệnh s t rét. Hợp chất hoạt đ ng nhất l ,6, ′-
triacetyl- ′, ′-dimetoxyaurone với giá trị IC50 = 0,007 µM [53, 54]
Li n quan đến hoạt tính ch ng kí sinh trùng, Souard và c ng sự cũng đ tổng
hợp và phân tích 35 aurone cho khả năng của chúng như l thu c ch ng s t rét. Tất
cả các sản phẩm không gây đ c tế bào trong dòng tế bào của người. Hầu hết các
hợp chất được thử nghiệm in vitro trên chu t v không đ c hại đ i với chính các

22
chu t. Phân tích m i quan hệ hoạt tính - cấu trúc cho thấy dimethyl hóa ở vị trí 4,6
(IC50 = 60,3 µM) là có lợi hơn ,6-hydroxyaurone (IC50 = 94,5 µM). Mặt khác, qua
điều tra nghiên cứu việc thay thế nguyên tử oxi vòng C bởi m t nhóm N-H
(azaurone) l m tăng hoạt tính của sản phẩm, đặc biệt là nhóm thế ethyl ở vị trí ′
của dimethylazaurone là hoạt đ ng t t nhất (IC50 = 1,0 µM) [39]
1.2.3.2. Kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm
Việc tìm kiếm các thu c kháng nấm mới đ đạt được đ ph t triển trong thập
kỷ qua, đ ng chú ý l c c sản phẩm bắt nguồn từ tự nhiên hoặc tổng hợp.
Nói về tiềm năng ch ng viêm, m t s dẫn xuất auronol đ được nghiên cứu
về khả năng n y [14, 64, 20]. Các aurones mimic (Hình b) được tổng hợp tương tự
như sulfuretin ( ‘, ‘,6-trihydroxyaurone) (Hình a) - m t chất được tìm thấy có khả
năng l m giảm việc sản xuất các chất trung gian gây viêm: nitric oxide (NO) và
prostaglandin E2 (PGE2) do các vi sinh vật như lipopolysaccharide (LPS) kích
thích đại thực bào tiết ra. Qua phân tích m i quan hệ cấu trúc- hoạt đ ng cho thấy
các aurone mimic có m t nhóm hydroxyl tại C6 ở vòng A và nhóm methoxy tại các
vị trí trên vòng B ức chế việc sản xuất NO và PGE2 mạnh hơn sulfuretin [64]. Cụ
thể, sulfuretin (ức chế NO và PGE2 với giá trị IC50 lần lượt là 28,97; 5,90µM), 6-
hydroxy- ‘-methoxyaurone (23,38; 3,79µM), 6-hydroxy- ‘-methoxyaurone (23,51;
2,00µM), 6-hydroxy- ‘, ‘-dimethoxyaurone (23,92; 2,90µM), 6-hydroxy- ‘, ‘-
dimethoxyaurone (22,64; 1,67µM). Chwan -Fwu Lin và c ng sự đ t ch được
auronol mới cudrauronol (2,6-dihydroxy-4-methoxy-2-[( ‘, ‘-dihydroxyphenyl)
methyl]-3(2H)-benzofuranone) (Hình c) từ Cudrania cochinchinensis có khả năng
ch ng vi m tr n cơ sở ức chế sản xuất NO [20].

23
Hình 1.20. Các aurone và auronol có khả năng chống viêm
1.2.3.3. Hệ miễn dịch và ảnh hưởng của thực vật đối với hệ miễn dịch
Hệ miễn dịch là mạng lưới vô cùng phức tạp của các tế bào, mô v c c cơ
quan, hoạt đ ng cùng nhau giúp bảo vệ cơ thể ch ng lại sự tấn công của các sinh
vật lạ. Các tác nhân xâm nhập như virus, vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm cũng như c c
r i loạn của tế bào. Hệ miễn dịch tạo ra các kháng thể và các tế bào đặc biệt để tấn
công và giết chết các vi sinh vật lạ, các tế bào bất thường đó
Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất có hoạt tính miễn dịch rất cao. Hoạt
tính miễn dịch của m t s auronol có khả năng kh ng kí sinh trùng: auronol có khả
năng kh ng vi m như cudrauronol ( ,6-dihydroxy-4-methoxy-2-[( ′, ′-
dihydroxyphenyl) methyl]-3(2H)-benzofuranone) . ặc biệt, theo nhóm nghiên cứu
của GS. Trần Văn Sung, hai auronol maesopsin 4-O-β-D-glucoside (TAT2) và
alphitonin 4-O- β-D-glucoside (TAT6) có khả năng ức chế miễn dịch mạnh hơn cả
cyclosporin A - m t chất ức chế miễn dịch được sử dụng r ng rãi trong lâm sàng
hiện nay để ngăn ngừa thải ghép hoặc trong điều trị các bệnh tự miễn dịch khác
nhau. Nồng đ ức chế miễn dịch của chúng từ 0,156 mg/mL hoặc cao hơn, chẳng
hạn ở nồng đ 1,25 mg/mL khả năng ức chế hoạt đ ng của chúng lần lượt là 99,6%
và 99,3% [16].
1.3. HỢP HẤT HỨ NITRILE TRONG HÓ DƢỢ VÀ PHƢƠNG
PHÁP TỔNG HỢP DẪN XUẤT NITRILE
Hiện nay có hơn hợp chất chứa nitrile được sử dụng trong các thu c chỉ
định với th m hơn sản phẩm chứa nitrile được phát triển lâm sàng. Vai trò của

24
các tác nhân nitrile trong y học đ nổi lên và ngày m t được chú trọng. Các cu c
điều tra cho thấy tác dụng hữu ích của các hợp chất chứa nitrile trong y học tập
trung chủ yếu vào nhóm −CN [- ]. Nhóm chức năng nitrile (– ≡N) l nhóm
phân tử nhỏ có vai trò như m t nhóm hydroxyl hay nhóm carboxyl, có khả năng tạo
liên kết hydro với các amino acid, các khung protein, enzyme hay với các phân tử
nước trong phân tử[49, 43, 42, 27].
* Một số phương pháp tổng hợp dẫn xuất nitrile cơ bản
- Phản ứng Kolbe: là phản ứng SN2 giữa m t alkyl halogenua (X= Br, Cl)
béo với cyanua kim loại kiềm trong dung môi DMSO hoặc acetone.
- Phản ứng Van Leusen: phản ứng chuyển đổi m t ketone thành m t nitrile
trong m t bước duy nhất sử dụng tosylmethyl isocyanide (TosMIC).
- Phản ứng theo Williamson ether: được sử dụng để tổng hợp O-acetonitrile,
phản ứng SN2 giữa alkoxides (hoặc phenoxide) với dẫn xuất halogenua hình thành
sản phầm ether.

25
HƢƠNG 2 – ỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHI N ỨU
2.1. ối tƣợng nghiên cứu
Maesopsin Alphitonin
2-(4-hydroxybenzyl)-2,4,6-trihydroxy
benzofuran-3(2H)-one (Ag-TAT2)
2-(3,4-dihydroxybenzyl)-2,4,6-trihydroxy
benzofuran-3(2H)-one (Ag-TAT6)
2.2. Mục tiêu
Tổng hợp m t s các dẫn xuất nitrile của hai auronol alphitonin, maesopsin
và khảo sát hoạt tính kích thích tế bào lympho, hoạt tính đ c tế bào của các chất
tổng hợp được.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
- Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện với bản mỏng tr ng s n -Alufolien 60
F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện vệt chất bằng đ n tử ngoại ở hai
bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thu c thử l dung dịch ceri sulfat trong
acid H2SO4, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.
- Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tr ng s n silica gel 6 G
F254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng đ tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm
và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thu c thử l dung dịch H2SO4 %, hơ
nóng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản mỏng như cũ để x c định vùng chất; sau đó
cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung
môi thích hợp.

26
- Sắc ký cột (CC)
Sắc ký c t được tiến hành với chất hấp phụ l Silica gel pha thường và pha
đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel
pha đảo YMC RP-18 (30- 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion
Diaion HP-20 ((Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).
- Sắc lý lỏng cao áp (HPLC)
Sắc ký lỏng cao áp Agilent technologies 1200 Series của Viện Hóa sinh biển,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.2. Phương pháp tổng hợp và tinh chế sản phẩm
- Các phản ứng được thực hiện bằng c c phương ph p tổng hợp hữu cơ cơ
bản như phương ph p khử, phương ph p oxi hóa, phương ph p ankyl hóa, phương
pháp glucosyl hóa ... Ngoài ra còn sử dụng m t s phương ph p tổng hợp hữu cơ
đặc thù như: phản ứng Houben - Hoesch, phản ứng ngưng tụ Claisen - Schmidt ...
- Phương ph p sắc ký lớp mỏng được sử dụng để giám sát tiến trình xảy ra
của các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng.
- Các hợp chất sau phản ứng được phân lập và tinh chế bằng c c phương
pháp chiết, phương ph p sắc ký c t, phương ph p kết tinh ...
- Tất cả các hóa chất dùng trong quá trình tổng hợp được mua từ các hãng:
Sigma Aldrich, Merck và sử dụng mà không cần tinh chế lại.
- Các dung môi sử dụng được cất lại hoặc l m khan theo điều kiện phản ứng.
2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
Phương ph p chung để x c định cấu trúc ho học của các hợp chất là sự kết
hợp x c định giữa các thông s vật lý với c c phương ph p phổ hiện đại bao gồm:
- Phổ hồng ngoại (FT-IR) được đo bằng m y NI OLET IMP T-410 FTIR
của h ng arl Zeiss Jena ( ức) tại Viện Hóa học – Viện Khoa học v ông nghệ
Việt Nam

27
- Phổ kh i lượng (ESI-MS) được ghi tr n m y gilent 6 ion trap tại Viện
Hóa học c c hợp chất thi n nhi n – Viện H n lâm Khoa học v ông nghệ Việt
Nam.
- Phổ c ng hưởng từ hạt nhân (NMR) chiều v chiều sử dụng chất n i
chuẩn l TMS (δ = 0ppm), dung môi CDCl3 hoặc DMSO-d6 được ghi tr n m y
Bruker AM500 FT-NMR của Viện Ho học, Viện H n lâm Khoa học v ông nghệ
Việt Nam ở tần s , MHz cho phổ 1
H-NMR v ở tần s ,76 MHz cho phổ
13
C-NMR ấu trúc của c c hợp chất được x c định bằng sự kết hợp c c phương
pháp phổ v so s nh t i liệu
2.4. hảo sát hoạt tính kích thích tế bào lympo và hoạt tính độc tế bào của
các chất tổng hợp đƣợc
Khảo sát hoạt tính kích thích tế bào lympo và hoạt tính đ c tế bào trên dòng
tế b o thường NIH/3T3 và 4 dòng tế b o ung thư: ung thư vú M F7, ung thư phổi
LU- , ung thư biểu mô KB v ung thư gan HepG được thực hiện tại phòng thử
nghiệm sinh học- Viện Công nghệ sinh học - Viện hàn lâm khoa học và công nghệ
Việt Nam.
2.4.1. Hoạt tính kích thích tế bào lympo
a/ Vật liệu nghiên cứu
- Tế bào lympho tổng s thu nhận trực tiếp từ máu ngoại vi thỏ.
- Thỏ dòng Newzeland White do Trung tâm dê thỏ Ba Vì cung cấp, có kh i
lượng từ , đến 2,5 kg. Thỏ được nuôi ổn định m t tuần trước khi thí nghiệm tại
khu nuôi đ ng vật của Viện Công nghệ sinh học.
- Môi trường nuôi cấy tế bào là RPMI-1640 (Roswell Park Memorial
Institute medium) và các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, Gibco,
Invitrogen …
b/ Phƣơng pháp nghiên cứu
Phương pháp phân lập tế bào lympho tổng số:

28
ược thực hiện theo thường quy phân lập tế bào lympho từ máu ngoại vi sử
dụng Ficol paque của GE LIFE SCIENCE
https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/13
14729545976/litdoc71716700AG_20110830221438.pdf) và theo Bøyum A (1974).
Phương pháp xác dịnh khả năng kích thích miễn dịch thông qua tăng sinh
tế bào lympho
ược thực hiện theo phương ph p x c định khả năng tăng sinh tế bào nhờ
MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) của
Mosmann và cs (1983) và Scudiero AD và cs (1988). Về nguyên lí, tế bào lympho
phân lập trực tiếp là những tế b o thường, không có khả năng tăng sinh v bất tử
nên sẽ chết sau 1-2 ngày nuôi cấy in vitro Ngo i ra, MTT dưới t c đ ng của hệ
enzyme của ti thể trong các tế bào s ng v tăng sinh sẽ bị chuyển hóa thành dạng
formazan có màu xanh tím. Do vậy, tế bào s ng càng nhiều th MTT được chuyển
hóa thành formazan nhiều, giá trị O thu được càng lớn. Từ đó x c định được khả
năng cảm ứng tăng sinh tế bào lympho của mẫu cần nghiên cứu.
2.4.2. Hoạt tính độc tế bào
a/ Vật liệu nghiên cứu
Dòng tế b o ung thư: M F7 (ung thư vú ở người); HepG (ung thư gan ở
người) và SK-LU- (ung thư phổi ở người).
Dòng tế b o thường: NIH/3T3 (Nguyên bào sợi của phôi chu t là tế bào
lành)
Môi trường nuôi cấy tế bào là DMEM ( ulbecco′s Modified Eagle′s
medium) và các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, Gibco, Invitrogen …
b/ Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro: ược thực hiện theo thường quy
nuôi cấy của Ngân hàng tế bào Mỹ - American Type Cell Collection (ATCC -
Manassas, VA 20110 USA).

29
Phương ph p x c định hoạt tính gây đ c tế bào tế bào in vitro: Được thực
hiện theo phương ph p của Monks và cs ( 99 ) Phương ph p n y được Viện Ung
thư Qu c gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử đ
đ c tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng k m h m sự phát
triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử tiến h nh x c định h m lượng
protein tế bào tổng s dựa vào mật đ quang học (OD – Optical ensity) đo được
khi thành phần protein của tế b o được nhu m bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá
trị O m y đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein o đó
lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.

30
HƢƠNG 3 - TH NGHIỆM
3.1. TỔNG HỢP H I URONOL LPHITONIN VÀ M ESOPSIN
3.1.1. Bán tổng hợp Alphitonin
lphitonin đ được tổng hợp theo phương ph p của Kiehlmann bằng phản
ứng đồng phân hóa taxifolin Taxifolin đ được điều chế từ sự thủy phân astilbin
m t hợp chất có h m lượng rất cao (~ 1%) trong rễ cây Thổ phục linh (Smilax
glabra Wall ex Roxb.) ở Việt Nam [5]. c bước phân lập astilbin, điều chế
taxifolin và phản ứng đồng phân hóa taxifolin được tr nh b y trong sơ đồ sau:
Hình 3.1. Sơ đồ tổng quát bán tổng hợp alphitonin (3)
stilbin đ được phân lập từ rễ thổ phục linh Việt nam tại phòng Công nghệ Hóa
dược – Viện Hóa sinh biển
Chất 1 (Astilbin) là chất rắn màu trắng, tnc: 1830
C – 1850
C
FT-IR max (cm-1
): 3427, 3263, 2912, 1640, 1603,
1519, 1476, 1363, 1301, 1177, 1070, 977.
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 6,98 (1H, d, J
= 2,0 Hz, H- ′), 6,86 ( H, dd, J = 8,0, 2,0 Hz, H-6′),
6,83 (1H, d, J = 8,0 Hz, H- ′), ,9 ( H, d, J = 2,0

31
Hz, H-6), 5,92 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 5,10 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-2), 4,60 (1H, d,
J = 10,5 Hz, H-3), 4,28 (1H, dq, J = 6,0, 9,6 Hz, H- ′′), , 7 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-
′′), ,68 ( H, dd, J = 3,0, 9,6 Hz, H- ′′), , 6 ( H, dd, J = 1,5, 3,0 Hz, H- ′′), ,
(1H, m, H- ′′), , ( H, d, J = 6,0 Hz, H-6′′).
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,0 (C=O), 168,5 (C-7), 165,5 (C-
5), 164,1 (C-9), 147,4 (C- ′), 6, ( - ′), 9, ( - ′), , ( -6′), 6, ( - ′),
115,5 (C- ′), , ( -10), 102,1 (C- ′′), 97, ( -6), 96,2 (C-8), 83,9 (C-2), 78,5
(C-3), 73,8 (C- ′′), 72,2 (C- ′′), 7 ,8 ( - ′′), 7 , ( - ′′), 7,8 ( -6′′)
Taxifolin được điều chế từ sự thủy phân astilbin
Sơ đồ phản ứng:
Hình 3.2. Phản ứng thủy phân astilbin (1) điều chế taxifolin (2)
stilbin ( , 9 g; mmol) v MeOH (8 mL) được lần lượt cho v o b nh cầu
cổ có lắp sinh h n hồi lưu có phễu nhỏ giọt v đặt tr n bếp gia nhiệt có khuấy từ
Hỗn hợp được khuấy cho tan hết astilbin sau đó dung dịch H l % ( , mL;
mmol) được nhỏ giọt từ từ v o trong khoảng phút Sau khi nhỏ hết H l, hỗn hợp
phản ứng được hồi lưu trong khoảng – giờ, kiểm tra SKLM khi astilbin bị thủy
phân ho n to n th dừng phản ứng ất loại bớt dung môi rồi th m H2O (2 – 5mL)
v o v chiết hỗn hợp phản ứng bằng ethyl acetate ( × mL) Kết hợp dịch chiết,
rửa bằng nước đến pH = rồi l m khan v quay cất loại dung môi thu được sản
phẩm thô m u v ng nhạt ( , g) Sản phẩm thô được t ch sắc ký c t nhanh tr n
silica gel với hệ n-hexan/EA (1/2; v/v) thu được , 9 g Sau đó được kết tinh lại từ

32
hỗn hợp dung dịch MeOH/H2O ( / ; v/v) thu được , 8 g taxifolin m u v ng nhạt,
hiệu suất phản ứng đạt 8 % T° n/c: -224º C.
Chất 2 (taxifolin) là chất rắn màu trắng
FT-IR: νKBr (cm-1
): 3416, 3195, 2854, 1644, 1614, 1479, 1267, 1169.
ESI-MS (m/z ): 303 [M-H]-
.
1
H-NMR (CD3OD; 500 MHz): δ (ppm) 6,98 (1H, d, J
= 2,0 Hz, H- ‘); 6,87 ( H, dd, J = 2,0 , 8,0 Hz; H-6‘,);
6,82 (1H, d, J = 8,0 Hz, H- ‘); ,9 ( H, d, J = 2,0 Hz,
H-6); 5,90 (1H, d, J = 2,0 Hz; H-8); 4,93 (1H, d, J =
11,5 Hz, H-2); 4,52 (1H, d, 11,5 Hz, H-3).
13
C-NMR (CD3OD; 125 MHz): δ (ppm) 198,4 (C=O);
168,7 (C-5), 165,3 (C-7), 164,5 (C-9); 147,2 (C- ‘), 6, ( - ‘), 9,9 ( - ‘),
120,9 (C-6‘); 6, ( - ‘), ,9 ( - ‘), ,9 ( -10); 97,3 (C-6); 96,3 (C-8), 85,1
(C-2); 73,7 (C-3).
lphitonin đ được bán tổng hợp từ taxifolin, phản ứng được tiến hành theo
qui trình trong tài liệu [- ] theo sơ đồ hình 3.3.
Hình 3.3. Sơ đồ bán tổng hợp alphitonin (3) từ taxifolin (2)
Hỗn hợp dung dịch của taxifolin (15 mmol), nước DI(105 ml) trong m t bình kín
m t cổ được làm lạnh rồi hút chân không và nạp khí nitơ v o Sau đó, b nh phản
ứng được đun tr n bếp cách dầu với nhiệt đ dầu truyền nhiệt l n đến 155 o
C và
thời gian phù hợp 96 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng được để
ngu i, lọc loại bỏ kết tủa m u v ng được x c định là quercetin. Dịch nước được
chiết bằng etylaxetat khoảng 5 lần đến hết sản phẩm auronol (kiểm tra bằng

33
SKLM). Dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4 , rồi quay cất loại dung môi. Phần
cặn thô được phân tách trên c t silicagen với hệ dung môi CH2Cl2/EA(2/1) cho
alphitonin (2,964g ) với hiệu suất ~ 65,01%.
Chất 3 (Alphitonin) là chất rắn màu vàng nhạt
ESI-MS (negative): m/z = 303 [M-H]-
.
1
H NMR (Acetone-d6, 500 MHz): δ (ppm)
9,65 (1H, brs, OH), 7,70 (1H, br s, OH),
7,66 (1H, br s, OH), 6,72 (1H, d, J = 2,0
Hz, H- ′), 6,6 ( H, d, J = 8,0 Hz, H- ′),
6,54 (1H, d, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6′), 6,
(1H, br s, OH), 5,86 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-
5), 5,82 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 3,05 (1H, d, J = 13,5 Hz, Hb-10), 3,02 (1H, d, J =
13,5 Hz, Ha-10).
13
C NMR (Acetone-d6, 125 MHz): δ (ppm) 195,4 (C=O), 172,5 (C-8), 169,6
(C-6), 158,8 (C-4), 145,3 (C- ′), ,7 ( - ′), 6, ( - ′), ,9 ( -6′), 8, ( -
′), , ( - ′), 7, ( -2), 102,7 (C-9), 96,7 (C-5), 91,4 (C-7), 41,8 (C-10).
3.1.2. iều chế maesopsin
Maesopsin được điều chế từ sự thủy phân của glucoside maesopsin-4-O-β-D-
glucopyranoside (9) là hợp chất được phân lập từ lá cây Chay Bắc b . Phản ứng
thủy phân được trình bày theo sơ đồ H nh 3.4.
Hình 3.4. Sơ đồ điều chế maesopsin (4)

34
Auronol glucoside Maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (TAT2, 9) được
phân lập từ lá Chay Bắc b tại phòng Công nghệ Hóa dược.
ESI-MS (m/z): 449[M-H]ˉ
.
1
H-NMR (500 MHz, DMSO): δ (ppm)
9,14 (OH), 7,56, 7,52 (1 × OH),
6,93/6,91 (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′,6′),
6,56/6,54 (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, ′),
6,00 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-5), 5,93 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-7), 5,20, 5,13, 5,06, 5,01
(4 × OH), 4,97/4,90 (1H, d, J = 7,5 Hz, H- ′′), , 9/ , ( × OH), ,6 / ,6 ( H,
br m, Ha-6′′), , 8 ( H, m, Hb-6′′), , 9 - 3,20 (m, H- ′′, H- ′′, H- ′′, H- ′′), 2,96 và
2,90 (2H, 2 × d, J = 13,5 Hz, CH2-10).
13
C-NMR (125 MHz, DMSO): δ (ppm) 192,8/192,4 (C=O), 171,9 (C-8),
168,5 (C-6), 156,8/156,7 (C-4), 155,9 (C- ′), , ( - ′), , / , 7( - ′),
114,7/114,6 (C- ′), ,6/ , ( -2), 102,0/101,8 (C-9), 99,5/99,3 (C- ′′),
95,8/95,3 (C-5), 91,7/91,5 (C-7), 77,2/77,1 (C- ′′), 76,8/76,7 ( - ′′), 7 , /7 ,9 ( -
′′), 69, /69, ( - ′′), 6 , /6 , ( -6′′), , ( -10).
uronol maesopsin thu được từ sự thủy phân auronol glucoside 9
Trong m t bình cầu đ được lắp sinh hàn và máy khuấy từ, gia nhiệt, hỗn
hợp dung dịch của chất 9 ( , g; mmol) v MeOH ( mL) được nhỏ từ từ HCl
10% (15 mL) vào trong thời gian phút Sau đó hỗn hợp phản ứng được đun hồi
lưu trong h, kiểm tra SKLM thấy glucoside đ bị thủy phân hết, cất loại dung môi,
phần dịch nước còn lại cho vào chiết với EA (5 × 5 mL). Dịch chiết được kết hợp
lại, rửa với nước mu i bão hòa (2 × 5 mL), làm khan bằng Na2SO4 v được cô quay
dưới chân không thấp thu được 0,43 g chất rắn. Chất rắn được phân lập bằng SKC
c t trên silica gel sử dụng hệ dung môi rửa giải n-hexan/E ( / ) thu được 0,216 g
sản phẩm maesopsin với hiệu suất 75%.

35
Chất 4 (Maesopsin) là chất rắn màu vàng nhạt
ESI-MS (m/z): 286,9 [M-H]-
.
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,02
(2H, d, J = 9 Hz, H- ′, H-6′), 6, 9 ( H, d, J =
8,5 Hz, H- ′, H- ′), ,78 ( H, br s, H-7), 5,74
(1H, br s, H-5), 3,08 (2H, brs, CH2-10).
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm)
196,8(C=O), 173,9 (C-8), 171,0 (C-6), 159,9 (C- 4), 157,2 (C- ‘), , ( - ′, -
6′), ,9 ( - ′), 115,7 (C- ′, - ′), 7, ( -2), 103,1 (C-9), 96,8 (C-5), 91,1 (C-
7), 42,1 (C-10).
3.2. TỔNG HỢP Á DẪN XUẤT NITRILE Ủ H I URONOL
ALPHITONIN VÀ MAESOPSIN
Các dẫn xuất nitrile của auronol maesopsin (4), alphitonin (3) được tổng hợp theo
sơ đồ
Hình 3.5. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất nitrile của chất 3 và 4

36
3.2.1. Tổng hợp dẫn xuất nitrile một nhóm thế của alphitonin và maesopsin
Trong m t bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, nhiệt kế v được nạp đầy khí N2, hỗn
hợp dung dịch của chất 3 (hoặc chất 4) (1,0 mmol) và cloroacetonitrile (0,069 mL;
, mmol) trong dimethylacetamide ( mL) được cho dần NaOH (44 mg; 1,1
mmol) v o Sau đó, hỗn hợp được khuấy trong 10 phút tại 0o
C và 24 giờ ở nhiệt đ
phòng. Sau khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM), hỗn hợp được làm lạnh
đến 0o
v được trung hòa bằng axit H l N đến pH = 6 rồi chiết với EtOAc (3 ×
20 mL). Dịch chiết được kết hợp lại, được làm khan bằng Na2SO4, được cô quay
dưới chân không thấp loại dung môi thu được sản phẩm thô. Phần cặn thô được tách
trên c t silica gel pha đảo (H2O/MeOH gradient) thu được dẫn xuất nitrile 1 nhóm
thế: chất 5 (hiệu suất 37,5%) hoặc chất 6 (39,8%).
Chất 5 Alphitonin-4-O-acetonitrile
1
H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm)
8,65 (2H, br s, OH), 7,51 (1H, br s, OH), 6,54
(1H, d, J = 2,0 Hz, H- ′), 6, 9 ( H, d, J = 8,0
Hz, H- ′), 6, 6 ( H, dd, J = 2,0 , 8,0 Hz, H-
6′), ,98 ( H, br s, H-5), 5,96 (1H, br s, H-7),
5,19 và 5,13 (2H, 2 × d, J = 16,0 Hz, OCH2-CN), 2,90 và 2,82 (2H, 2 × d, J =
14,0 Hz, CH2-10).
13
C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 192,4 (C=O), 172,3 (C-8), 169,4 (C-6),
155,5 (C-4), 144,4 (C- ′), ,8 ( - ′), ,6 ( - ′), , ( -6′), 7,8 ( - ′),
116,0 (CN), 115,0 (C- ′), ,9 ( -2), 101,3 (C-9), 94,4 (C-5), 92,3 (C-7), 53,5 (O-
CH2-CN), 40,7 (C-10).
Chất 6: Maesopsin-4-O-acetonitrile
ESI-MS (negative): m/z = 326 [M-H]-.

37
1
H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm)
9,12 (1H, br s, OH), 7,49 (1H, br s, OH),
6,91 (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, H-6′), 6,
(2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, H- ′), ,9 ( H,
br s, H-5), 5,87 (1H, br s, H-7), 5,17 và
5,12 (2H, 2 × d, J = 16,5, O-CH2-CN), 2,93 và 2,87 (2H, 2 × d, J = 13,5 Hz,
CH2-10).
13
C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 191,8 (C=O), 172,2 (C-8), 170,5 (C-6),
155,8 (C- ′), , (C-4), 131,2 (C- ′, -6′), , ( - ′), 6, ( N), ,6 ( - ′,
C- ′), ,8 ( -2), 100,6 (C-9), 94,9 (C-5), 92,4 (C-7), 53,4 (O-CH2-CN), 40,5 (C-
10).
3.2.2. Tổng hợp dẫn xuất nitrile hai nhóm thế của lphitonin và Maesopsin
Trong m t bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, nhiệt kế v được nạp đầy khí N2,
hỗn hợp dung dịch của chất 3 (hoặc chất 4) (1,0 mmol) và cloroacetonitrile (0,138
mL; , mmol) trong dimethylacetamide ( mL) được cho dần NaOH (88 mg; 2,2
mmol) v o Sau đó, hỗn hợp được khuấy trong 10 phút tại 0o
C và 24 giờ ở nhiệt đ
phòng. Sau khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM), hỗn hợp được làm lạnh
đến 0o
v được trung hòa bằng acid H l N đến pH = 6 rồi chiết với EtOAc (3 ×
20 mL). Dịch chiết được kết hợp lại, được làm khan bằng Na2SO4, được cô quay
dưới chân không thấp loại dung môi thu được sản phẩm thô. Phần cặn thô được tách
trên c t silica gel pha đảo (H2O/MeOH gradient) thu được dẫn xuất nitrile 2 nhóm
thế: chất 7 (hiệu suất 37%) hoặc chất 8 ( 39%).
Chất 7: Alphitonin-4,6-di-(O-acetonitrile)
ESI-MS (negative): m/z = 417 [M+2H2O-H]-
, 381 [M-H]-
.
1
H NMR (500 MHz, CD3OD): δ
(ppm) 6,64 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- ′), 6,
(1H, d, J = 8,0 Hz, H- ′), 6, ( H, dd, J =

38
2,0 , 8,0 Hz, H-6′), 6, 8 ( H, d, J = 2,0 Hz, H-7), 6,24 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5), 5,00
– 5,12 (4H, m, 2 × O-CH2-CN), 3,10 và 3,06 (2H, d, J = 13,5, CH2-10).
13
C NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,6 (C=O), 174,7 (C-8), 168,4 (C-
6), 157,0 (C-4), 145,6 (C- ′), , ( - ′), ,9 ( - ′), , (C-6′), 8,7 ( - ′),
116,0, (CN), 115,9 (C- ′, N), 8, ( -2), 106,1 (C-9), 95,9 (C-5), 92,7 (C-7),
55,0 (O-CH2-CN), 54,8 (O-CH2-CN), 42,2 (C-10).
Chất 8: Maesopsin-4,6-di-(O-acetonitrile)
.
1
H NMR (500 MHz, CD3OD): δ
(ppm) 7,01 (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, H-6′),
6,58 (2H, d, J = 8,5 Hz, H- ′, H- ′), 6, 9
(1H, d, J = 1,8 Hz, H-7), 6,24 (1H, d, J = 1,8
Hz, H-5), 5,00 – 5,10 (4H, m, 2 × O-CH2-CN), 3,16 và 3,11 (2H, d, J = 14,0 Hz,
CH2-10).
13
C NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,5 (C=O), 174,6 (C-8), 168,4 (C-
6), 157,3 (C- ′), 7, ( -4), 132,5 (C- ′, -6′), , ( - ′), ,9 ( N), ,8 ( -
′, - ′, N), 8, ( -2), 106,1 (C-9), 96,01 (C-5), 92,7 (C-7), 55,0 (O-CH2-CN),
54,8 (O-CH2-CN), 41,9 (C-10).
3.3. THỬ HO T TÍNH SINH HỌ Ủ Á DẪN XUẤT NITRILE Ã
TỔNG HỢP ƢỢ
3.3.1. Hoạt tính kích thích lympho bào
Phương pháp phân lập tế bào lympho tổng số:
ml m u được lấy từ tĩnh mạch thỏ khỏe mạnh, ch ng đông bằng heparin và
phủ lên thể tích ficoll paque tương đương Sau đó ly tâm ở t c đ 3000 vòng / phút
trong 30 phút. Tách, thu lấy lớp giữa, loại bỏ hồng cầu còn lại bằng NH4Cl. Sau khi
ly tâm, cặn tế b o được hòa lại trong HBSS. S tế b o được đếm bằng buồng đếm
neubaurer. Tế bào lympho sau khi thu nhận được hòa lại trong môi trường nuôi cấy

39
RPMI có bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) với nồng đ tế bào 2 ×
106
tế bào/mL.
Phương pháp xác định khả năng kích thích miễn dịch thông qua tăng sinh
tế bào lympho
Phép thử được thực hiện như sau:
Tế bào lympho (180 L ) được đưa v o c c giếng của đĩa 96 giếng với nồng
đ 2 × 106
tế bào/mL.
Các chất thử 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 (phân lập và tổng hợp), pha trong DMSO
% được đưa v o c c giếng của khay 96 giếng để có nồng đ là 100 g/mL; 20
g/mL; 4 g/mL; 0,8 g/mL oncavalin được sử dụng l m đ i chứng với nồng
đ là 5 g/mL, 2,5 g/mL, 1,25 g/mL và 0,625 g/mL. Mẫu được ủ trong 48h ở
37 o
C, 5% CO2.
3 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào (180 L) sẽ được sử dụng
l m đ i chứng âm.
Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, thêm vào mỗi giếng 50 L MTT 1
mg/mL. Sau khi ủ đĩa tế bào ở 37o
C trong 4h, loại bỏ môi trường và thêm vào mỗi
giếng 100 L MSO ĩa tế b o được đưa l n m y lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và
sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về h m lượng màu qua
phổ hấp phụ ở bước sóng 490nm. Chỉ s kích thích (SI – stimulate index) được tính
theo công thức:
Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác.
MSO % luôn được sử dụng như đ i chứng âm. Chất thử nào có SI > 1,2
sẽ được xem là có khả năng kích thích miễn dịch. Nồng đ kích thích 50% sự phát

40
triển của tế bào (SD50 – Stimulate Dose at SI= 1,5) sẽ được x c định nhờ vào phần
mềm máy tính TableCurve 2Dv4
3.3.2. Hoạt tính độc tế bào
Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro
Các dòng tế b o được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy
DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0
mM sodium pyruvate, 1% PSF (Penicilline-Streptomycine-Fungizone), ngoài ra bổ
sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).
Tế b o được cấy chuyển sau 3 - 5 ngày với tỉ lệ (1/3) và nuôi trong tủ ấm
CO2 ở điều kiện 37o
C, 5% CO2.
Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)
Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
Chất thử (20 L) pha trong MSO % được đưa v o c c giếng của khay 96
giếng để có nồng đ 100 g/mL; 20 g/mL; 4 g/mL; 0.8 g/mL.
Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế b o v đếm trong buồng đếm để
điều chỉnh mật đ cho phù hợp với thí nghiệm.
Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 180 L môi
trường) v để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày.
M t khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT ( 8 L) sẽ
được sử dụng l m đ i chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đ i chứng ngày 0 sẽ được c
định tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA.
Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế b o được c định v o đ y giếng
bằng T trong phút, được nhu m bằng SRB trong 1 giờ ở 37 o
ổ bỏ SRB
và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không
khí ở nhiệt đ phòng.

41
Cu i cùng, sử dụng mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đ
bám và nhu m các phân tử protein, đưa l n m y lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử
dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về h m lượng màu của
chất nhu m SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng s ng sót của tế
bào khi có mặt chất thử sẽ được x c định thông qua công thức sau:
% ức chế = 100% - % sống sót
Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine
(Sigma) luôn được sử dụng như l chất đ i chứng dương v được thử nghiệm ở các
nồng đ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL.
MSO % luôn được sử dụng như đ i chứng âm. Giá trị IC50 (nồng đ ức
chế 50% sự phát triển) sẽ được x c định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve
2DV4. Chất thử nào có IC50 < 20 g/mL (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa
học) hoặc IC50  4 g/mL (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây
đ c tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt TBUT.

42
HƢƠNG 4 - ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TỔNG HỢP H I URONOL LPHITONIN VÀ M ESOPSIN
4.1.1. Bán tổng hợp auronol alphitonin
Hình 4.1. Sơ đồ tổng quát bán tổng hợp alphitonin
Alphitonin (3) đ được chúng tôi nghiên cứu tổng hợp theo phương ph p của
Kielhmann bằng phản ứng đồng phân hóa taxifolin dưới tác dụng của nhiệt Phương
pháp này thể hiện nhiều ưu điểm là nguyên liệu từ nguồn thực vật trong nước, phản
ứng chỉ có bước và sử dụng dung môi nước rất thân thiện với môi trường. Hợp
chất đầu taxifolin được điều chế từ astilbin có h m lượng rất cao (~ 1%) trong rễ
Thổ phục linh (S. glabra) [5].
Astilbin được phân lập tại phòng Công nghệ Hóa dược có s liệu phổ phù hợp với
tài liệu [5 ]
Taxifolin (C15H22O7, 2) thu được từ sự thủy phân của astilbin là nguồn
nguyên liệu cho việc nghiên cứu bán tổng hợp alphitonin. Astilbin đ được thủy
phân bằng H l/MeOH theo phương ph p thông thường. Sản phẩm thủy phân đ
được phân lập kết hợp SKC và kết tinh thu được taxifolin sạch. Cấu trúc của sản
phẩm đ được x c định bằng c c phương ph p phổ phù hợp với cấu trúc phân tử và
các dữ liệu phổ của taxifolin đ được công b .

43
Phổ kh i ion hóa phun mù điện tử cho pic ion âm giả phân tử [M-H]ˉ
với m/z=
phù hợp với trọng lượng phân tử taxifolin Tr n phổ proton 1
H-NMR của sản
phẩm thủy phân, taxifolin, không còn c c tín hiệu của đường Rhamnose, chỉ còn
c c tín hiệu của c c proton của vòng , B, Ở vùng trường thơm l tín hiệu của
proton methine thơm của vòng v B, vòng B cho c c tín hiệu của c c proton
thơm hệ BX ở δC 6,98 ppm (d, H- ′) với Jmeta = , Hz, ở δC 6,87 (dd, H-6′) với
Jmeta = 2,0 Hz và Jortho = 8, Hz, ở δC 6,82 (d, H- ′) với J = 8,0 Hz; vòng A cho các
tín hiệu doublet của proton thơm meta ở δC 5,94(d, H-5); 5,90 (d, H-7) với Jmeta =
2,0 Hz Ở trường cao hơn l cặp doublet của vòng ở δC 4,92 (d, H-2) và δC 4,52
(d, H- ) với J = , Hz l tương t c của c c Haxial vicinal ở vị trí trans.
Phổ 13
C-NMR của hợp chất 2 (H nh) cho tín hiệu của carbon của khung
flavonol ít thay đổi so với trong phân tử glucoside (astilbin) Hai vòng v B cho
c c tín hiệu của carbon ở vùng trường thơm gồm tín hiệu của carbon thơm
li n kết với oxy của ở δC 168,71 (C-7), 165,32 (C-5), 164,52 (C-9); 147,15 (C- ′),
146,32 (C- ′) v carbon methine thơm ở δC 120,90 (C-6′); 6, ( - ′), ,89
(C- ′), 97, ( -6); 96,28 (C-8) v carbon thơm bậc ở δC 129,88 (C- ′), ,8
(C- ) Vòng cho tín hiệu ở δC 198,41 (CO); 85,13 (C-2); 73,68 (C-3). Các tín
hiệu n y khẳng định khung chắc chắn của flavonol taxifolin

44
Hình 4.2. Phổ 1
H-NMR giãn của chất 2 (CD3OD)
Hình 4.3. Phổ 13
C-NMR của chất 2 (CD3OD)

45
Phản ứng đồng phân hóa taxifolin tổng hợp alphitonin
Hình 4.4. Sơ đồ phản ứng đồng phân hóa taxifolin tổng hợp alphitonin
Phản ứng đồng phân hóa taxifolin được giả thiết xảy ra theo cơ chế tr nh b y trong
Hình 4.5.
Hình 4.5. Sơ đồ cơ chế phản ứng đồng phân hóa taxifolin
Theo Kielhmann, Paul ở nhiệt đ cao hay có mặt của xúc tác acid/base, liên
kết 1-2 (C-O) trong vòng dị t C mở ra tạo thành quinone methide 2a. Hợp chất

46
quinone methide 2a hoặc có thể đóng vòng lại cho hỗn hợp sản phẩm 2d gồm 4
đồng phân (±)-taxifolin và (±)-epimertaxifolin; hoặc tautomer hóa hình thành
chalcone 2b rồi diketone 2c v đóng vòng với sự cấu trúc lại thành vòng 5 bền hơn
cho sản phẩm (±)-alphitonin (3) Paul đ chứng minh sự có mặt của đồng phân
(±)-taxifolin và (±)-epimertaxifolin trong giai đoạn đầu của hỗn hợp phản ứng dựa
trên phổ v đ phân lập được cả đồng phân này. Quá trình cấu trúc lại thành
vòng 5 hình thành (±)-alphitonin đ được cả Kielhmann v Paul đề nghị qua hợp
chất trung gian diketone 2c ể giải thích cho sự hình thành sản phẩm racemate
Paul đ đưa ra trạng thái chuyển tiếp của diketone 2c kết hợp với 2 phân tử nước
với các mức năng lượng nhỏ có thể dễ d ng vượt qua ở nhiệt đ phòng. Do sự
racemate nhanh của alphitonin n n không thu được sản phẩm chọn lọc lập thể của
phản ứng.
Phổ NMR của hợp chất 3 cho c c tín hiệu của c c proton v carbon khung
auronol, c c s liệu phổ phù hợp với cấu trúc phân tử v với c c s liệu đ được
công b Phổ kh i ion hóa phun mù điện tử cho pic ion âm phân tử đề proton hóa
[M-H]-
với m/z = phù hợp với công thức phân tử 15H12O7.

47
Hình 4.6. Phổ ESI-MS của chất 3
Hình 4.7. Phổ 1
H-NMR của chất 3 (acetone- d6)
Ở vùng trường thấp phổ proton 1
H-NMR (H nh 4.7) cho c c tín hiệu singlet tù
của c c proton OH ở δH 9,65, 7,70, 7,76. Ở vùng trường thơm cho tín hiệu của

48
proton thơm của vòng v B Vòng B cho tín hiệu của proton dạng BX ở
δH 6,72 (d, J = 2 Hz, H- ‘); ở δH 6,61 (d, J = 8,0 Hz, H- ‘) v ở δH 6,54 (dd, J = 2,0
và 8,0 Hz, H-6‘) Vòng cho cặp doublet của c c proton meta ở δH 5,86 (d, H-5)
v ở δH 5,82 (d, H-7) với hằng s tương t c Jmeta = 1,5 Hz. Hai proton metylene
CH2-10 cho doublet ở δH , v ở δH , với hằng s tương t c Jgem = 13,5 Hz.
Hình 4.8. Phổ 13
C-NMR của chất 3 (acetone- d6)
Phổ carbon 13
C-NMR (H nh 4.8) cho tín hiệu của carbon khung auronol
bao gồm carbon thơm vòng v B, carbon thu c vòng v m t carbon
methylene Hai vòng thơm , B cho tín hiệu của carbon thơm li n kết với oxy ở
C 172,5(C-8), 169,6 (C-6), 158,8 (C-4), 145,3 (C- ‘) và 144,7 (C- ‘); 6 tín hiệu của
6 carbon methine thơm ở C 122,9 (C- ‘), 118,5 (C-6‘), , ( - ‘), ở C 96,7 và
91,4 (C-5 và C- 7), tín hiệu của carbon thơm bậc ở C 126,3 (C- ‘) v ,7
(C-9). Vòng cho tín hiệu của carbon carbonyl ở C 195,4 (3- =O) v tín hiệu của
carbon hemicetal ở C 107,0 (C- ) Ở trường cao l tín hiệu của carbon methylene
C- ở C ,8 Như vậy c c tín hiệu phổ NMR khung auronol của aglycone

49
alphitonin (chất 3) ít thay đổi so với trong phân tử glucoside của nó (chất 10) Phổ
HSQ (phụ lục) cho c c tương t c -H trực tiếp và HMBC (H nh 4.9) cho các
tương t c xa của proton H2-10 (3,05, 3,02 ppm)/C-2 (107,0 ppm)/C- ‘( 6,
ppm)/C-6‘ ( ,9 ppm)/ - ‘ ( 8, ppm)/ -3 (19 , ppm), cùng với đ chuyển
dịch thấp bất thường của carbon -8 (172,5 ppm) và C-6 ( 69,6 ppm) do ảnh hưởng
sức căng vòng (vòng ), đ chứng minh cấu trúc khung auronol của chất 3.
Hình 4.9. Phổ HMBC của chất 3 (acetone- d6)
4.1.2. iều chế Maesopsin
Kết quả phân lập hợp chất auronol glucoside maesopsin-4-O-β-D-
glucopyranoside (9) từ lá cây Chay Bắc b (A. Tonkinensis ) cho thấy hợp chất
auronol glucoside maesopsin-4-O-β-D-Glc (9) có h m lượng khá lớn trong lá cây
Chay Bắc b (> 0,07 %). Vì vậy hợp chất maesopsin-4-O-β-D-Glc (9) đ được sử
dụng là nguồn cung cấp auronol maesopsin (4). Từ lá cây Chay Bắc B (10 kg lá
khô) đ phân lập được 7 g chất 9 sạch có s liệu phổ phù hợp với tài liệu [- ]

50
Thủy phân 9 sạch (5 g) bằng HCl loãng ở điều kiện đun hồi lưu nhẹ trong
methanol thu được 3,75 g maesopsin với hiệu suất 75%.
Phổ NMR của auronol 4 cho c c tín hiệu của c c proton v carbon khung
auronol v không còn c c tín hiệu của phần đường v ta cũng không thấy xuất hiện
c c tín hiệu kép trong phổ NMR của nó Ở vùng trường thơm, phổ 1
H-NMR cho 2
cặp doublet của proton thơm hệ ′XX′ vòng B ở H 7,01 (H- ′, H-6′) v 6, 9
(H- ′, H- ′) với hằng s tương t c Jortho = 8, Hz, ở trường cao hơn l tín hiệu
singlet tù của proton thơm meta vòng ở H 5,78 (1H, H-5) và H 5,74 (1H, H-7).
Phổ 13
C-NMR (H nh 4.11) cho tín hiệu của carbon khung auronol: gồm
carbon thơm vòng v B, trong đó tín hiệu của carbon thơm li n kết với oxy
ở C 173,7 (C-8), 171,0 (C-6), 159,7 (C-4), 157,2 (C- ′); 6 tín hiệu của 6 carbon
methine thơm ở C 132,5 (C- ′, -6′), ,7 ( - ′, - ′) v ở C 96,8, 91,1 (C-5, C-
7), tín hiệu của carbon thơm bậc ở C 125,9 (C- ′) v ở C 103,1 (C-9); Vòng C
cho tín hiệu của carbon carbonyl ở C 196,8 (3- =O) v m t carbon hemicetal ở C
107,4 (C- ); Ngo i ra ở trường cao l tín hiệu của carbon methylene - ở C 42,1.
Phổ HSQ (phụ lục) cho c c tương t c -H trực tiếp v HMB (phụ lục) cho các
tương t c xa của proton H2-10 (3,08 ppm)/C-2 (107,0 ppm)/C- ′( ,9 ppm)/ - ′,
6′ ( , ppm)/ - ( 96,8 ppm), cùng với đ chuyển dịch thấp bất thường của
carbon C-8 ( 7 ,9 ppm) do ảnh hưởng sức căng vòng (vòng ) đ chứng minh
cấu trúc khung auronol của chất 4. Phổ kh i ESI-MS (phụ lục a) của chất 4 cho
pic ion âm giả phân tử m/z = 287 [M-H]ˉ
phù hợp với s kh i công thức phân tử
C15H12O6.

51
Hình 4.10. Phổ 1
H-NMR của chất 4 (CD3OD)
Hình 4.11. Phổ 13
C-NMR của chất 4 (CD3OD)

52
4.2. TỔNG HỢP Á DẪN XUẤT NITRILE Ủ H I URONOL
ALPHITONIN VÀ MAESOPSIN
Các dẫn xuất nitrile của hai auronol alphitonin (3) và maesopsin (4) được
trình bày trong H nh
Hình 4.12. Sơ đồ chung điều chế dẫn xuất nitrile của hai auronol 3 và 4
Phản ứng tổng hợp c c dẫn xuất nitrile của c c auronol được tiến h nh
trong môi trường kiềm ở nhiệt đ ° cho c c sản phẩm thế lần v lần phụ
thu c v o tỉ lệ mol của chất nền v c c t c nhân Ở tỉ lệ mol của c c t c nhân l
auronol /chloroacetonitrile/NaOH ( / , / , ; mol/mol/mol) ta thu được sản phẩm
lần thế v o vị trí - l chất 5 v chất 6 Khi tăng tỉ lệ mol của xúc t c base v
chloroacetonitrile l n gấp hơn lần lượng mol của chất phản ứng (3 hoặc 4) ta thu
được c c sản phẩm thế lần v o vị trí C-4 và C-6 l chất 7 và 8 Nếu ta tiếp tục
tăng tỉ lệ mol của xúc t c base v chloroacetonitrile l n gấp hơn hay lần lượng
mol của c c auronol ta cũng chỉ thu được sản phẩm thế lần v o vị trí -4 và C-
6 Sự ưu ti n thế v o vị trí -OH và 6-OH có thể được giả thiết l do ảnh hưởng của
nhóm =O vòng đ hoạt hóa c c nhóm -OH và 6-OH qua c c n i đôi li n hợp v
thế khi lượng t c nhân phản ứng dư ta sẽ thu được c c sản phẩm thế ở c c vị trí n y
Ở tỉ lệ mol của c c t c nhân l auronol/chloroacetonitrile/NaOH (1/1,1/1,1;
mol/mol/mol) ta thu được sản phẩm lần thế v o vị trí - có thể do sự kết hợp của
hiệu ứng –C và –I của nhóm -C=O. Ngo i hiệu ứng –C, nhóm 3-C=O còn có
hiệu ứng –I l m bền ion phenolate ở -C-Oˉ
nên khả năng phản ứng nucleophine của
nhóm n y tạo sản phẩm ở - thuận lợi hơn so với ở -6 v cho ta sản phẩm ở -4

53
trước Kết quả thực nghiệm đ cho thấy phản ứng thế ưu ti n hơn v o vị trí - m t
lần nữa chứng tỏ không có li n kết cầu hydro giữa nhóm -OH (vòng ) với nhóm
3-C=O (vòng ) như đ được khẳng định bởi tín hiệu r ng v thấp của c c nhóm
OH hai vòng , B ở dưới ppm tr n phổ 1
H-NMR của alphitonin Kết quả thu
được sản phẩm ưu ti n thế v o nhóm -OH của khung auronol rất thú vị nó đ
chứng minh sự bắt gặp auronol glucoside (chất 9, 10) với nhóm đường gắn v o vị
trí C- trong tự nhi n
Phản ứng tổng hợp c c hợp chất auronol-O-acetonitrile (5, 6, 7, 8), l phản
ứng tổng hợp Williamson ether, xảy ra theo cơ chế như sau:
Với sự có mặt của xúc t c base, phenol h nh th nh phenolate đóng vai trò
như l t c nhân i nhân tấn công v o carbon dương điện trong phân tử
chloroacetonitrile h nh th nh do sự hút điện tử của nguy n tử clo thay thế clo v
h nh th nh li n kết -O mới cho sản phẩm ether rOCH2CN.
 Khảo sát các điều kiện phản ứng tổng hợp nitrile một nhóm thế của
alphitonin (3) và maesopsin (4)
Hợp chất 5 và 6 được tổng hợp theo quy trình chung , các yếu t ảnh hưởng
đến hiệu suất của phản ứng đ được khảo sát về:
Tỉ lệ mol tác nhân maesopsin hoặc alphitonin / chloroacetonitrile / NaOH
Dung môi phản ứng.
Các kết quả thu được được trình bày trên bảng dưới đây:

54
Bảng 4.1. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng
tổng hợp dẫn xuất nitrile một nhóm thế của hai auronol 3 và 4
Stt 3/4
(mmol)
ClCH2CN
(mmol/ml)
NaOH
(mmol/mg)
Dung môi
(ml)
Hiệu suất
(%)
1 1 0,9/0,056 0,9/36 DMF(10ml) 30,5/30
2 1 0,9/0,056 0,9/36 DMAc(10ml) 31/31
3 1 1,0/0,063 1,0/40 DMF(10ml) 31/31
4 1 1,0/0,063 1,0/40 DMAc(10ml) 32,5/32
5 1 1,1/0,069 1,1/44 DMF(10ml) 37/35
6 1 1,1/0,069 1,1/44 DMAc(10ml) 37,5/39,8
7 1 1,3/0,082 1,3/52 DMF(10ml) 33,5/34
8 1 1,3/0,082 1,3/52 DMAc(10ml) 34/34,8
9 1 1,5/0,094 1,5/60 DMF(10ml) 33/36
10 1 1,5/0,094 1,5/60 DMAc(10ml) 33,5/36,5
Từ các kết quả thu được trong bảng trên chúng tôi lựa chọn tỉ lệ mol của các
tác nhân alphitonin(maesopsin)/chloroacetonitrile/NaOH là 1/1,1/1,1 trong dung
môi dimethylacetamide cho hiệu suất cao nhất là 37,5% với 5 và 39,8% với 6. Cấu
trúc của các sản phẩm đ được chứng minh bằng c c phương ph p phổ cho thấy
trong điều kiện phản ứng không ảnh hường đến cấu trúc khung auronol, các sản
phẩm mang m t nhóm thế acetonitrile cho các tín hiệu của chất đầu alphitonin hoặc
maesopsine với các tín hiệu mới của m t nhóm thế acetonitrile (-CH2CN).

55
* Alphitonin-4-O-acetonitrile (5)
Tương tự như alphitonin, phổ NMR của hợp chất 5 cho c c tín hiệu của c c
proton v carbon khung auronol với m t nhóm thế acetonitrile, c c s liệu phổ phù
hợp với cấu trúc phân tử Phổ kh i ion hóa phun mù điện tử cho pic ion âm phân tử
đề proton hóa [M-H]ˉ
với m/z= 342 [M-H]ˉ
phù hợp với công thức phân tử
C17H13NO7 dự đo n phân tử sản phẩm có th m nhóm (-CH2CN) (Hình 4.13.).
Phổ proton 1
H-NMR của chất 5 (Hình 3.14) cho c c tín hiệu singlet tù ở
vùng trường thấp của c c proton OH ở δH 9,6 , 7, , Ở vùng trường thơm cho tín
hiệu của proton thơm của vòng v B gồm tín hiệu của proton methine
thơm dạng BX của vòng B ở δH 6,54 (d, J = 2,0 Hz, H- ′); ở δH 6,49(d, J = 8,0 Hz,

56
H- ′) v ở δH 6,36 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6′); singlet tù của proton meta vòng A
ở δH 5,98 (H- ) v ở δH 5,96 (H-7) Tiếp theo l doublet mới của proton
metylene li n kết với oxy của nhóm thế acetonitrile (-CH2 N) ở δH , 9 v δH 5,13
với hằng s tương t c Jgem = 16,0 Hz. Ở vùng trường cao l tín hiệu của nhóm
methylene CH2- ở δH ,9 v ở δH ,8 với hằng s tương t c Jgem = 10,0 Hz.
Phổ carbon 13
C-NMR của chất 5 (Hình 4.15) cho tín hiệu của 7 carbon bao
gồm carbon khung auronol v carbon mới của nhóm acetonitrile Khung
auronol bao gồm carbon thơm vòng v B, carbon thu c vòng v m t
carbon methylene Hai vòng thơm , B cho tín hiệu của carbon thơm li n kết
với oxy ở C 172,3 (C-8), 169,4 (C-6), 155,4 (C-4), 144,4 (C- ′) và 143,8 (C- ′);
tín hiệu của carbon methine thơm ở C 121,2 (C-6′), 7,8 (C- ′), 115,5 (C- ′),
94,4 (C-5) và C 92,3 (C- 7); tín hiệu của carbon thơm bậc ở C 124,6 (C- ′) v
C 101,3 (C-9). Vòng cho tín hiệu của carbon carbonyl ở C 192,4 (3-C=O) và
carbon hemicetal ở C 105,9 (C- ); tín hiệu carbon methylene của H2- ở C 40,7.
Nhóm acetonitrile cho c c tín hiệu mới của carbon ankinyl li n kết với nitơ ở C
116,0 (-CN) và carbon methylene li n kết với oxy ở C 53,5 (-CH2 N) Phổ
HSQ (phụ lục ) cho c c tương t c -H trực tiếp v HMB (Hình 3.16) cho các
tương t c xa của proton H2-10 (2,90 và 2,82 ppm)/C-2 (105,9 ppm)/C- ′( ,6
ppm)/C-6′ ( , ppm)/ - ′ ( 7,8 ppm)/C- ( 9 , ppm), cùng với đ chuyển
dịch thấp bất thường của carbon -8 (172,3 ppm) và C-6 ( 69, ppm) do ảnh hưởng
sức căng vòng (vòng ), đ chứng minh cấu trúc khung auronol của chất 5. ặc
biệt, phổ HMB đ b c l cấu trúc của alphitonin-4-O-acetonitrile với tín hiệu
tương t c xa của proton metylene của nhóm thế acetonitrile với - ở -OCH2CN (
5,19-5,13 ppm) / C- ( , ppm) đ khẳng định nhóm acetonitrile (-OCH2 N) đ
được gắn v o vị trí s của khung auronol (Hình 4.16)

57
Hình 4.14. Phổ 1
H-NMR của chất 5 (DMSO- d6)
C-NMR của chất 5 (DMSO- d6)

58
Hình 4.16. Phổ HMBC của chất 5 (DMSO- d6)
* Maesopsin-4-O-acetonitrile (6)
Tương tự chất 5, chất 6 cho c c s liệu phổ phù hợp với cấu trúc phân tử bao
gồm cấu trúc khung auronol maesopsin v nhóm thế acetonitrile Phổ kh i ion hóa
phun mù điện tử cho pic ion âm phân tử đề proton hóa [M-H]ˉ
với m/z = 326 [M-H]ˉ
phù hợp với công thức phân tử 17H13NO6 dự đo n phân tử sản phẩm có th m
nhóm (-CH2 N) (phụ lục ) Phổ 1
H-NMR của chất 6 cho c c tín hiệu singlet tù của
các proton nhóm hydroxy phenolic (Ph-OH) ở δH 9,12 và 7,49. Vòng thơm B cho
cặp doublet của proton dạng ′XX′ ở δH 6,91 (H- ′, 6′) v ở δH 6,53 (H- ′, ′)
với J = 8, Hz Vòng cho tín hiệu singlet tù của hai proton meta ở δH 5,91 (H-5)

59
và δH 5,87(H-7) c tín hiệu doublet mới của proton methylene li n kết với oxy
của nhóm acetonitrile (-OCH2 N) ở δH 5,17 và δH , với Jgem = 6, Hz Ở
trường cao l doublet của proton geminal của H2-10 ở δH 2,93 và δH ,87 với
hằng s tương t c lớn Jgem = 13,5 Hz. Phổ 13
C-NMR của chất 6 (Hình 4.17) cho tín
hiệu của 7 carbon bao gồm tín hiệu của khung maesopsin v tín hiệu của
carbon của nhóm thế acetonitrile (-OCH2CN). Khung auronol maesopsin bao gồm
carbon thơm vòng v B, carbon thu c vòng v m t carbon methylen
Hai vòng thơm , B cho tín hiệu của carbon thơm li n kết với oxy ở C 172,2
(C-8), 170,5 (C-6), 155,8 (C- ′), , ( - ); 6 tín hiệu của 6 carbon methine thơm
ở C 131,2 (C- ′, 6′), ,6 ( - ′, ′), 9 ,9 ( -5) và 92,4 (C- 7); tín hiệu của
carbon thơm bậc ở C 124,1 (C- ′) v ,6 ( -9). Vòng cho tín hiệu của
carbon carbonyl ở C 191,8 (3- =O) v carbon hemicetal ở C 105,8 (C- ) Ở vùng
trường cao cho tín hiệu carbon methylene ở C 40,5 (CH2-10). Nhóm acetonitrile
cho c c tín hiệu mới của carbon ankinyl li n kết với nitơ ở C 116,1 (-CN) và 1
carbon methylene li n kết với oxy ở C 53,4 (-CH2 N) Phổ HSQ (phụ lục) cho
c c tương t c -H trực tiếp v HMB (H nh) cho c c tương t c xa của proton
methylene nhóm CH2-10 (2,93 và 2,87 ppm)/C-2 (105,8 ppm)/C- ′( , ppm)/ -
′, 6′ ( , ppm)/ -3 (191,8 ppm). ặc biệt, phổ HMB đ b c l cấu trúc của
maesopsin-4-O-acetonitrile 6 với tín hiệu tương t c xa của proton metylene li n kết
với oxy của nhóm thế O-acetonitrile với - ở -OCH2CN (5,17- 5,12 ppm) / C-4
( , ppm) đ khẳng định nhóm acetonitrile (-OCH2 N) đ được gắn v o vị trí s
của khung auronol (Hình 4.18)

60
C-NMR của chất 6 (DMSO- d6)
Hình 4.18. Phổ HMBC của chất 6 (DMSO- d6)

61
 Khảo sát các điều kiện tổng hợp nitrile hai nhóm thế của alphitonin và
maesopsin
Hợp chất 7 và 8 được tổng hợp theo húng tôi đ khảo sát các yếu t ảnh
hưởng đến hiệu suất phản ứng như:
Tỉ lệ mol tác nhân alphitonin (maesopsin ) / chloroacetonitrile / NaOH.
Lượng dung môi phản ứng.
Các kết quả thu được được trình bày trên :
Bảng 4.2 Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng
tổng hợp dẫn xuất nitrile hai nhóm thế của hai auronol 3 và 4
Stt 3/4
(mmol)
ClCH2CN
(mmol/ml)
NaOH
(mmol/mg)
Dung môi
(ml)
Hiệu suất
(%)
1 1 1,8/0,113 1,8/72 DMF(20ml) 28,9/32
2 1 1,8/0,113 1,8/72 DMAc(20ml) 29,1/32,5
3 1 2,0/0,125 2,0/80 DMF(20ml) 29/33
4 1 2,0/0,125 2,0/80 DMAc(20ml) 31,5/34
5 1 2,2/0,138 2,2/88 DMF(20ml) 37/35
6 1 2,2/0,138 2,2/88 DMAc(20ml) 37/39
7 1 2,5/0,156 2,5/100 DMF(20ml) 33/36
8 1 2,5/0,156 2,5/100 DMAc(20ml) 33,5/36,5
9 1 4,0/0,125 4,0/160 DMF(20ml) 25/28
10 1 4,0/0,125 4,0/160 DMAc(20ml) 25,5/29,5

62
Từ c c kết quả thu được trong bảng tr n chúng tôi lựa chọn tỉ lệ mol của c c
tác nhân alphitonin(maesopsin)/chloroacetonitrile/NaOH là 1/2,2/2,2 trong dung
môi dimethylacetamide cho hiệu suất cao nhất l 7% (chất 7) v 9% (chất 8).
ấu trúc của c c sản phẩm đ được chứng minh bằng c c phương ph p phổ
cho thấy trong điều kiện phản ứng không ảnh hưởng đến cấu trúc khung auronol
c sản phẩm mang nhóm thế acetonitrile cho c c tín hiệu tương tự của chất đầu
alphitonin (hoặc maesopsine) v c c tín hiệu mới của nhóm thế O-acetonitrile (-
OCH2CN).
* Alphitonin-4,6-di-(O-acetonitrile) (7)
Tương tự như trong trường hợp dẫn xuất alphitonin mang m t nhóm thế (5),
phổ NMR của hợp chất 7 cho c c tín hiệu của c c proton v carbon khung auronol
alphitonin với nhóm thế acetonitrile, c c s liệu phổ phù hợp với cấu trúc phân tử
Phổ kh i ion hóa phun mù điện tử cho pic ion âm phân tử đề proton hóa [M-H]ˉ
với
m/z = 381 [M-H]ˉ
phù hợp với công thức phân tử 19H14N2O7, dự đo n phân tử sản
phẩm có th m nhóm acetonitrile (-CH2CN) (Hình 4.19) Tr n phổ proton 1
H-
NMR của chất 7 (Hình 4.20), ở vùng trường thơm, vòng v B cho tín hiệu của
proton methine thơm gồm tín hiệu của proton dạng BX của vòng B ở δH
6,64 (d, J = 2,0 Hz, H- ′); ở δH 6,55 (d, J = 8,0 Hz, H- ′) v ở δH 6,51 (dd, J = 2,0,
8,0 Hz, H-6′); singlet tù của proton meta vòng ở δH 6,38 (H-7) v ở δH 6,24
(H- ) với Jmeta = , Hz, như vậy do ảnh hưởng của nhóm acetonitrile đ chuyển
dịch của proton vòng đ thay đổi, H-7 đ dịch chuyển xu ng trường thấp hơn
H- Tiếp theo l cụm multiplet mới của proton của nhóm metylene li n kết với
oxy của nhóm thế acetonitrile ở δH 5,00 - 5,12 (OCH2 N) Ở vùng trường cao l
tín hiệu proton methylene ở δH 3,10 và 3,06 (CH2- ) với hằng s tương t c Jgem =

63
, Hz Phổ carbon 13
C-NMR của chất 7 (phụ lục ) cho tín hiệu của 9 carbon bao
gồm carbon khung auronol v carbon mới của nhóm acetonitrile Khung
auronol bao gồm carbon thơm vòng v B, carbon thu c vòng v m t
carbon methylene Hai vòng thơm , B cho tín hiệu của carbon thơm li n kết
với oxy ở C 174,7 (C-8), 168,4 (C-6), 157,0 (C-4), 145,6 (C- ′) v , ( - ′);
tín hiệu của carbon methine thơm ở C 123,1 (C-6′), 8,7 (C- ′), 115,9 (C- ′),
95,9 (C-5) và 92,7 (C- 7); tín hiệu của carbon thơm bậc ở C 125,9 (C- ′) v
106,1 (C-9). Vòng C cho tín hiệu của carbon carbonyl ở C 196,6 (3-C=O) và
carbon hemicetal ở C 108,1 (C- ) Hai nhóm acetonitrile cho c c tín hiệu mới của
carbon ankinyl li n kết với nitơ ở C 116,0 và C 115,9 (2 × CN) và 2 carbon
methylene li n kết với oxy ở C 55,0 và C 54,4 (2 × OCH2 N) Ở trường cao cho
tín hiệu carbon methylene ở C 42,2 (CH2-10).

64
Hình 4.20. Phổ 1
H-NMR của chất 7 (CD3OD)
Hình 4.21. Phổ HMBC của chất 7 (CD3OD)

Luận văn: Dẫn xuất nitrile của 2 auronol alphitonin và maesopsin

Luận văn: Dẫn xuất nitrile của 2 auronol alphitonin và maesopsin

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (17)

Similar to Luận văn: Dẫn xuất nitrile của 2 auronol alphitonin và maesopsin

Similar to Luận văn: Dẫn xuất nitrile của 2 auronol alphitonin và maesopsin (20)

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Luận văn: Dẫn xuất nitrile của 2 auronol alphitonin và maesopsin