Graduation thesis: Cordyceps

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN NẤM CORDYCEPS ĐỂ NÂNG CAO
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CORDYCEPIC ACID, POLYSACCHARIDE
Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Văn Hiếu
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Lương
Lớp : KSCNSH 10-01
Hà Nội - 2014

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
Nghiên cứu điều kiện lên men nấm Cordyceps để nâng cao khả
năng sinh tổng hợp Cordycepic acid và Polysaccharide
Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Văn Hiếu
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Lương
Lớp : 10-01
Khóa : 2010 - 2014
Hà Nội – 2014

i
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp ngành
Công nghệ Sinh học, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía thầy cô,
bạn bè, người thân.
Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm
ơn đặc biệt tới TS. Ngyễn Văn Hiếu, Phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam là người đã tạo điều kiện,
hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cần có, những bước tiếp cận đầu tiên trong
nghiên cứu khoa học, tận tâm và nhiệt tình, giúp cho tôi có thể hình thành nên các
kỹ năng cần thiết trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp.
Tôi cũng xin được gửi lời cám ơn tới TS. Phan Thị Hồng Thảo, Trưởng
phòng Phòng Vi sinh vật Đất Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam là người đã tạo điều kiện, thuận lợi về phương tiện, hướng
dẫn các qui tắc làm việc phòng thí nghiệm trong suốt thời gian làm luận văn.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong khoa Công
nghệ sinh học, các giáo viên phụ trách, các kĩ thuật viên phòng thí nghiệm đã tạo
mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý kiến cho
tôi trong suốt quá trình làm đề tài.
Và tôi xin được chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè
đã động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành
luận văn này.
Hà Nội, ngày 26 tháng 05 năm 2014
Sinh viên

ii
MỤC LỤC
Lời cảm ơn i
Danh mục chữ cái viết tắt vi
Danh mục các bảng số liệu vii
Danh mục các hình ix
MỞ ĐẦU 1
1. Cơ sở đề tài 1
2. Đối tượng, phạm vi và nghiên cứu 1
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 3
1.1 Đặc điểm phân loại Cordyceps 3
1.1.1. Cấu tạo hình thái của Cordyceps 4
1.1.2. Cấu tạo kính hiển vi của Cordyceps spp. 6
1.1.3. Qúa trình xâm nhiễm nấm vào cơ thể côn trùng 8
1.2. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học thu nhận từ nấm Cordyceps 10
1.2.1 Cordycepin 10
1.2.2 Adenosine 11
1.2.3 Nucleotides 11
1.2.4 Các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa của Cordyceps sp. 12
1.2.5 Sterol 13
1.2.6 Protein và các amino acid 13
1.2.7 Acid béo và các nguyên tố kim loại 13
1.2.8 Polysaccharide 14

iii
1.2.9 Cordycepic acid 14
1.3 Giá trị dược liệu của các hoạt chất sinh học tới sức khỏe con người 16
1.4 Nghiên cứu nâng cao khả năng thu nhân polysacharide từ nấm
Cordyceps sp.
17
1.4.1 Đặc điểm của polysaccharide 17
1.4.2 Đặc tính chống ung thư của polysaccharide 18
1.4.3 Nguồn cacbon 19
1.4.4 Nguồn nitơ 20
1.4.5 Ảnh hưởng của điều kiện lên men tới hàm lượng polysaccharide 20
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1 Vật liệu nghiên cứu 24
2.2 Hóa chất 24
2.3 Dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 24
2.4 Môi trường 25
2.5 Phương pháp thu nhận các hợp chất sinh học 26
2.6 Phương pháp xác định 29
2.7 Nâng cao hoạt tính polysaccharide và cordycepic acid của chủng
nấm Cordyceps spp. truyển chọn
30
2.7.1 Tuyển chọn các chủng nấm có hoạt tính sinh học cao 30
2.7.2 Ảnh hưởng của môi trường lên men 31
2.7.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 31
2.7.4 Ảnh hưởng của nồng độ cacbon 31
2.7.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 31
2.7.6 Ảnh hưởng của nồng độ nitơ 32

iv
2.7.7 Ảnh hưởng của pH 32
2.7.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ 32
2.7.9 Ảnh hưởng của thể tích dịch lên men 32
2.7.1
0
Ảnh hưởng của thời gian nuôi 33
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34
3.1. Tuyển chọn chủng nấm Cordyceps sp. có hoạt tính sinh học cao 34
3.1.1 Khả năng sinh trưởng của các chủng nấm 34
3.1.2 Khả năng sinh các hợp chất polysaccharide và cordycepic acid của các
chủng nấm Cordyceps sp.CM khi nuôi trên các môi trường lỏng
40
3.2. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp polysaccharide và cordycepic
acid của chủng Cordyceps sp. CM
41
3.2.1. Lựa chọn môi trường nhân giống thích hợp 41
3.2.2. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp 44
3.2.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon 47
3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 48
3.2.5 Ảnh hưởng của nồng độ cacbon 49
3.2.6. Ảnh hưởng của sự thay đổi tỷ lệ cao nấm men: peptone. 51
3.3. Ảnh hưởng của các điều kiện lên men 52
3.3.1. Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu 52
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 53
3.3.3. Ảnh hưởng của tốc độ thông khí 54
3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian 55
KẾT LUẬN 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

v
DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Nội dung
C. Cordyceps
C. militaris Nhộng trùng thảo
C. sinensis Đông trùng hạ thảo
D Đường kính khuẩn lạc
Da Dalton. Đơn vị trọng lượng phân tử
DO Độ hòa tan oxy
EtOH Ethanol
EPS Exopolysaccharide (Extracellular polysaccharide)
polysaccharide ngoại bào
IPS Intracellular polysaccharide. Polysaccharide nội bào
HPLC High Performace Liquid Chromatography – Phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
lux Độ rọi của ánh sáng
sp. Species - Một loài
spp. Species plural - Nhiều loài
rpm Tốc độ lắc vòng/phút
vvm Thể tích không khí trên thể tích của môi trường/phút
%w/v Phần trăm khối lượng thể tích, biểu thị khối lượng chất
trong một hỗn hợp theo phần trăm thể tích của toàn bộ
hỗn hợp.

vi
DANH MỤC HÌNH
Hình Nội dung Trang
Hình 1.1 Hình thái tự nhiên một số chủng nấm Cordyceps:
A- C.sinensis; B- C.gunnii; C- C. Barnesii; D-
C.gracilis; E- C.liangshanensis, F- C.militaris
6
Hình 1.2 Bề mặt cắt ngang cơ thể ấu trùng của các chủng
Cordyceps. (A) C.sinensis, (B) C.gunnii, (C)
C.barnesii, (D) C.gracilis, (E) C.liangshanensis
8
Hình 1.3 Mặt cắt hiển vi phần chất nền của các chủng
Cordyceps, .(A) C.sinensis, (B) C.gunnii, (C)
C.barnesii, (D) C.liangshanensis, (E) C.militaris.
8
Hình 1.4 Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 10
Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của Adenosine và Cordycepin 11
Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của cordycepic acid của Cordyceps 15
Hình 1.7 Hình thái sợi nấm C.sinensis 16 sau 5 ngày lên men
ở các nồng độ pH khác nhau.
25
Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp thu nhận các hợp chất sinh học
từ môi trường lên men nấm Cordyceps
26
Hình 2.2 Đồ thị đường chuẩn D-manitol 29
Hình 3.1 Hình thái các chủng nấm Cordyceps trên các môi
trường khác nhau
38
Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc chủng Cordyceps sp. CM trên
các môi trường lên men là CB, MYPS, MPA, PDA,
BEDA khi nuôi ở 25C theo thời gian
43
Hình 3.3 Khả năng phát triển của chủng nấm Cordyceps
sp.CM trên các môi trường lên men khác nhau theo
thời gian
43
Hình 3.4 Ảnh hưởng của môi trường lên men đến khả năng
sinh polysaccharide và cordycepic acid của chủng
46

vii
nấm Cordyceps sp. CM khi nuôi lắc 150 rpm ở nhiệt
độ 25Csau 11 ngày.
Hình 3.5 Hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn Bacillus
subtilis của dịch lên men Cordyceps sp. CM
46
Hình 3.6 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh
polysaccharide và cordycepic acid của chủng nấm
Cordyceps sp. CM khi nuôi lắc 150 rpm ở nhiệt độ
25Csau 11 ngày.
48
Hình 3.7 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới sự phát triển của
25Csau 11 ngày.
49
Hình 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ cacbon đến khả năng sinh
tổng hợp polysaccharide và cordycepic acid của
chủng nấm Cordyceps sp. khi nuôi lắc 150 rpm ở
nhiệt độ 25Csau 11 ngày.
50
Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ cacbon đến khả năng sinh
polysaccharide và cordycepic acid ccủa chủng nấm
25Csau 11 ngày.
51
Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH tới khả năng phát triển và sinh
tổng hợp hợp chất của Cordyceps sp. CM
53
Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng phát triển và
sinh tổng hợp hợp chất của Cordyceps sp. CM
54

viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng Tên bảng Trang
Bảng 1.1 Mô tả hình thái một số loài nấm Cordyceps sp. 5
Bảng 1.2 Mô tả mặt cắt phần cơ thể ấu trùng và mặt cắt phần chất
nền của các chủng Cordyceps
7
Bảng 2.1 Một số thiết bị hay sử dụng trong nghiên cứu 25
Bảng 2.2 Một số môi trường nuôi cấy 25
Bảng 2.3 Giá trị OD 412 nm khi đo ở các nồng độ D-manitol khác
nhau.
28
Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc các chủng nấm Cordyceps trên một
số môi trường khác nhau khi nuôi lắc 150 rpm ở nhiệt
độ 25Csau 11 ngày.
34
Bảng 3.2 Khả năng phát triển của các chủng nấm Cordyceps spp.
trên một số môi trường khác nhau khi nuôi ở 25C khi
nuôi ở nhiệt độ 25Csau 11 ngày.
38
Bảng 3.3 Khả năng sinh tổng hợp polysaccharide và cordycepic
acid của 3 chủng nấm khi nuôi lắc 150 rpm ở nhiệt độ
25Csau 11 ngày.
40
Bảng 3.4 Khả năng phát triển của nấm Cordycep sp. CM trên các
môi trường khác nhau trong theo thời gian
41
Bảng 3.5 Khả năng sinh tổng hợp polysaccharide và cordycepic
acid của chủng nấm Cordyceps sp. CM trên một số
môi trường lên men khi nuôi lắc 150 rpm ở nhiệt độ
25Csau 11 ngày.
44
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của môi trường lên men đến khả năng sinh
25Csau 11 ngày.
45
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh
47

ix
Cordyceps sp.CM khi nuôi lắc 150 rpm ở nhiệt độ
25Csau 11 ngày.
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh
25Csau 11 ngày.
48
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ cacbon đến khả năng sinh
25Csau 11 ngày.
50
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của tỷ lệ cao nấm men: peptone đến khả
năng sinh hợp chất sinh polysaccharide và cordycepic
acid của chủng nấm Cordyceps sp. CM khi nuôi lắc 150
rpm ở nhiệt độ 25Csau 11 ngày.
51
Bảng 3.11 Ảnh hưởng của pH môi trường lên men ban đầu đến
khả năng sinh polysaccharide và cordycepic acid của
chủng nấm Cordyceps sp. CM khi nuôi lắc 150 rpm ở
52
Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy trong lên men đến khả
năng sinh polysaccharide và cordycepic acid của chủng
nấm Cordyceps sp. CM khi nuôi lắc 150 rpm ở nhiệt độ
25Csau 11 ngày.
53
Bảng 3.13 Ảnh hưởng của thể tích dịch nuôi cấy trong lên men đến
khả năng sinh polysaccharide và cordycepic acid của
chủng nấm Cordyceps sp. CM khi nuôi lắc 150 rpm ở
55
Bảng 3.14 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh
25Csau 11 ngày.
56

Luận văn tốt nghiệp 2013 – 2014 Khoa Công nghệ sinh học
Nguyễn Thị Lương KSCNSH10.01 1
MỞ ĐẦU
1. Cơ sở đề tài
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa được thiên nhiên ưu đãi
nguồn tài nguyên sinh học phong phú và đa dạng. Bên cạnh hệ động thực vật quý
hiếm Việt Nam còn là nơi lưu trữ các giống nấm dược liệu rất đa dạng, có hoạt tính
sinh học cao, có nhiều tác dụng trong việc làm thuốc chữa bệnh, thực phẩm chức
năng. Tuy nhiên, hiện nay chúng ta vẫn chủ yếu dựa trên khai thác tư nhiên do vậy
không đáp ứng được nhu cầu, để có thể sản xuất và tạo ra nguồn lợi nhuận hàng
năm từ việc lưu giữ, phát triển ứng dụng công nghệ sản xuất nấm dược liệu vẫn là
một lĩnh vực mới và chúng ta.
Nấm ký sinh côn trùng - Entomology pathogenic fungi (EPF) hay nấm côn
trùng (Insect fungi) không chỉ là một nhóm có tính đa dạng sinh học cao, nguồn lợi
tài nguyên quý giá mà còn có vai trò rất quan trọng trong phòng trừ sinh học sâu hại
cây trồng và trong y - dược. Trong y học cổ truyền nấm ký sinh côn trùng như
Cordyceps sinensis “Đông trùng - Hạ thảo” được sử dụng như thuốc trị bệnh và bồi
bổ cơ thể từ hơn 1000 năm qua tại các nước châu Á, đặc biệt là Trung Quốc và Nhật
Bản. Với hơn 25 tác dụng đáng lưu ý như, bổ phế, kiện tỳ, tư âm, tráng dương, tiêu
đàm, trị đau lưng mỏi gối, tăng cường sức khỏe, nâng cao miễn dịch, bồi bổ sức
khỏe cho người sau bệnh... Ngày nay, với sự phát triển của y học, Cordyceps đã
được sử dụng để sản xuất các hoạt chất sinh học, enzim, sản xuất thuốc bổ và các
chất tăng cường sinh lực cho con người.
Trên thế giới, nấm Đông Trùng hạ thảo đã được các nhà khoa học nghiên
cứu và thu được nhiều thành tựu có giá trị. Từ năm 1998, ở Trung Quốc, đã những
nghiên cứu đi sâu vào các hoạt chất sinh học có trong Cordyceps trong đó chủ yếu
tập trung vào các hợp chất polysaccharide, adenosine, cordycepin, cordycepic acid.
Các nước như, Hàn Quốc, Mỹ, Nhật Bản cũng đã sản xuất được nấm Đông trùng hạ
thảo trên quy mô công nghiệp từ những năm 1995, thế kỷ XX và bán trên thị trường
với giá khá cao. Trên thị trường Việt Nam cũng có bán nhiều loại nấm đông trùng
hạ thảo, song phần lớn đều nhập từ Trung Quốc, nguồn gốc và chất lượng không rõ
ràng, giá lại đắt đỏ. Trong khi đó, điều kiện, quy trình để làm ra sản phẩm này khá
phức tạp, đòi hỏi phải có sự đầu tư kỹ lưỡng về công nghệ. Chính vì những tính
chất độc đáo về dược liệu như vậy đã thôi thúc chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên
cứu điều kiện lên men nấm Cordyceps để nâng cao khả năng sinh tổng hợp
Cordycepic acid và Polysaccharide”. Với mục đích tìm ra được điều kiện nuôi cấy
phù hợp với điều kiện Việt Nam trong khi vẫn thu được nấm Cordyceps có đầy đủ

giá trị dược liệu để đáp ứng nhu cầu sử dụng làm nguyên liệu thuốc nâng trong cao
sức khỏe của con người. Đồng thời đóng góp một phần nhỏ bé trong việc xây dựng
nền công nghiệp dược trong nước.
2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn chủng nấm Cordyceps sp. từ bộ sưu tập giống, nâng cao khả
năng sinh hai hợp chất cordycepic acid và polysaccharide trong nấm bằng các kỹ
thuật lên men.
3. Đối tượng và nội dung nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các chủng nấm Cordyceps spp. được liệu nhận từ
phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học-Viện Hàn Lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu
- Tuyển chọn chủng nấm Cordyceps sp. có khả năng sinh trưởng, phát triển
nhanh, tạo ra lượng hợp chất có hoạt tính sinh học lớn.
- Nâng cao khả năng sinh tổng hợp hoạt chất polysaccharide và cordycepic
acid của Cordyceps sp. được tuyển chọn bằng các kỹ thuật lên men.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Đề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn bởi những kết quả nghiên cứu thu
đượccho thấy, các nhà khoa học Việt Nam bước đầu có thể tiếp cận các kỹ thuật lên
men lỏng đối với chủng nấm Cordyceps. Đồng thời mở ra những hướng đi mới có
thể phát triển để sản xuất nguyên liệu thô phục vụ cho công nghiệp dược được sản
xuất từ nấm Cordyceps phù hợp với điều kiện Việt Nam.

PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm phân loại Cordyceps
Hàng nghìn năm nay, Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) được coi là thần dược
trong y học cổ truyền Việt Nam và Trung Quốc. Theo y học, Đông trùng hạ thảo
được hình thành lên từ hai loại nấm chủ yếu: Cordyceps Sacc Link (dài từ 4 đến 11
cm) và Cordyceps ophiglossoides Her- Fr (dài từ 2 đến 6cm). Nấm Cordyceps là
một giống nấm túi, được các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện lần đầu tiên ở
vùng núi cao nguyên Tây Tạng, loại dược liệu quý này thực chất là ấu trùng các loài
bướm thuộc chi Thitarodes hoặc Hepialus bị nấm Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc
ký sinh. Đông trùng hạ thảo còn có các tên khác trùng thảo, hạ thảo đông trùng hay
đông trùng. Thường gặp nhất là sâu non của loài Hepialus armoricanus. Chi nấm
Cordyceps có tới 350 loài khác nhau, chỉ riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy 60 loài
như C. liangshanensis Zhang, C. taishanensis Liu, C. shanxiensis Liu, C.
gansuensis Zhang, C. grasspara Zang, C. kangdingensis Zang, C. guizhouensis
Liu… Ngoài ra còn có các chủng C. militaris, C. nutans Pat, C. tricentri Yasuda, C.
gunnuii Berk. Tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu nhiều nhất được
về 2 loài Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris Link. loài nấm này phân bố
rộng ở Trung Quốc, cao nguyên Tây Tạng, Bhutan, Nepal và vùng đông bắc Ấn Độ
ở độ cao từ 3500- 5000 m so với mặt nước biển. Tuy nhiên theo một số nghiên cứu
cho thấy, các thành viên của chi nấm Cordyceps còn có thể được tìm thấy ở Thái
Lan, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [12, 19]
Nấm Cordyceps spp. thuộc
Giới: Nấm
Ngành: Ascomycota
Lớp: Ascomycetes
Bộ: Hypocreales
Họ: Clavicipataceae
Chi: Cordyceps
Loài: C. sinensis (Berk.) Sacc.
Nấm Cordyceps là loại nấm dược rất quan trọng và được sử dụng rộng rãi
trong y học truyền thống của Trung Hoa. C. sinensis là loài hầu như được tìm thấy

trong tự nhiên đều cho ở trạng thái quả thể. Quá trình hình thành và tạo ra một sản
lượng quả thể lớn trong điều kiện nhân tạo thì chưa thể đạt được như ý muốn.
Nguyên nhân là do nấm Cordyceps có chu kỳ sinh trưởng chậm, quá trình tăng
trưởng, thường gắn liền hoặc có thể cộng sinh với các loại nấm khác, do vậy khi
thuần khiết của các chủng từ tự nhiên sau đó nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo là
khá khó khăn.
1.1.1. Cấu tạo hình thái của Cordyceps
Các sách trong y học cổ truyền mô tả sự hình thành của Đông trùng hạ thảo
như sau: Các chủng nấm thuộc bộ Ascomycestes sống ký sinh trên vật chủ là sâu
non của một loài bướm (Caterpillar) họ cánh vẩy, đặc biệt ở loài bướm đêm
Hepialus armoricanus, đặc điểm loại bướm này đẻ trứng, trứng nở thành ấu trùng
rồi thành sâu non. Mùa đông sâu non chui xuống đất sinh sống. Trong môi trường
ẩm, bào tử nấm Ascomycestes trên cơ thể sâu non, gặp điều kiện thích hợp sẽ nảy
mầm phát triển trên thân sâu nở thành các sợi nấm. Ban đầu sợi nấm có màu trắng
dạng mảnh, càng về sau chúng phát triển nhanh thành một khối dày, chắc, một số
biến thành màu vàng đậm cho tới nâu, một số vẫn phát triển một màu hồng mờ, đến
màu da cam. Cuối cùng, khi các nguồn dinh dưỡng được tiêu thụ hoàn toàn, hệ sợi
nấm nhanh chóng trở nên tối màu giống bùn sau từ 30-60 ngày, Khi đó toàn bộ
thân sâu chỉ còn là một cái vỏ bao bọc các sợi nấm. Sang mùa hạ, từ miệng sâu,
cuống nấm mọc ra, đội đất nhô lên, giữa cuống phình ra, trên bề mặt cuống có
những mầm nhọn. Các mầm nhọn này nẩy ra một số hạt tròn, trong chứa các bào tử
nấm. Thân nấm cao gần 10 cm. Khi đào nấm lên làm thuốc, người ta thấy gốc nấm
còn dính liền với đầu của xác sâu. Ấu trùng của bướm dài khoảng từ 3-6 cm, dày độ
0,4- 0,7 sắc nâu vàng, mình nhám với nhiều vạch chạy ngang. Sâu có 8 cặp chân cụt
ở khúc bụng và 4 cặp chân hơi dài ở khúc trên. Cắt ngang mình sâu thì thịt sâu ở
ruột màu trắng hơi ngả vàng vàng, còn chung quanh có màu vàng sẫm. Cây nấm
mọc từ đầu con sâu trông nhưng một cái cọng cắm vào, đầu cọng phình ra như cái
chùy rồi thuôn nhỏ lại. Cây mầu nâu hay sẫm đen lại, dài 4 - 8 cm, kính đo 0,3 cm,
đầu há ra cho thấy ruột trắng ở trong và một hốc rỗng, đây là phần mang bào tử
thường bị gẫy khi phơi khô.

Bảng 1.1 Mô tả hình thái một số loài nấm Cordyceps sp. [9].
Loài Ấu trùng Chất nền
C. sinensis
Phần cơ thể ấu trùng giống như
nhộng tằm, có chiều dài từ 3-5cm,
đường kính từ 3 – 8mm, màu vàng
đậm tới vàng nâu.
Chất nền hình trụ mảnh , 4-7
cm chiều dài và khoảng 3
mm, với đỉnh nhọn vô trùng.
C. gunnii
Phần cơ thể ấu trùng giống như
nhộng tằm, dài từ 3 – 6cm, đường
kính 3 – 10mm, vàng nâu đến nâu,
Chất nền hình trụ, mập mạp
và thô, 4-12cm chiều dài và
khoảng 4mm, với bulgy vô
trùng hoặc phân nhánh đỉnh
C. barnesii
Cơ thể ấu trùng cong hình thận,
ngắn, 1,5-2cm chiều dài, đầu nhỏ,
với một cặp răng.
Chất nền duy nhất, thanh
mảnh và cong, 2-6cm chiều
dài và khoảng 2 mm đường
kính.
C.
liangshanensis
Cơ thể ấu trùng giống như một
con tằm, dày, chiều dài 3-6 cm,
đường kính 6-10 mm; Bề mặt bên
ngoài với màu nâu để màng màu
nâu sẫm.
Chất nền như sợi, phân
nhánh hoặc không phân
nhánh, 10-30cm chiều dài
và đường kính 1-2mm.
C. militaris
Môi chất dinh dưỡng không có cơ
thể ấu trùng
Chất nền phẳng, hơi cong,
khoảng 5cm chiều dài, màu
vàng cam đến màu đỏ da
cam.

Hình 1.1 Hình thái tự nhiên một số chủng nấm Cordyceps: A- C.sinensis;
B- C.gunnii; C- C. Barnesii; D- C.gracilis; E- C.liangshanensis, F- C.militaris
1.1.2 Cấu tạo kính hiển vi của Cordyceps spp.
Trong tự nhiên, nấm Cordyceps để hoàn thành chu kỳ sinh trưởng của mình
chúng phải trải qua nhiều giai đoạn phát triển phức tạp; từ giai đoạn sống trong đất
tới sau khi lây nhiễm vào cơ thể ấu trùng, chúng chịu sự canh tranh với các vi khuẩn
khác, thậm chí cả sự tham gia nhiều loài khác của chi nấm Cordyceps [2]. Ở giai
đoạn đầu, bào tử nấm nhiễm vào cơ thể sâu non, nhộng, sâu trưởng thành nằm dưới
đất hoặc ở trên mặt đất. Trong suốt mùa đông, những ấu trùng này sẽ ngủ đông,
lượng dinh dưỡng chúng tích trữ được đủ để duy trì sống trong 4 tháng. Nấm ký
sinh sẽ tấn công cơ thể các ấu trùng ngủ đông này. Chúng sử dụng các chất hữu cơ
trong cơ thể côn trùng làm thức ăn. Vào mùa đông, nhiệt độ và ẩm độ không khí
thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi, phát triển trên toàn thân con sâu để hút chất dinh
dưỡng làm cho con sâu chết. Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm
chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính, hình thành thể quả.

Bảng 1.2 Mô tả mặt cắt phần cơ thể ấu trùng và mặt cắt phần chất nền của các
chủng Cordyceps
Chủng Mặt cắt phần cơ thể ấu
trùng
Mặt cắt phần chất nền
C. sinensis Ấu trùng dày 20-40µm trên bề
mặt lông dài 23-85 µm. Cơ thể
ấu trùng đầy sợi nấm màu
trắng, hình chữ C, sọc hình
chữ V hay hình chữ L ở trung
tâm
Qủa thể hình elip hoặc bầu
dục, bán nhúng với phần
chất nền dinh dưỡng. Phần
trung tâm phủ đầy sợi khí
sinh.
C.gunnii Phần ấu trùng bao phủ bởi sợi
khí sinh, hình V hoặc hình khe
thẳng trung tâm. Các cạnh của
cơ thể ấu trùng cong.
Qủa thể hình bầu dục, bán
nhúng với phần chất nền
dinh dưỡng, phần trung tâm
phủ đầu sợi khí sinh và các
khe
C.barnesii Cạnh cơ thể ấu trùng cong, các
sợi khí sinh mọc trên ấu trùng,
đường kính 9 - 25 ʮm, có thể
dài tới 100 ʮm.
Không có quả thể. Vỏ ngoài
màu nâu, chứa đốm mô giả.
lớp bên trong không màu,
sợi nấm sắp xếp hình lưới.
C.gracilis Màu vàng nâu, bề mặt trơn
bong. Cạnh của cơ thể ấu
trùng hình C, V, hoặc L
Không có rãnh giữa các sợi
nấm.Không có chất nền
C.militaris Không có cơ thể ấu trùng Sợi nấm màu trắng

Hình 1.2 Bề mặt cắt ngang cơ thể ấu trùng của các chủng Cordyceps. (A)
C.sinensis, (B) C.gunnii, (C) C.barnesii, (D) C.gracilis, (E) C.liangshanensis
Hình 1.3 Mặt cắt hiển vi phần chất nền của các chủng Cordyceps, .(A) C.sinensis,
(B) C.gunnii, (C) C.barnesii, (D) C.liangshanensis, (E) C.militaris.
1.1.3. Qúa trình xâm nhiễm nấm vào cơ thể côn trùng
Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính:

(i) Giai đoạn xâm nhập
Tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trong
xoang cơ thể côn trùng. Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh mầm bệnh, nó giải
phóng các enzym ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticun
của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như Protease, chitinase, lipase, aminopeptidase,
carboxypeptidase A, esterase, N - axetylglucosaminidase, cenlulase. Các enzym này
được tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và
thậm chí ngay trong một loài.
Enzym protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân
hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein). Lipase,
cenlulase và các enzym khác cũng là những enzym có vai trò không kém phần quan
trọng. Nhưng quan trọng hơn nhất là enzym phân hủy protein (protease) và enzym
phân huỷ kitin (chitinase) của côn trùng. Hai enzym này có liên quan trực tiếp đến
hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng [1].
(ii) Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết
Đây là giai đoạn sống ký sinh của nấm. Trong xoang cơ thể côn trùng nấm
tiếp tục phát triển, hình thành rất nhiều sợi nấm ngắn. Khi hệ sợi nấm được hình
thành trong cơ thể, nó phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, phá hủy các tế bào máu
và làm giảm tốc độ lưu thông máu. Toàn bộ các bộ phận nội quan bị xâm nhập.
Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp. Hoạt động của côn trùng
trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài. Kết quả
là vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt động sống và dẫn đến chết [18].
(iii) Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết
Ở bên trong cơ thể côn trùng, sợi nấm sinh trưởng và nhân lên nhanh chóng.
Một số loài nấm tiếp tục sinh trưởng ở dạng sợi nấm. Hệ thống miễn dịch của ký chủ
côn trùng sử dụng cơ chế thực bào và tiết ra các hợp chất đối kháng (như quinine và
melanine).
Đầu tiên, cơ thể côn trùng phải xác định cơ thể ngoại lai và tạo ra phản ứng
miễn dịch. Tuy nhiên, nấm ký sinh côn trùng phát triển rất nhanh thông qua việc tái
sản xuất nhanh chóng sợi nấm làm áp đảo hệ thống miễn dịch của côn trùng. Hơn thế
nữa nấm còn tạo ra các dạng độc tố và một số công cụ tấn công khác để giết chết côn
trùng, chính những độc tố và công cụ tấn công này đã phá hủy cơ chế kháng của ký chủ.
Hầu hết các nấm bất toàn (inperfect fungi) thường tạo ra độc tố và giết chết côn trùng
trong một thời gian ngắn hơn là nấm có giai đoạn sinh sản hữu tính. Trong giai đoạn

đầu độc ký chủ, một số loài nấm bất toàn giết chết ký chủ trước khi gây hại ra toàn bộ
cơ thể côn trùng và trên cơ thể côn trùng quan sát thấy rất ít sợi nấm [4].
Hình 1.4 Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng
1.2. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học thu nhận từ nấm Cordyceps
Các thành phần hóa học chứa trong nấm Cordyceps, quan trọng nhất là nhóm
chất cordycepic acid, cordycepin và polysaccharide có tác dụng rất tốt trong điều trị
bệnh ung thư và các bệnh do virus. Ngoài ba thành phần trên khi phân tích nấm
người ta còn phát hiện rất nhiều hợp chất có giá trị cordycepic acid, N-
acetylgalactosamine, adenosine, ergosterol và ergosterol esters, bioxanthracenes,
hypoxanthine, polysaccharide và exopolysaccharide, chitinase, cicadapeptins, và
myriocin, các chất có hoạt tính sinh học là saccharides (trehalose và
polysaccharides), nucleosides (adenosine, inosine và cordycepin), manitol và sterols
(ergosterol).
1.2.1. Cordycepin
Cordycepin lần đầu tiên được tách ra từ C. militaris năm 1950 do
Cunningham và cộng sự thực hiện, sau đó chúng cũng được tìm thấy ở C. sinensis
và C. kyushuensis. Mặc dù cordycepin có thể được tổng hợp hóa học nhưng chỉ cho
sản lượng thấp. Cordyceps tự nhiên chứa lượng cordycepin vào khoảng 0,006 –
6,36 mg/g. Trong sinh khối sinh nấm nuôi và quả thể của Cordyceps, hàm lượng
cordycepin ở giai đoạn đầu sau khi được tách và nuôi thường thấp với hàm lượng từ
0,006 – 1,64 mg/g [8]. Các nhà khoa học cho biết khi thu nhận trong tự nhiên, nồng
độ cordycepin trong quả thể C. militaris cao hơn C. sinensis với hàm lượng lần lượt

là 2,65 và 1,64 mg/g, trong khi trong nuôi cấy trong các bình lên men hàm lượng
các chất thu được là 1,59 mg/g tương tự C. sinensis trong tự nhiên [8].
Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của Adenosine và Cordycepin
Cordycepin là một dẫn xuất của nucleoside adenosine mà tại vị trí 3’ không
có O khác với thực thể ribose. Trọng lượng phân tử của cordycepin C10H13N5O3 là
251, có nhiệt độ nóng chảy là 230 – 231°C, độ hấp thụ cao nhất ở 259nm [5].
Cordycepin có thể tan trong saline, cồn ấm, hoặc methanol, nhưng không tan trong
benzene, ether hoặc chloroform, các nhà khoa học thường sử dụng saline khử trùng
và đệm phosphates để hòa tan cordycepin [22]. Cordycepin có khả năng kháng nấm,
kháng ung thư và kháng virus. Gần đây hơn, cordycepin cũng cho thấy khả năng
điều hòa sản phẩm của interleukins trong tế bào lympho T [17]. Cordycepin phát
huy tác dụng gây độc tế bào thông qua methyl hóa acid nucleic, ức chế sự phát triển
của Clostridium paraputrificum và Clostridium perfringens, nhưng không có tác
động nào tới Bifidobacterium spp. và Lactobacillus spp. do Ahn và cộng sự đã
chứng minh năm 2000 [14, 10].
1.2.2. Adenosine
Adenosine xuất hiện khá nhiều trong quả thể và được cho là phong phú ở
hầu hết các loài Cordyceps với hàm lượng dao động từ 0,28 tới 14,15 mg/g. Khi thu
nhận nấm Cordyceps trong tự nhiên, nồng độ adenosine là 2,45±0,03mg/g trong quả
thể và ở nấm C. militaris cao hơn C. sinensis, ở C. sinensis hàm lượng chỉ có
1,643±0,03 mg/g, trong khi đó, hàm lượng trong sợi nấm C. militaris lên men là
1,592±0,03 mg/g gần tương tự C. sinensis trong tự nhiên [8]. Adenosine được cho
là có tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch [16].
1.2.3. Nucleotides
Nucleotides (gồm có adenosine, uridine và guanosine) là các thành phần khá
đa dạng trong nấm Cordyceps. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, guanosine có hàm

lượng cao nhất trong tất cả các mẫu tự nhiên, khi nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo
hàm lượng của nucleotide thường cao hơn Cordycep spp. tự nhiên. Nucleotides
trong Cordyceps tự nhiên bắt nguồn từ sự phân rã của nucleoside trong suốt quy
trình bảo quản, tiếp đó các nhà nghiên cứu cũng tìm ra rằng độ ẩmcó thể làm tăng
đáng kể hàm lượng nucleotide trong Cordyceps khi nuôi trên môi trường rắn [22].
1.2.4. Các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa của Cordycep ssp.
Hoạt tính chống oxy hóa (AOA) là một hoạt tính sinh học quan trọng xuất
hiện trong các chủng thuộc ngành nấm Basidiomycetes. Mặc dù có nhiều nhà
nghiên cứu đã khảo sát đặc tính chống oxy hóa phổ rộng của các quả thể nấm,
những chỉ có số ít được chú ý và tiến hành thu nhận các chất chống oxy hóa này
nhờ lên men chìm. Một trong số các nghiên cứu được thực hiện bởi Badalyan khi
lên men trên môi trường lỏng để thu nhận dịch sau lên men, dịch chiết sinh khối
nấm và sinh khối) của 14 chủng nấm (Cordycép comatus, C. disseminatus, C.
micaceus, Hypholoma fasciculare, Lentinus edodes, Lepista personât, Marasmius
oreades, Pholiota alnicola, Pleuronata versicolor, Stropharia coronilla,
Suillusltuteus, Schizophyllum commune, Trimetes versicolor và Volvariella
bombycina) đều cho thấy có chứa các chất chống oxy hóa có khả năng ức chế gốc
tự do trong phản ứng peroxide hóa lipid khi thí nghiệm trên não chuột. Hiệu quả
loại bỏ gốc tự do thu nhận từ sinh khối các chủng nấm từ môi trường nuôi cấy, các
chất khô của dịch lọc sau lên men, các hợp chất chiết khi sử dụng dung môi chiết
khác nhau thu nhận nấm Antrodia camphorata trong lên men chìm. Kết quả thu
được trong dịch chiết sinh khối có tác động tích cực với khả năng loại bỏ gốc tự do,
đặc biệt hơn khi chiết sinh khối nấm bằng nước cũng cho thấy khả năng và hoạt
tính chống oxy hóa. Ngay cả dịch sau lên men sau khi đã loại bỏ sinh khối cũng có
hiệu quả loại bỏ gốc tự do nhưng với hiệu quả thấp hơn. Các nhà nghiên cứu đã
chứng minh được mối quan hệ tuyến tính giữa sự ức chế quá trình peroxy hóa chất
béo và hàm lượng polyphenol tổng thu nhận được từ dịch lên men của các chủng
nấm Antrodia camphorata. Hơn nữa, họ cũng tìm ra sự tương quan cao giữa sự ức
chế quá trình peroxy hóa chất béo và hàm lượng triterpenoids thô trong dịch chiết
bởi dung môi methanol, ethyl acetate [14, 20].
Mặc dù các nghiên cứu đều đã chứng minh được rằng nấm Cordyceps có
hoạt tính chống oxy hóa, nhưng để chắc chắn hợp chất nào đảm nhiệm công việc
này lại chưa có một kết luận nào rõ ràng. Chưa thể kết luận được rằng bất cứ thành
phần nào như polysaccharides, mannitol và cordycepin ở Cordyceps sinensis có tác
động chính là chống oxy hóa [16].

1.2.5. Sterol
Ergosterol là sterol duy nhất của nấm và là tiền chất thiết yếu của vitamin
D2, có giá trị dược liệu quan trọng. Hàm lượng ergosterol trong quả thể nhân tạo
của Cordyceps rất cao (10,68 mg/g) cao hơn nhiều so với hệ sợi nấm chỉ có 1,44
mg/g [22]. Ergosterol trong C. sinensis có thể được xác định bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao HPLC (High Performace Liquid Chromatography) do Li và
cộng sự thực hiện năm 1991 [10,14], được cho là chất ophiocordin, ở C.
pseudomilitaris là chất bioxanthracenes và tập hợp bốn exopolysaccharide với các
trọng lượng phân tử thay đổi từ 50 kDa tới 2260 kDa tìm thấy ở C. militaris [10,14].
1.2.6. Protein và các amino acid
Nấm Cordyceps có hàm lượng protein thô trong khoảng 29,1 – 33%. Protein
này bao gồm 18 loại amino acid, gồm có aspartic, threonine, serine, glutamate,
proline, glycine, valine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine,
lysine, histidine, cystine, cysteine và tryptophan. Hàm lượng amino acid sau khi
thủy phân hầu hết là 20 – 25%, lượng thấp nhất là 5,53%, cao nhất là 39,22%. Hàm
lượng cao nhất là glutamate, arginine và acid aspartic, các thành phần có tác dụng
dược lý chính là arginine, glutamate, tryptophan và tyrosine [22]. Các chủng
Cordyceps spp. cũng chứa các loại protein, peptides, polyamines và tất cả các
amino acid thiết yếu. Thêm nữa, Cordyceps spp. cũng chứa các loại dipeptide vòng
hiếm gặp có vòng gồm có cyclo-[Gly-Pro], cyclo-[Leu-Pro], cyclo-[Val-Pro], cyclo-
[Ala-Leu], cyclo-[Ala-Val] và cyclo-[Thr-Leu]. Một lượng nhỏ polyamines như
1,3-diamino propane, cadavarine, spermidine và putrescine cũng được tìm thấy
[13].
1.2.7 Acid béo và nguyên tố kim loại
Acid béo bao gồm carbon, hydro, và oxy và là thành phần chính của lipids,
phospholipid và glycolipid, chúng được phân loại thành acid béo no và không no. Ở
Cordyceps, lượng acid béo no được tìm thấy là 57,84%, gồm có C16:1, C17:1, C18:1,
C18:2. Acid linoleic chiếm hàm lượng cao nhất 38,44%, tiếp đó là acid oleic 17,94%.
Các acid béo nó chiếm 42,16%, bao gồm C14, C15, C16, C17, C18, C20, và C22. Acid
palmitic và acid octadecanoic chiếm hàm lượng cao nhất lần lượt là 21,86% và
15,78%. Các acid béo không nó có chức năng giảm lipid máu và bảo vệ chống lại
bệnh tim mạch, chứa một loạt các hợp chất dinh dưỡng như các acid amin thiết yếu,
vitamin E và K, các vitamin tan trong nước như B1, B2, và B12. và các nguyên tố đa

lượng và vi lượng (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ti, Cr, Ga, V
[12].
1.2.8 Polysaccharide
Nấm Cordyceps spp. được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng trong sản xuất
thực phẩm chức năng và sản xuất thuốc trong phòng và chữa bệnh. Chúng chứa rất
nhiều loại đường, bao gồm mono-, di-, và các oligosaccharide, và nhiều
polysaccharides phức tạp (gồm có cyclofurans (đường 5C, mạch vòng, chưa rõ chức
năng), beta-glucans; beta-mannans; và phức hợp polysaccharides có cả đường 5 và
6C cùng tham gia vào các chuỗi nhánh, dùng cả cầu nối alpha- và beta-).
Các polysaccharides chính trong nấm Cordyceps là một dạng glucans với các
mối liên kết glycosidic chứa các liên kết: (1/3) - (1/6) - β glucans và (1/3) - 1 -
glucans. Mặc dù, vách tế bào nấm là nguồn cung cấp chính của polysaccharides đã
được chứng minh kháng khối u, trong khi polysaccharide thu nhận từ thực vật lại
không có đặc điểm này, điều này chỉ có thể giải thích được thông qua sự khác nhau
trong cấu trúc hóa học của các polysaccharide. Các polysaccharide có khả năng
chống lại hoạt động của các tế bào ung thư chúng bao gồm homopolyme có cấu tạo
đơn giản đến phức tạp bao gồm glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose,
fucose, ribose và acid glucuronic. Trong một số loài nấm, polysaccharides liên kết
với các protein hoặc peptide tạo thành các hệ polysaccharide - protein hoặc
polysaccharide - peptide cấu trúc có hoạt tính kháng u mạnh hơn. Cấu trúc 1/3 - β -
glucans có khả năng kháng khối u được biết nhiều nhất, theo các nghiên cứu cho
biết những glucans có được hoạt tính sinh học này là trong cấu tạo các phân tử có
dạng mạch thẳng hoặc phân nhánh với cấu trúc chính là phân tử đường glucose liên
kết với các đơn vị trong chuỗi tại các vị trí khác nhau, với các chuỗi bên bao gồm
các đơn vị như acid glucuronic, xylose, galactose, mannose, arabinose hoặc ribose.
Heteroglycans là một nhóm lớn polysaccharides lớn hoạt tính sinh học đa dạng
được phân loại là galactans, fucans, xylans, và mannans [7,13,14].
1.2.9 Acid cordycepic
Theo dược điển của Trung Quốc, acid cordycepic hay D-manitol, một đồng
phân của acid quinic với cấu trúc polyol chiếm khoảng 9% trong Cordyceps, đây là
thành phần được sinh ra trong hoạt động sinh tổng hợp và được sử dụng như một
dấu hiệu trong kiểm soát chất lượng nuôi cấy nấm C. sinensis. Mannitol là sản
phẩm sinh học chính với hoạt tính sinh học quan trọng, tồn tại trong tự nhiên ở rễ
cây, mầm và lá của thực vật, trong khi đó cũng có nhiều mannitol được phát hiện ở

các loài nấm ăn được, cà rốt và địa y. Thông thường, hàm lượng cordycepic trong
Cordyceps spp. là 7-29%, thành phần này khác nhau trong từng giai đoạn phát triển
của quả thể. Về mặt hóa học, mannitol là một rượu và một đường hoặc là một
polyol; nó tương tự như xylitol và sorbitol. Tuy nhiên, mannitol có xu hướng mất
một ion hydro trong dung dịch, điều này gây đến dung dịch có tính acid. Công thức
hóa học của mannitol là C6H14O6, trọng lượng phân tử là 182, có điểm nóng chảy là
166o
, điểm sôi là 290-295o
C. Mannitol được sử dụng rộng rãi trong y dược và công
nghiệp thực phẩm. Thông thường, hàm lượng mannitol có trong quả thể Cordyceps
sp. là 29 – 85 mg/g, lượng mannitol chứa trong hệ sợi nấm của Cordyceps thì cao
hơn trong quả thể [22]. Trong nuôi cấy invivo, hàm lượng acid cordycepic tạo ra
bởi C. sinensis là khá cao và hầu như giống với các mẫu trong tự nhiên. Hơn nữa,
khi nuôi C. sinensis cho hàm lượng D-manitol cao hơn trong quả thể của C.
militaris. Các thành phần hóa học tự nhiên của Cordyceps bao gồm cả cordycepic
acid, đã được Dong và cộng sự ., mô tả, cho thấy hoạt động chống oxy hóa và hàm
lượng cordycepic acid trong quả thể của C. militaris phụ thuộc vào nồng độ khoáng
chất selenite natri trong môi trường. Và họ cũng công bố rằng, C. sinensis chứa
nhiều thành phần có hoạt tính sinh học hơn như 3’-deoxyadenosine, cordycepic acid
và polysaccharides [11]. Acid cordycepic được tách ra từ C. sinensis từ những năm
1957, đã được chứng minh có tác dụng lợi tiểu và phòng ngừa biến chứng sau phẫu
thuật cắt thận, làm giảm ho và hen suyễn. Đặc biệt acid cordycepic có thể cung cấp
sự bảo vệ hiệu quả trong điều trị các bệnh nhân sau nhồi máu não và chấn thương,
chẳng hạn như cải thiện vi tuần hoàn não và lưu lượng máu não, thúc đẩy phục hồi
thần kinh và bảo tồn các khu vực thiếu máu cục bộ, giảm điều tiết áp lực nội sọ, và
giảm sự hình thành dịch não tủy và não mô hàm lượng nước. [11, 13, 14 ].
Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của cordycepic acid của Cordyceps spp.

1.3 Giá trị dược liệu của các hoạt chất sinh học tới sức khỏe con người
Các tác động được cho là của nấm Cordyceps là chống ung thư, chống di
căn, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, chống viêm, diệt khuẩn, hạ đường huyết,
chống lão hóa, bảo vệ thần kinh và bảo vệ thận. Cụ thể, polysaccharides đảm nhiệm
chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư, chống di căn khối u, điều hòa miễn
dịch , hypoglycaemic, steroidogenic và hypolipidaemic. Cordycepin đảm nhiệm
chống ung thư, trừ sâu, chống nhiễm khuẩn. Ergosterol ức chế ung thư, và điều hòa
miễn dịch [16].
Hiệu quả chống ung thư
Khả năng ức chế sự phát triển của các khối u được phát hiện ở nhiều chi của
loài Cordyceps. Các thành phần hoạt tính sinh học có tác động chống ung thư chủ
yếu là polysaccharide, sterols và adenosine. Trong đó, sterols và adenosine là các
chủ đề nghiên cứu nóng nhất về khả năng chống ung thư. Cho tới nay, các nhà khoa
học vẫn chưa thể biết chính xác cơ chế ức chế sự phát triển của tế bào ung thư của
Cordyceps, cơ chế này có thể là (1) tăng cường chức năng của hệ thống miễn dịch
và miễn dịch tự nhiên; (2) ức chế có chọn lọc tổng hợp RNA, từ đó ảnh hưởng tới
tổng hợp protein; (3) hoạt động chống oxy hóa và chống các gốc tự do; (4) chống
đột biến; (5) làm nhiễu quá trình sao chép của virus cảm ứng khối u; (6) cảm ứng
methyl hóa acid nucleic [22].
Tác động điều hòa miễn dịch
Các tác động chính của Cordyceps lên hệ thống miễn dịch vào các tế bào như
đáp ứng tăng sinh lymph, tế bào giết tự nhiên (NK), và kích thích tạo thành: ngưng
kết tố thực vật (PHA) interleukin-2 (IL-2) và tác nhân hoại tử tế bào ung thư (TNF-
α) trên các tế bào đơn nhân ở người , đây là kết quả sự sản xuất của cytokines. Các
tác động trị liệu của nấm, như ngăn chặn bệnh tự miễn, dị ứng cũng có liên quan
đến tác động điều hòa miễn dịch [22].
Tác động bảo vệ gan
Bệnh về gan là căn bệnh đe dọa chính tới sức khỏe của con người và ảnh
hưởng tới chất lượng cuộc sống. Các thử nghiệm trên động vật và các dữ liệu từ các
phòng khám cho thấy, Cordyceps có tác dụng bảo vệ gan của bệnh nhân, như các
bệnh do viêm gan virus A, viêm gan B mạn tính, viêm gan C, xơ gan. Chúng làm
tăng các tế bào hữu cơ chức năng điều hòa, đưa trạng thái HBeAg-dương tính về
HBeAg-âm tính, tăng cường chức năng gan và ức chế xơ gan [22].

Bảo vệ thận
Các tác động bảo vệ thận được trình bày chủ yếu là: (1) tác động trị liệu lên
thận tổn thương độc thận; (2) bảo vệ, chống lại sự sai hỏng chức năng mạn tính ở
thận; (3) đảo ngược tác dụng của viêm tiểu cầu thận [22].
Bảo vệ tim và chống lại chứng tăng huyết áp
C. sinensis có rất nhiều ảnh hưởng tới hệ thống tim mạch, chẳng hạn như có
tần số âm tính, cơ tim giảm tiêu thụ oxy, cải thiện cơ tim thiếu máu cục bộ, chống
đông tụ tiểu cầu, tác động chống loạn nhịp [22].
Bảo vệ các cơ quan khác
C. sinensis cũng cho thấy tác động lên hệ thống các cơ quan khác. Ví dụ như
trung khu thần kinh, C. sinensis làm giảm đau, chống co giật và thanh nhiệt. Trên hệ
thống hô hấp, C. sinensis có tác dụng làm giãn cuống phổi, cụ thể là sự tăng tiết
adrenaline từ tuyến thượng thận, và cũng có vai trò co khí quản do histamine. Nó
cũng có tác dụng chống ho, long đàm, và trị hen, ngăn cản tràn khí màng phổi.
Trong hệ thống nội tiết, C. sinensis có tác động tới hormone của nam giới; và tăng
mức corticosterone [22].
Trong những năm gần đây, Cordyceps trở thành nguồn nguyên liệu rất quan
trọng cho làm thuốc và thực phẩm chức năng. Giá cả của chúng tăng lên rất nhanh,
có rất nhiều người đã canh tác chúng. Hiện tại, sự phát triển của Cordyceps và các
chế phẩm của chúng chủ yếu tập trung vào ba hướng. Thuốc ăn kiêng. Thực phẩm
chức năng. Phát triển tính thuốc. Hầu hết các hoạt chất sinh học chiết xuất từ
Cordyceps như cordycepin, cordycepic acid và polysaccharide đều là các chất
chống lão hóa và tác động giúp điều hòa giấc ngủ cũng đã được cấp phép như một
nguồn thuốc mới bởi SFDA của Trung Quốc. Vì vậy, sử dụng Cordyceps và cả dịch
chiết, chúng ta có thể phát triển rất nhiều sản phẩm nhờ công nghệ hiện đại. các sản
phẩm này có rất nhiều chức năng chủ yếu tập trung vào các phương diện: tăng
cường thể chất, chống lão hóa, bảo vệ tim mạch, cải thiện giấc ngủ, tăng ngon
miệng, tăng cường miễn dịch.
1.4. Nghiên cứu nâng cao khả năng thu nhân polysacharide từ nấm Cordyceps
sp.
1.4.1 Đặc điểm của polysacharide
Có rất nhiều polysaccharide trong các chủng Cordyceps spp. Wang tìm ra
hàm lượng polysaccharide chứa trong sợi nấm của C. sinensis là 157,3 mg/g và khi

so sánh hàm lượng đường tổng giữa thể trùng và quả thể có chút khác nhau tương
ứng 24,2 và 24,9%, nhưng hàm lượng trong sợi nấm vẫn cao nhất chiếm 39,4%.
Theo phương pháp đo màu sử dụng acid sulphuric (Dubois 1956), lại thấy rằng hàm
lượng của polysaccharides trong C. sinensis và C. hawkesii lần lượt là 3,5 và 0,7 %
thấp hơn so với C. sinensis [20].
C. militaris được cho là chủng thích hợp nhất trong chi nấm Cordyceps,
chúng có thể được nuôi cấy tốt trong môi trường rắn hoặc lỏng. Huang và cộng sự,
đã nghiên cứu các thành phần của quả thể và sợi nấm của C. militaris và nhận thấy
rằng hàm lượng đường tổng là 260,64 và 389,47 mg/g, nhưng sự giảm hàm lượng
đường trong quả thể lại cao hơn trong sợi nấm khi thu nhận từ tự nhiên và nuôi
nhân tạo. So sánh lượng polysaccharide chứa trong quả thể nhộng tằm Cordyceps,
chất nền, hạch nấm và sợi nấm thấy rằng, polysaccharide cao nhất trong quả thể,
sau đó là chất nền và hạch nấm. Trong môi trường nhân tạo, lượng polysaccharide
trong sinh khối khô là 0,14% [20].
1.4.2.Đặc tính chống ung thư của polysaccharides
Đặc tính kháng khối u của các polysaccharides có thể bị ảnh hưởng bởi kích
thước của phân tử, mức độ phân nhánh, hình thức, và khả năng hòa tan trong nước.
Nói chung, các polysaccharide càng có trọng lượng phân tử lớn và hòa tan trong
nước tốt có khả năng kháng khối u cao hơn. Một số nghiên cứu thu được về khả
năng kháng khối u của phức hợp polysaccharide liên kết với protein tách ra từ các
phần khác nhau của nấm Cordyceps trên một số dạng khối u cho thấy, các
polysaccharides cho hoạt động kháng khối u cao có nguồn gốc từ quả thể, đây là
các heteropolysaccharides có khối lượng phân tử khoảng 10 - 103 Da, có chứa
galactose, glucose, mannose và fucose. Ngoài ra, một số polysaccharides có chứa
hoạt tính cao được tách từ các khuẩn ty dưới dạng sợi nấm chủ yếu là glucans chứa
protein với trọng lượng phân tử khoảng 10 -103 Da. Hầu hết các polysaccharides
công bố có hoạt động kháng u đã biết đều có cấu trúc cơ bản β-glucan chỉ khác
nhau về loại hình liên kết guclosidic [12, 21]. Do vậy, hoạt động chống khối u đòi
hỏi có cấu trúc đặc trưng như liên kết β-(1→3) trong chuỗi chính của glucan và
thêm vào đó là nhánh β-(1→6) Nếu β-glucans chủ yếu là mạch thẳng, chứa các
nhánh không quá dài, chúng sẽ cho thấy hoạt động chống ung thư. Polysaccharide
cho thấy khả năng chống tế bào ung thư có thể chứa các cấu trúc khác như hetero-β-
glucans, heteroglycan, β-glucan-protein, α-manno-β-glucan liên kết glucosidic [21].

1.4.3 Nguồn cacbon
Nguồn cacbon là thành phần chính của môi trường dinh dưỡng, đảm bảo cho
sự phát triển của vi sinh vật và tạo các hợp chất thứ cấp như polysaccharide,
cordycepic acid. Mặc dù, nhiều nghiên cứu coi sử dụng glucose như một nguồn
cacbon thích hợp và cơ bản, tuy nhiên một số nghiên cứu cũng đã so ánh ảnh hưởng
của các nguồn cacbon khác nhau tới sự sinh trưởng của nấm Cordyceps sp. và việc
tạo ra các hợp chất polysaccharide và cordycepic acid.
Khi lên men Cordyceps sp. Pokhrel và Ohga đã sử dụng 7 nguồn cacbon
khác nhau ở cùng nồng độ 30g/l trong môi trường cơ bản. Trên các môi trường ở
các nguồn cacbon khác nhau, kết quả thu được về sinh khối nấm, EPS và IPS cũng
rất khác biệt trong số 7 các nguồn cacbon, lượng sinh khối nấm tốt nhất là lactose
xếp sau glucose và fructose có (6,36 – 6,73 g/l) [7]. Glucose là nguồn cacbon tốt
cho sản phẩm EPS, tuy nhiên không cao hơn nhiều so với maltose. Lượng EPS thấp
nhất trên môi trường có nguồn cacbon là saccarose.Sự tạo thành IPS dao động từ
187 tới 317 mg/g sinh khối. Glucose cũng là nguồn cacbon tốt nhất để sản sinh IPS
sau là xylose và sorbitol. Lượng IPS thấp nhất được ghi nhận ở môi trường có
nguồn cacbon là fructose. Điều đó chứng tỏ, quá trình sinh tổng hợp của EPS và
IPS phụ thuộc nguồn cacbon và lượng tiêu thụ. Các tác giả cho rằng các nguồn
cacbon khác nhau đã ảnh hưởng tới cơ chế ức chế dị hóa của trao đổi thứ cấp.
Glucose hoặc maltose dễ dàng sử dụng hơn cho sự tổng hợp EPS vì glucose là
thành phần đường cơ bản của các EPS. Các nhà nghiên cứu phát hiện ra rằng, thời
gian lên men càng lâu, trọng lượng phân tử của các polymer sinh học càng cao.
Nồng độ cơ chất trong môi trường ban đầu là một trong các nhân tố có ảnh
hưởng mạnh tới sự phát triển và sự tạo thành các sản phẩm bậc hai. Đối với môi
trường có nguồn cacbon là glucose sự tăng sinh khối và EPS thu được trong môi
trường có nồng độ glucose cao, nồng độ glucose tăng từ 10 g/l tới 20 g/l cho kết quả
tăng từ 1,2 tới 1,7 lần với sinh khối và 1,6 tới 3 lần với EPS. Khi nồng độ glucose
lớn hơn 40 g/l glucose, việc thu nhận EPS không có được những sản phẩm mong
muốn và ở nồng độ glucose cao có thể ức chế sự phát triển của nấm Cordyceps sp.
Nồng độ thường ban đầu cũng ảnh hưởng tới kích thước các hạt pillet. Kích thước
các hạt pillet nhỏ hơn 1,2 mm chiếm ưu thế ở nồng độ glucose ban đầu cao, trong
khi đó đường kính hạt lớn hơn 1,6 mm chiếm ưu thế khi ở nồng độ thường ban đầu
là 20 g/l. Vì kích thước hạt lớn hơn có liên quan tới hàm lượng acid cordypic cao và
IPS thấp hơn, và còn chịu ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu. Để xác định ảnh
hưởng của nồng độ nguồn cacbon trong môi trường nuôi nấm Cordyceps để thu
nhận sinh khối và polysaccharide, Lee và cộng sự đã nuôi nấm ở các nồng độ

glucose thay đổi từ 10 – 80 g/l. Kết quả cho thấy, nồng độ glucose càng cao, càng
có nhiều EPS được tạo ra. Trái ngược với nó, hàm lượng IPS lại giảm khi tăng nồng
độ cacbon trong môi trường. Các tác giả cũng đã thiết lập tỷ lệ C/N khác nhau bằng
cách chỉ thay đổi nồng độ nitơ, với nồng độ cacbon được giữ ở 40 g/l. Kết quả cho
thấy, sự sản sinh EPS dường như không chịu tác động khi tỷ lệ C/N thay đổi, ngược
lại, lượng IPS tăng mạnh khi tỉ lệ C/N đạt 3:1
1.4.4 Nguồn nitơ
Một nhân tố thiết yếu khác ảnh hưởng tới sự phát triển của nấm Cordyceps.
Và khả năng sản sinh polysaccharide là nguồn nitơ và nồng độ của nó. Nitơ là nhân
tố có tính quyết định tới sự tổng hợp enzyme có trong cơ thể, ảnh hưởng mạnh tới
sự trao đổi sơ cấp và thứ cấp. Một nguồn nitơ cơ bản có trong môi trường bao gồm
dạng vô cơ: ammonium, nitrat hoặc dạng hữu cơ là các acid amin hoặc protein và
thường sử dụng nguồn nitơ là cao nấm men, peptone ở dạng riêng rẽ hoặc kết hợp
cả hai loại ở mỗi nồng độ từ 1 – 5 g/l. Pokhrel và Ohga đã nghiên cứu ảnh hưởng
của nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ cho sự phát triển của nấm trong việc tạo
polysaccharide. Tám nguồn nitơ khác nhau với nồng độ sử dụng 1%, được thực
nghiệm riêng rẽ trong môi trường cơ bản. Trong số các nguồn nitơ sử dụng trong
nghiên cứu, cao nấm men cho khả năng phát triển cao nhất với lượng sinh khối đạt
7,03 g/l, cùng với EPS và IPS lần lượt là 1,76 g/l và 325 mg/g sinh khối khô. Sau đó
là cao nấm men và trypton và cuối cùng là trên môi trường có bổ sung ammonium
sulfate. Khi nồng độ cao nấm men thay đổi từ 0,5% tới 2% thì ở nồng độ cao nấm
men 1% cho nấm khả năng phát triển tối đa và lượng IPS tạo thành là lớn nhất, trái
lại để tạo thành EPS nhiều thì cần cung cấp hơn cao nấm men và đạt cao nhất ở
nồng độ (2,46 g/l).
Một số tác giả cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ vô cơ và
hữu cơ khác nhau (ở nồng độ cuối là 20 mm) đến sự phát triển và sinh tổng hợp
EPS của nấm trên môi trường chứa 50 g/l glucose. Tất cả hợp chất chứa nitơ đều
cho thấy những ảnh hưởng tích cực đến quá trình tạo sinh khối nấm và tạo EPS, làm
tăng mức độ tăng trưởng và lượng sinh khối thu được lên xấp xỉ 2,5 tới 4,7 lần, EPS
lên 1,5 tới 5 lần so với môi trường đối chứng chỉ chứa 3 g/l cao nấm men. Lượng
sinh khối tối đa và EPS cao nhất trên môi trường sử dụng hợp chất nitơ hữu cơ và
cao ngô với EPS đạt (2,5 – 3,0 g/l).
1.4.5 Ảnh hưởng của điều kiện lên men tới hàm lượng polysaccharide
Rất nhiều loại môi trường, các kỹ thuật và công nghệ đã được sử dụng cho
việc nuôi cấy nấm, cũng như việc tạo quả thể nấm, tuy nhiên lên men chìm lại thích

hợp hơn để sản xuất thu nhận sinh khối và các sản phẩm có hoạt tính sinh học. Lên
men bề mặt rắn có một số lợi ích nhất định khi so sánh với lên men chìm, đặc biệt,
là sự tiêu thụ ít năng lượng môi trường dinh dưỡng tập trung và có thể thu được với
chất lượng cao từ những cơ chất rẻ tiền như các chế phẩm nông nghiệp. Ngoài ra
thương mại hóa ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy bề mặt vẫn có nhiều khó khăn do
quá trình nuôi chiếm dịch tích lớn, rất khó khăn trong điều chỉnh các thông số như
pH, nhiệt độ, cấp khí và vận chuyển oxy, độ ẩm và đảo trộn. Đối lập với lên men bề
mặt, lên men chìm đòi hỏi sự tiêu thụ năng lượng lớn cho việc đảo trộn chất dinh
dưỡng và cung cấp oxy. Cơ chế hoạt động của lên men chìm giống như một hệ
thống đồng nhất, và điều khiển quy trình nuôi đơn giản các thông số được điều
khiển và thể hiện thông qua các điện cực cắm trực tiếp trong hệ thống lên men.
Trong quá trình lên men một lượng lớn sản phẩm có thể được tạo ra từ các chủng
nấm có thể được rút ra và bổ sung liên tục các chất dinh dưỡng. Với kỹ thuật này
giúp chúng ta có thể thu nhận trực tiếp ra các sản phẩm đích bằng cách thiết lập
điều kiện môi trường nuôi mong muốn. Lên men chìm cho phép tạo ra đầy đủ các
sản phẩm đã được chuẩn hóa trong sinh khối có giá trị dinh dưỡng cao và các sản
phẩm khác mà thành phần có thể đoán trước được, nhưng quá trình thu nhận và tinh
sạch có thể dễ dàng hơn so với lên men bề mặt. Vì vậy, nuôi lên men chìm nấm lớn
cũng có tiềm năng trong sản xuất công nghiệp sẽ giúp giảm giá thành sản phẩm
[9,20,19].
Trong quá trình lên men chìm nấm Cordyceps chịu tác động trực tiếp của các
yếu tố môi trường bao gồm: điều kiện môi trường và thành phần môi trường gồm
nguồn cacbon, nitơ, pH… các nghiên cứu chỉ ra rằng việc lựa chọn chính xác thành
phần môi trường và các thông số sẽ mang tính quyết định nhằm tối ưu quá trình
sinh sinh khối hoặc các sản phẩm trao đổi chất, các yếu tố vật lý và hóa học cũng
ảnh hưởng tới khả năng tạo ra các sản phẩm đích.
a) Ảnh hưởng của pH
Trị số pH đầu ảnh hưởng không nhỏ tới sự sinh trưởng và sinh tổng hợp của
vi sinh vật, các quá trình trao đổi chất và giai đoạn tổng hợp các hợp chất trung gian
đòi hỏi những điều kiện nuôi cấy nhất định, trong đó có pH môi trường. pH đầu tác
dụng đến sinh trưởng của vi sinh vật và tạo điều kiện thích hợp cho những giai đoạn
đầu của quá trình đồng hóa, tích tụ những bán thành phẩm để tổng hợp những phân
tử, các hợp chất cần thiết.
Các nghiên cứu gần đây báo cáo rằng, pH có tính acid thì phù hợp với sự
phát triển của hệ sợi nấm và các sản phẩm tạo thành đúng với rất nhiều chủng loại
thuộc Ascomycetes và Basidiomycetes. Một số thí nghiệm trước đó đã cho thấy, ảnh

hưởng của pH môi trường tới hệ sợi nấm là có liên quan mật thiết, và được thể hiện
trong khoảng pH môi trường từ 4,0 – 9,0. Dưới điều kiện pH từ 4,0 – 6,0 sợi nấm
dài hơn và có nhiều đỉnh nấm hơn. Ở pH 5 quá trình lên men phát triển của nấm
diễn ra nhanh hơn, khối lượng nấm tối đa có thể thu được là 10,21 g/l [19].
b) Ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng.
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn tới sự phát triển của hệ sợi nấm, và khả năng sinh
tạo các hợp chất sinh học bởi Cordyceps. Các nghiên cứu trên khả năng sinh tổng
hợp cordycepin, polysaccharide, và các thành phần khác đều được tiến hành theo
các nhiệt độ thay đổi từ 15o
C, 20o
C, 25o
C, 30o
C. Kết quả cho thấy, 25o
C là nhiệt độ
tối ưu cho sự phát triển của sợi nấm, sự sản sinh cordycepin và các nucleoside khác.
Nhiệt độ thấp 15o
C, 20o
C không phù hợp cho sự phát triển hệ sợi nấm. Ở nhiệt độ
cao 30o
C, ức chế sự tạo thành cordycepin [15].
Hình 1.7 Hình thái sợi nấm C.sinensis 16 sau 5 ngày lên men ở các
nồng độ pH khác nhau.
c) Tốc độ khuấy trộn
Trong nuôi cấy bề mặt các lớp môi trường phải mỏng để tạo ra mặt thoáng
rộng và trong nuôi cấy chìm phải tạo ra điều kiện cho không khí hòa tan nhiều vào
môi trường lỏng. Độ hòa tan oxy (DO) không chỉ phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy,
nồng độ chất hợp phần, độ nhớt môi trường mà còn phụ thuộc tốc độ khuấy. Tốc độ
khuấy trộn là một thông số quan trọng trong chuyển hóa cơ chất, sinh nhiệt, và khả
năng hòa tan oxy (DO), có tác động rõ rệt tới sự thay đổi hình thái. Khả năng hòa
tan oxy là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự sản sinh polysaccharide. Một vài thí

nghiệm gần đây ở các mức khuấy trộn khác nhau, lượng sinh khối nấm lớn nhất
(40,6 g/l) và sản lượng EPS (6,23 g/l) lần lượt thu được ở 250 và 200 rpm [10, 16].
d) Ảnh hưởng của tốc độ thông khí
Tăng sự thông khí trong giới hạn nhất định thì sự phát triển của vi sinh vật
cũng tăng biểu hiện như rút ngắn pha tiềm phát, nâng cao sinh khối. Cung cấp khí
trong tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp đồng nghĩa với thúc đẩy sự chuyển hóa cơ
chất, tạo sản phẩm và hòa tan oxy. Vì vậy, ảnh hưởng của tốc độ thông khí trong
nuôi cấy nấm và tạo các hoạt chất ngoại bào là một yếu tố quan trọng. Trong một
nghiên cứu mới đây, lượng sinh khối tối đa (43,00 g/l)và lượng EPS (6,47 g/l) thu
được ở tốc độ thông khí là 1,5 vvm, thêm nữa, mức độ tiêu thụ glucose tăng cao khi
ở tốc độ thông khí lớn nhất [10, 16].

II. VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu nghiên cứu
a) Chủng giống
Các chủng nấm Cordyceps sp. CM nhận từ phòng Công nghệ tế bào thực vật,
Viện Công nghệ sinh học.
b) Chủng VSV kiểm định
- Bacilus subtilis LH68
2.2. Hóa chất
Các loại chất chính được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:
- Peptone, cao nấm men, cao thịt, , (NH4)2SO2
- Tryptone
- Tinh bột
- Saccharose, glucose, lactose , L-rhamnose, D-manitol
- Muối khoáng: MgSO4.7H2O, K2HPO4, KH2PO4, KIO4
- Acetyl acetone, H2SO4 98%, Phenol 80%, HCl 36%
- Agar
- Nước cất
2.3. Dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
a) Dụng cụ
- Ống nghiệm
- Que cấy
- Đĩa petri
- Bình Elenmeyer
- Ống đong
- Phễu đong
- Giấy quỳ

b) Thiết bị
Bảng 2.1 Một số thiết bị hay sử dụng trong nghiên cứu
Thiết bị Nơi sản xuất
Tủ ấm
Tủ cấy vô trùng
Nồi hấp thanh trùng
Cân phân tích
Máy ly tâm
Tủ lạnh
Trung Quốc
Việt Nam
Đức
Thụy sĩ
Đức
Việt Nam
2.4. Môi trường
Bảng2.2 Một số môi trường nuôi cấy
Thành phần Môi trường g.L-1
MYPS CB PDA BEDA MPA CHDA
MgSO4.7H2O
K2HPO4
Casein
NaCl
FeSO4.7H2O
Peptone
Cao nấm men
Tryptone
Cao thịt bò
Cao malt
Cao thịt
Dextrose
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

Glucose
Saccharose
Mantose +
+
+
+ + +
2.5. Phương pháp thu nhận các hợp chất sinh học
Lọc
sấy, nghiền
EtOH 95o
, 1:5, 24h
H2O, 100°C, 1h
Nước cất
Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp thu nhận các hợp chất sinh học từ môi trường lên men
nấm Cordyceps
Chủng C. militaris sau khi lên men 11 ngày ở điều kiện 25C, tốc độ lắc 150
rpm dừng lên men để thu nhận các hợp chất sinh học theo hình 2.1. Dịch sau lên
men được lọc qua giấy lọc có đường kính lỗ lọc là 25µm, thu dịch sau lọc và sinh
khối trên giấy lọc. Phần dịch sau lọc thu sử dụng để xác định cordycepic acid, và
xác định polysacharide ngoại bào theo các bước:
Dịch sau
lên men
Dịch lọc Sinh
khối
Đo Thu sk
Dịch
chiết Et
Bột sk
Dịch
chiết nc

Bước 1: Bổ sung ethanol có nồng độ 95o
vào dịch sau lọc theo tỷ lệ 1:5,
Bược 2: Hỗn hợp sau bổ sung cồn được lắc đều và giữ ở nhiệt độ 10C trong
24h.
Bước 3: Dịch sau khi giữ lạnh được ly tâm 10.000rpm trong 10 phút ở nhiệt
độ 4C để thu sinh khối.
Bước 4: Sinh khối thu được dem lam khô ở nhiệt độ phòng để loại bỏ hết
phần ethanol sau đó được hòa với nước cất theo tỷ lệ 1:1(w/v). Dịch thu được sử
dụng để xác định polysacharide.
Đối với phần sinh khối sau lọc, được rửa sạch lại 3 lần với nước cất, sau đó
đem sấy khô dến khối lượng không đổi và được xác định khối lượng thu được. Phần
sinh khối sau khi sấy khô được nghiền nhỏ. Để xác định lượng polysacharide và
codycepic có trong sinh khối được tiến hành theo các bước sau:
Bước 1: Phần sinh khối sau khi nghiền nhỏ bổ sung nước cất với tỷ lệ 1:5
(w/v).
Bước 2: Hỗn hợp dịch sau khi bổ sung nước được đun ở 100°C trong vòng 1
giờ.
Bước 3: Dịch sau đun sôi được ly tâm loại phần sinh khối giữ lại phân dịch
trong.
Phần dịch trong sẽ được sử dụng xác định hàm lượng acid codycepic và
polysacharide với các bước lặp lại như phần trên.
2.6 Phương pháp xác định
a) Acid Cordycepic
Phương pháp xác định cordycepic acid theo Xiao et al., 2009. được tiến hành
như sau:
Sinh khối sau khi làm khô và được trích ly bằng nước theo tỷ lệ 1:5 (w/v) ở
100o
C trong 2 giờ, sau đó ly tâm ở nhiệt độ 4C ở 10000rpm trong 5 phút thu dịch
loại sinh khối. Dịch sau ly tâm hút 0.25ml đưa vào ống mẫu 25ml, sau đó chuẩn độ
đến 25ml bằng nước tinh khiết. Sau đó hút 1ml dung dịch mẫu pha loãng tiến hành
oxy hóa với dung dịch kali periodate (15mmol/L periodate kali có chứa 0.12mol/l
acid chlohydric) ở nhiệt độ 53C trong 10 phút, sau quá trình oxy hóa bổ sung thêm
2ml dung dịch L-rhamnose nồng độ 0.1% (w/w) để loại bỏ lượng kaliperiodate dư.

Phản ứng hiện màu được thực hiện ở 53C bằng cách bổ sung thêm 4ml (có chứa
150g amoni actetate , 2 ml dung dịch acid acetic, và 2ml acetyl acetone trong 1 lít
nước tinh khiết) trong trong 15 phút. sau thời gian phản ứng tạo màu dung dịch
phản ứng được làm lạnh nhanh xuống nhiệt độ phòng.
Gía trị của cordycepic acid (Ac) được tính như sau: Ac= Am- An, Am là giá
trị OD 412nm hấp thụ đo được của mẫu thí nghiệm, và An là giá trị OD 412nm của
mẫu đối chứng. Lượng acid cordycepic có trong mẫu được tính toán dựa trên đường
chuẩn của được lặp bởi đường manitol với các bước tương tự.
Cách lập đường chuẩn acid cordycepic
Đường chuẩn của cordycepic acid (D- manitol) được lập ở các nồng độ : 0,
0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, và 1.50 trong 25 ml dịch pha loãng có dịch gốc là dung
dịch 1 mg/ml cordycepic acid với nước cất sử dụng làm mẫu trắng. Mỗi thí nghiệm
được đo trong 3 lần. Đường chuẩn đã được tính toán bằng cách vẽ độ hấp thụ với
giá trị OD 412 nm thu được của mỗi nồng độ (trục Y) so với nồng độ (trục X, mg/l),
và một phương trình hồi quy tương ứng đã được thành lập.
Bảng 2.3 Giá trị OD 412 nm khi đo ở các nồng độ D-manitol khác nhau.
STT Nồng độ (µg/ml) Giá trị OD 412 nm
1 0 0
2 10 0.11
3 20 0.196
4 30 0.28
5 40 0.38
6 50 0.45

Hình 2.2 Đồ thị đường chuẩn D-manitol
b) Polysaccharide
Hàm lượng polysaccharide được xác định theo phương pháp sử dụng acid
sulfuric và phenol đo màu ở OD 480 nm với bước sóng được đo tương tự như với
dextran được sử dụng làm chất chuẩn. Đối với các loại đường đơn giản,
oligosaccharides, polysaccharides, và các dẫn xuất của chúng, bao gồm cả các gốc
methyl ether tự do hoặc ít tự do sau khi được xử lý với phenol và acid sulfuric đặc
sẽ cho màu cam vàng. Phản ứng khá nhạy và màu ổn định. Bằng việc sử dụng
phenol-sulphuric acid cho phản ứng, phương pháp này cho phép phát hiện và định
lượng đường rất nhỏ. Khi sử dụng kết hợp với sắc ký giấy phương pháp càng trở
nên ưu việt hơn cho xác định thành phần polysaccharides và các dẫn xuất methyl
của chúng
Các bước tiến hành:
- Sử dụng pipette hút 0.5 ml dịch cần xác định polysaccharides cho vào ống
nghiệm có lắp, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần (lượng đường trong mẫu cần xác định
có nồng độ trong khoảng từ 0,5-50 µg) (được thực hiện trong các bốc hút).
- Hút tiếp 0.5ml dung dịch phenol 5% cho vào các ống nghiệm.
- Sau đó bổ sung 2.5ml acid sulfuric đặc với d=1,84 g/ml. Đóng nắp ống
nghiệm, lắc đều các ống để phản ứng đều. Khi phản ứng xảy ra, quá trình tỏa nhiệt
diễn ra mạnh mẽ, do vậy các ống nghiệm phản ứng được làm nguội nhanh bằng
nước tới nhiệt độ phòng, để yên trong thời gian 20 phút, sau đó tiến hành đo OD
480 nm. Mẫu đối chứng được thay thế bằng dung dịch nước cất quá trình tiến hành
với các bước tương tự. Hàm lượng polysaccharides trong mẫu thí nghiệm được tính
y = 0.009x + 0.0114
R² = 0.997
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 10 20 30 40 50 60
GíatrịOD412nm
Nồng độ manitol (µg/ml)

toán theo công thức và dựa trên sử bảng chuẩn (Dubois 1956). Công thức tính tính
hàm lượng polysacharide:
𝛾 = (
𝑦
0.0166
) × 34.36 × 𝐷
Trong đó:
γ – Tổng polysacharide trong dung dịch cần xác định (µg)
y – Giá trị OD của dung dịch sau khi trừ đi mẫu trắng.
D – Hệ số pha loãng.
0.0166 – Gía trị độ hấp thụ của tra bảng.
34.36 – Gía trị của tra bảng
2.7 Nâng cao hoạt tính polysaccharide và cordycepic acid của chủng nấm
Cordyceps sp. truyển chọn
2.7.1. Tuyển chọn các chủng nấm có hoạt tính sinh học cao
Dựa trên khả năng phát triển của hình thái nấm sợi nấm cả mặt trước và mặt
sau trong quá trình hình thành khuẩn lạc khi nuôi cấy trên các môi trường đặc trưng
CHDA, PDA, BEDA, CB khi nuôi nhiệt độ 25°C.
Đo đường kính khuẩn lạc sau 3, 5, 7, 9, 11, 14 ngày (dùng thước đo cm) để
đo đường kính, đo cả mặt trước và mặt sau của đĩa theo hai đường vuông góc, sau
đó tính trị số trung bình theo công thức:
𝐷 =
𝐷1 + 𝐷2
2
Trong đó:
D - Đường kính trung bình của khuẩn lạc (cm).
D1, D2 – Đường kính khuẩn lạc của hai đường vuông góc (cm).
Các nấm Cordyceps sp. sau khi được nhân giống trên môi trường cơ bản ở
nhiệt độ 25°C sau 72 giờ được cấy chuyển sang các bình tam giác 250 ml chứa 50
ml các môi trường chứa CHDA, CB2, PDA, CB1, BEDA1và BEDA2 với lượng
5%, các bình tam giác được nuôi trên máy lắc ở tốc độ 150 rpm ở 25°C, sau thời
gian 11 ngày xác định hàm lượng polysaccharide và cordycepic acid.

Căn cứ vào đặc điểm hình thái, khả năng sinh các hợp chất chọn ra chủng
thích hợp nhất.
2.7.2. Ảnh hưởng của môi trường lên men
Chủng nấm Cordyceps sp. sau khi được nhân giống trên môi trường cơ bản ở
nhiệt độ 25°C sau 72 giờ được cấy chuyển với lượng giống 5% sang các môi trường
lên men bao gồm MYPS, PDA, MPA, CB1 với thể tích 50m/250ml, nuôi lắc ở 150
rpm ở nhiệt độ 25C trong thời gian 11 ngày. Sau thời lên men, thu hồi xác định
hoạt tính sinh học từ đó, lựa chọn môi trường phù hợp.
2.7.3.Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Chủng nấm Cordyceps sp. sau khi được nhân giống trên môi trường cơ bản ở
nhiệt độ 25°C sau 72 giờ được cấy chuyển với lượng giống 5% sang các bình tam
giác 250 ml chứa 50 ml môi trương cơ bản giữ nguyên các thành phân và chỉ thay
đổi nguồn với khối lượng tương đương nhau bao gồm: lactose, tinh bột, bột đậu
tương, sacharose, malto dextrin, bột malt . Sau khi cấy giồng các bình được lên men
trên máy lắc ở tốc độ 150 rpm ở 25°C, sau 11 ngày xác định hàm lượng
polysaccharide và cordycepic acid và lượng sinh khối thu được.
2.7.4.Ảnh hưởng của nồng độ cacbon
Chủng nấm Cordyceps sp.CM sau khi được nhân giống trên môi trường cơ
bản ở nhiệt độ 25°C sau 72 giờ được cấy chuyển với lượng giống 5% sang các bình
tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trương cơ bản giữ nguyên các thành phần và chỉ
thay đổi nồng độcacbon . Sau khi cấy giống các bình được lên men trên máy lắc ở
tốc độ 150 rpm ở 25°C, sau 11 ngày xác định hàm lượng polysaccharide và
cordycepic acid và lượng sinh khối thu được.
2.7.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trương cơ bản giữ nguyên các thành phân và chỉ
thay đổi nguồn với khối lượng tương đương nhau bao gồm: cao thịt, cao thịt bò,
cao nấm men, NH4NO3, (NH4)SO4. Sau khi cấy giồng các bình được lên men trên
máy lắc ở tốc độ 150 rpm ở 25°C, sau 11 ngày xác định hàm lượng polysaccharide
và cordycepic acid và lượng sinh khối thu được.

2.7.6. Ảnh hưởng của nồng độ nitơ
Chủng nấm Cordyceps sp. CM sau khi được nhân giống trên môi trường cơ
tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trương cơ bản giữ nguyên các thành phần khoáng
và chỉ thay đổi nồng độ nitơ là 5, 10, 20, 30, 40, 50 với tỷ lệ cao nấm men: Pepton
3:1. Sau khi cấy giồng các bình được lên men trên máy lắc ở tốc độ 150 rpm ở
25°C, sau 11 ngày xác định hàm lượng polysaccharide và cordycepic acid và lượng
sinh khối thu được.
2.7.7. Ảnh hưởng của pH
tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường thích hợp bao gồm (g/l): glucose 40; cao
nấm men 22; peptone 6, KH2PO4 3, MgSO4 3 và được điều chỉnh pH ban đầu lần
lượt 4,0; 5,0; 5.5; 6,0; 6,5; 7,0 và 8,0. Khi chuẩn bị môi trường pH 7 - 8 nên dùng
thêm 0,2% KH2PO4 và K2HPO4 hoặc CaCO3 để làm chất đệm, giữ cho pH ổn định
Sau khi cấy giồng các bình được lên men trên máy lắc ở tốc độ 150 rpm ở 25°C, sau
11 ngày xác định hàm lượng polysaccharide và cordycepic acid và lượng sinh khối
thu được.
2.7.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Chủng nấm Cordyceps sp. CM sau khi được nhân giống trên môi trường cơ
tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường thích hợp bao gồm glucose 40; cao nấm
men 22; peptone 6, KH2PO4 3, MgSO4 3 và được điều chỉnh với pH ban đầu 6. Sau
khi cấy giồng các bình được lên men trên máy lắc ở tốc độ 150 rpm và được nuôi ở
các nhiệt độ 20C 25°C, 30C, 37C, sau 11 ngày xác định hàm lượng
polysaccharide và cordycepic acid và lượng sinh khối thu được.
2.7.9 Ảnh hưởng của thể tích dịch lên men
tam giác 250 ml chứa môi trường thích hợp bao gồm (g/l): glucose 40; cao nấm
men 22; peptone 6, KH2PO4 3, MgSO4 3 và được điều chỉnh với pH ban đầu 6 với
lượng dịch thay đổi : 25, 50, 75/250ml. Sau khi cấy giồng các bình được lên men
trên máy lắc ở tốc độ 150 rpm và được nuôi ở 25°C, sau 11 ngày xác định hàm
lượng polysaccharide. cordycepic acid và lượng sinh khối thu được.

2.7.10 Ảnh hưởng của thời gian nuôi
tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường thích hợp bao gồm (g/l): glucose 40; cao
nấm men 22; peptone 6, KH2PO4 3, MgSO4 3 và được điều chỉnh với pH ban đầu 6.
Sau khi cấy giồng các bình được lên men trên máy lắc ở tốc độ 150 rpm và được
nuôi ở 25°C, và được lấy mẫu theo thời gian 5, 8, 11, 12, 13, 14, 15 ngày, mẫu thu
được sử dụng để xác định polysaccharide, cordycepic acid và lượng sinh khối.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn chủng nấm Cordyceps spp. có hoạt tính sinh học cao
3.1.1. Khả năng sinh trưởng của các chủng nấm
Polysaccharide và cordycepic acid là một thành phần hoạt tính quan trọng có
trong sinh khối và dịch sau lên men của nấm Cordyceps spp. khi lên men trên môi
trường lỏng với tác dụng y dược quan trọng như chống ung thư, điều hòa miễn dịch,
tiêu viêm, chống nhiễm khuẩn, hạ đường huyết và giảm cholesterol. Polysaccharide
bảo vệ tế bào thần kinh chống lại các gốc tự do gây ra do nhiễm độc tế bào, nó cũng
đã được chứng minh có đặc tính chống oxy hóa khá tốt. Theo một số nghiên cứu,
khả năng sinh tổng hợp polysaccharide và cordycepic acid của các chủng
Cordyceps spp. phụ thuộc mạnh vào thành phần môi trường và điều kiện lên men.
Khi các chủng nấm sinh trường tốt, quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp sẽ
diễn ra mạnh mẽ. Các chủng nấm Cordyceps sp. CM; Cordyceps sp. CS, Cordyceps
sp. CmHH và Cordyceps sp. CS1 nhận từ Bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ tế
bào thực vật - Viện công nghệ sinh học, sau quá trình tuyển chọn sơ bộ đã xác định
đây là các chủng có tiềm năng ứng dụng làm thuốc. Trong điều kiện nghiên cứu của
chúng tôi, với hạn chế về điều kiện thời gian và yêu cầu thực tế, từ các chủng sau
khi sơ tuyển chúng tôi sẽ chọn ra một chủng có khả năng phát triển nhanh, sinh ra
một lượng lớn các hợp chất sinh học, từ đó tiếp tục nghiên cứu nâng cao khả năng
sinh tổng hợp các hoạt chất để có thể ứng dụng trong công nghiệp. Các chủng nấm
được nuôi trên một số môi trường khác nhau ở nhiệt độ 25C, đánh giá khả năng
sinh trưởng bằng cách đo đường kính khuẩn lạc theo thời gian, kết quả được thể
hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc các chủng nấm Cordyceps trên một số môi
trường khác nhau khi nuôi ở 25C, sau thời gian 11 ngày.
Chủng
Môi
trường
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các
chủng nấm theo thời gian (tuần)
1 2 4
CS
PDA1 Sợi nấm ngắn có
màu trắng, tạo dạng
bông, tạo thành hình
tròn
Sợi nấm ngắn có màu
trắng, tạo dạng bông,
tạo thành hình tròn
trắng, tạo dạng rất
tròn

CHDA Sợi nấm ngắn có
tròn
tròn
CB1 Sợi nấm ngắn có
tròn
tròn
BEDA1 Sợi nấm ngắn có màu
tròn
PDA2 Sợi nấm ngắn có màu
tròn
CB2 Sợi nấm ngắn có màu
tròn
BEDA2 Sợi nấm ngắn có màu
tròn
CS1
PDA1 Sợi nấm ngắn trắng,
tạo dạng bông
Sợi nấm ngắn trắng, tạo
dạng bông
Sợi nấm ngắn có dạng
bông và chuyển màu
nâu ngà và dạng bột
CB1 Sợi nấm ngắn màu
bông
Sợi nấm ngắn màu
trắng, tạo dạng rất bông
BEDA1 Sợi nấm ngắn màu
bông

CHDA Sợi nấm ngắn màu
bông
BEDA2 Sợi nấm ngắn màu
bông
CB2 Sợi nấm ngắn màu
bông
Sợi nấm ngắn trắng, tạo
dạng bông
PDA2 Sợi nấm ngắn màu
bông
CmHH
PDA1 Sợi nấm ngắn có màu
nâu
nâu
Sợi nấm có màu nâu,
tạo thành các đường
tròn
màu nâu
nâu
tròn
BEDA1 Sợi nấm ngắn có
màu nâu
nâu
tròn
PDA2 Sợi nấm ngắn có
màu nâu
nâu
tròn
màu nâu
nâu
tròn
BEDA2 Sợi nấm ngắn có
màu nâu
nâu
tròn

CHDA Sợi nấm ngắn có
màu nâu
nâu
tròn
CM PDA1 Sợi nấm có màu
trắng, tạo thành hình
tròn
Sợi nấm có màu trắng
ngắn, không tạo dạng
bông và hình tròn đều
Sợi nấm có màu trắng,
CB1 Sợi nấm có màu
tròn
PDA1 Sợi nấm có màu
tròn
BEDA2 Sợi nấm có màu
tròn
CB2 Sợi nấm có màu
tròn
PDA2 Sợi nấm có màu
tròn
CHDA Sợi nấm có màu
tròn

(A) (B)
(C) (D)
Hình 3.1 Hình thái các chủng nấm Cordyceps trên các môi trường khác nhau
BEDA, PDA, CHDA, CB. (A) Cordyceps sp. CmHH, (B) Cordyceps sp. CS, (C)
Cordyceps sp.CM, (D) Cordyceps sp. CS1, nuôi ở 25C, sau 7 ngày.
Bảng 3.2 Khả năng phát triển của các chủng nấm Cordyceps spp. trên một số
môi trường khác nhau khi nuôi ở 25C
Chủng
Môi
trường
Khả năng phát triển (đường kính khuẩn lạc, cm) của các
chủng nấm Cordyceps spp, trên các môi trường khác
nhau theo thời gian (ngày)
5 7 11
CS
PDA1 1,1±0,21 2,3±0,21 5,9±0,21
CHDA 1,2±0,13 1,5±0,13 3,3±0,23
CB1 0,8±0,05 2,5±0,41 6,3±0,25
BEDA1 1,3±0,14 3,8±0,23 6,9±0,23
PDA2 0,8±0,15 1,4±0,20 3,5±0,05
CB2 1,3±0,21 3,4±0,41 6,4±0,35
BEDA2 1,2±0,13 3,9±0,13 6,9±0,13

CM
PDA1 2,2±0,24 4,2±0,42 8,0±0,15
CB1 3,5±0,32 4,4±0,14 8,1±0,15
BEDA1 3,3±0,13 4,8±0,31 7,5±0,22
CHDA 1,0±0,23 4,2±0,22 7,6±0,24
BEDA2 1,6±0,42 4,0±0,65 5,6±0,24
CB1 2,2±0,32 2,6±0,21 6,5±0,25
PDA2 3,2±1,15 3,9±0,15 4,5±0,24
CmHH
PDA1 1,8±0,25 2,3±0,25 2,8±0,22
CB1 1,9±0,13 2,3±0,05 3,4±0,05
BEDA1 1,8±0,32 2,4±0,32 2,8±0,45
PDA2 1,3±0,32 1,6±0,32 2,3±0,25
CB2 2,0±0,13 2,8±0,15 3,5±0,05
BEDA2 1,8±0,13 2,6±0,05 3,6±0,23
CHDA 1,8±0,25 2,4±0,14 3,3±0,25
CS1
PDA1 1,2±0,23 3,6±0,55 8,3±0,25
CB1 1,4±0,21 3,2±0,15 7,5±0,05
BEDA1 1,8±0,23 2,1±0,32 4,9±0,15
BEDA2 1,4±0,21 3,9±0,23 7,1±0,75
CB2 1,5±0,21 2,3±0,31 5,7±0,15
PDA2 0,8±0,25 1,7±0,12 3,1±0,23
CHDA 0 0,3±0,13 1,8±0,12
Kết quả thể hiện trên bảng 3.2 và hình 3.1 cho thấy, trên cả 5 môi trường lựa
chọn dinh dưỡng các chủng nấm Cordyceps spp. đều sinh trưởng phát triển tốt,
trong đó ở môi trường CB2 cho khả năng sinh trưởng tốt nhất đối với cả 4 chủng

Graduation thesis: Cordyceps

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Graduation thesis: Cordyceps

Similar to Graduation thesis: Cordyceps (20)

More from Luong NguyenThanh

More from Luong NguyenThanh (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Graduation thesis: Cordyceps