1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------
BÀI GIẢNG
THỰC HÀNH
HÓA SINH
TS. Nguyễn Hoài Hương
CN. Bùi Văn Thế Vinh
Dùng cho sinh viên ngành Môi trường và Công nghệ Sinh học
Năm xuất bản: 2009
2. 2
MỤC LỤC Trang
Giới thiệu môn học 4
Quy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm Hóa
sinh
5
1. An toàn khi làm việc với axit và kiềm 5
2. Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm 6
Bài 1 Cách pha chế các dung dịch dùng trong thí
nghiệm Hóa sinh
8
I Lý thuyết 8
1. Dung dịch 8
2. Dung dịch đệm 14
II Thực hành 20
III Bài nộp 20
Bài 2 Định lượng đường khử bằng phương pháp Acid
dinitro-salicylic (DNS)
21
I Lý thuyết 21
1. Định nghĩa 21
2. Nguyên tắc 21
3. Xử lý mẫu 21
II Thực hành 22
1. Dụng cụ - hóa chất 22
2. Tiến hành thí nghiệm 23
3. Tính kết quả 24
III Bài nộp 24
Bài 3 Định lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp
Kjeldahl
25
I Lý thuyết 25
1. Định nghĩa 25
3. 3
2. Nguyên tắc 26
II Thực hành 26
1. Dụng cụ - hóa chất 26
2. Tiến hành thí nghiệm 27
3. Tính kết quả 28
III Bài nộp 28
Bài 4 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford 30
I Lý thuyết 30
1. Định nghĩa 30
2. Nguyên tắc 30
II Thực hành 31
1. Dụng cụ - hóa chất 31
2. Tiến hành thí nghiệm 31
3. Tính kết quả 32
III Bài nộp 32
Bài 5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 33
I Lý thuyết 33
1. Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme 33
2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 34
3. Enzyme amylase và phương pháp xác định hoạt
tính
35
II Thực hành 36
1. Dụng cụ - hóa chất 36
2. Tiến hành thí nghiệm 36
3. Tính kết quả 38
III Bài nộp
Tài liệu tham khảo
38
39
4. 4
GIỚI THIỆU MÔN HỌC
Bài giảng “Thực hành sinh hoá” dành cho sinh viên năm thứ hai khoa Môi
trường & Công nghệ Sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM.
Với thời lượng 30 tiết và tuỳ thuộc điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thí
nghiệm cho phép, sinh viên tiến hành làm 5 bài thực hành gồm các nội dung chính của
học phần lý thuyết hóa sinh cơ sở.
1. Giới thiệu phòng thí nghiệm hóa sinh, cách pha chế các dung dịch dung
trong thí nghiệm hóa sinh ;
2. Định lượng đường khử bằng phương pháp acid dinitro-salicylic (DNS);
3. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl;
4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford;
5. Xác định hoạt tính enzyme amylase.
5. 5
QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM HÓA
SINH
I. An toàn khi làm việc với axit và kiềm
1. An toàn khi làm việc với axit:
Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản
ứng với các hơi axit tự do.
Khi pha loãng, luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực tiếp.
Giữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang, găng tay và
kính bảo vệ mắt. Nếu làm văng lên da, lập tức rửa ngay bằng một lượng nước lớn.
Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng.
H2SO4: Luôn cho acid vào nước khi pha loãng, sử dụng khẩu trang và găng tay
để tránh phòng khi văng acid
Các acid dạng hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay, kính bảo hộ.
2. An toàn khi làm việc với kiềm
Kiềm có thể làm cháy da, mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp.
Mang găng tay cao su, khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm đặc.
Thao tác trong tủ hút, mang mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm.
Amoniac: là một chất lỏng và khí rất ăn da, mang găng tay cao su, khẩu trang,
thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp. Hơi amoniac dễ cháy, phản ứng mạnh với chất oxy
hoá, halogen, axit mạnh.
Amoni hydroxyt: chất lỏng ăn da, tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kim loại nặng: Ag,
Pb, Zn ... và muối của chúng.
Kim loại Na, K, Li, Ca: phản ứng cực mạnh với nước, ẩm, CO2, halogen, axit
mạnh, dẫn xuất clo của hydrocacbon. Tạo hơi ăn mòn khi cháy. Cần mang dụng cụ
bảo vệ da mắt. Chỉ sử dụng cồn khô khi tạo dung dịch natri alcoholate, cho vào từ từ.
Tránh tạo tinh thể cứng khi hoà tan. Tương tự khi hoà tan với nước, đồng thời phải
làm lạnh nhanh.
Oxit canxi rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước, cần bảo vệ da mắt, đường
hô hấp do dễ nhiểm bụi oxit.
6. 6
Natri và kali hydroxyt: rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước. Các biện pháp
an toàn như trên, cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ không được làm ngược lại.
II. Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm
1. Hoá chất thí nghiệm:
Các hoá chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, ... trong phòng thí
nghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm.
Hoá chất có thể ở dạng rắn (Na, MgO, NaOH, KCl, (CH3COO)2...; lỏng (H2SO4,
aceton, ethanon, chloroform, ...) hoặc khí (Cl2, NH3, N2, C2H2 ...) và mức độ tinh khiết
khác nhau:
- Sạch kỹ thuật (P): độ sạch > 90%
- Sạch phân tích (PA): độ sạch < 99%
- Sạch hóa học (PC): độ sạch > 99%
Hóa chất có độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo những yêu cầu khác
nhau và chỉ nên sử dụng hóa chất còn nhãn hiệu.
2. Nhãn hiệu hoá chất:
Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghi
tên hoá chất, công thức hóa học, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh, khối lượng
phân tử, nơi sản xuất, điều kiện bảo quản.
3. Cách sử dụng và bảo quản hoá chất:
Khi làm việc với hóa chất, nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết sức
cẩn thận, tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi người. Những điều
cần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất được tóm tắt như sau:
- Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ, vô cơ,
muối, acid, bazơ, kim loại, ...) hay theo một thứ tự a, b, c để khi cần dễ tìm.
- Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi, phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trước
khi dùng, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu.
- Chai lọ hóa chất phải có nắp. Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp,
cổ chai, tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai.
- Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chai
lọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối.
7. 7
- Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay,
không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất.
- Khi làm việc với chất dễ nổ, dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa. Khi
cần sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi, có mùi,... phải đưa vào tủ hút, chú ý đậy kín nắp
sau khi lấy hóa chất xong.
- Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ, không ngửi hay nếm
thử hóa chất.
- Khi làm việc với acid hay base mạnh:
Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng (không được đổ nước
vào acid hay base);
Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như ống
bóp cao su.
Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên vết
bỏng NaHCO3 1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH3COOH 1% (nếu bỏng base). Nếu
bị bắn vào mắt, dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%.
Trường hợp bị hóa chất vào miệng hay dạ dày, nếu là acid phải súc miệng và
uống nước lạnh có MgO, nếu là base phải súc miệng và uống nước lạnh có CH3COOH
1%.
Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm:
8. 8
BÀI 1: CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH
DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
I. Lý thuyết
1.1. Dung dịch
Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau về
mặt vật lý và hóa học. Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi. Nếu chất
hòa tan ở dạng rắn thì gọi là chất tan, nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất.
Tùy theo tính chất của dung môi mà phân thành dung dịch nước và dung dịch
khan. Phần lớn các dung dịch acid, base, muối trong phòng thí nghiệm là dung dịch
nước, dùng dung môi là nước. Một số chất khác tan trong dung môi hữu cơ.
Hàm lượng chất hòa tan trong dung dịch thể hiện ở nồng độ dung dịch. Có
nhiều cách biểu thị nồng độ khác nhau. Mỗi cách sẽ tiện dụng trong chuẩn bị, phân
tích và tính toán khác nhau.
1.1.1. Các đơn vị nồng độ dung dịch
a) Nồng độ phần trăm, (%)
i) Nồng độ phần trăm khối lượng - khối lượng, % (w/w): là số gam chất tan có
trong 100g dung dịch.
Ví dụ: dung dịch NH4Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH4Cl
ii) Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung
dịch.
Ví dụ: dung dịch CuSO4 10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO4
iii) Nồng độ phần trăm thể tích - thể tích, % (v/v): là số ml dung chất có trong
100ml dung dịch.
Ví dụ: dung dịch glycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10ml glycerine.
b) Nồng độ gam-lit, (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch.
c) Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol, (Mol/L) hay M: là số phân tử gam
(hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch.
Ví dụ: Dung dịch KH2PO4 M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15 phân tử gam
KH2PO4.
9. 9
d) Nồng độ đương lượng (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1
lit dung dịch.
Số đương lượng chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z)
Hệ số đương lượng (z): phụ thuộc vào bản chất của chất đó và phản ứng mà
chất đó tham gia.
i) Nếu phản ứng là phản ứng acid, base: z là số ion H+
hay OH-
mà 1 phân tử,
ion của chất đó tác dụng vừa đủ.
Ví dụ: Phản ứng giữa HCl và NaOH
H2SO4 + 2 NaOH → Na2SO4 + 2 H2O
H2SO4 → 2 H+
z = 2
NaOH → 1 OH-
z = 1
ii) Nếu phản ứng là phản ứng ôxy – hóa khử: z là số electron mà 1 phân tử, ion
của chất đó cho hay nhận.
Ví dụ: 2 Na2S2O3 + I2 → Na2S4O6 + 2 NaI
I + 1e → I-
z = 1
S2+
- 1e → S+
z = 1
e) Nồng độ dung dịch bão hòa: là nồng độ dung dịch khi tối đa chất hòa tan
có mặt trong dung dịch.
f) Đơn vị nồng độ dùng trong các phép phân tích vi lượng :
- Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch
- Miligam phần trăm, mg%: mg chất hòa tan trong 100g dung dịch.
- Microgam phần trăm, µg%: là số µg chất hòa tan trong 100g dung dịch.
- Phần nghìn, 0
/00: số g chất hòa tan trong 1000g dung dịch.
- Phần triệu, ppm: số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch.
- Phần tỷ, ppb: số µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch.
1.1.2. Cách pha dung dịch có nồng độ xác định
a) Pha dung dịch có nồng độ phần trăm theo khối lượng, % (w/w)
i) Chất tan là chất rắn khan:
Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 40% (w/w)
100g dung dịch cần 40g NaOH
500g dung dịch cần X g?
10. 10
Lượng NaOH cần để pha dung dịch : X= (40*500)/100= 200g
Lượng nước cần thiết: 500-200=300g (hay 300ml)
Vậy, cân 200g NaOH và đong 300 ml nước cất, hòa tan ta được 500g dung
dịch NaOH 40%
ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.5H2O; Na2HPO4. 12H2O;...)
Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn.
Ví dụ: Pha 320g dung dịch CuSO4 10% (w/w) từ CuSO4.5H2O
M(CuSO4) = 160 và M(CuSO4.5H2O) = 250
Lượng CuSO4 khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32g
Lượng CuSO4.5H2O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50g
Lượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml)
Vậy, cân 50g CuSO4.5H2O, đong 270ml nước cất, hòa tan ta được 320g dung
dịch CuSO4 10%.
b) Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn:
Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10%
Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25g
Lượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250g
Lượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250g
Vậy, đong 250ml nước cất và 250g dd NaOH 10%, hòa tan ta được 500g
NaOH 5%
c) Pha dung dịch bão hoà:
Lấy chất tan cần pha vào becher, thêm một ít nước cất và khuấy cho tan. Nếu
sau khi khuấy, chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung
dịch bão hòa. Nếu chất tan tan hết, thêm chất tan và tiếp tục khuấy, cứ như thế cho
đến khi chất tan không còn tan được nữa.
d) Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích
i) Chất tan là chất rắn khan
Cân lượng chất tan cần thiết, chuyển sang bình định mức, dùng nước cất hòa
tan và định mức đến thể tích đúng.
Ví dụ: Pha 1 lít dung dịch NaCL 5% (w/v)
Lượng NaCl cần để pha dung dịch: X = (5*1000)/100 = 50g
11. 11
Vậy, cân 50g NaCl, hòa tan và định mức thành 1 lít bằng nước cất, ta được 1 lít
dung dịch NaCl 5%.
ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.5H2O; Na2HPO4. 12H2O;...)
Khi pha dung dịch ta cần phải tính đến lượng nước kết tinh có sẵn giống như ở
phần a.
iii) Chất tan dạng lỏng: Một số chất tan ở dạng lỏng như HCl, H2SO4 ...
Việc cân không thuận lợi, có thể đưa về đơn vị thể tích theo công thức
V = M/d
V: Thể tích chất lỏng; M: khối lượng chất lỏng cần cân; d: tỷ trọng chất lòng
Chú ý: Các hóa chất lỏng bán trên thị trường thường không ở dạng nguyên chất
mà là các dung dịch đậm đặc. Giới hạn hòa tan tối đa được tính bằng % thể tích và
thay đổi tùy theo loại hóa chất. Ví dụ như H2SO4: 95-98%; HCl: 37%; H3PO4: 65-
85%; NH4OH: 25%. Do đó khi pha các dung dịch từ các loại hóa chất này ta phải chú
ý đến nồng độ của dung dịch đậm đặc.
Ví dụ: Pha 440ml dung dịch HCl 1% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml)
Lượng HCl cần để pha dung dịch 1% là: X= (1*440)/100 = 4,4g
Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = (100*4,4)/37 = 11,9g
= 11,9/1,19 = 10 ml
Lượng nước cất thêm vào:440-10 = 430ml
Vậy, dùng ống đong lấy 10ml dung dịch HCl37%, và 430ml nước cất ta được
440 ml HCl 1%
Do việc sử dụng các loại bình định mức làm cho việc pha chế dung dịch thí
nghiệm trở nên đơn giản và chính xác vì vậy ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm
được pha chế theo nồng độ khối lượng - thể tích (w/v).
e) Pha dung dịch nồng độ phân tử gam
i) Chất tan là chất rắn khan
Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó, ta tính khối lượng phân
tử chất đó (hoặc tra bảng) theo đơn vị gam. Cân chính xác lượng chất tan, qua phễu
cho vào bình định mức có dung tích 1 lít. Cho vào từng lượng nước cất nhỏ, lắc để
hòa tan hoàn toàn và đưa nước cất tới mức. Chuyển dung dịch sang bình chứa, lắc để
trộn đều đồng nhất.
12. 12
Khi phải đun nóng dung dịch để hòa tan, hoặc quá trình hòa tan có toả nhiệt thì
phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạch
định mức.
Ví dụ: Pha 1 lít dung dịch KOH 1M
Phân tử lượng của KOH: MKOH = 39 +16 +1 =56
Lượng KOH để pha 1 lít dung dịch 1M là: 56g
Vậy, cân 56g KOH, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 1000. Đây
là phản ứng tỏa nhiệt, cần làm nguội dung dịch trước khi định mức thành 1 lít.
Nếu muốn pha dung dịch 2M; 3M hay 0,1M; 0,05M ta cũng tiến hành tương tự
với lượng cân tương ứng.
Ví dụ: Pha 500ml dung dịch KCl 3M
Phân tử lượng của KCl: MKCl = 39 +35,5 = 74,5
Lượng KCl để pha 500ml dung dịch 3M là: X= (74,5 *3*500)/1000 =
111,75g
Vậy, cân 111,75g KCl, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 500,
định mức đến vạch.
ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước: khi tính lượng chất tan cần cân phải tính
luôn cả khối lượng các phân tử nước.
iii) Chất tan dạng lỏng: nếu chất tan là dung dịch, ta phải tính toán dựa vào
nồng độ dung dịch đó.
Ví dụ: 8) Pha 1 lít dung dịch HCl 1M từ HCl 37%
Phân tử lượng HCl: MHCl = 1+35,5 = 36,5
Lượng HCl 37% để pha dung dịch 1M là: X = (36,5*100)/37 = 98,65g
Hay 98,65/1,19 = 83ml
Vậy, đong 83ml HCl 37% cho vào bình định mức 1000 có sẵn 1 ít nước.
Định mứ c thành 1 lít. Tiến hành pha trong tủ Hotte vì hơi acid bay lên rất độc
hại.
f) Pha nồng độ đương lượng (N)
Việc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) cũng tương tự với cách pha
dung dịch nồng độ phân tử gam (M).
1.1.3. Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
13. 13
Khi pha hóa chất, có nhiều nguyên nhân làm cho nồng độ dung dịch không
chính xác như việc cân đong không chính xác, các hóa chất không tinh khiết hay bị
hút ẩm. Thời gian tàng trữ lâu nên chất tan bị thăng hoa, bị oxy hóa, dung môi bay
hơi, vì vậy phải kiểm tra nồng độ thực của các dung dịch pha sẵn dựa vào các dung
dịch có nồng độ chính xác được gọi là dung dịch chuẩn (fixanal)
a) Dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác và
được dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm. Các chất dùng
trong dung dịch chuẩn phải khá bền vững sao cho nồng độ của chúng không thay đổi
nhanh chóng theo thời gian.
Pha dung dịch chuẩn, ta phải dùng ống chuẩn. Ống chuẩn là một ống ampun
thủy tinh hay nhựa đóng kín. Bên trong chứa một lượng cân chính xác chất tan hoặc
dung dịch chất tan. Khi chuyển hết lượng chất tan trong ống vào bình định mức và pha
thành 1 lít ta được dung dịch chuẩn có nồng độ đã ghi trên nhãn ngoài ống.
Cách pha dung dịch chuẩn từ ống chuẩn :
- Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức,
dùng bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừa thêm
nước cất vừa lắc và đưa nước cất tới vạch mức.
- Đối với các hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi như NaCl,
AgNO3, acid oxalic, ... có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác
chất cần pha, pha loãng và định mức tới thể tích đúng.
- Đối với các chất như NaOH, HCl, Na2S2O3, ... không thể pha ngay được dung
dịch chuẩn, do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần, vì vậy
sau khi pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ.
Ví dụ: NaOH thường nhiễm một lượng Na2CO3 rất dễ chảy nước, HCl dễ bay
hơi, Na2S2O3 dễ bị mất nước tinh thể khi để ngoài không khí.
b) Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha dung
dịch có nồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó hiệu chỉnh
nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp.
14. 14
Ví dụ: Pha dung dịch NaOH 0,1 N từ NaOH rắn và dùng dung dịch chuẩn
H2SO4 0,1N để chuẩn độ lại.
Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản, mỗi lần sử dụng lại
phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
Xét một phản ứng trung hòa acid - base, 1 ion gam H+
sẽ phản ứng với 1 ion
gam OH-
. Do đó:
C1V1 = C2V2
Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch
ta có hệ số hiệu chỉnh K:
K= Cp/Ct = Vp/Vt
Ví dụ: Dung dịch chuẩn là H2SO4 0,1N, dung dịch định pha là NaOH 0,1N.
Lấy 10ml H2SO4 0,1N cho vào erlen, thêm ba giọt chỉ thị màu phenolphtalien,
dùng burette chuẩn độ bằng NaOH được 11 ml NaOH
Vậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : Ct = (10*0,1)/11 = 0,091 N
Hệ số điều chỉnh K: K= 0,091/0,1 = 10/11 = 0,91
1.2. Dung dịch đệm:
1.2.1. Định nghĩa dung dịch đệm
pH môi trường làm thay đổi cấu trúc không gian protein vì một số amino acid
có mạch nhánh phân ly (COO-
và NH4
+
tạo liên kết ion). Họat động tối ưu của protein
phụ thuộc vào cấu trúc không gian nhất định trong môi trường, nghĩa là phụ thuộc vào
tỉ lệ phân ly của mạch nhánh thành ion, hay nói tóm lại là phụ thuộc vào pH môi
trường.
Dung dịch đệm là dung dịch có pH không thay đổi nhiều lắm khi một lượng
nhỏ acid (H+
) hoặc base (OH-
) được thêm vào. Như vậy, dung dịch đệm bao gồm một
cặp acid base liên hợp (acid yếu và muối của acid yếu này hoặc base yếu và muối của
base này) và tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch.
Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp acid – base có hằng số
phân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với số mol bằng nhau.
Thí dụ, để có đệm pH ở giá trị 4.75, chọn cặp acid - base CH3COOH
(0,1M)/CH3COONa (0,1M). Nếu thêm vào dung dịch 0.001 mol HCl thì pH của hệ
vẫn chỉ ở mức 4.748 gần bằng 4.75. Nghĩa là pH thay đổi rất ít.
15. 15
Trong cơ thể sống, dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng, ví dụ như ổn định
pH của máu bằng các hệ đệm carbonate và phosphate.
Về nguyên tắc thì phối hợp các loại đệm có các khoảng đệm khác nhau thành 1
dung dịch là không có vấn đề gì. Tuy nhiên sử dụng các đệm nào còn tùy thuộc vào
ứng dụng sao cho thành phần của đệm không phản ứng với các cấu tử trong hệ phản
ứng khảo sát theo chiều hướng có hại. Các phản ứng thường thấy là phản ứng tạo kết
tủa hay tạo phức hoặc oxy hóa khử.
Có dung dịch chứa hỗn hợp 1 acid yếu (Ví dụ: acid acetic) với muối của nó (Ví
dụ: muối natri acetate), dung dịch sẽ cân bằng dạng như sau:
CH3COOH + H2O -----> CH3COO-
+ H3O+
Có dung dịch khác chẳng hạn, chứa hỗn hợp base yếu (Ví dụ: ammoniac) với
muối của nó (Ví dụ: muối amoni clorua),trong dung dịch cân bằng có dạng sau:
NH3 + H2O ----------> NH4
+
+ OH-
Dung dịch đệm có pH thay đổi rất ít khi thêm một lượng acid hoặc base.
Khi thêm một lượng acid mạnh (H3O+
), base liên hợp kết hợp với nó cho acid yếu
(cân bằng chuyển dịch theo chiều nghịch) pH của dung dịch giảm không đáng kể.
Trái lại, khi thêm một lượng base mạnh (OH-
), acid điện li cho H3O+
(cân bằng
chuyển dịch theo chiều thuận), ion hidroni H3O+
trung hòa OH-
cho base yếu H2O. Kết
quả pH của dung dịch tăng không đáng kể.
Khả năng đệm của hỗn hợp đệm phụ thuộc vào hàm lượng acid và base liên
hợp có trong hỗn hợp.
1.2.2. Cách pha một số dung dịch đệm thường dùng
a) Dung dịch đệm borat:
- Dung dịch acid boric (a): 12,404 g H3BO3 hòa tan và định mức đến 1000 ml.
- Dung dịch borat (b): 19,108 g Na2B4O7.10H2O hòa tan và định mức đến 1000
ml
Dung dịch đệm borat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và
dung dịch (b) theo bảng dưới đây:
A b pH a b pH
16. 16
9,80 0,2 6,60 6,50 3,50 8,20
9,70 0,6 6,77 6,00 4,00 8,31
9,40 0,6 7,09 5,50 4,50 8,41
9,00 1,0 7,36 5,00 5,00 8,51
8,75 1,25 7,50 4,50 5,50 8,60
8,50 1,50 7,60 4,00 6,00 8,69
8,00 2,0 7,78 3,00 7,00 8,84
7,70 2,30 7,88 2,00 8,00 8,98
7,50 2,50 7,94 1,00 9,00 9,11
7,00 3,00 8,08 0,00 10,0 9,24
b) Dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 6,2)
- Dung dịch acid citric 0,1M (a): 21,01 g C6H8O7.H2O hòa tan và định mức đến
1000 ml.
- Dung dịch trinatri citrate 0,1M (b): 29,41 g C6H5O7Na3.2H2O hòa tan và dẫn
nước đến 1000 ml.
Dung dịch đệm citrate có giá trị pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch
(a) và số ml dung dịch (b) theo bảng sau:
A b pH A b pH
46,5 3,50 3,0 23,0 27,0 4,8
43,8 6,20 3,2 20,5 29,5 5,0
40,0 10,0 3,4 18,0 32,0 5,2
37,0 13,0 3,6 16,0 34,0 5,4
35,0 15,0 3,8 13,7 36,3 5,6
33,0 17,0 4,0 11,8 38,2 5,8
31,0 19,0 4,2 9,5 40,5 6,0
28,0 22,0 4,4 7,2 42,8 6,2
25,5 24,5 4,6 - - -
17. 17
c) Dung dịch đệm phosphate (pH = 5,7 – 8,0)
- Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M (a): 27,8 g NaH2PO4 hòa tan và
định mức đến 1000 ml.
- Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M (b): 53,05 g Na2HPO4.7H2O hoặc
71,7 g Na2HPO4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.
Dung dịch đệm phosphate có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a)
và số ml dung dịch (b) định mức đến 200 ml.
a b pH A b pH
93,5 6,50 5,6 45,0 55,0 6,9
92,0 8,00 5,8 39,0 61,0 7,0
90,0 10,0 5,9 33,0 67,0 7,1
87,7 12,3 6,0 28,0 72,0 7,2
85,0 15,0 6,1 23,0 77,0 7,3
81,5 18,5 6,2 19,0 81,0 7,4
77,5 22,5 6,3 16,0 84,0 7,5
73,5 26,5 6,4 13,0 87,0 7,6
68,5 31,5 6,5 10,5 89,5 7,7
62,5 37,5 6,6 8,50 91,5 7,8
56,5 53,5 6,7 7,00 93,0 7,9
51,0 49,0 6,8 5,30 94,7 8,0
d) Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (pH = 5,0 – 8,0)
- Dung dịch dinatri hydrophosphate 1/15M (a): 23,9 g Na2HPO4.12H2O hòa tan
và định mức đến 1000 ml.
- Dung dịch kali dihydrophosphate 1/15M (b): 9,07 g KH2PO4 hòa tan và định
mức đến 1000 ml.
Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml
dung dịch (b).
18. 18
a b pH a b pH
10 990 5,0 372 628 6,6
18 982 5,2 492 508 6,8
30 970 5,4 612 388 7,0
49 951 5,6 726 274 7,2
79 921 5,8 818 182 7,4
121 879 6,0 885 115 7,6
184 816 6,2 936 64 7,8
264 736 6,4 969 31 8,0
e) Dung dịch đệm Glycine – HCl (pH = 2,2 – 3,6)
- Dung dịch glycine 0,2 M (a): 15,01g glycine hòa tan và định mức đến 1000
ml.
- Dung dịch HCl 0,2 M (b): 16,8 ml HCl đặc (37%) pha thành 1000 ml.
Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml
dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.
X pH X pH
5,0 3,6 16,8 2,8
6,4 3,4 24,2 2,6
8,2 3,2 32,4 2,4
11,4 3,0 44,0 2,2
f) Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8,6 – 10,6)
- Dung dịch glycine 0,2 M (a): 15,01g glycine hòa tan và định mức đến 1000
ml.
- Dung dịch NaOH 0,2 M (b): 8 g NaOH hòa tan và định mức đến 1000 ml.
Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml
dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.
19. 19
X pH X pH
4,0 8,6 22,4 9,6
6,0 8,8 72,2 9,8
8,8 9,0 32,0 10,0
12,0 9,2 38,6 10,4
16,8 9,4 45,5 10,6
g) Dung dịch đệm acetate (pH = 3,6 – 5,6)
- Dung dịch acid acetic 0,2M (a): 11,55 ml CH3COOH đặc và định mức đến
1000 ml.
- Dung dịch natri acetate 0,2M (b): 16,4 g CH3COONa hoặc 27,2 g
CH3COONa.3H2O được hòa tan và định mức đến 1000 ml.
Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y ml
dung dịch (b) và định mức đến 100 ml.
a b pH A b pH
46,3 3,7 3,6 20,0 30,0 4,8
44,0 6,0 3,8 14,8 35,2 5,0
41,0 9,0 4,0 10,5 39,5 5,2
36,8 13,2 4,2 8,8 41,2 5,4
30,5 19,5 4,4 4,8 45,2 5,6
25,5 24,5 4,6
h)Dung dịch đệm vạn năng 0,1M
- Dung dịch acid acetic 0,1M (a): 5,7 ml CH3COOH đặc và định mức bằng
nước cất đến 1000 ml.
- Dung dịch acid phosphoric 0,1M (b): 6,45 ml H3PO4 đậm đặc và định mức
bằng nước cất đến 1000 ml.
- Dung dịch acid ortho-boric 0,1M (c): hòa tan 6,18 g acid ortho-boric trong
nước cất và định mức đến 1000 ml.
20. 20
- Dung dịch natri hydroxide 1N (d): hòa tan 40 g NaOH trong nước cất và định
mức đến 1000 ml.
Trộn lẫn các dung dịch (a), (b), (c) với thể tích bằng nhau nhận được dung dịch
đệm 0,1M có pH = 1,8. Điều chỉnh giá trị pH của dung dịch đệm trong khoảng pH =
1,8 đến pH = 12,0 bằng cách bổ sung dung dịch NaOH 1N (d). Các dung dịch đệm
vạn năng nồng độ khác được chuẩn bị tương tự.
II. Thực hành
Sinh viên pha dung dịch đệm và một số dung dịch sử dụng trong các bài thí
nghiệm sau theo hướng dẫn của giảng viên.
III. Bài nộp
1. Ghi chép phương pháp pha các dung dịch thực chuẩn bị.
2. Làm các bài tập sau:
1. Pha 1 L dung dịch NaOH 40% (w/v): cân …..g NaOH khô
2. Pha 0,5 L dung dịch H2SO4 2M cần bao nhiêu ml H2SO4 đậm đặc, biết rằng H2SO4
đđ là acid 97% có M=98 g/mol, tỉ trọng d=1,84 g/ml.
Nồng độ mol của H2SO4 đđ là:
Thể tích H2SO4 cần sử dụng là:
Lượng nước cần bổ sung là :
3. Pha 250 ml dung dịch CuSO 4 1 M, cân …….g CuSO4.5H2O
4. Pha 1 L dung dịch H2SO4 0.1N từ dung dịch H2SO4 2M:
5. Pha 500 g dung dịch NaOH 10% từ dung dịch NaOH 40%
Lượng NaOH cần để pha dung dịch 10% là: X =
Lượng dung dịch NaOH 40% cần dùng là: Y =
Lượng nước cất thêm vào:
6. Pha 500 ml dung dịch HCl 2% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml)
Lượng HCl cần để pha dung dịch 2% là: X=
Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y =
Lượng nước cất thêm vào:
21. 21
BÀI 2. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ACID DINITRO - SALICYLIC (DNS)
I. Lý thuyết
1. Định nghĩa
Đường khử là các đường chứa nhóm aldehyde (-CHO) hoặc ketone (-CO) như
glucose, fructose, arabinose, maltose, lactose; trong khi đó saccharose, trehalose
không phải đường khử.
2. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc
thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với
nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bước sóng
540nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính
được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS acid:
Acid dinitrosalicylic 3-amino, 5- dinitrosalicylic acid
3. Xử lý mẫu
Tùy vào đối tượng nghiên cứu (hạt, quả,...) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên
cứu dùng để định lượng đường có khác nhau đôi chút, nhưng nguyên tắc chung như
sau:
- Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc
inulin, có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước. Cân và cho vào cối sứ 1 g
nguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây, lá hoặc quả khô,... đã
được nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi). Nếu là nguyên liệu tươi (như
hoa, quả tươi) thì cân 5 – 10 g. Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30
22. 22
ml nước cất nóng 70 – 80o
C. Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích
1000 ml. Đun cách thủy 70 – 80o
C trong 35 – 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất
bằng dung dịch chì acetate [Pb(C2H2O2)2.3H2O] hoặc chì nitrate [Pb(NO3)2] 10%.
Tránh dùng quá dư chì acetate (dùng 2 – 5 ml chì acetate). Sau đó loại bỏ lượng chì
acetate dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa, để yên hỗn hợp 10 phút. Tiếp đó thêm
nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô. Nước lọc dùng
làm dung dịch thí nghiệm.
- Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang,
sắn, khoai tây,... cần chiết đường bằng rượu 70 – 80o
C, đun hỗn hợp cách thủy trong
bình cách thủy có lắp ống làm lạnh không khí. Trong trường hợp này không cần kết
tủa protein bằng chì acetate vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều.
- Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ như cà chua, dứa, chanh,
khế,... cần chú ý là trong quá tình đun khi chiết, đường saccharose có thể bị thủy phân
một phần. Do đó cần xác định riêng đường khử và riêng saccharose. Trước khi đun
cách thủy hỗn hợp phải trung hòa acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6,4 –
7,0.
II. Thực hành
1. Dụng cụ - hóa chất:
a) Dụng cụ, thiết bị
- Máy so màu hoặc quang phổ kế
- Cuvette d= 1 cm, V = 4 ml
- Ống nghiệm có nắp và các dụng cụ thủy tinh thông thường khác
- Bếp điện
b) Hóa chất - nguyên liệu
- Mẫu rau quả chứa đường (rau cải ngọt, dứa)
- Thuốc thử DNS
Caân 5g DNS vaø 300 ml nöôùc caát vaøo coác, hoøa tan ôû 500
C, sau ñoù cho theâm 5ml
dung dòch NaOH 4M. Cuoái cuøng cho theâm 150g muoái tartrat keùp hoøa tan roài cho
vaøo bình ñònh möùc vaø theâm nöôùc caát ñuû 500ml, ñöïng trong loï thuûy tinh saãm maøu.
Chuaån 3 ml thuoác thöû DNS bằng HCl 0.1N vôùi chæ thò laø phenolphtalein, neáu heát 5 -
6 ml HCl laø ñöôïc.
23. 23
- Dung dịch glucose chuẩn: pha sẵn dung dịch glucose chuẩn 10 mg/ ml (bảo quản tủ
lạnh vài ngày).
2. Tiến hành
a) Chiết xuất đường trong thực vật
- 5g rau cải ngọt → nghiền nhỏ → cho vào becher 100ml + 10ml cồn 900
→ đun cách
thủy (sôi 3 lần) → khuấy đều bằng đũa thủy tinh → để nguội → lọc (chỉ gạn lấy phần
trong).
- Cho tiếp 10ml cồn 800
vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun sôi 2 lần trên nồi đun cách
thủy→ Để nguội → lọc (lặp lại 2 lần)
- Đưa phần bã lên lọc và rửa bằng rượu nóng (800
)
- Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong phòng hoặc trên nồi cách thủy đun nhẹ. Sau
khi cho bay hơi rượu, mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm.
- Cặn khô trong cốc được pha loãng thành thể tích V = 50ml với nước cất ta được
dung dịch đường gốc. Pha lõang dung dịch đường gốc với một hệ số pha lõang n thích
hợp.
b) Dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng đường
- Cho vào 6 ống nghiệm sạch với các chất có thể tích như bảng sau:
Hoá chất Ống
ĐC
Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5
Glucose 10
mg/ml (ml)
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Nước cất (ml) 10 9.8 9.6 9.4 9.2 9.0
Nồng độ
(mg/ml)
OD540nm
(Sinh viên điền nồng độ glucose chuẩn vào bảng trên)
- Từ các ống nghiệm trên lấy 1ml ở mỗi ống vào 6 ống nghiệm khác và thêm vào mỗi
ống 3ml thuốc thử DNS.
- Đun sôi đúng 5 phút (có đậy nút).
24. 24
- Làm lạnh đến nhiệt độ phòng.
- Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm với mẫu trắng pha từ ống đối chứng.
Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang (OD540nm), trục hoành là nồng
độ glucose. Tìm phương trình biểu diễn đường chuẩn dạng y = ax + b với y =
OD540nm; x = [glucose] (mg/ml) và hệ số tương quan R2
nhờ phần mềm Excel.
- Tương tự hút 1 ml dung dịch đường pha lõang X cho vào ống nghiệm, thêm 3 ml
DNS, đun sôi 5 phút. Sau khi để nguội đo mật độ quang (OD), sử dụng mẫu trắng ở
trên.
Chú ý: tiến hành các mẫu dựng đường chuẩn và mẫu thí nghiệm đồng thời.
3. Tính kết quả:
- Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được X mg/ml đường khử trong dung
dịch đường pha lõang.
- Nhân với hệ số pha lõang n để được lượng đường trong 1 ml dung dịch gốc.
- Chọn hệ số pha lõang n sao cho OD nằm trong giới hạn đường chuẩn.
- Tính hàm lượng đường trong nguyên liệu (mg/g) =
V = thể tích dịch đường gốc (ml)
m = khối lượng mẫu cân (g)
III. Bài nộp:
1. Vẽ đường chuẩn glucose
2. Viết phương trình đường chuẩn y = ax + b
3. Tính R2
=
4. Biện luận các hệ số pha lõang.
25. 25
BÀI 3. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL
I. Lý thuyết
1. Định nghĩa
Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số.
Nitơ có trong thành phần amino acid của protein là nitơ protein. Nitơ không có trong
thành phần protein như của các muối vô cơ, acid nitric, các amino acid tự do, các
peptide, urea và các dẫn xuất của urea, các alkaloid, các base purine và pyrimidine,...
là nitơ phi protein.
Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
Đạm tổng số hay protein tổng số là nitơ tổng số nhân với hệ số chuyển đổi. Hệ
số này phụ thuộc vào hàm lượng nitơ trong protein. Thông thường nitơ chiếm 16%
protein nên hệ số chuyển đổi thường được sử dụng là 100/16 = 6.25.
Đạm tổng số = Nitơ tổng số x hệ số chuyển đổi
Bảng dưới đây biểu diễn hệ số chuyển đổi cụ thể cho nhiều đối tượng mẫu khác
nhau.
Mẫu Hệ số chuyển đổi
Nguồn gốc động vật 6.25
Hạt bông 5.30
Đậu phộng 5.46
Đậu nành 5.71
Hạt hướng dương 5.3
Cơm dừa 5.3
Hạt mè 5.3
Bắp 6.25
Gạo 5.95
Lúa mì 5.83
26. 26
2. Nguyên tắc
a) Vô cơ hóa mẫu
- Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc
tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:
2H2SO4 → 2H2O +2SO2↑+ O2
- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử
chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân
thành acid amine; carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O; còn nitơ
được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong
dung dịch
2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
Các nguyên tố P, K, Ca, Mg,... chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO,
MgO,...
b) Chưng cất đạm:
- Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH
(NH4)2SO4 + 2 NaOH = Na2SO4 +H2O + 2NH3↑
- NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bình
hứng chứa H2SO4 0.1N
2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư
c) Chuẩn độ H2SO4 dư
- Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0.1N
H2SO4 dư + NaOH → Na2SO4 + H2O
II. Thực hành
1. Dụng cụ - hóa chất
a) Dụng cụ
- Bình phá mẫu
- Bếp đun
- Bộ chưng cất Kjeldahl định lượng Nitơ gồm:
Bình cất đạm (bình Kjeldahl)
Ống dẫn khí
Ống sinh hàn
27. 27
Bình hứng (becher 250ml)
Bi thủy tinh
- Pipet 20ml; pipet 10ml
- Erlen 250ml
Bộ chưng cất Kjeldahl
b) Hóa chất + nguyên liệu
- Bột đậu nành (0.1g), nước tương 1-2 ml
- H2SO4 đậm đặc
- NaOH 40%
- H2SO4 0.1N chuẩn
- NaOH 0.1N chuẩn
- Thuốc thử Tashiro
- Chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1)
2. Tiến hành
a) Vô cơ hóa mẫu
- Cân 100mg bột đậu nành đã sấy khô tuyệt đối cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp
5ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hóa).
Cho thêm vào 200mg chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt bình
Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh.
Lưu ý giai đoạn này phải thực hiện trong tủ Hotte, đặt bình hơi nghiêng trên
bếp, tránh trường hợp khi sôi mạnh hóa chất bắn ra ngoài, khi đã sôi giữ nhiệt độ bếp
đun vừa phải để tránh hóa chất trào ra ngoài và không bị bay mất ammoniac.
28. 28
- Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi
thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên
thành bình còn chưa bị oxi hoá vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung
dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức
100 ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch.
b) Cất đạm
- Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn
50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng. Tiếp
tục cho vào bình cất 20ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang
màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết
sang màu xanh lá mạ).
- Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0.1N và 3
giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đầu
ống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm. Kiểm tra xem hơi ra từ đầu ống sinh hàn có làm
xanh giấy quỳ không, nếu không thêm NaOH 40%.
- Sau khi cất đạm 20-25 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không,
dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy qùy không đổi sang màu xanh là
được. Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa.
c) Chuẩn độ:
- Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất màu
tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0.1 N sử dụng.
3. Tính kết quả:
Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức
N (mg%) = {1,42 * (V1-V2)*100/a}*2
V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng
V2: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ
a số miligam nguyên liệu
1,42: hệ số, cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với
1,42 mg Nitơ
III. Bài nộp
1. Giải thích ý nghĩa các bứơc trong thí nghiệm.
29. 29
2. Thảo luận các yếu tố dẫn đến sai số.
3. Nếu thay H2SO4 trong bình hứng bằng acid boric thì kết quả có gì thay đổi không ?
30. 30
BÀI 4. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
BRADFORD
I. Lý thuyết
1. Định nghĩa
Protein được định lượng bằng phương pháp Bradford là protein tan trong dung
dịch. Vì vậy, muốn xác định hàm lượng protein một mẫu ta phải trích ly protein. Hàm
lượng protein xác định sẽ phụ thuộc vào hiệu quả trích ly (khả năng hòa tan của
protein trong dung môi trích ly).
2. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc
nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang
tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại
465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm.
Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein.
Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với
dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là
bovine serum albumin (BSA). Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc
nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo mật độ quang hỗn
hợp dung dịch bằng máy quang phổ kế.
Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250
31. 31
II. Thực hành
1. Dụng cụ - hóa chất
a) Dụng cụ
- Máy đo quang phổ
- Ống nghiệm (14)
- Pipette 5ml, 1ml (có thể thay bằng pipetteman)
- Đồng hồ bấm giây
- Giấy thấm
- Giá để ống nghiệm
- Bình tia đựng cồn
b) Hóa chất
- Cồn 900
- Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin bằng cân phân tích, pha trong 1
ml nước cất, lắc đều cho tan. Giữ ở -200
C. Khi dùng pha loãng ra 100 lần, được dung
dịch có nồng độ 0,1 mg/ml.
- Dung dịch thuốc thử Bradford: dung dịch thuốc thử có thành phần trong 1 l
như sau:
Coomassie Brilliant Blue: 0,05g
Methanol: 50 ml
Phosphoric acid 85%: 100 ml
Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue 0,1 g được làm tan trong 50 ml methanol, pha
lõang với nước cất thành 500 ml để dược dung dịch (1)đựng trong chai màu tối có
nắp, 100 ml H3PO4 85% pha lõang thành 500 ml được dung dịch (2). Khi cần sử dụng
hòa 1 V (1) và 1V (2) rồi lọc lấy dịch trong.
2. Tiến hành
- Thu dịch trích ly protein như trong bài enzyme (10 g malt trích ly bằng nước
thu được V = 100 ml). Pha lõang mẫu với hệ số pha lõang n lần để được mẫu phân
tích (mẫu X) (n=1, 2 đối với malt).
- Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu
cần phân tích X
32. 32
- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống
nghiệm 0, lắc đều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1,
lắc đều để yên,... cứ tiếp tục cho đến hết.
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 X
Nước cất, ml 1 0.9 0.9 0.7 0.6 0.5 -
Albumin chuẩn (0,1mg/ml),
ml
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 -
TT Bradford, ml 5 5 5 5 5 5 5
Nồng độ Albumin (µg/ml) ?
OD595nm
(Sinh viên điền nồng độ albumin (µg/ml) vào bảng trên)
- Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở
bước sóng 595 nm. Ta có giá trị OD0, ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1),... tương tự
cứ cách một phút đo cho hết các ống. Ghi lại giá trị OD.
3. Tính kết quả:
- Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595
- Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật
độ quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein P ở trong mẫu phân tích X.
P = X*n
Để tính tóan hàm lượng protein trong 1g mẫu cân:
Protein (mg/g) = P x V/m
V = thể tích dung dịch trích ly, ml
m = khối lượng mẫu, g.
III. Bài nộp
1. Vẽ đường chuẩn protein theo Bradford
2. Tìm phương trình đường chuẩn y = ax +b
3. Tính R2
=
4. Tính tóan kết quả thí nghiệm, chọn hệ số pha lõang nào?
33. 33
BÀI 5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME
I. Lý thuyết
1.1. Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme
a) Định nghĩa
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao.
Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định. Hoạt động
hay hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng
sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Vì vậy có thể đánh giá hoạt
tính xúc tác của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ
tích lũy sản phẩm phản ứng.
Về nguyên tắc có thể hai nhóm phương pháp chính sau:
- Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời
gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định.
- Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất
hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định.
Để thực hiện được mục đích trên, nhiều phương pháp phân tích khác nhau được
sử dụng: phương pháp đo quang phổ, đo độ phân cực, áp suất, độ nhớt, phương pháp
sắc ký và phương pháp hóa học.
b) Đơn vị hoạt tính enzyme
Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính. Một đơn vị
họat tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp.
i) Đơn vị đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U) do Hiệp hội Hóa sinh Quốc
tế (International Union of Biochemistry – IUB) định nghĩa:
Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được
1 mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 U = 1 mol sản phẩm = 1 mol cơ chất (10-6
mol)/phút
ii) Katal:
Năm 1979, Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal làm
đơn vị cơ bản của hoạt tính enzyme.
34. 34
Một Katal là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 giây
ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây = 60 mol/ phút = 60 x 106
mol/ phút = 6 x 107
U
1 U = 1/60 x 10-6
Kat = 16,67 nKat (nanokatal)
Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI).
iii) Đơn vị tự đặt: đơn vị hoạt tính dựa vào sự thay đổi đặc tính hỗn hợp phản
ứng, ví dụ sự thay đổi độ đục, độ nhớt ...trong một đơn vị thời gian. Trường hợp cơ
chất và sản phẩm là một hỗn hợp phức tạp thì áp dụng đơn vị hoạt tính này.
N hư vậy, có nhiều đơn vị hoạt tính enzym e. Đ iều quan trọng nhất là cần địn h
nghĩa rõ ràng đơn vị hoạt tính.
c) Hoạt tính riêng (specific activity) của enzyme
Hoạt tính riêng của một chế phẩm enzyme đặc trưng cho độ tinh sạch của chế
phẩm enzyme. Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị enzyme/mg protein
protein (U/mg protein) hoặc Kat/kg protein, trong đó hàm lượng protein được xác
định theo phương pháp Lowry hoặc Bradford.
1.2. Phương pháp xác định họat tính enzyme
Khi tiến hành thí nghiệm đo họat tính enzyme cần chú ý những điểm sau:
- Cần tránh nhữ ng yếu tố có thể biến tính protein enzym e.
- C ác thông số nhiệt độ, pH , nồng độ ion và thành phần dung dịch đệm ảnh hưởng
lên hoạt tính enzym e. T hử hoạt tính enzym e phải được tiến hành trong điều kiện thích
hợp như điều kiện sinh lý, điều kiện tồn trữ thực phẩm hoặc điều kiện mà hoạt lực có
thể đạt tối ư u.
- V ới nhữ ng enzym e cần có chất hoạt hóa hoặc chất ổn định thì phải cho các chất
này vào enzym etrước khi cho cơ chất vào hỗn hợp phản ứ ng.
- N ồng độ cơ chất trong phản ứng enzym e phải ở trong giới hạn thích hợp, đủ
thừa để bão enzym e, nhưng không quá caođể kìm hãm enzym e. S au khi dừ ng phản
ứ ng lượng cơ chất được chuyển hóa 20-30% .
- T hời gian xác định hoạt tính thường 5-30 phút. Tốt nhất là xác định tốc độ ban
đầu của phản ứng (30-60 giây), vì giaiđoạn này tốc độ phản ứng lớn nhất, sauđó bắt
đầu giảm (Hình 1).
35. 35
- K hi xác định hoạt tính phải làm mẫu đối chứ ng song song với m ẫu thí nghiệm .
T rong mẫu đối chứ ng enzym e phải bị bất hoạt trước khi tiếp xúc với cơ chất.
Hình 1. Động học phản ứng enzyme
1.3. Enzym e am ylase và phương pháp xác định hoạt tính
a) Khai quát về enzym e am ylase
A m ylase là các enzym e xúc tác cho các phản ứng thủy phân tinh bột, glycogen,
và các polysaccharide tư ơng tự. A m ylase chia làm 3 loại chính:
- -am ylase (Endo -1,4-glucanase; E C 3.2.1.1) có trong nước bọt, hạt hòa thả o
nảy m ầm , tụy tạng, nấm m ốc, vi khuẩn. E nzym e này phân giải liên kết 1,4-
glycoside ở giữa chuỗi polysaccharide (hoạt tính endoam ylase) tạo thành
m altose, dextrin phân tử thấp. Dưới tác dụng của enzym e này, dung dịch tin h
bột nhanh chóng bị m ất khả năng tạo màu với dung dịch iodvà bị giảm độ nhớt.
-am ylase bền với nhiệt, nhưng kém bền với acid.
- -am ylase (Exo -1,4-glucanase; EC 3.2.1.2) có nhiều ở thực vật (hạt, củ), xúc
tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4-glycoside từ đầu không khử tạo thành
maltose và dextrin phân tử lớn. Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC,
nhưng bền với acid hơn -am ylase.
- Glucoamylase (Exo -1,4-glucanase; EC 3.2.1.3) xúc tác cho phản ứng thủy
phân liên kết 1,4- và 1,6-glycoside từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.
Sản phẩm chủ yếu là glucose và dextrin. Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ
trên 70o
C. Nhiều glucoamylase hoạt động mạnh ở pH 3,5-5,5.
b) Các phương pháp đo hoạt tính enzym e -am ylase
36. 36
N guyên tắc chung dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzym e trong dung dịch
enzym e nghiên cứ u thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đ o cường độ màu
tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iodbằng m áy so màu sẽ
tính được hoạt tính enzym e.
Đ ơn vị am ylase (theo S m ith và R oe)là lượng enzym e cần thiết để thủy phân
hoàn toàn 10 m g tinh bột sau thời gian phản ứng 30 phút trong điều kiện thí nghiệm .
II. Thực hành
1. Hóa chất – Dụng cụ
a) Hóa chất
- D ung dịch đệm
- D ung dịch đệm acetate pH = 4,7 (xác định hoạt tính enzym e nấm m ốc): trộn 1 thể
tích C H3C O O H 1N với 1 thể tích C H3C O O N a 1N . K iểm tra pH .
- D ung dịch đệm phosphate pH = 4,9 (xác định hoạt tính enzym e của m alt): trộn 10
m l dung dịch N a2H P O4 1/15 M với 990 m l dung dịchK H2P O4 1/15 M nhận được 1 l
dung dịch đệm phosphate pH = 4,94. K iểm tra pH .
- D ung dịch đệm glycine – N aO H 0,1 M pH = 10 (dùng để xác định hoạt tính -
am ylase kiềm .
- D ung dịch H C l 0,1N.
- D ung dịch iod: hòa tan 30 m g K I và 3 m g I2 với m ột lượng nhỏ nước cất. L ắc nhẹ
hỗn hợp để hòa tan hoàn toàn, sauđó chuyển dung dịch sang bình định m ức 1000 m l,
bổ sung nước cất đến vạch m ức. B ảo quản dung dịch trong bình m àu nâuđể chỗ tối.
- D ung dịch tinh bột 1% : hòa tan 1 g tinh bột (theo chất khô tuyệt đối) với 50m l
nước cất trong bình định m ức 100 m l, lắc đều. Đ ặt vào bếp cách thủy đang sôi, lắc liên
tục cho đến khi tinh bột tan hoàn toàn. Sau đó làm nguội và bổ sung 10 m l đệm acetate
pH = 4,7 (hoặc 10 m l dung dịch đệm phosphate pH = 4,9) bổ sung nước cất đến vạch
m ức, lắc đều. D ung dịch được chuẩn bị trong ngày sử dụng.
- D ung dịch enzym e gốc
2. Tiến hành:
a) Trích ly enzym e:enzym e được trích ly từ chế phẩm hay tế bào, m ô động thực
vật bằng dung dịch đệm có pH thích hợp.
i) Trích ly enzyme từ vi khuẩn: C ân m = 0,1 g chế phẩm nghiên cứ u, dùng đũa
37. 37
thủy tinh chà cẩn thận chế phẩm trong m ột cốc thủy tinh dung tích 50 m l với m ột lượng
nước nhỏ. S au đó chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định m ức dung tích 100 m l, bổ
sung nước cất tới vạch m ức. L ọc và thu hồi dịch trích ly enzym e. Bảo quản dung dịch
enzym e gốc ở 2 – 4o
C trong thời gian 1 ngày.
ii) Trích ly enzyme nấm mốc: C ân m = 5 g chế phẩm enzym e thô đã nghiền sơ
bộ, dùng đũa thủy tinh chà cẩn thận chế phẩm trong m ột cốc dung tích 50 m l. S au đó
chuyển toàn bộ chế phẩm vào bình tam giác dung tích 250 m l, bổ sung 50 m l nước cất
và 10 m l dịch đệm acetate pH = 4,7. G iữ hỗn hợp ở nhiệt độ 30o
C trong thời gian 1 giờ
có khuấy đảo định kỳ. L ọc, rửa thu hồi dịch trích ly enzym esao cho V = 100 m l. Bảo
quản dung dịch enzym e gốc ở 2 – 4o
C trong thời gian 1 ngày.
iii) Trích ly enzyme từ malt: C ân m = 5-10 g m alt đã nghiền nhỏ, cho vào bình
nón dung tích 250 m l, bổ sung 50 m l nước cất và 10 m l dung dịch đệm phosphate pH =
4,9. G iữ hỗn hợp ở nhiệt độ 30o
C trong thời gian 1 giờ có khuấy đảo định kỳ. L ọc, rửa
thu hồi dịch trích ly enzym esao cho V = 100 m l. Bảo quản dung dịch enzym e gốc ở 2
– 4o
C trong thời gian 1 ngày.
b) Pha lõang enzym e
P ha loãng dung dịch enzym e gốc (hệ số pha loãng n = 25, 50, 100) bằng dung
dịch đệm sao cho trong 1 m l dung dịch enzym e phân tích có chứa m ột lượng enzym e
đủ để thủy phân 20%- 30% tinh bột trong dung dịch ở điều kiện xác định. N hư vậy, độ
pha loãng phụ thuộc vào hoạt tính chế phẩm enzym e cần phân tích.
c) Xác định họat tính
C huẩn bị m ẫu thí nghiệm , m ẫu đối chứ ng và mẫu trắng theo bảng sau:
M ẫu thí nghiệm M ẫu đối chứ ng M ẫu trắng
D ung dịch tinh bột 1% 2 m l 2 m l 0
N ước cất 0 0 2 m l
Đ ệm 1 m l 1 m l 1m l
D ung dịch N aC l 3% 0,5 m l 0,5 m l 0,5 m l
Ủ 40o
C , 10 phút để đạt nhiệt độ
D ung dịch enzym e 1 m l 0 0
Ủ 40o
C , 30 phút để xảy ra phản ứ ng
38. 38
H C l 1N 1 m l 1 m l 1 m l
E nzym e 0 1m l 1 m l
C huyển sang bình định m ức 100 m l
N ước cất Đ ến vạch Đ ến vạch Đ ến vạch
Iode 0,5 m l 0,5 m 1 0,5 m 1
- D ung dịch đối chứng có m àu xanh
- D ung dịch thí nghiệm có màu tím với cường độ khác nhau tùy vào lượng tinh
bột chưa bị thủy phân.
- Đ o mật độ quang (O D ) của các dung dịch ở bước sóng = 620 nm so với m ẫu
trắng.
3. Tính kết quả:
Số m g tinh bột bị thủy phân S = x 20
Hoạt tính tòan phần (đơn vị họat tính/g)=
m
VnS
10
Họat tính riêng (đơn vị họat tính/mg protein) = họat tính toàn phần/mg protein
(Bradford).
trong đó:
n = hệ số pha loãng
V = thể tích dịch trích ly, ml
m = khối lượng enzyme, g
III. Bài nộp
1. Đơn vị họat tính enzyme amylase trong bài là gì ?
2. So sánh các hệ số pha lõang, chọn hệ số pha lõang nào ?
3. Có thể sử dụng phương pháp đo đường khử bằng DNS acid để đo họat tính enzyme
amylase không ? Tại sao ?
39. 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Văn Mùi. Hóa sinh học. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà nội, 2001
2. Holtzhauer M. Basic Methods for the Biochemical Lab. Springer, 2006.
3. Ronald E. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. John Wiley &
Sons, Inc., 2003
4. Smith B, Roe J. A photometric method for the determination of α-amylase in
blood and urine, with the use of the starch-iodine color. J. Biol. Chem. 179, 53
(1949).
