2. ТемаТема 44.. КультивуванняКультивування
мікроорганізмів для одержаннямікроорганізмів для одержання
антибіотиківантибіотиків..
Особливості біосинтезу антибіотиків уОсобливості біосинтезу антибіотиків у
мікроорганізмів.мікроорганізмів.33
Вплив умов середовища наВплив умов середовища на
антибіотичну продуктивністьантибіотичну продуктивність1010
..
Спеціальні умови культивування дляСпеціальні умови культивування для
отримання антибіотиків.отримання антибіотиків.1818
Спрямований біосинтез антибіотиків.Спрямований біосинтез антибіотиків.2323
22
3. Особливості біосинтезу антибіотиків уОсобливості біосинтезу антибіотиків у
мікроорганізмівмікроорганізмів
Особливість біосинтезу антибіотиківОсобливість біосинтезу антибіотиків
мікроорганізмами полягає в тому, щомікроорганізмами полягає в тому, що
цей процес відбувається за двохфазнимцей процес відбувається за двохфазним
принципом (рис.принципом (рис.11) Ця закономірність) Ця закономірність
характерна для більшості стрептоміцетівхарактерна для більшості стрептоміцетів
і міцеліальних грибів. В 1-й фазі (фазаі міцеліальних грибів. В 1-й фазі (фаза
збалансованого росту,збалансованого росту, тропофаза)тропофаза)
відбувається процес накопиченнявідбувається процес накопичення
біомаси продуцента.біомаси продуцента.
33
4. В 2-й фазі (В 2-й фазі (ідіофазіідіофазі, фазі, фазі
незбалансованого росту) спостерігаєтьсянезбалансованого росту) спостерігається
уповільнення накопичення біомаси,уповільнення накопичення біомаси,
навіть її зменшен-ня. В період ідіофазинавіть її зменшен-ня. В період ідіофази
відбувається дерепресія ферментів, щовідбувається дерепресія ферментів, що
приймають участь у біосинтезіприймають участь у біосинтезі
антибіотиків. Починаєтьсяантибіотиків. Починається
антибіотикоутворення.антибіотикоутворення.
44
5. 55
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216
Тривалість культивування, год
Інтенсивністьпроцесу,ум.од
утворення біомаси стрептоміцета біосинтез стрептоміцина
Рис. 1. Схема двофазного процесу культивування
Streptomyces griseus
6. Основні біосинтетичні шляхи утворенняОсновні біосинтетичні шляхи утворення
антибіотиківантибіотиків
Механізми біосинтезу антибіотиків можнаМеханізми біосинтезу антибіотиків можна
розділити на три основні категорії:розділити на три основні категорії:
1.1. Антибіотики, що походять від одногоАнтибіотики, що походять від одного
первинного метаболіту. Шлях їхпервинного метаболіту. Шлях їх
біосинтезу складається з послідовностібіосинтезу складається з послідовності
реакцій, які модифікують вихіднийреакцій, які модифікують вихідний
метаболіт, як це має місце за синтезуметаболіт, як це має місце за синтезу
амінокислот та нуклеотидів.амінокислот та нуклеотидів.
66
7. 2.2. Антибіотики, що походять від двох чиАнтибіотики, що походять від двох чи
трьох різних первинних метаболітів, якітрьох різних первинних метаболітів, які
модифікуються та конденсуються змодифікуються та конденсуються з
утворенням складної молекули.утворенням складної молекули.
33. Антибіотики, що є продуктами. Антибіотики, що є продуктами
полімеризації декількох схожихполімеризації декількох схожих
метаболітів з утворенням основноїметаболітів з утворенням основної
структури, що згодом можеструктури, що згодом може
модифікуватися.модифікуватися.
77
8. В результаті полімеризаціїВ результаті полімеризації
утворюються антибіотикиутворюються антибіотики чотирьохчотирьох
типів:типів:
1)1) поліпептидні антибіотикиполіпептидні антибіотики, які, які
утворюються шляхом конденсаціїутворюються шляхом конденсації
амінокислот;амінокислот;
2)2) антибіотики, утворені зантибіотики, утворені з
ацетат-ацетат-
пропіонатних одиницьпропіонатних одиниць в реакціяхв реакціях
полімеризації,полімеризації, ccхожих на реакціїхожих на реакції
біосинтезу жирних кислот;біосинтезу жирних кислот;
88
9. 3)3) терпеноїдні антибіотикитерпеноїдні антибіотики, що, що
утворюються з ацетатнихутворюються з ацетатних
субодиниць в шляху синтезусубодиниць в шляху синтезу
ізопреноїдних сполук;ізопреноїдних сполук;
4)4) аміноглікозидні антибіотикиаміноглікозидні антибіотики, що, що
утворюються в реакціяхутворюються в реакціях
конденсації, сходних з реакціямиконденсації, сходних з реакціями
біосинтезу полісахаридів.біосинтезу полісахаридів.
99
10. Вплив умов середовища наВплив умов середовища на
антибіотичну продуктивністьантибіотичну продуктивність
Для кожного продуценту антибіотикаДля кожного продуценту антибіотика
розробляється оптимальне поживнерозробляється оптимальне поживне
середовище, яке повиннесередовище, яке повинне
забезпечувати максимальнезабезпечувати максимальне
накопичення продуцентом антибіотика.накопичення продуцентом антибіотика.
1010
11. Поживне середовище (ПС) повинноПоживне середовище (ПС) повинно
відповідати наступним вимогам:відповідати наступним вимогам:
• повноцінність;повноцінність;
• вміст доступних і дешевихвміст доступних і дешевих
компонентів;компонентів;
• забезпечувати можливістьзабезпечувати можливість
ефективної фільтрації ;ефективної фільтрації ;
• використання економічних методіввикористання економічних методів
виділення і очищення антибіотика.виділення і очищення антибіотика.
1111
12. Джерела азоту при культивуванніДжерела азоту при культивуванні
продуцентів антибіотиківпродуцентів антибіотиків
Продуценти антибіотика засвоюютьПродуценти антибіотика засвоюють
азот в окисленій (азот в окисленій (NONO22
--
, NO, NO33
--
) або у) або у
відновленій (відновленій (NHNH44
++
, -NH, -NH22) формах.) формах.
Найбільш важливі джерела азоту – соліНайбільш важливі джерела азоту – солі
азотної або азотистої кислот, а такожазотної або азотистої кислот, а також
амонійні солі органічних абоамонійні солі органічних або
неорганічних кислот, амінокислоти,неорганічних кислот, амінокислоти,
продукти гідролізу білків, білки.продукти гідролізу білків, білки.
1212
13. В натуральних середовищахВ натуральних середовищах
невизначеного складу (невизначеного складу (кукурудзянийкукурудзяний
екстракт, меляса, соєве борошноекстракт, меляса, соєве борошно) азот) азот
міститься у формі білків. Утилізаціяміститься у формі білків. Утилізація
такого азоту залежить від наявності утакого азоту залежить від наявності у
продуцента відповідного протеїназногопродуцента відповідного протеїназного
комплексу для перетворення білків докомплексу для перетворення білків до
амінокислот. У більшості продуцентівамінокислот. У більшості продуцентів
антибіотиків найефективніше засвоює-антибіотиків найефективніше засвоює-
ться азот амонійних солей таться азот амонійних солей та
амінокислот, в яких він знаходиться уамінокислот, в яких він знаходиться у
відновленій формі.відновленій формі.
1313
14. Джерела вуглецю С при культивуванніДжерела вуглецю С при культивуванні
продуцентів антибіотиківпродуцентів антибіотиків
Значення джерела вуглецю СЗначення джерела вуглецю С
для антибіотикоутворення полягаєдля антибіотикоутворення полягає
насамперед у впливі на використаннянасамперед у впливі на використання
джерела азотуджерела азоту NN. Для біосинтезу. Для біосинтезу
антибіотика можуть бути використані:антибіотика можуть бути використані:
глюкоза, галактоза, мальтоза,глюкоза, галактоза, мальтоза,
сахароза, лактоза, крохмаль, гліцерин,сахароза, лактоза, крохмаль, гліцерин,
етанол, янтарна, пировиноградна,етанол, янтарна, пировиноградна,
оцтова, молочна кислоти.оцтова, молочна кислоти.
1414
15. Важливе значення має такожВажливе значення має також
співвідношення вуглецю С та азотуспіввідношення вуглецю С та азоту NN вв
середовищі. Для росту багатьохсередовищі. Для росту багатьох
продуцентів зазвичай оптимальним єпродуцентів зазвичай оптимальним є
співвідношенняспіввідношення 20:120:1 (С:N).(С:N).
Але не завжди таке співвідношенняАле не завжди таке співвідношення
призводить до максимальногопризводить до максимального
накопичення антибіотика.накопичення антибіотика. ДляДля
кожного конкретного продуцента вонокожного конкретного продуцента воно
встановлюється окремовстановлюється окремо
експериментальним шляхом.експериментальним шляхом.
1515
16. • Джерела мінерального живленняДжерела мінерального живлення
Важливими є фосфор (Р), калій (К),Важливими є фосфор (Р), калій (К),
кальцій (Са), магній (кальцій (Са), магній (Mg)Mg), сірка, сірка (S)(S),,
залізозалізо (Fe)(Fe), цинк, цинк (Zn)(Zn), мідь, мідь (Cu)(Cu), молібден, молібден
(Mo)(Mo) та інші елементи. Вони входять дота інші елементи. Вони входять до
складу протоплазми клітини як складовіскладу протоплазми клітини як складові
деяких ферментів, виступають якдеяких ферментів, виступають як
компоненти для регулюваннякомпоненти для регулювання
осмотичного тиску.осмотичного тиску.
1616
17. Важливе значення для утворенняВажливе значення для утворення
антибіотиків, що містять хлорантибіотиків, що містять хлор (( ССl )l )
(хлортетрациклін, хлорамфенікол), має(хлортетрациклін, хлорамфенікол), має
наявність в середовищі цього галогену.наявність в середовищі цього галогену.
При цьому наявність іншихПри цьому наявність інших
галогенів (наприклад, брому) призводитьгалогенів (наприклад, брому) призводить
до інгібування процесу хлорування ідо інгібування процесу хлорування і
утворення антибіотика, що позбавленийутворення антибіотика, що позбавлений
хлору.хлору.
1717
18. Спеціальні умови культивування дляСпеціальні умови культивування для
отримання антибіотиківотримання антибіотиків
Інтенсифікувати утворенняІнтенсифікувати утворення
антибіотика окрім відомих підходівантибіотика окрім відомих підходів
((отримання мутантних штамів зотримання мутантних штамів з
підвищеною здатністю до синтезупідвищеною здатністю до синтезу
антибіотика, підбір відповіднихантибіотика, підбір відповідних
середовищ для культивування,середовищ для культивування,
покращення технологічних умовпокращення технологічних умов
розвитку продуцентарозвитку продуцента) можна шляхом) можна шляхом
сумісного культивування продуцентасумісного культивування продуцента
антибіотика з іншими спеціальноантибіотика з іншими спеціально
підібраними видами мікроорганізмів.підібраними видами мікроорганізмів. 1818
19. Змішана культура термофільнихЗмішана культура термофільних
Lactococcus та LactobacillusLactococcus та Lactobacillus,, щощо
складають мікрофлору йогуртів (кислогоскладають мікрофлору йогуртів (кислого
молока), має більшу антибіотичнумолока), має більшу антибіотичну
активність, порівняно з активністю цихактивність, порівняно з активністю цих
мікроорганізмів поодинці.мікроорганізмів поодинці.
Вплив мікроорганізмів вВплив мікроорганізмів в
змішаних культурах один на одного можезмішаних культурах один на одного може
відбуватися по різному:відбуватися по різному:
1919
20. –– продукти обміну одного організмупродукти обміну одного організму
можуть бути використані іншим в якостіможуть бути використані іншим в якості
джерела азоту, вуглецю або іншогоджерела азоту, вуглецю або іншого
компонента чи в якості попередникакомпонента чи в якості попередника
біосинтезу якої-небудь сполуки;біосинтезу якої-небудь сполуки;
–– в змішаній культурі один зв змішаній культурі один з
мікроорганізмів може утворюватимікроорганізмів може утворювати
стимулятори росту для іншого.стимулятори росту для іншого.
2020
21. –– продукти життєдіяльності одного зпродукти життєдіяльності одного з
мікроорганізмів, що не утворюємікроорганізмів, що не утворює
антибіотик, дещо притримують розвитокантибіотик, дещо притримують розвиток
продуцента, який у відповідь починаєпродуцента, який у відповідь починає
активніше синтезувати антибіотики.активніше синтезувати антибіотики.
Необхідно враховувати, що неНеобхідно враховувати, що не
існує універсальних комбінацій дляіснує універсальних комбінацій для
сумісного культивування. В кожномусумісного культивування. В кожному
конкретному випадку необхідноконкретному випадку необхідно
підбирати відповідні організми і їхнєпідбирати відповідні організми і їхнє
оптимальне співвідношення.оптимальне співвідношення.
2121
22. В останні десятиріччя ХХ століттяВ останні десятиріччя ХХ століття
успішно розвинувся новий напрям ууспішно розвинувся новий напрям у
біосинтезі антибіотиків – це використан-нябіосинтезі антибіотиків – це використан-ня
імобілізованих клітин продуценту.імобілізованих клітин продуценту.
Виявилося, що живі клітини мікро-Виявилося, що живі клітини мікро-
організмів в імобілізованому стані здатніорганізмів в імобілізованому стані здатні
досить довго існувати і здійснюватидосить довго існувати і здійснювати
характерні для них біохімічні процеси.характерні для них біохімічні процеси.
Існування мікроорганізмів в імобілі-Існування мікроорганізмів в імобілі-
зованому стані є більш екологічним, тоб-тозованому стані є більш екологічним, тоб-то
в природних умовах більшість мікро-в природних умовах більшість мікро-
організмів існують саме в такому стані.організмів існують саме в такому стані.
2222
23. Спрямований біосинтез антибіотиківСпрямований біосинтез антибіотиків
Під спрямованим біосинтезомПід спрямованим біосинтезом
антибіотиків необхідно розуміти втручанняантибіотиків необхідно розуміти втручання
експериментатора в метаболізмекспериментатора в метаболізм
мікроорганізму-продуценту для отриманнямікроорганізму-продуценту для отримання
одного (з декількох) або нових порівняно зодного (з декількох) або нових порівняно з
тими, що звичайно синтезуються.тими, що звичайно синтезуються.
2323
24. Для спрямованого утворенняДля спрямованого утворення
переважно одного антибіотика з тих, щопереважно одного антибіотика з тих, що
продукує обраний продуцент (або їхньоїпродукує обраний продуцент (або їхньої
модифікації) використовують наступнімодифікації) використовують наступні
методи втручання в метаболізмметоди втручання в метаболізм
мікроорганізмів:мікроорганізмів:
• зміна умов культивування і передусімзміна умов культивування і передусім
зміна складу поживного середовища.зміна складу поживного середовища.
• введення в середовище длявведення в середовище для
культивування специфічних інгібіторівкультивування специфічних інгібіторів
2424
25. • отримання мутантів вихідногоотримання мутантів вихідного
продуцента, що утворюютьпродуцента, що утворюють
модифіковані антибіотики.модифіковані антибіотики.
• оброблення отриманого антибіотикаоброблення отриманого антибіотика
певними ферментами абопевними ферментами або
мікроорганізмамимікроорганізмами..
2525
26. Отримання деяких антибіотиків шляхомОтримання деяких антибіотиків шляхом
спрямованого синтезу:спрямованого синтезу:
• введення до складу поживноговведення до складу поживного
середовища речовин, що вбудовуютьсясередовища речовин, що вбудовуються
в молекулу антибіотика, забезпечуючив молекулу антибіотика, забезпечуючи
отримання препаратів з новимиотримання препаратів з новими
властивостями (введення попередниківвластивостями (введення попередників
біосинтезу.)біосинтезу.) ПопередникиПопередники – це органічні– це органічні
речовини, які в процесі біосинтезу антибіотикаречовини, які в процесі біосинтезу антибіотика
включаються в його молекулу безвключаються в його молекулу без
попереднього розщеплення на окреміпопереднього розщеплення на окремі
фрагменти і їх наступного ресинтезу.фрагменти і їх наступного ресинтезу.
2626
27. • зміна співвідношення концентраційзміна співвідношення концентрацій
джерел вуглецю та азоту (або ступенюджерел вуглецю та азоту (або ступеню
аерації культури);аерації культури);
• введення специфічного інгібітору -навведення специфічного інгібітору -на
середовищі з хлоридами S.aureofaciensсередовищі з хлоридами S.aureofaciens
продукує хлортетрациклін (90-95%) іпродукує хлортетрациклін (90-95%) і
тетрациклін (5-10%).тетрациклін (5-10%).
2727
31. Київський завод медичних препаратів
(нині корпорація "Артеріум")
• 1949 рік початок виробництва бензилпеніциліна;
• 1950 рік початок виробництва стрептоміцину;
• 1955 рік налагоджено випуск кристалічних
калієвих і натрієвих солей бензилпеніциліну
32. • Продуцент зберігають у
вигляді спор на пшоні
• Періодична перевірка
продуктивності
Scientific classification
Kingdom: Fungi
Division: Ascomycota
Subdivision: Pezizomycotina
Class: Eurotiomycetes
Order: Eurotiales
Family: Trichocomaceae
Genus: Penicillium
Species: P. chrysogenum
Binomial name
Penicillium chrysogenum
Thom (1910)
34. Умови біосинтезу пеніциліну
• Оптимальна температура росту 30ºС, в
другій фазі – 20ºС.
• Найбільш сприятливе значення рН для
росту міцелію 6,0-6,5. рН у другій фазі
повинно бути 7-8.
• Біосинтез пеніциліну супроводжується
інтенсивною аерацією.
• Максимум утворення пеніциліну
відбувається на 6-7добу.
35. Для отримання бензилпеніциліну в якості
попередника додають фенілоцтову кислоту або її
похідні – фенілацетамід, фенілетиламін,
фенілацетилгліцин та інші речовини.
Фенілоцтова кислота
Для отримання феноксиметилпеніциліну в
середовище для культивування додають
феноксиоцтову кислоту.
Феноксиоцтова кислота
36. Технологія виробництва бензилпеніциліну
(біосинтез)
Приготування посівного матеріалу
t = 26°C, τ -=12 – 48 год
Приготування та стерилізація
поживного середовища
Ферментація для отримання
Бензилпеніцину
рН = 6.0 – 6,5, τ = 6 – 7 діб
Компоненти
середовища
Penicillium
chrysogenum
Повітря
Попередник
Піногасник
Пара
Вода
Середовище
37. Технологія виробництва бензилпеніциліну
(попереднє оброблення культуральної рідини)
Фільтрування на фільтр-пресі
t = 4 - 6°С
Фільтрування на барабанному
вакуум-фільтрі
Коагуляція
t = 60 -75°С, рН = 5,5 – 6,0
Міцелій
Міцелій
38. Культуральна рідина містить 3-6% сухих
речовин, з них 15 -30% пеніцилін.
Виділення пеніциліну в промисловості
базується на екстрагуванні розчинниками,
що не змішуються з водою.
Недоліком цього методу є екстрагування
разом з пеніциліном інших органічних
кислот.
3838
39. Концентрування при
екстрагуванні базується на великій
розчинності бензилпеніциліну у
вигляді кислоти в органічних
розчинниках і малій розчинності у
воді.
Солі бензилпеніциліну навпаки
добре розчинні у воді. Це дозволяє
видаляти пеніцилін з нативного
розчину невеликим об'ємом
органічного розчинника і
концентрувати цільовий продукт.
40. Вимоги до розчинників, що використовують
для екстрагування бензилпеніциліну:
- Мала розчинність у воді;
- Відсутність взаємодії з пеніциліном;
- Можливість регенерації при температурі
не вище 120 – 140°С;
- Низька собівартість.
Найкращими розчинниками визнано
бутилацетат і амілацетат.
41. Технологія виробництва бензилпеніциліну
(екстрагування пеніциліну)
Бутилацетатна екстракція
пеніциліну з нативного розчину
підкислення нативного розчину
до рН = 1,9 – 2,2
Екстрагування пеніциліну
з бутилацетатного екстракту
розчином бікарбонату натрію
рН= 6,3 – 6,8
H2SO4
Бутилацетат
Бікарбонат
натрію
42. Технологія виробництва бензилпеніциліну
(екстрагування пеніциліну)
Освітлення бутилацетатного
екстракту вугіллям
Друге екстрагування пеніциліну
бутанолом з бікарбонатного
екстракту
рН = 2,0
Зневоднення бутилацетатного
екстракту
t = -16 – -18°С
Активоване
вугілля
H2SO4
Бутанол
43. Технологія виробництва бензилпеніциліну
(отримання кристалічних солей пеніциліну)
Стерилізуюча фільтрація
концентрату натрієвої
солі бензилпеніциліну
Отримання концентрату натрієвої
солі бензилпеніциліну
рН = 6,4 – 6,8
Упарювання під вакуумом
t = 16 - 26°С
0,56-0,6 н р-н NaОН
Безводний
бутанол
44. Технологія виробництва бензилпеніциліну
(отримання кристалічних солей пеніциліну)
Гранулювання пасти натрієвої
солі бензилпеніциліну
Фільтрування та промивка осаду
натрієвої солі бензилпеніциліну
Сушіння натрієвої
солі бензилпеніциліну
під вакуумом
t – 75 - 80°С
Безводний
бутанол
