Downloaded 31 times
More Related Content
Similar to คู่มือวิธีการเก็บรักษาจุลินทรีย์โดยวิธีการระเหยแห้งใน สภาวะสุญญากาศ (Liquid drying)
คู่มือวิธีการเก็บรักษาจุลินทรีย์โดยวิธีการระเหยแห้งใน สภาวะสุญญากาศ (Liquid drying)
- 1. คู่มือการเก็บรักษาจุลินทรีย์ โดยวิธีการระเหยแห้งในสภาวะสูญญากาศ (Liquid-drying) ศูนย์ชีววัสดุประเทศไทย (Thailand BioresourceResearch Center) ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ สานักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand
- 2. การเก็บรักษาจุลินทรีย์โดยวิธีการระเหยแห้งฯ หลักการ • อาศัยหลักการดึงน้าออกจากเซลล์ภายใต้สภาวะสูญญากาศใน ขณะที่ตัวอย่างเป็นของเหลว (ระเหย) •แตกต่างจากวิธีระเหิดแห้ง (Freeze drying) ซึ่งใช้หลักการดึงน้า ออกจากเซลล์ในขณะที่น้าอยู่ในสภาวะของแข็ง (ระเหิด) ที่ต้องแช่ แข็งตัวอย่างก่อนท้าแห้ง ท้าให้การเก็บรักษาโดยวิธีการระเหยแห้ง ใช้เวลาการเก็บรักษาน้อยกว่าวิธีระเหิดแห้ง และสามารถใช้เก็บ รักษาจุลินทรีย์ที่ไม่สามารถทนสภาวะแช่แข็งได้ ข้อดี • สามารถเก็บรักษาจุลินทรีย์ได้หลายชนิด เช่น แบคทีเรียและยีสต์ ส่วนใหญ่ รวมถึงราที่สร้างสปอร์หลายกลุ่ม • สามารถเก็บรักษาจุลินทรีย์ได้นานถึง 10 ปี หรือมากกว่า เมื่อเก็บ ในที่มืดอุณหภูมิ 4-10C • สามารถเก็บรักษาที่อุณหภูมิห้องได้ แต่อายุการเก็บรักษาจะสันลง หากเก็บไว้ที่อุณหภูมิสูงเป็นเวลานาน Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand 2
- 3. การเตรียมอุปกรณ์ และสารป้องกันเซลล์ จุลินทรีย์ • เตรียมเซลล์จุลินทรีย์บ่มที่อุณหภูมิเหมาะสมส้าหรับแบคทีเรียและ ยีสต์อายุประมาณ 24-48 ชม. หรือจนจุลินทรีย์เจริญอยู่ในช่วง Late log phase • ส้าหรับราและแบคทีเรียกลุ่มแอคติโนมัยสีท ให้บ่มที่อุณหภูมิ เหมาะสมจนสร้างสปอร์ที่เจริญเต็มที่ สารป้องกันเซลล์ • เตรียมสารป้องกันเซลล์ (ตารางที่ 1) 3-4 มล. ใส่ในหลอด นึ่งฆ่า เชือที่อุณหภูมิ 121C นาน 15 นาที หลอด ampoule • ล้างหลอดโดยแช่ในกรดไฮโดรคลอริก (HCl) ความเข้มข้น 2% ข้ามคืน จากนันล้างด้วยน้าสะอาด 2 ครังและน้ากลั่น 1 ครัง แล้ว อบให้แห้ง อุดปากหลอดด้วยจุกส้าลี นึ่งฆ่าเชือที่อุณหภูมิ 121C นาน 15 นาที แล้วอบให้แห้ง Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand 3
- 4. สารป้องกันเซลล์ จุลินทรีย์ ส่วนประกอบของสารป้องกันเซลล์ แบคทีเรีย ทั่วไป sodium L(+)-glutamatemonohydrate 3 g, ribitol 1.5 g, L-cystein hydorochloride monohydrate 0.05 g, 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) 100 ml หมายเหตุ: ส้าหรับแบคทีเรียผลิตกรดแลคติก (lactic acid bacteria) ให้เติม activated charcoal 1 g ในสารละลาย ป้องกันเซลล์ ยีสต์ A: polyvinylpyrrolidone (K-90) 6 g, lactose 5 g, distilled water 75 ml B: sodium L(+)-glutamate monohydrate 3 g, 1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) 10 ml, trehalose 5 g, distilled water 15 ml sterilized separately by autoclaving, then mix A & B รา sodium L(+)-glutamate monohydrate 3 g, 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) 100 ml Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand Source: NBRC, Japan ตารางที่ 1 สารป้องกันเซลล์ส้าหรับจุลินทรีย์แต่ละประเภท 4 หมายเหตุ: สารป้องกันเซลล์ที่เหมาะสมสาหรับจุลินทรีย์แต่ละชนิดอาจแตกต่างไปจากที่ระบุ และจุลินทรีย์บางชนิดอาจ มีอัตราการรอดชีวิตต่า หรือไม่รอดชีวิตเมื่อใช้สารดังกล่าว ควรมีการศึกษาวิจัยเพิ่มเติมเพื่อปรับปรุงสูตรสาร ป้องกันเซลล์ให้เหมาะสมกับจุลินทรีย์ชนิดที่ต้องการเก็บรักษานั้นๆ
- 5. วิธีการเก็บรักษา ใช้พาสเจอร์ปิเปตถ่ายสารป้องกันเซลล์ 3-4 มล.ใส่หลอดจุลินทรีย์ แล้วผสมให้เข้ากัน จากนันใช้พาสเจอร์ปิเปตแบ่งสารละลายเซลล์ใส่หลอด Ampoule หลอดละ 0.1-0.2 มล. ใช้กรรไกรตัดส่วนปลายของส้าลีอุดหลอดออก และใช้แท่งแก้ว รูปตัวแอล (L) ดันส้าลีให้ลึกจากปลายหลอดประมาณ 3-4 ซม. คอดหลอดโดยใช้เปลวไฟความร้อนสูง โดยให้รอยคอดอยู่บริเวณเหนือ จุกส้าลีประมาณ 1 ซม. และให้บริเวณที่คอดมีเส้นผ่านศูนย์กลางของ หลอดประมาณ 1-2 ม.ม. Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand (มีต่อ) 5
- 6. วิธีการเก็บรักษา (ต่อ) เสียบหลอดที่คอดแล้วเข้ากับเครื่องท้าแห้ง ท้าแห้งประมาณ 3-4ชั่วโมง ปิดหลอดในสภาวะสูญญากาศ โดยใช้เปลวไฟความร้อนสูงลนบริเวณรอยคอด น้าหลอดไปตรวจความเป็นสูญญากาศภายในหลอด โดยใช้เครื่อง High-frequency spark tester หลอดที่เป็นสูญญากาศ จะเห็นประกายแสงสีน้าเงิน-ม่วงภายในหลอด น้าหลอดที่มีสภาวะเป็นสูญญากาศเก็บในที่มืดอุณหภูมิ 4-10C Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand 6
- 7. การเพาะจุลินทรีย์ที่เก็บรักษาโดยวิธีระเหยแห้ง • ใช้อุปกรณ์เปิดหลอด Ampouleกรีดรอบหลอด บริเวณกึ่งกลางจุก ส้าลี • ใช้ส้าลีชุบแอลกอฮอล์หมาดเช็ดบริเวณรอบรอยกรีด • ใช้แผ่นส้าลีหนาหุ้มหลอดแล้วหักหลอดบริเวณรอยกรีด • ใช้พาสเจอร์ปิเปตเติมสารที่ใช้เพาะจุลินทรีย์ (ตารางที่ 2) ใส่หลอด จุลินทรีย์ ประมาณ 0.3-0.4 มล. • ทิงไว้ประมาณ 2-3 นาทีแล้วผสมให้เข้ากัน • ถ่ายส่วนผสมลงในอาหารเลียงเชือที่เหมาะสม Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand 7
- 8. สารที่ใช้เพาะจุลินทรีย์ จุลินทรีย์ ส่วนประกอบสารที่ใช้เพาะจุลินทรีย์ แบคทีเรียทั่วไป polypeptone10 g, yeast extract 2 g, MgSO4.7H2O 1 g, distilled water 1 L, pH 7.0 ยีสต์ glucose 10 g, peptone 5 g, yeast extract 3 g, malt extract 3 g, distilled water 1 L, pH 6.0 รา และแบคทีเรีย กลุ่มแอคติโนมัยสีท peptone 5 g, yeast extract 3 g, MgSO4.7H2O 1 g, distilled water 1 L, pH 7.0 Copyright 2016 TBRC, BIOTEC, Thailand ตารางที่ 2 สารที่ใช้เพาะจุลินทรีย์แต่ละประเภท ศูนย์ชีววัสดุประเทศไทย (TBRC) ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ อาคารกลุ่มนวัตกรรม 2 อาคาร B ชัน 8 ห้อง 817 143 อุทยานวิทยาศาสตร์ประเทศไทย ถนนพหลโยธิน ต. คลองหนึ่ง อ. คลองหลวง จ. ปทุมธานี 12120 โทร: +66 (0) 2117 8000-1 อีเมล์: tbrcservice@biotec.or.th 8 สอบถามข้อมูลเพิ่มเติม