Nhận viết luận văn Đại học , thạc sĩ - Zalo: 0917.193.864 Tham khảo bảng giá dịch vụ viết bài tại: vietbaocaothuctap.net Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Nghiên cứu khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp phân lập tại Việt Nam, cho các bạn tham khảo

1. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Đoàn Thị Bắc
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10
CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP
PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hà Nội, 2020

2. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Đoàn Thị Bắc
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10
CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP
PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hướng dẫn 1: TS. Lê Thị Nhi Công
Hướng dẫn 2: TS. Tạ Thu Hằng
Hà Nội, 2020

3. i
Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác
với các cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần
đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả;
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả
Đoàn Thị Bắc

4. ii
Lời cảm ơn
Với tất cả tấm lòng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc
nhất tới TS. Lê Thị Nhi Công, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi
trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam và TS. Tạ Thu Hằng, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Nông nghiệp,
Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng, là những người thầy đã dành cho tôi
những ý tưởng quý báu, cũng như sự hướng dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện
thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Liên và các anh chị
trong Phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ sinh học đã
giúp đỡ nhiệt tình và đóng góp những ý kiến quý báu cũng như tận tình chỉ
dạy, tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa
học và Công nghệ cùng với Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học
tập và nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu và Phát
triển Vùng đã tạo điều kiện cho tôi có thời gian để học tập trong thời gian
công tác ở Viện, tôi đã nhận được sự hỗ trợ nhiệt tình từ Phòng Công nghệ
sinh học Nông nghiệp nơi tôi đang công tác, sự giúp đỡ nhiệt tình và động
viên của các anh, chị, em đồng nghiệp, nhân dịp này tôi xin chân thành cảm
ơn sự giúp đỡ quí báu đó.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những người
thân trong gia đình và những người bạn thân thiết đã luôn bên cạnh, động viên
và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tác giả
Đoàn Thị Bắc

5. iii
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Chữ viết
tắt, kí hiệu
Tiếng anh Tiếng việt
Bchl Bacteriochlorophyll Sắc tố diệp lục vi khuẩn
CoQ Coenzyme Q
CoQ10 Coenzyme Q with chain
containing 10 isoprene subunits
Coenzyme Q với chuỗi
isoprene có chứa 10 tiểu
đơn vị
HPLC High-performance liquid
chromatography
Sắc kí lỏng hiệu năng
cao
OD Optical Density Mật độ quang
TCL Thin layer chromatography Sắc kí lớp mỏng
VKQH Vi khuẩn quang hợp
VKTQH Vi khuẩn tía quang hợp

6. iv
Danh mục các bảng
Bảng 1.1. Hàm lượng Coenzyme Q10 (μg/g) của một số loại thực phẩm........ 7
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá hàm lượng Coenzyme Q10 của các chủng.........28
Bảng 3.2. So sánh khả năng sử dụng một số nguồn C của các chủng lựa chọn
với Rhodopseudomonas palustris (Molish) van Niel BCRC16408................31
Bảng 3.3. Hàm lượng CoQ10 của các chủng VKTQH tích lũy trên môi trường
nuôi cấy khác nhau..........................................................................................42

7. v
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1.1. Chuỗi vận chuyển điện tử ................................................................ 4
Hình 1.2. Hình ảnh quang phổ của vi khuẩn tía quang hợp............................13
Hình 3.1. Khả năng sinh trưởng các chủng vi khuẩn tía quan hợp trên môi
trường DSMZ 27 sau khi hoạt hóa..................................................................27
Hình 3.2. Sắc ký bản mỏng thể hiện sự có mặt của Coenzyme Q10..............28
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng FO2 (A, B) và
của chủng DQ4 (C, D) ....................................................................................30
Hình 3.4. Cây phát sinh chủng loại chủng FO2 và DQ4 dựa vào so sánh trình
tự gen 16S rRNA.............................................................................................32
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía
quang hợp lựa chọn.........................................................................................34
Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn
tía quang hợp lựa chọn....................................................................................35
Hình 3.7. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng của 2 chủng vi
khuẩn tía quang hợp lựa chọn .........................................................................36
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía
quang hợp lựa chọn.........................................................................................37
Hình 3.9. Ảnh hưởng của NaCl đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía
quang hợp lựa chọn.........................................................................................39
Hình 3.10. Phương pháp thu nhận CoQ10 từ 2 chủng FO2 và DQ4..............40

8. vi
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ COENZYME Q10................................................. 3
1.1.1. Cấu tạo của Coenzyme Q10 ..................................................................3
1.1.2. Đặc tính của Coenzyme Q10.................................................................3
1.1.2.1. Đặc tính lý hóa.....................................................................................3
1.1.2.2. Đặc tính sinh học trong cơ thể sinh vật..............................................4
1.1.3.1. Tổng hợp hóa học................................................................................5
1.1.3.2. Coenzyme từ động vật và thực vật.....................................................6
1.1.3.3. Coenzyme Q10 từ vi sinh vật.............................................................7
1.1.4. Các nghiên cứu về phương pháp tách chiết Coenzyme Q10..............8
1.1.5. Ứng dụng của Coenzyme Q10 ............................................................10
1.1.5.1. Ứng dụng trong y học........................................................................10
1.1.5.2. Trong mỹ phẩm..................................................................................11
1.2. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP VÀ
ỨNG DỤNG TRONG VIỆC SẢN XUẤT COENZYME Q10................11
1.2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp............................................11
1.2.2. Giới thiệu chung về vi khuẩn tía quang hợp ......................................12
1.2.3. Ảnh hưởng của các nhân tố lý hóa đến sinh trưởng của vi khuẩn tía
quang hợp.........................................................................................................13
1.2.4. Các nghiên cứu về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi khuẩn
tía quang hợp....................................................................................................15
1.2.4.1. Nghiên cứu trên thế giới về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của
vi khuẩn tía quang hợp....................................................................................15
1.2.4.2. Nghiên cứu trong nước về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của
vi khuẩn tía quang hợp....................................................................................16

9. vii
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC ....18
2.1.1. Nguyên vật liệu.....................................................................................18
2.1.2. Các thiết bị máy móc............................................................................18
2.1.3. Hóa chất.................................................................................................19
2.1.4. Thành phần môi trường nuôi cấy ........................................................19
2.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ...................................20
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................20
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy, hoạt hóa và đánh giá sinh trưởng của vi
khuẩn tía quang hợp........................................................................................20
2.3.2. Phương pháp xác định Coenzyme Q10 từ các chủng vi khuẩn tía
quang hợp.........................................................................................................20
2.3.3. Phương pháp xác định các đặc điểm sinh học của các chủng vi
khuẩn tía quang hợp........................................................................................22
2.3.3.1 Phương pháp đánh giá sinh trưởng và xác định các đặc điểm hình
thái.....................................................................................................................22
2.3.3.2.Phương pháp xác định khả năng sử dụng một số nguồn carbon....22
2.3.3.3 Phương pháp phân tích gene mã hóa 16S rRNA.............................23
2.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng của các chủng vi
khuẩn tía quang hợp lựa chọn ........................................................................23
2.3.5.Xây dựng phương pháp tách chiết Coenzyme Q10 từ các chủng lựa
chọn...................................................................................................................25
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu....................................................................25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................26
3.1. TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC
CHỦNG VKTQH CÓ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CAO
...................................................................................................................26

10. viii
3.1.1.Sàng lọc các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng tích lũy
Coenzyme Q10 cao.........................................................................................26
3.1.1.1.Hoạt hóa và đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn
tía quang hợp....................................................................................................26
3.1.1.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả tích lũy
Coenzyme Q10 cao.........................................................................................27
3.1.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng lựa chọn.......29
3.1.2.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào...........................29
3.1.2.2 Khả năng sử dụng các nguồn carbon................................................31
3.1.2.3. Xác định trịnh tự gene 16S rRNA của các chủng lựa chọn...........32
3.2. KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƯỞNG
CỦA 2 CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP LỰA CHỌN..............33
3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía
quang hợp lựa chọn.........................................................................................33
3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía quang
hợp lựa chọn.....................................................................................................35
3.2.3. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng của 2 chủng vi
khuẩn tía quang hợp lựa chọn ........................................................................36
3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của 2 chủng lựa chọn ...37
3.2.5. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sinh trưởng của 2 chủng lựa
chọn...................................................................................................................38
3.3. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT COENZYME Q10 TỪ
CÁC CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP LỰA CHỌN.................39
CHƯƠNG 4.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................44
4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................44
4.2. KIẾN NGHỊ........................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................45

11. 1
MỞ ĐẦU
Coenzyme Q10 hay còn được gọi là ubiquinone (ubidecarenone hoặc
CoQ10) là một trong ba Coenzyme tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử ở
màng tế bào của sinh vật nhân sơ và lớp màng trong ty thể của sinh vật nhân
chuẩn. CoQ10 có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp ATP – năng
lượng sinh học của cơ thể sống. Ngoài ra, CoQ10 còn có tính chất chống oxy
hóa mạnh và có khả năng trung hòa các gốc tự do, vì vậy CoQ10 ngày càng
được ứng dụng rộng rãi làm nguồn thực phẩm chức năng, giúp cải thiện sức
khỏe; được đưa vào mỹ phẩm làm đẹp như một chất chống oxy hóa, chống
lão hóa để giúp cơ thể trẻ hóa; được ứng dụng trong y tế nhằm ngăn ngừa ung
thư, điều trị nhiều bệnh về tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng cường hệ
thống miễn dịch …
Với nhiều ứng dụng có lợi như vậy nên nhu cầu về CoQ10 ngày một
tăng lên và đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để tổng hợp CoQ10
như: lên men, tổng hợp sinh học, tổng hợp hóa học hoặc tách chiết từ mô
động vật và thực vật. Đối với quá trình tổng hợp hóa học vẫn bị nhược điểm
là các chất hóa học sử dụng có thể gây độc ra môi trường. CoQ10 có thể được
thu nhận từ động vật và thực vật, tuy nhiên nồng độ CoQ10 trong tế bào rất
thấp không thể tách chiết ở qui mô công nghiệp và chi phí rất cao. Vì vậy, quá
trình tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp sinh học được sử dụng rất nhiều
hiện nay, có thể đem lại hiệu quả thương mại, đặc biệt sản phẩm CoQ10 rất
an toàn cho người sử dụng, đồng thời giá thành lại rẻ nhất.
CoQ10 có thể được tổng hợp thông qua quá trình lên men nhờ các vi
khuẩn (Agrobacterium tumefaciens, Paracoccus denitrificans, Rhizobium
radiobacter, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter sulfidophilus,
Rhodopseudomonas palustris …), nấm mốc và nấm men (Asperillus, Bullera,
Bulleromyces, Cyptococcus, Fellomyces, Kockovaella, Rhodoturola,
Sporobolomyces, Utilago). Trong số các vi khuẩn này, vi khuẩn tía quang hợp
(VKTQH) là nguồn vi sinh vật lý tưởng để thu nhận CoQ10 vì chúng có khả
năng tổng hợp, tích luỹ hàm lượng ubiquinone cao hơn các vi sinh vật khác,
đặc biệt cho sản phẩm chủ yếu là CoQ10. Bên cạnh đó, VKTQH có thể nuôi

12. 2
cấy dễ dàng bằng môi trường đơn giản dưới ánh sáng mặt trời. Vì vậy, đây có
thể là nguồn tiềm năng thu nhận một lượng lớn các chất có tác dụng sinh học,
đặc biệt là CoQ10.
VKTQH có rất nhiều loài và khả năng tích lũy CoQ10 sẽ khác nhau
phụ thuộc vào sự sinh trưởng cũng như điều kiện nuôi cấy của các loài. Ở tế
bào VKTQH, CoQ10 nằm trong vùng kỵ nước của lớp màng phospholipid
của màng tế bào, do đó điều cần thiết là phá vỡ màng tế bào để chiết xuất
thành phần này. Phương thức phá vỡ màng tế bào VKTQH sẽ ảnh hưởng đến
hiệu quả của việc chiết xuất CoQ10. Một số phương pháp chiết xuất CoQ10
đã được thực hiện với hiệu quả khác nhau và chủ yếu phù hợp cho quy mô
phòng thí nghiệm. Các nghiên cứu về tác động của một số yếu tố như nhiệt
độ, ánh sáng, độ pH và nồng độ muối ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát
triển của VKTQH cũng như khả năng tích lũy CoQ10 của VKTQH chưa được
công bố nhiều ở Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp
phân lập tại Việt Nam”.
*Mục tiêu nghiên cứu:
- Lựa chọn và xác định được điều kiện nuôi cấy thích hợp các chủng vi
khuẩn tía quang hợp có khả năng tích lũy CoQ10 cao.
- Xây dựng phương pháp tách chiết CoQ10 nhằm định hướng ứng dụng
trong sản xuất thực phẩm chức năng
*Nội dung nghiên cứu
- Tuyển chọn và đánh giá đặc điểm sinh học của 1-2 chủng VKTQH có
khả năng tích lũy CoQ10 cao
- Khảo sát các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho việc sinh trưởng của
các chủng lựa chọn
- Xây dựng phương pháp tách chiết CoQ10 từ các chủng VKTQH lựa
chọn

13. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1. TỔNG QUAN VỀ COENZYME Q10
1.1.1. Cấu tạo của Coenzyme Q10
Coenzyme Q10 (CoQ10) có công thức phân tử C59H90O4, trọng lượng
phân tử 863,34 g/mol. CoQ10 có cấu trúc dạng chuỗi dài nằm trên màng sinh
chất của tế bào vi khuẩn và màng trong ty thể của tế bào sinh vật nhân thực
[1]. Đầu của CoQ10 là đầu quinone, nó có chức năng chuyển giao điện tử.
Đuôi của CoQ10 là một chuỗi isoprenoid dài, giúp cho các phân tử CoQ10 có
thể khuếch tán dễ dàng trong lớp màng lipid [2].
Coenzyme Q có thể tồn tại dưới 3 trạng thái: dạng khử ubiquinol
(CoQH2), dạng trung gian (CoQH •), và dạng ôxi hóa ubiquinone (CoQ) [2].
1.1.2. Đặc tính của Coenzyme Q10
1.1.2.1. Đặc tính lý hóa
 Tính chất vật lý
CoQ10 là một chất tinh thể dạng bột có màu vàng đến màu cam, không
mùi, không vị. Nhiệt độ nóng chảy của CoQ10 từ 48 -52 o
C, tương đối ổn
định ở 37 o
C [3] và nó bị nhiệt phân (pyrolysis) từ từ khi bị đun lên ở nhiệt độ
120 o
C hoặc cao hơn.
Molyneux (2006) cho rằng CoQ10 bị nhạy cảm với ánh sáng và bị phân
hủy gần như hoàn toàn sau 24 giờ tiếp xúc với ánh sáng (bao gồm ánh sáng
huỳnh quang). Hàm lượng CoQ10 không bị thay đổi khi được gói trong giấy
bạc do tránh khỏi sự tác động của ánh sáng. Vì vậy, trong quá trình tách chiết
CoQ10 cần bảo vệ mẫu tránh tiếp xúc với ánh sáng và định lượng CoQ10 có
thể được tiến hành trong điều kiện ánh sáng bình thường của phòng thí nghiệm
với thời gian không quá 2 giờ [1]. CoQ10 được bảo vệ tốt nhất khi tạo phức với
β – cylodextrin, hàm lượng CoQ10 bị tổn thất chỉ khoảng 20 % khi có sự kết
hợp chiếu sáng UV và ở nhiệt độ cao [4, 5].
 Tính chất hóa học:
CoQ10 là một hợp chất kị nước, tan trong chất béo và các dung môi
phân cực, có những tính chất tương tự như vitamin [6, 7]. Nó rất dễ tan trong

14. 4
chloroform và carbontetra chloride, tan tự do trong dioxane, ether và hexane,
tan một phần trong acetone, hầu như không tan trong nước, methanol và
ethanol.
CoQ10 kỵ với các tác nhân oxy hóa mạnh, khi tiếp xúc với các hợp chất
kiềm tính CoQ10 có thể tạo ra ubichromenol, là một dạng sản phẩm phân hủy.
1.1.2.2.Đặc tính sinh học trong cơ thể sinh vật
 Vận chuyển điện tử và cung cấp năng lượng
CoQ10 được xác định chủ yếu nằm ở lớp màng trong ty thể của sinh
vật nhân chuẩn và màng plasma của sinh vật nhân sơ. CoQ10 đóng vai trò
chính trong việc chuyển điện tử giữa các phức hợp hô hấp của chuỗi vận
chuyển điện tử, nằm trong màng trong ty thể, mà sản phẩm cuối cùng là
adenosine triphosphate (ATP). Quá trình này thường được gọi là sự hô hấp.
Hình 1.1. Chuỗi vận chuyển điện tử [8]
Cả dạng khử (quinol) và dạng ôxi hóa (quinone) của Coenzyme Q có
thể di chuyển dễ dàng trong lớp màng lipid. Trong chuỗi hô hấp, CoQ10 chịu
trách nhiệm vận chuyển điện tử từ phức hợp protein I (NADH dehydrogenase)
đến phức hợp protein II (succinate dehydrogenase) và từ phức hợp II đến phức
hợp III (phức hợp bc1) [9] . Khi nhận các electron từ cả phức I và phức II, nó

15. 5
vẫn ở dạng khử là ubiquinol và sau khi chuyển các electron sang phức III, nó
trở lại dạng oxy hóa thành ubiquinone [8] (Hình 1.1). Chính sự khuếch tán của
CoQ cùng với Cytochrome C trong lớp màng ti thể đã đóng vai trò quan trọng
trong việc luân chuyển các điện tử đến các phức hợp kế nhau trong chuỗi
chuyển điện tử [2]. Các cơ quan đòi hỏi nhu cầu năng lượng cao hơn như não,
tim, thận và gan có hàm lượng CoQ10 cao hơn.
 Chức năng chống oxy hóa
CoQ10 là chất chống oxy hóa hòa tan lipid duy nhất được tìm thấy ở
người và nó tập trung vào hầu hết mọi màng, từ màng ty thể đến màng
lipoprotein mật độ rất thấp (VLDL) [9]. Nhờ tính hòa tan này CoQ10 có thể
bảo vệ lipoprotein và lipid khỏi sự peroxy hóa và tổn thương oxy hóa
[10]. CoQ10 có thể kết hợp cùng với các chất chống oxy hóa khác, chẳng hạn
như vitamin C và vitamin E để chống lại tác hại của các gốc tự do phát sinh từ
các phản ứng trong ty thể tạo ra năng lượng [11].
CoQ10 có khả năng dọn dẹp gốc tự do trong cơ thể sống kém hiệu quả
hơn so với các vitamin. Tuy nhiên CoQ10 lại là một chất chống oxy hóa có
khả năng tái tạo vitamin E [12]. CoQ10 còn có chức năng bảo vệ màng tế bào,
protein và các acid nucleic (DNA, RNA) khỏi quá trình oxy hóa bằng cách
trực tiếp ngăn cản tia UV, làm sạch các gốc tự do hoặc gián tiếp bằng cách tái
tạo thành α- tocopherol [13, 14].
CoQ10 cũng ức chế collagenase - một loại enzyme phá hủy các mô
liên kết của da [8], trao đổi các proton và Ca 2+
qua màng sinh học [15].
CoQ10 có vai trò trong các quá trình sinh lý khác, bao gồm quá trình hình
thành liên kết disulfide, oxy hóa sulfide, chuyển hóa pyrimidine [16].
1.1.3. Nguồn thu Coenzyme Q10
CoQ10 được sản xuất từ 3 nguồn thu: từ vi sinh vật (tổng hợp sinh học),
các mô động vật và thực vật, tổng hợp từ các chất hóa học (tổng hợp hóa học).
1.1.3.1. Tổng hợp hóa học
CoQ10 có thể tổng hợp theo một số con đường bán tổng hợp [17].
Phương pháp này sử dụng solanesol một chất nền khởi đầu cho quá trình tổng

16. 6
hợp chuỗi mạch nhánh isoprene liên kết với dẫn xuất quinone, sau đó được
chuyển đổi thành CoQ10. Solanesol có thể được tổng hợp hoặc dễ dàng thu
được bằng cách chiết xuất từ lá thuốc lá hoặc khoai tây [18, 19].
Mu và cộng sự (2011) đã tiến hành tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp
hóa học một cách đơn giản và hiệu quả thông qua hợp chất (2'E) -1- (3-methyl-
4-p-toluenesulfonyl-2-butene)-6-methyl-2,3,4,5-tetramethoxybenzene là tiền
thân của vòng quinone. Hợp chất này là chất trung gian quan trọng để tổng hợp
CoQ10 thông qua một phản ứng ghép đôi với các bromide solanesyl [18].
Tuy nhiên, việc sản xuất theo phương pháp này thường trải qua nhiều
bước và tốn kém rất nhiều chi phí liên quan đến các phản ứng xúc tác năng
lượng cao do sử dụng chất nền đắt tiền và gây ra nhiều ảnh hưởng tới môi
trường bởi các chất thải hóa học được tạo ra nhiều từ quá trình sản xuất [18].
Vì vậy, quá trình tổng hợp CoQ10 vẫn được cải tiến để ứng dụng trong sản
xuất công nghiệp.
1.1.3.2. Coenzyme từ động vật và thực vật
CoQ10 có trong nhiều loại thực phẩm nhưng với hàm lượng ít, nhưng
hàm lượng CoQ10 đặc biệt cao trong các loại nội tạng như tim, gan, thận,
cũng như thịt bò, dầu đậu nành. CoQ10 lần đầu tiên được phân lập từ tim bò
bởi Frederick Crane (USA) năm 1957 [20].
Một số loài có chất béo như cá thu, cá trích là những nguồn tài nguyên
có chứa hàm lượng dầu và CoQ10 cao trong mô cơ của chúng [8, 21]. Ngoài
ra, CoQ10 cũng có trong cây thuốc lá (360 μg/g CoQ10), lúa (600 μg/g), các
loại quả và các loại rau củ (nhiều nhất là trong bông cải xanh, rau bina, dầu
đậu nành, cải dầu, dầu cọ, các loại hạt và cây họ đậu) [22, 23].
Mặc dù có thể thu nhận CoQ10 từ động vật và thực vật tuy nhiên nồng
độ CoQ10 trong tế bào rất thấp không thể chiết tách ở quy mô công nghiệp do
hiệu suất thấp và chi phí cao. Đây là lí do chính khiến cho các nghiên cứu về
CoQ10 từ động vật và thực vật bị hạn chế.

17. 7
Bảng 1.1. Hàm lượng Coenzyme Q10 (μg/g) của một số loại thực phẩm [24]
Thịt & Cá Rau củ quả Dầu và các loại hạt
Tuần lộc 157,9 Trái bơ 9,5 Dầu ô liu (EV) 114-160
Tim bò 113,3 Cây cải dầu
(Hoa)
6,7-
7,4
Dầu đậu phộng 77
Tim lợn 118,1-282 Bông cải
xanh
5,9-
8,6
Dầu hạt cải 63,5-73,4
Gan gà 116,2-
132,2
Khoai lang 3,0-
3,6
Đậu phộng (rang) 26,7
Tim cá trích 120,0-
148,4
Cây me
chua
3,6 Hạt hồ trăn (rang) 20,1
Tim cá thu 105,5-
109,8
Ớt ngọt 3,3 Quả óc chó
(nguyên)
19,0
1.1.3.3. Coenzyme Q10 từ vi sinh vật
Cho đến gần đây, sản xuất CoQ10 dựa trên quá trình lên men vi sinh vật
được coi là phương pháp khả thi vì khả năng sản xuất các chất đồng phân tự
nhiên mạnh về mặt sinh học của CoQ10 với chi phí giảm so với phương pháp
tổng hợp hóa học [25, 26].
 Coenzyme Q10 từ nấm men và nấm mốc
Một số loại nấm men đã được nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp
Coenzyme Q10 như Cryptococcus laurentii, Trichosporon sp.,
Sporobolomyces salmonicolor, và R. sphaeroides và các loại nấm men khác
như Candida, Rhodotorula và Saitoella [25, 37]. Các loài nấm men như
Sporidiobolus johnsonii, tích lũy CoQ10 nội bào từ 0,8 đến 3,3 μg/g khối
lượng tế bào khô [28].
Schizosaccharomyces pombe cũng là một loại nấm phổ biến để sản
xuất protein và CoQ10 [29]. Saccharomyces cerevisiae cũng đã được nghiên
cứu về các điều kiện tối ưu quá trình sản xuất CoQ10 [30]. Trong một số loài

18. 8
nấm mốc như Neurospora crassa và Aspergillus fumigatus cũng sinh tổng
hợp CoQ10 nhưng với hàm lượng thấp [31].
 Coenzyme Q10 từ vi khuẩn
Các vi khuẩn sinh tổng hợp CoQ10 nhiều chủ yếu tập trung ở các
chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter,
Paracoccus denitrificans và Rhodopseudomonas sphaeroides [25, 26, 27, 32].
Agrobacterium tumefaciens cho thấy năng suất tổng hợp CoQ10 cao nhất
[26].
1.1.4. Các nghiên cứu về phương pháp tách chiết Coenzyme Q10
 Tách chiết bằng phương pháp cơ học
Có thể dùng các phương pháp như siêu âm hoặc dùng áp suất để phá
vỡ tế bào và thu nhận CoQ10. Tian (2010) tiến hành thu nhận CoQ10 từ
chủng Agrobacterium tumefaciens 1.2554 theo quy trình: sinh khối sau ly tâm
bổ sung đệm 2 mM Tris HCl (pH 7,5), tiến hành siêu âm (12 giây on, 10 giây
off) năng lượng sóng siêu âm 500W, tổng thời gian siêu âm 12 phút [33].
Nghiên cứu của Wu và Tsai (2013), sử dụng biện pháp cơ học để tách
chiết CoQ10 từ Rhodobacter sphaeroides như sau: các tế bào thô được trộn
với 5 mL nước cất và bị phá vỡ ở các áp suất khác nhau (5,5; 16,5; 27,5 hoặc
38,5 MPa) bằng cách sử dụng máy đồng nhất hóa cao (Constant, England) [34].
 Tách chiết bằng phương pháp nhiệt độ
Nghiên cứu của Wu và Tsai (2013), tách chiết CoQ10 từ Rhodobacter
sphaeroides như sau: các tế bào ướt (0,5 g DCW) được trộn đều với nước cất
(2 mL) và để đông lạnh ở -75 o
C trong 30 phút, sau đó được làm nóng ở
100 o
C trong 30 phút, thêm 5 ml HCl 4N vào dung dịch mẫu. Hỗn hợp được
lắc votex trong 20 phút ở 30 o
C, sau đó được chiết xuất với 28 ml hỗn hợp
n-propanol và hexane (tỷ lệ thể tích = 3: 5) và lắc đều trong 5 phút ở 40 o
C.
Mẫu chiết sau đó được hòa tan trong ethanol 95 %. Dung dịch mẫu (10 mL) là
được xử lý bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định
hàm lượng của CoQ10 [34].

19. 9
 Tách chiết bằng phương pháp sử dụng các chất hóa học
Ranadive và cộng sự (2011) đã tiến hành thu nhận CoQ10 từ chủng
Sporidiobolus johnsonii ATCC 20490. 20 ml dịch nuôi được ly tâm với tốc độ
1000 vòng/phút trong 20 phút để thu sinh khối. Để chiết CoQ10, sinh khối
được bổ sung 20 ml 100 % ethanol lắc trong nước 60 o
C trong 3 giờ. Tế bào
được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm và thu dịch, ethanol được chiết lại với
20 ml n-hexane. Thu lấy pha n-hexane có chứa CoQ10, cô đặc tới 1 ml và đưa
vào sắc ký để định lượng [35].
Narendra và cộng sự (2012) đã tiến hành thu nhận CoQ10 từ
Saccharomyces cerevisiae như sau: sinh khối ướt tế bào được ủ với ethanol tỷ
lệ (1:5) ở 60 o
C trong 1 giờ. Chiết xuất lặp lại 3 lần bằng n-hexane [30].
Theo Nguyễn Bá Kiên và cộng sự (2010), CoQ10 từ Rhodobacter
sphaeroides đột biến được thu nhận theo phương pháp sau: 10 g sinh khối ướt
được hòa trong 70 ml methanol, ủ 55 o
C trong 5 phút. Bổ sung 140 ml
chloroform và khuấy ở 30 o
C trong 20 phút, sau đó được lọc qua giấy lọc
(Whatman no.1). Bổ sung NaCl (0,58 %, w/v) bằng 1/5 so với thể tích dịch
lọc. Dịch lọc và dung dịch muối NaCl được đảo trộn, để yên, thu pha dưới,
làm khô và hòa tan lại trong ethanol [36].
Thitima Rujiralai và cộng sự (2014) đã nghiên cứu phương pháp chiết
xuất Coenzyme Q10 (CoQ10) từ Artemia. 1 g Artemia tươi được ủ với acid
axetic 75 % ở (30 ± 2) o
C trong 24 giờ, sau đó là ba lần chiết liên tiếp với hỗn
hợp 5 ml hexane và 5 ml ethanol, sau đó phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao được kiểm chứng với máy dò mảng diode [37].
 Tách chiết bằng phương pháp sử dụng enzyme
Theo Ha và cộng sự (2007b), khi thực hiện với chủng Agrobacterium
tumefaciens KCCM 10413 sinh khối được bổ sung dung dịch ly giải tế bào
Cellytic B, ủ 30 phút, bổ sung hỗn hợp dung môi propanol và n-hexane (3:5)
vào dịch ly giải tế bào và khuấy mạnh. Chiết thu pha trên sau đó đem cô đặc,
hòa tan trong ethanol [38].

20. 10
Zahiri và cộng sự (2006) đã lựa chọn Lysozym thường thủy phân liên
kết β (1-4) glucosid của các peptidoglucan để tạo ra độ cứng cho tế bào vi
khuẩn Gram dương và Gram âm. Lysozym thường được liên kết với EDTA
để tạo phức với canxi sẽ làm giải phóng các lipopolysacarit và phá hủy tế bào
đặc biệt là vỏ tế bào vi khuẩn gram âm. Nhóm nghiên cứu tách CoQ10 từ các
tế bào E. coli tái tổ hợp theo phương pháp sau: sinh khối sau ly tâm bổ sung
dung dịch ly giải tế bào [sucrose 8 %, Triton X-100 5%, Tris-HCl 50 mM (pH
8.0), EDTA 50 mM (pH 8.0) và 1 mg/ml lysozyme] ủ 37 o
C trong 30 phút. Bổ
sung n-hexane: n-propanol (5:3) (tỉ lệ 1: 2 so với dịch nuôi), thu pha trên, lặp
lại bước chiết 2 lần. Cô đặc, và hòa tan sản phẩm trong ethanol [39].
Nghiên cứu của Wu và Tsai (2013) cũng xử lý enzyme để phá vỡ tế bào
bằng cách: khi được rửa hai lần bằng nước cất, các tế bào ướt (0,5 g DCW)
được hòa tan trong 450 µl dung dịch Cell Lytic B, trộn với 50 µl dung dịch
lysozyme (10 mg/mL), sau đó được ủ trong 20 phút 25 o
C để gây ra ly giải tế
bào. Sau khi phá vỡ tế bào, CoQ10 được chiết xuất bằng hỗn hợp 25 ml n-
propanol và hexane (tỷ lệ thể tích = 3: 5). Thời gian chiết là 5 phút ở nhiệt độ
40 o
C. Lượng CoQ10 trong mẫu được đo bằng HPLC [34].
1.1.5. Ứng dụng của Coenzyme Q10
1.1.5.1. Ứng dụng trong y học
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sử dụng CoQ10 có chức năng cải
thiện chức năng tim mạch thông qua việc tăng cường sản xuất năng lượng, co
bóp cơ tim, hoạt động chống oxy hóa và ngăn chặn quá trình oxy hóa
lipoprotein mật độ thấp [6, 40]. Việc điều trị với CoQ10 cải thiện đáng kể
chức năng cơ tim mà không có tác dụng phụ hoặc tương tác thuốc [41].
Điều trị bằng CoQ10 làm giảm các thay đổi sinh lý bệnh tế bào liên quan
đến rối loạn chức năng ty thể ở bệnh nhân Parkinson PD [42], làm giảm các
biểu hiện stress oxy hóa ở bệnh nhân Huntington [43], bảo vệ thần kinh với
việc điều trị các tổn thương gây ra bởi rối loạn chức năng ty thể trong biểu hiện
bệnh Alzheimer (AD), có liên quan đến tổn thương oxy hóa gây ra bởi rối loạn
chức năng ty thể [44, 45].

21. 11
CoQ10 cũng có khả năng tăng cường hệ miễn dịch thông qua làm tăng
cường hoạt động của đại thực bào và làm tăng sinh bạch cầu hạt. Điều trị
CoQ10 dẫn đến làm giảm khối u và biến mất các di căn được chẩn đoán và
khoảng 1-3 năm sau di căn không xuất hiện trở lại [46]. Bổ sung CoQ10 giúp
ngăn ngừa tổn thương tim, nhiễm độc gan, tiêu chảy và viêm miệng mà không
làm giảm hiệu quả điều trị trong quá trình hóa trị với doxorubicin [47,
48]. Thực phẩm và đồ uống có chứa CoQ10 đã được đề xuất để ngăn ngừa
ung thư và giảm thiểu các phản ứng bất lợi của bệnh ung thư [49].
Ngoài ra, CoQ10 còn được sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường
[50], sơ vữa động mạch [34], bệnh hen suyễn [51], bệnh hen phế quản, đau
nửa đầu [52].
1.1.5.2. Trong mỹ phẩm
CoQ10 được bổ sung vào mỹ phẩm có tác dụng ngăn ngừa các nếp
nhăn. CoQ10 có hiệu quả trong việc bảo vệ các tế bào sừng bởi sự phá hủy
của tia UVA. CoQ10 cũng có hiệu quả đáng kể trong việc giảm sự lão hóa cơ
thể người bằng cách làm giảm nếp nhăn thông qua khả năng làm tăng cường
sức đề kháng của da, giảm sự lão hóa da và dọn dẹp gốc tự do. CoQ10 có thể
xâm nhập vào lớp biểu bì, nơi mà có sự biến đổi từ dạng oxy hóa sang dạng
khử và hoạt động như một chất chống oxy hóa. Hiện nay CoQ10 được kết
hợp với retinoic acid dùng để điều trị bệnh lão hóa.
Như vậy có thể thấy, CoQ10 có rất nhiều ứng dụng trong thực tế và có
thể được tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau như tổng hợp hóa học, từ động
thực vật, đặc biệt là từ vi sinh vật. Trong các nhóm vi sinh vật, vi khuẩn tía
quang hợp là một trong những vi sinh vật tiềm năng và có khả năng tích lũy
CoQ10 khá cao.
1.2. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP VÀ ỨNG
DỤNG TRONG VIỆC SẢN XUẤT COENZYME Q10
1.2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp
Đây là nhóm vi khuẩn có khả năng quang hợp nhờ có sắc tố quang hợp.
Sắc tố quang hợp ở vi khuẩn (bacteriochlorophyll) khác với sắc tố quang hợp
của thực vật. Đặc biệt VKQH không sử dụng nước làm nguồn hidro như thực

22. 12
vật và không tạo ra sản phẩm cuối cùng là oxi. Chúng sử dụng nguồn hidro là
sunfit thiosunfat, hidro tư do, chất hữu cơ và sản sinh ra nhiều sản phẩm phụ
dạng oxi hóa. Bao gồm: vi khuẩn lưu huỳnh lục, vi khuẩn tía lưu huỳnh và vi
khuẩn tía không lưu huỳnh.
1.2.2. Giới thiệu chung về vi khuẩn tía quang hợp
Vi khuẩn tía quang hợp là các tế bào gram âm, đơn bào, có các dạng
cầu, xoắn, hình que ngắn, hình phẩy đứng riêng rẽ hoặc thành chuỗi. Các loài
vi khuẩn tía quang hợp đều sinh sản bằng cách nhân đôi, một số loài sinh sản
bằng cách nảy chồi [53].
Chúng có khả năng chuyển hóa năng lượng mặt trời thành năng lượng
hóa học bởi quá trình quang hợp kị khí. VKTQH thường có màu hồng đến
màu đỏ tía, sắc tố quang hợp chính là bacteriochlorophyll a hoặc b. Cơ quan
quang hợp là màng quang hợp được gắn với màng tế bào.
Năm 1907, Molish là người đầu tiên phát hiện ra các vi khuẩn có sắc tố
màu đỏ và có khả năng quang hợp, nên ông gọi chủng vi khuẩn quang hợp này
là Rhodobacteria. Nhóm này gồm hai họ là Thiorhodaceae (những vi khuẩn tía
có khả năng hình thành giọt “S” bên trong tế bào) và Athiorhodaceae (là những
vi khuẩn tía không có khả năng hình thành giọt “S” bên trong tế bào) [54].
Nhóm vi khuẩn tía bao gồm hai họ này sau này được đổi tên là bộ
Rhodosprillales và hai họ Choromatiaceae và Rhodospirillaceae [55].
Vi khuẩn tía lưu huỳnh và vi khuẩn tía không lưu huỳnh ban đầu được
phân biệt dựa trên cơ sở sinh lý (dựa trên khả năng chứa và sử dụng sulfide
của chúng). Nhóm vi khuẩn tía lưu huỳnh là các loài có thể chống chịu được
hàm lượng sulfide trong môi trường ở mức độ cao và trong quá trình oxy hóa
sulfide, "giọt" lưu huỳnh được tích lũy bên trong tế bào, trong khi đó, nhóm vi
khuẩn tía không lưu huỳnh thì có thể chống chịu sulfide ở mức độ thấp hơn và
không tích lũy giọt lưu huỳnh bên trong tế bào (Hình.1.2a).
Vì vậy, khi sinh trưởng trên môi trường chứa sulfide thì có thể dễ dàng
phân biệt được nhóm vi khuẩn tía lưu huỳnh và nhóm vi khuẩn tía không lưu
huỳnh nhờ sự quan sát giọt lưu huỳnh tích lũy trong hay ngoài tế bào dưới
kính hiển vi điện tử phản pha (Hình 1.2a).

23. 13
Hình 1.2. Hình ảnh quang phổ của vi khuẩn tía quang hợp [56]
Ngoài ra, phân tích phylogenetic của VKTQH dựa trên trình tự so
sánh 16S rRNA đã chỉ ra rằng vi khuẩn tía lưu huỳnh là loài vi khuẩn
gammaproteobacteria trong khi vi khuẩn tía không lưu huỳnh là alpha hoặc
betaproteobacteria [57].
1.2.3. Ảnh hưởng của các nhân tố lý hóa đến sinh trưởng của vi
khuẩn tía quang hợp
 Ảnh hưởng của pH
Quang hợp của vi khuẩn tía có thể xảy ra trong môi trường có pH 3-11
[58]. Vi khuẩn tía sinh trưởng và phát triển ở pH tối ưu khoảng 6-7.
VKTQH ưa acid là khá ít, chỉ có hai chi (ba loài) được biết đến như là
Rhodoblastus acidophilus (trước đây là Rhodopseudomonas acidophila) là
phổ biến trong môi trường acid yếu như đầm lầy. Các chủng này đều cho thấy
sự tăng trưởng bị giới hạn khi pH gần bằng 4 [59]. Rhodopila continiformis
được phân lập từ các suối nước nóng có tính acid (pH 3,5 – 4) [60] .
Rhodopila continiformis có độ pH tối ưu cho sự tăng trưởng tương tự như của
các loài Rhodoblastus, nhưng có khả năng chịu acid cao hơn vì tính chất acid
mạnh hơn trong môi trường sống của nó. Rất ít vi khuẩn tía quang hợp sống ở

24. 14
điều kiện acid và điều này có thể là do ở môi trường acid pH thấp, sulfide sẽ
tồn tại ở dạng độc hại H2S.
 Ảnh hưởng của ánh sáng
Vi khuẩn tía lưu huỳnh sử dụng ánh sáng để quang hợp, phát triển
mạnh ở môi trường có ánh sáng đỏ hơn ánh sáng vàng và ánh sáng xanh [61].
Vi khuẩn tía không lưu huỳnh có thể phát triển quang dưỡng và trong điều
kiện bóng tối [58]. Biểu hiện gen của VKTQH ảnh hưởng bởi cường độ ánh
sáng khác nhau. Cường độ ánh sáng thấp tạo ra các sắc tố quang hợp cao;
cường độ ánh sáng cao gây ra sự suy giảm các sắc tố quang hợp.
 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Năm 1980, vi khuẩn tía lưu huỳnh Thermochromatium (ban đầu là
Chromatium) được phân lập trong nuôi cấy thuần [62] là một loài vi khuẩn ưa
nhiệt (tối ưu hóa nhiệt độ ~ 50 ºC, nhiệt độ tối đa 57 ºC) và tạo ra một phức
hợp hấp thụ ánh sáng (LH) hấp thụ tối đa gần 920 nm [63].
Các vi khuẩn tía ưa nhiệt nhẹ khác (nhiệt độ tăng trưởng tối ưu ~ 40 ºC)
đã được nuôi cấy từ thảm vi khuẩn suối nước nóng. Chúng bao gồm các loài
có chứa BChl như Rhodopseudomonas sp. chủng GI, Rhodocista cryptolactis
và Rhodocista centenum. Quang hợp của vi khuẩn tía có thể xảy ra ở nhiệt độ
lên tới 57 o
C và xuống tới 0 o
C [64]. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và
phát triển của hầu hết vi khuẩn tía là 30 o
C.
 Ảnh hưởng của các yếu tố khác
Nhiều loài vi khuẩn tía có thể sinh trưởng quang dưỡng với sulfide như là
chất cho điện tử với nồng độ nhỏ hơn 2 mM (tương đương 64 mgS-2
/L). Nếu
môi trường sống có nồng độ sulfide quá cao sẽ ức chế sự sinh trưởng của chúng
[58]. Hai loài Rhodobacter Sulfi dophilus và loài Rhodoferax antarcticus có thể
chịu đựng được sulfide với nồng độ hơn 4 mM [65]. Ngoài ra, nồng độ NaCl
trong môi trường cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của vi khuẩn tía. Có loài
sống được trong môi trường nước biển có độ mặn từ 8-11 % NaCl.

25. 15
1.2.4. Các nghiên cứu về khả năng tích lũy Coenzyme Q10 của vi
khuẩn tía quang hợp
1.2.4.1. Nghiên cứu trên thế giới về khả năng tích lũy Coenzyme Q10
của vi khuẩn tía quang hợp
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về khả năng tích lũy Coenzyme
Q10 của một số loài VKTQH.
Tian và cộng sự (2010) nghiên cứu về tối ưu môi trường nuôi cấy đối
với loài Rhodospirillum rubrum nhằm tăng khả năng tổng hợp CoQ10 bằng
phương pháp phản ứng bề mặt (RSM) trong nuôi cấy ống nghiệm tĩnh. Môi
trường tối ưu để sản xuất CoQ10 là: 2,5 g/l axit malic; 1,29 g/l chiết xuất
men; 1,34 g/l (NH4)2SO4; 0,20 g/l MgSO4.7H2O; 0,9 g/l K2HPO4; 0,6 g/l
KH2PO4; 0,08 g/l citrat sắt; 0,02 g/l EDTA. Hàm lượng thu được cao nhất của
CoQ10 là 9,76 mg/l, phù hợp với hàm lượng dự đoán RSM (9,63 mg /l). Năng
suất của CoQ10 trong thiết bị lên men 3 l cao hơn so với đạt được trong nuôi
cấy tĩnh và đạt 10,81 mg /l, có thể được quy cho sự khuấy trộn liên tục (400
vòng/phút) giúp tăng cường tiếp xúc với chất nền tế bào trong suốt quá trình
lên men [66].
Jiang và cộng sự (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa
tan (DO) về khả năng tích lũy CoQ10 của Rhodopseudomonas palustris bằng
cách sử dụng quy trình lên men hai giai đoạn J001. Hàm lượng DO tối ưu cho
sự phát triển của tế bào và tích lũy CoQ10 lần lượt là 45 % và 15 %. Quá trình
lên men hai giai đoạn, bao gồm giai đoạn 1 với 45 % DO, giai đoạn 2 với 15
% DO và 2,0 % NaAc tại thời điểm chuyển đổi (42 giờ sau khi tiêm chủng),
đã được chứng minh là tối ưu quá trình lên men để sản xuất CoQ10. Sinh khối
tối đa, hàm lượng CoQ10 và tỷ lệ tích lũy CoQ10 lần lượt là 1,31 mg/l; 89,1
mg/l và 1,142 mg/l, tăng lần lượt 28 %; 585 % và 426 % so với quá trình lên
men giai đoạn 1 với nồng độ DO là 45 %. Nồng độ DO là yếu tố chính để
tăng hàm lượng CoQ10 theo quy trình lên men hai giai đoạn [67].
Nghiên cứu của Whu và cộng sự (2013) về tách và tinh chế CoQ10 từ
các tế bào ướt được sản xuất bởi Rhodobacter sphaeroides BCRC 13100.

26. 16
Hàm lượng của CoQ10 được xử lý trước bằng cách sử dụng enzyme, ethanol
hoặc homogenizer cao ở nông độ lần lượt là 2,85 mg/g; 2,01 mg/g và 2,11
mg/g. CoQ10 được chiết xuất với các dung môi hữu cơ khác nhau. Sử dụng
ethanol để chiết xuất CoQ10 hai lần trực tiếp từ các tế bào thô sau khi lên men
tạo ra năng suất CoQ10 là 2,9 mg/g. Chiết xuất thô được tinh chế bằng cách
sử dụng chiết xuất ethanol, sử dụng hexane để phá vỡ tế bào, sự kết tinh để
tinh chế CoQ10 tinh khiết. Độ tinh khiết của CoQ10 được xác định bằng
phương pháp HPLC đạt 96 % [34].
Wang và cộng sự (2016) đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sản xuất
CoQ10 từ Rhodobacter sphaeroides. Các quy trình tối ưu để sản xuất CoQ10
từ Rhodobacter sphaeroide là: hàm lượng chủng thêm vào là 2 % so với môi
trường, nhiệt độ lên men 30 °C, thời gian lên men 72 h, thể tích môi trường
đến bình tổng thể tích 60 %, nhiệt độ chiết 90 °C, giá trị pH của nước axit
trong chất chiết là pH=3. Trong các điều kiện tối ưu, năng suất của CoQ10
được tăng thêm 141 % so với các điều kiện trước khi tối ưu hóa [68].
1.2.4.2. Nghiên cứu trong nước về khả năng tích lũy Coenzyme Q10
của vi khuẩn tía quang hợp
Từ năm 1999, nhóm nghiên cứu của PGS.TS. Lê Quang Huấn đã có
những kết quả ban đầu về khả năng tích lũy CoQ10 của một chủng VKTQH
thuộc chi Rhodobacter. Nhóm tác giả đã tinh sạch được ubiquinone với phổ
hấp thụ đặc trưng ở dạng oxy hóa tại bước sóng 275 nm và phổ hấp thụ đặc
trưng ở dạng khử tại bước sóng 291 nm [69].
Năm 2005, nhóm tác giả Đỗ Thị Tố Uyên và Trần Văn Nhị đã bước
đầu xây dựng được quy trình sản xuất ubiquinone từ sinh khối VKTQH. Kết
quả cho thấy, nhóm tác giả đã lựa chọn được bể thủy tinh để nuôi lấy sinh
khối VKTQH và sử dụng phương pháp siêu âm để phá vỡ tế bào. Từ đó, tách
chiết ubiquinone dạng thô bằng hệ dung môi diethyl ether/ethanol với tỷ lệ
3/1 (v/v) [70].
Trong nghiên cứu của Lê Thị Thanh Thảo, tiến hành khảo sát các yếu
tố ảnh hưởng như nguồn carbon, nguồn nitơ, vitamin, dịch chiết cà rốt và dịch

27. 17
chiết cà chua đến sự tăng trưởng tế bào cũng như sản xuất CoQ10 của các
chủng vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris PN16, PN21 và PN31 được
phân lập tại Việt Nam. Bổ sung vào môi trường nuôi cấy mannitol, pepton,
cao nấm men và vitamin E sẽ làm tăng việc sản xuất CoQ10 từ các chủng vi
khuẩn khảo sát. Chọn được phương pháp chiết Q10 từ tế bào vi khuẩn và
chủng PN31 có hàm lượng Q10 là 399,8 µg/g sinh khối sau thời gian nuôi cấy
là 72 giờ [71].
Tuy nhiên, khu hệ vi sinh vật ở nước ta là rất đa dạng, nhưng số lượng
nghiên cứu và công bố về VKTQH có khả năng tích lũy CoQ10 còn chưa
phong phú. Qua so sánh với các công bố trên thế giới, có thể thấy rằng hàm
lượng tích lũy CoQ10 ở các chủng này còn chưa cao và quy trình tách chiết
còn chưa được tối ưu [9, 49]. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu khả năng tích lũy
Coenzyme Q10 của một số chủng vi khuẩn tía quang hợp phân lập tại Việt
Nam” đã được đặt ra.

28. 18
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC
2.1.1. Nguyên vật liệu
- 06 chủng VKTQH có khả năng tích lũy sinh khối cao được phân lập
từ các mẫu nước nhiễm dầu được ký hiệu là: FO2, DQ1, DQ2, DQ3, DQ4 và
DQ5 và chủng Rhodopseudomonas palustris (Molish) van Niel BCRC16408
được lưu giữ tại Phòng CNSH Môi trường, Viện Công nghệ sinh học
- Trình tự nucleotide của các cặp mồi đã sử dụng để tách gen 16S
rRNA: cặp mồi đặc hiệu 27F (5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) và
1527R (5′-AGAAAGGAGGTGATCC AGCC-3′).
- Vector pCRTM được sử dụng làm vector tách dòng nhân đoạn gen 16S
rRNA, chủng E. coli DH5 được sử dụng cho biến nạp do Phòng Vi sinh vật
học phân tử, Viện Công nghệ sinh học.
2.1.2. Các thiết bị máy móc
Các thiết bị máy móc được sử dụng bao gồm thiết bị của Phòng công
nghệ sinh học Môi trường và phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen,
Viện Công nghệ sinh học:
+ Tủ nuôi cấy vi sinh (Binder, infors, Đức);
+ Bình khí nitơ (Nga), máy quang phổ NOVASPEC II (Anh);
+ Máy quang phổ UV-1650PC (Shimazdu, Nhật Bản);
+ Cân phân tích Mettler toldo (Thụy Sỹ);
+ Máy li tâm lạnh CT15RE HiMac (Hitachi);
+ Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ);
+ Máy điện di Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ);
+ Máy soi DNA (mini-transllumminator, Bio-Rad, Mỹ);
+ Máy Vortex (Đức),
+ Máy đo pH (Thommas Scientific, Mỹ),
+ Máy lắc ổn nhiệt (N-Biotex, Hàn Quốc),

29. 19
+ Bể ổn nhiệt (N-Biotex, Hàn Quốc),
+ Máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ),
+ Tủ lạnh thường GR-K22EA (Toshiba) và
+ Tủ lạnh sâu -20o
C (Alaska),
+ Box cấy Biocyt ESI Flufrance (Pháp),
+ Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật Bản) và
+ Kính hiển vi điện tử JEM1010 (Nhật Bản),
+ Máy đọc trình tự gene tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic
Analyzer.
2.1.3. Hóa chất
- CoQ10 chuẩn từ hãng Sigma. Các hóa chất thông thường dùng trong
môi trường nuôi cấy vi sinh vật do Trung Quốc và Việt Nam sản xuất. Các
hóa chất dùng trong sinh học phân tử đều là các hóa chất có độ tinh khiết cao
đặt từ các hãng như Merk (Đức), Ferrmentas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Ấn Độ.
2.1.4. Thành phần môi trường nuôi cấy
- Môi trường phân lập và nuôi cấy VKTQH là môi trường DSMZ 27
bao gồm các thành phần sau: Cao nấm men (0,3 g/l), succinate –Na (1 g/l),
acetate (0,5 g/l), K2HPO4 (1 g/l), KH2PO4 (0,5 g/l), MgSO4.7H2O (0,4 g/l),
CaCl2.2 H2O (0,05 g/l), NH4Cl (0,4 g/l), vi lượng SL6 (1 ml/l), dung dịch
vitamin B12 (0,4 ml/l), nước cất (1000 ml), pH (6,8).
- Môi trường DSMZ 27 có bổ sung 2% thạch
- Vitamin và vi lượng bổ sung:
+ Dung dịch vi lượng SL6 (mg/l): HCl (25%) 6,5 ml; FeCl2.4H2O 1,5 g;
H3BO3 0,3 g; MnCl2.2H2O 0,03 g; CoCl2.6H2O 0,2 g; ZnSO4. 7H2O 0,1 g;
CuCl2.2H2O 17 mg; NiCl2.6H2O 24 mg; Na2MoO4.2H2O 36 mg, H2O 993 ml.
+ Dung dịch vitamin B12: 10 mg trong 100 ml nước được khử trùng
bằng màng lọc và bổ sung vào môi trường trước khi sử dụng

30. 20
2.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Thời gian thực hiện: từ 15/8/2018 đến 15/8/2019
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ sinh học Môi trường
(CNSHMT), Viện Công nghệ sinh học, VAST
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy, hoạt hóa và đánh giá sinh trưởng của
vi khuẩn tía quang hợp
VKTQH được nuôi cấy trong ống thủy tinh có nắp đậy cao su hoặc
trong các bình thủy tinh hình trụ có thể tích chứa dịch môi trường DSMZ 27.
Môi trường trong các bình và các ống thủy tinh được sục khí nitơ qua màng
lọc vô trùng thay thế khí oxy trong môi trường sao cho nồng độ oxy hòa tan
0 mg/l. Các chủng VKTQH được nuôi trong lọ penicillin V=10 ml hoặc bình
thủy tinh V=100 ml chứa môi trường DSMZ 27 ở điều kiện kỵ khí, ánh sáng
đèn sợi đốt có cường độ 5000 lux, nhiệt độ 27-30 o
C.
Hoạt hóa các chủng VKTQH bằng cách: Khi sinh trưởng của các chủng
VKTQH được nuôi cấy ở pha log với mật độ tế bào khoảng 109
thì được cấy
vào bình thí nghiệm thể tích 500 ml khoảng 5-10 % (v/v) để đạt mật độ ban
đầu OD800 khoảng 0,1. Sau đó các chủng VKTQH được nuôi bằng cách nuôi
tĩnh trong môi trường DSMZ 27 điều kiện kỵ khí với cường độ ánh sáng 5000
lux từ đèn sợi đốt. Mỗi chủng VKTQH được hoạt hóa làm lặp lại 3 lần, mỗi
lần 3 bình thí nghiệm.
Sinh trưởng của các chủng VKTQH được xác định thông qua độ hấp phụ
của dịch huyền phù tế bào ở pha log (khoảng 5 ngày nuối cấy) tại bước sóng 800
nm (OD800), vì trong tế bào VKTQH Bchl có cực đại hấp thụ ở 800 nm và độ
hấp thụ này tỷ lệ với hàm lượng Bchl và do vậy tỷ lệ thuận với sinh khối của tế
bào. Các chỉ số này được đo trên máy máy quang phổ UV-1650 PC.
2.3.2. Phương pháp xác định Coenzyme Q10 từ các chủng vi khuẩn
tía quang hợp
- Tách chiết, tinh sạch CoQ10 [13]: Dịch nuôi cấy các chủng VKTQH
trong môi trường DSMZ 27 sau 5 ngày nuôi cấy được ly tâm loại dịch thu

31. 21
sinh khối tươi (ly tâm ở 8000 vòng/phút, 4 o
C trong 10 phút). CoQ10 được
tiến hành chiết xuất dựa theo phương pháp của Paterson và Buddie [72].
+ Cân khoảng 2,5 g sinh khối tươi cho vào ống falcol được thêm 25 ml
hỗn hợp methanol: n- hexane (tỉ lệ thể tích 3:2). Sau đó lắc votex hỗn hợp
trong 20-30 phút, ly tâm ở 8000 vòng/phút, 4 o
C trong 10 phút. Tách lấy dịch
trên và cô chân không ở 60 o
C thu được cặn thô.
+ Cặn khô có chứa CoQ10 được hoàn tan trở lại trong hỗn hợp dung
môi methanol: hexane và chiết lấy pha hexane; sau đó pha hexane được cô
đặc đến khô (quá trình lặp lại 3 lần). Sau đó CoQ10 tiếp tục được tinh sạch
bằng cột silica với dung môi methanol làm pha động và được cân bằng 10 lần
thể tích cột. Mẫu dịch chiết CoQ10 được đưa lên cột và chạy với hệ dung môi
rửa giải là ethanol. Do CoQ10 có màu vàng nên tiến hành thu nhận các phân
đoạn chứa CoQ10. Cặn thô được hòa tan dung môi n –hexan được gọi là dịch
thô chứa CoQ10.
- Xác định sự có mặt của CoQ10 bằng sắc ký bản mỏng (TCL): Dịch
thô thu được từ sinh khối các chủng được sử dụng để xác định sự có mặt của
CoQ10 bằng phương pháp sắc kí bản mỏng tráng silicagel 60 F254 (TCL) pha
thường với hệ dung môi n–hexan: etyl ete với tỉ lệ là 4:1 (v/v). Lượng dịch
thô của mỗi chủng tiêm vào sắc kí bảng mỏng là 5 µl. Chủng VKTQH có vết
CoQ10 đậm nhất và sinh trưởng tốt nhất được lựa chọn cho các nghiên cứu
tiếp theo.
- Định lượng CoQ10 bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao
(HPLC) [73].
Xây dựng đường chuẩn Q10 bằng phương pháp HPLC
Xây dựng đồ thị mối quan hệ giữa nồng độ Q10 và diện tích píc hấp
thụ sắc ký trong khoảng nồng độ là 1200; 2400; 3600; 4800 và 6000 mg/l.
Phân tích từng mẫu trên với thiết bị sắc ký lỏng cao áp HPLC 1100 tại bước
sóng  = 280 nm cho ra đường chuẩn dùng để xác định hàm lượng Q10 trong
mẫu thí nghiệm.

32. 22
Phân tích hàm lượng CoQ10 được thực hiện trên hệ thống HPLC: Dịch
thô thu được từ sinh khối các chủng VKTQH được xác định hàm lượng bằng
phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) với các điều kiện: sử dụng cột
Hypersil C18 (200 x 4 mm); tỷ lệ pha động Hexan : Aceton = 90: 10 (v/v); tốc
độ dòng chảy 0,5 ml/phút và áp suất là 220 bar.
Tiến hành: Sau khi đặt xong các thông số cần thiết, tiến hành rửa bơm,
rửa cột, chạy đường nền và áp suất ổn định 30  45 phút. Lọc mẫu trước khi
đo bằng micro filter 2-3 lần, lượng mẫu tối thiểu đạt 0,5 ml. Dùng Micropipet
lấy 5 ml dung dịch phân tích đưa vào buồng mẫu. Máy sẽ tự động ghi các
thông số: Thời gian lưu (RT), chiều cao pic và tính điện tích cũng như thành
phần phần trăm (%) của từng cấu tử trong hỗn hợp.
+ Sau khi đo xong mẫu để thiết bị chạy đường nền 10 phút trước khi
bơm mẫu tiếp theo.
2.3.3. Phương pháp xác định các đặc điểm sinh học của các chủng
vi khuẩn tía quang hợp
2.3.3.1 Phương pháp đánh giá sinh trưởng và xác định các đặc điểm
hình thái
Chủng VKTQH sinh tổng hợp CoQ10 tốt nhất được nuôi cấy đồng thời
trên môi trường DSMZ 27 thạch để quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào. Hình
thái tế bào được quan sát dưới kính hiển vi quang học OLYMPUS (Nhật Bản)
và chụp ảnh tế bào trên kính hiển vi điện tử JEM1010 (Nhật Bản) và được
tiến hành tại phòng Vi sinh vât – Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Hà Nội.
Phương pháp nhuộm Gram: Xác định Gram của vi khuẩn theo phương
pháp của Harry, sử dụng chủng vi khuẩn E. coli và vi khuẩn Bacillus subtillis
làm đối chứng.
2.3.3.2.Phương pháp xác định khả năng sử dụng một số nguồn carbon
Các chủng lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường DSMZ-27 trong đó
nguồn carbon được thay thế bằng các nguồn như: glucose, acetate, fructose,
citrate, succinate, benzoate với nồng độ 1 g/l. Khả năng sinh trưởng của

33. 23
chúng được ghi nhận sau 5 ngày nuôi cấy ở điều kiện kỵ khí, có chiếu sáng
với cường độ khoảng 5000 lux.
2.3.3.3 Phương pháp phân tích gene mã hóa 16S rRNA
ADN của các chủng lựa chọn đã được tách chiết bằng bộ kit QIAmp
ADN mini và Blood Hard Book theo quy trình của nhà sản xuất Qiagen. Phản
ứng PCR để nhân đoạn gen 16S rARN với cặp mồi đặc hiệu 27F (5′-
GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) và 1527R (5′-AGAAAGGAGGTGATCC
AGCC-3′). Quá trình nhân tiến hành với tổng thể tích 25 l bao gồm: 12,5 l
PCR master mix; 0,75 l mồi (20 M) mỗi loại; 8 l dH2O; 3 l ADN khuôn.
Việc nhân gen được tiến hành với chu trình nhiệt: 94 0
C trong 5 phút; 32 chu
kỳ lặp lại (94 o
C trong 1 phút; 56 o
C trong 50 giây; 72 o
C trong 50 giây);
72 o
C trong 7 phút và 4 o
C để bảo quản.
Sản phẩm PCR được phân tách trên gel agarose 1 % và tinh sạch bằng
bộ kit AccuPrep PCR Purification theo quy trình của nhà sản xuất Bioneer.
Tiếp đó sản phẩm PCR (kích thước khoảng 1500 bp) được gắn vào vectơ tách
dòng, biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Dòng plasmid chứa đoạn
gen mong muốn được tách chiết, tinh sạch và xác định trình tự trên máy xác
định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer. Việc so sánh
trình tự nucletide và xây dựng cây phát sinh chủng loại của chủng BTLP1 với
các chủng vi khuẩn đại diện khác sử dụng phần mềm Blast, Bioedit, Clustal X
và Treeview.
2.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng của các
chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn
- Ảnh hưởng của nhiệt độ: thí nghiệm được tiến hành như mục 2.3.1
trong các bình thủy tinh hình trụ 100 ml và được nuôi trong ở 3 khoảng nhiệt
độ khác nhau 14-16 o
C, 27-30 o
C, 38-40 o
C. Mỗi thí nghiệm về khoảng nhiệt
độ nuôi cấy làm lặp lại 3 lần. Các bình được nuôi ở điều kiện kỵ khí, có ánh
sáng. Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào
ở các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm (OD800) và đánh giá kết quả.

34. 24
- Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng: thí nghiệm được tiến hành như
mục 2.3.1 trong các bình thủy tinh hình trụ 100 ml, nhiệt độ 27-30 o
C dưới
ánh sáng đèn sợi đốt, có 6 mức cường độ ánh sáng thí nghiệm là 0, 1000,
2000, 3000, 4000 và 5000 lux. Ở mỗi thí nghiệm về cường độ ánh sáng làm
lặp lại 3 lần. Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ của dịch huyền
phù tế bào ở các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm (OD800) và đánh giá
kết quả.
- Ảnh hưởng của pH: thí nghiệm được tiến hành như mục 2.3.1 trong
các bình thủy tinh hình trụ 10 ml chứa các môi trường DSMZ-27 được điều
chỉnh với 9 mức pH: 4; 5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5 và 9. Các bình được nuôi trong
điều kiện kị khí, sáng, nhiệt độ 27 – 30 o
C. Ở mỗi thí nghiệm pH làm lặp lại 3
lần.Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở
các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm (OD800) và đánh giá kết quả.
- Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl: thí nghiệm được tiến hành như
mục 2.3.1, các chủng lựa chọn được nuôi trong các bình thủy tinh hình trụ 10
ml chứa môi trường DSMZ-27 với nồng độ muối ban đầu được điều chỉnh ở
10 mức nồng độ: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4 và 5 %. Ở mỗi thí nghiệm
nồng độ muối làm lặp lại 3 lần. Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành đo độ hấp phụ
của dịch huyền phù tế bào ở các bình thí nghiệm tại bước sóng 800 nm
(OD800) và đánh giá kết quả.
- Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ: thí nghiệm được tiến hành như
mục 2.3.1 trong các bình thủy tinh hình trự 100 ml chứa các môi trường
DSMZ-27 có thay thế hàm lượng nitơ trong NH4Cl bằng 7 nguồn nitơ từ
pepton, (NH4)2SO4, ure, NH4NO3, KNO3, NaNO3 và Ca(NO3)2.4H2O. Ở mỗi
thí nghiệm về các nguồn nitơ làm lặp lại 3 lần. Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành
đo độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở các bình thí nghiệm tại bước sóng
800 nm (OD800) và đánh giá kết quả.

35. 25
2.3.5. Xây dựng phương pháp tách chiết Coenzyme Q10 từ các
chủng lựa chọn
Tiến hành nuôi cấy các chủng VKTQH lựa chọn trong bình 500 ml có
chứa môi trường DSMZ 27 và môi trường tối ưu thu được từ các điều kiện
nuôi cấy ở trên.
Sau đó tiến hành tách chiết, xác định hàm lượng CoQ10 theo các bước
ở mục 2.3.2 và so sánh đánh giá kết quả hàm lượng CoQ10 thu được.
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình của các lần lặp lại
thí nghiệm ± độ lệch chuẩn (Standard Deviation - SD). Sử dụng phương pháp
xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007 và phần mềm Irristat 5.0
để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa là α = 0,05.

36. 26
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC
CHỦNG VKTQH CÓ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY COENZYME Q10 CAO
3.1.1.Sàng lọc các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng tích
lũy Coenzyme Q10 cao
Việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả năng sinh
tổng hợp CoQ10 cao trước tiên dựa trên khả năng sinh trưởng (tạo sinh khối)
và hàm lượng CoQ10 tích lũy.
3.1.1.1.Hoạt hóa và đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi
khuẩn tía quang hợp
06 chủng VKTQH từ bộ sưu tập chủng giống của phòng CNSH Môi
trường được hoạt hóa trên môi trường DSMZ 27. Sau 5 ngày nuôi tĩnh trong
điều kiện kỵ khí, sáng, chúng tôi tiến hành đo độ huyền phù tế bào OD800
của các chủng và thu được kết quả thể hiện ở Hình 3.1A và Hình 3.1B
(A)

37. 27
(B)
Hình 3.1. Khả năng sinh trưởng các chủng vi khuẩn tía quan hợp trên môi
trường DSMZ 27 sau khi hoạt hóa
Từ hình 3.1A cho thấy, cả 6 chủng đều có khả năng sinh trưởng tốt
(∆OD800 > 1,5), trong đó 2 chủng FO2 và DQ4 sinh trưởng tốt hơn cả
(∆OD800 > 1,8). Tương ứng với giá trị ∆OD800 của 2 chủng FO2 và DQ4,
nhận thấy dịch chứa sinh khối thu được từ hai chủng này màu đỏ đậm hơn so
với 4 chủng còn lại (Hình 3.1 B).
Như vậy, trong 6 chủng nghiên cứu có 2 chủng FO2 và DQ4 có khả
năng tích lũy sinh khối tốt hơn trong môi trường DSMZ 27.
3.1.1.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả tích lũy
Coenzyme Q10 cao
Để tiến hành sang lọc các chủng VKTQH có khả năng tích lũy CoQ10
cao, 06 chủng VKTQH lựa chọn đều được tiến hành loại dịch thu sinh khối
tươi (ly tâm ở 8000 vòng/phút, 4 o
C trong 10 phút). CoQ10 được tiến hành
chiết xuất theo phương pháp của Paterson và Buddie (1991) [72]. Cặn thô
được hòa tan vào dung môi n–hexan. Sự có mặt của CoQ10 ở các chủng đã
được định tính trên sắc ký bản mỏng (Hình 3.2).
FO2 DQ1 DQ2 DQ3 DQ4 DQ5

38. 28
Hình 3.2. Sắc ký bản mỏng thể hiện sự có mặt của Coenzyme Q10
(Chú thích C: Đối chứng CoQ10 chuẩn)
Từ kết quả Hình 3.2 cho thấy, cả 6 chủng VKTQH đều có khả năng
sinh tổng hợp CoQ10 (vạch ở vị trí tương ứng với vạch màu vàng đậm của
đối chứng CoQ10 chuẩn). Trong đó, chủng FO2 và DQ4 cho kết quả đậm
nhất, điều này có thể phần nào khẳng định chủng này có khả năng tổng hợp
CoQ10 cao hơn 4 chủng còn lại.
Để đánh giá rõ hơn về khả năng tích lũy CoQ10 của các chủng chúng
tôi tiến hành phân tích định lượng hàm lượng CoQ10 bằng phương pháp
HPLC. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá hàm lượng Coenzyme Q10 của các chủng
STT Ký hiệu chủng Hàm lượng CoQ10
(mg/g sinh khối tươi)
1 FO2 5,67
2 DQ1 0,95
3 DQ2 1,15
4 DQ3 1,30
5 DQ4 6,06
6 DQ5 2,09
C FO2 DQ1 DQ2 DQ4 DQ3 DQ5
CoQ10

39. 29
Từ số liệu bảng 3.1 cho thấy, trong 6 chủng VKTQH thì có 2 chủng
FO2 và DQ4 có khả năng tích lũy CoQ10 là cao hơn hẳn so với các chủng
còn lại, đạt lần lượt là 5,67 mg/g và 6,06 mg/g sinh khối tươi. Kết hợp với khả
năng sinh trưởng ở trên, chủng VKTQH FO2 và DQ4 đã được chúng tôi lựa
chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng lựa chọn
3.1.2.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào
Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào là đặc điểm quan trọng trong
việc phân loại các vi khuẩn. Để xác định đặc điểm hình thái, các chủng lựa
chọn được nuôi cấy trong môi trường DSMZ -27 bổ sung 2 % thạch vào môi
trường dịch thể, ở điều kiện kỵ khí-sáng với cường độ chiếu sáng khoảng
5000 lux, nhiệt độ 27-30 o
C. Tiến hành nhuộm Gram và quan sát hình thái tế
bào dưới kính hiển vi điện tử đã được tiến hành khi chúng đang sinh trưởng ở
giai đoạn logarit. Sau 5 ngày nuôi cấy, chúng tôi tiến hành quan sát hình dạng
qua kính tử vi điện tử và quan sát huyền phù tế bào. Kết quả thu được như
sau:
Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào chủng FO2: Khuẩn lạc chủng
FO2 có màu đỏ đậm, bề mặt bóng, mọc nổi trên bề mặt thạch, đường kính từ
0,7-1,2 mm. Tế bào dạng hình que hơi lượn sóng, bề mặt xù xì, thô ráp. Kích
thước từ (0,52-0,55) x (1,14-1,17) µm. Dịch huyền phù tế bào của chủng FO2
màu đỏ đậm, sinh sản bằng cách nảy chồi, không quan sát thấy “giọt” lưu
huỳnh tích lũy trong tế bào. Chủng FO2 là vi khuẩn Gram (-).
Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào chủng DQ4: Khuẩn lạc chủng
DQ4 hình tròn, bóng, màu đỏ đậm, bề mặt lồi, đường kính khoảng 1-2 mm.
Tế bào dạng hình que, bề mặt xù xì, thô ráp. Kích thước từ (0,596-0,835) x
(1,75-3,64) µm (Hình 3.3). Dịch huyền phù tế bào chủng DQ4 màu nâu đỏ,
sinh sản bằng cách nảy chồi, không qua sát thấy “giọt” lưu huỳnh tích lũy
trong tế bào. Chủng DQ4 là vi khuẩn Gram (-).

40. 30
(A) (B)
(C) (D)
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng FO2 (A, B) và
của chủng DQ4 (C, D)
Như vậy 2 chủng mà chúng tôi lựa chọn có đặc điểm như: dịch huyền
phù màu đỏ đậm hoặc nâu đỏ, tế bào các chủng lựa chọn đều có dạng hình que
hoặc với các kích thước khác nhau, không quan sát thấy “giọt” lưu huỳnh tích
lũy trong tế bào.
Theo khóa phân loại của Bergey’s, mặc dù khả năng sử dụng các hợp
chất khử lưu huỳnh đều được phát hiện ở cả hai họ vi khuẩn tía lưu huỳnh và
không lưu huỳnh, nhưng “giọt” lưu huỳnh chỉ quan sát được trong tế bào các
loài vi khuẩn tía lưu huỳnh. Như vậy cả hai chủng trên đều thuộc nhóm
VKTQH không lưu huỳnh. Cả 2 chủng này đều là vi khuẩn Gram (-), các đặc
điểm hình thái trên tương tự với một số loài thuộc chi Rhodopseudomonas. Tuy
nhiên, để xác định chính xác vị trí phân loại của các chủng lựa chọn, cần có các
nghiên cứu sâu hơn.
5 mm

41. 31
3.1.2.2 Khả năng sử dụng các nguồn carbon
Ngoài khả năng cố định CO2, VKTQH có khả năng sử dụng được nhiều
nguồn carbon hữu cơ cho sinh trưởng, một số nguồn carbon được sử dụng
mang tính chất đặc trưng cho loài như một yếu tố để phân loại vi khuẩn. Để
xác định khả năng sử dụng một số nguồn carbon cho sinh trưởng của 2 chủng
FO2 và DQ4, chúng tôi đã nuôi cấy chúng trong môi trường DSMZ 27 dịch
thể và trên đĩa thạch, trong đó acetate được lần lượt thay thế bằng một số
nguồn khác cùng nồng độ 1 g/l, thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện kỵ khí
sáng. Khả năng sử dụng các nguồn carbon: acetate, glucose, fructose, citrate,
succinate, benzoate của 2 chủng được ghi nhận sau 5 ngày nuôi cấy và so
sánh với khả năng cố định carbon của chủng Rhodopseudomonas
palustris (Molish) van Niel BCRC16408 trong nghiên cứu của Wong và cộng
sự (2014) [74].
Kết quả so sánh khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau của 2
chủng lựa chọn với Rhodopseudomonas palustris (Molish) van Niel
BCRC16408 được thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. So sánh khả năng sử dụng một số nguồn C của các chủng lựa
chọn với Rhodopseudomonas palustris (Molish) van Niel BCRC16408
Nguồn FO2 DQ4 Rhodopseudomonas
palustris (Molish) van
Niel BCRC16408
Glucose + + +
Acetate + + +
Fructose + + +
Citrate + + -
Succinate + + +
Benzoate + + +

42. 32
Kết quả Bảng 3.1 cho thấy, 2 chủng FO2 và DQ5 đều có khả năng sử
dụng các nguồn cacbon là glucose, acetate, fructose, succinate, benzoate
tương tự như loài Rhodopseudomonas palustris (Molish) van Niel
BCRC16408. Tuy nhiên 2 chủng này đều có khả năng sử dụng citrate cho quá
trình sinh tổng hợp sinh khối thì loài Rhodopseudomonas palustris (Molish)
van Niel BCRC16408 lại không có khả năng này.
3.1.2.3. Xác định trịnh tự gene 16S rRNA của các chủng lựa chọn
DNA tổng số của 2 chủng nghiên cứu được tách chiết và sử dụng mồi
đặc hiệu để khuếch đại gen 16S rRNA với kỹ thuật PCR trình bày ở mục
2.3.3. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR trên bản gel điện di cho thấy chỉ có
duy nhất một băng có kích thước khoảng 1500 bp phù hợp với kích thước gen
16S rRNA ở vi khuẩn. Trình tự nucleotide thu được 2 chủng chủng FO2 và
DQ4 được xác định khi so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA với trình tự đoạn
gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn khác trên Ngân hàng gen quốc tế
(NCBI). Sử dụng các phần mềm ClustalX, MegaBlast và Phylip đã xây dựng
cây phát sinh chủng loại của 2 chủng lựa chọn được thể hiện ở Hình 3.4.
Hình 3.4. Cây phát sinh chủng loại chủng FO2 và DQ4 dựa vào so sánh
trình tự gen 16S rRNA

43. 33
Kết quả cho thấy, cả 2 chủng này đều có quan hệ gần gũi với các loài
thuộc chi Rhodopseudomonas, đặc biệt tương đồng tới 99 % với loài
Rhodopseudomonas palustris (AB017261). Do vậy, 2 chủng được đặt tên lần
lượt là Rhodopseudomonas sp. FO2 và Rhodopseudomonas sp. DQ4. Trình tự
gen 16S rRNA của 2 chủng này được đăng ký trên ngân hàng gen Nhật Bản
DDBJ với mã số là LC318129 và LC318128.
3.2. KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SINH TRƯỞNG CỦA
2 CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP LỰA CHỌN
Để 2 chủng VKTQH lựa chọn có mức sinh trưởng tối đa, thu được
sinh khối lớn và các hoạt chất thứ cấp như CoQ10 cao nhất thì môi trường và
điều kiện nuôi cấy của chúng phải được xác định tối ưu. Do đó chúng tôi tiến
hành đánh giá ảnh hưởng của môi trường như nhiệt độ, pH, ánh sáng, nồng độ
muối, nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của 2 chủng nhằm tìm ra những điều
kiện môi trường tối ưu nhất cho sự sinh trưởng của 2 chủng.
3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của 2 chủng vi
khuẩn tía quang hợp lựa chọn
Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ là một trong những yếu tố
quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và tích lũy các hợp chất thứ
cấp của các loài VKTQH. Trên thực tế, do các loài VKTQH là các sinh vật
đơn bào cho nên chúng rất mẫn cảm với sự thay đổi của nhiệt độ và thường bị
biến hóa cùng với sự thay đổi về nhiệt độ của môi trường xung quanh. Để lựa
chọn được điều kiện nuôi cấy chủng VKTQH có khả năng sản xuất CoQ10
tốt. Các chủng VKTQH càng thu được nhiều sinh khối thì hàm lượng CoQ10
thu được càng nhiều. Do đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của
các khoảng nhiệt độ 14 - 16; 27 - 30; 38 - 40 o
C đến 2 chủng
Rhodopseudomonas sp. DQ4 và FO2. Thí nghiệm được tiến hành như mục
2.3.4 chương 2. Kết quả về khả năng sinh trưởng của 2 chủng sau 5 ngày nuôi
cấy trên môi trường DSMZ 27 được trình bày ở Hình 3.5.

44. 34
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn
tía quang hợp lựa chọn
Kết quả từ Hình 3.5 cho thấy, ở khoảng nhiệt độ nuôi cấy từ 27-30 o
C là
tốt nhất cho khả năng sinh trưởng của cả 2 chủng Rhodopseudomonas sp. FO2
và DQ4, giá trị ∆OD800 của 2 chủng lần lượt đạt 1,92 và 1,85. Mức độ tích lũy
sinh khối của các chủng chọn lựa ở khoảng nhiệt độ từ 38 – 40 o
C kém hơn so
với nhiệt độ tối ưu giá trị ∆OD800 của chủng FO2, DQ4 đạt lần lượt là 1,5 và
1,3. Ở mức nhiệt độ thấp từ 14-16 o
C khả năng sinh trưởng của cả hai chủng
kém nhất, giá trị ∆OD800 chỉ đạt dưới 1. Khi xử lý thống kê thì khả năng sinh
trưởng của mỗi chủng ở 3 mức nhiệt độ thí nghiệm là khác nhau có ý nghĩa ở
mức độ tin cậy 95 %.
Nhiệt độ phù hợp cho sự tích lũy sinh khối tự nhiên của 2 chủng
Rhodopseudomonas sp. DQ4 và FO2 trong nghiên cứu này phù hợp với nghiên
cứu của Wong và cộng sự (2014), khoảng nhiệt độ sinh trưởng của
Rhodopseudomonas palustris PS3, YSC3 và YSC4 là 25-37 o
C, và sự tăng
trưởng tối ưu của các chủng đạt ở 30 o
C [74].Trong các thí nghiệm tiếp theo,
chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 27 – 30 o
C là tối ưu nhất cho sự sinh trưởng của cả
2 chủng lựa chọn.

45. 35
3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía
quang hợp lựa chọn
pH có ảnh hưởng rõ rệt đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Mỗi vi
sinh vật đều có một phạm vi pH sinh trưởng nhất định và pH sinh trưởng tốt
nhất. Để đánh giá ảnh hưởng của yếu tố này đến sinh trưởng của các chủng
VKTQH không lưu huỳnh lựa chọn, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm như
mục 2.3.5 chương 2. Kết quả xác định sinh khối tế bào trong môi trường nuôi
được trình bày ở Hình 3.6.
Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh trưởng của 2 chủng vi
khuẩn tía quang hợp lựa chọn
Kết quả từ Hình 3.6 cho thấy: 2 chủng nghiên cứu đều chịu ảnh hưởng
của pH khá giống nhau và có thể sinh trưởng khá tốt trong khoảng pH từ 6 -
8,5. Cũng trong khoảng này mỗi chủng có khả năng tích lũy sinh khối khác
nhau nhưng đều chung pH tối ưu là 6,5-7. Bên cạnh đó, cả 2 chủng VKTQH
đều bị ức chế sinh trưởng ở pH thấp hơn 5, trong khoảng pH này sinh trưởng
bị ức chế nên sinh khối thu được sẽ giảm đồng thời hàm lượng CoQ10 tạo ra
cũng sẽ giảm đi. Tương tự với các nghiên cứu khác, khoảng pH cho sự thích
hợp phát triển của các chủng thuộc Rhodopseudomonas palustris thường nằm

46. 36
trong khoảng rộng hơn từ 5,5 đến 8,5 [50, 75, 76]. Để tối ưu điều kiện nuôi
cấy của 2 chủng, chúng tôi chọn pH từ 6,5-7 để sử dụng cho các nghiên cứu
tiếp theo.
3.2.3. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng của 2
chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn
Ánh sáng là một trong những yếu tố quan trọng đối với nhóm sinh vật
quang hợp trong đó có nhóm VKTQH. Để xác định nhu cầu về ánh sáng đối
với các chủng VKTQH không lưu huỳnh lựa chọn, chúng tôi tiến hành thí
nghiệm như ở mục 2.3.4 chương 2. Kết quả xác định mức độ tích lũy sinh
khối trong môi trường sau 5 ngày nuôi cấy được trình bày ở Hình 3.7.
Hình 3.7. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng của 2
chủng vi khuẩn tía quang hợp lựa chọn
Kết quả cho thấy, cả 2 chủng vi khuẩn nghiên cứu đều chịu ảnh hưởng
của cường độ chiếu sáng, cường độ chiếu sáng càng giảm thì khả năng sinh
trưởng của các chủng càng thấp. Sau 5 ngày nuôi cấy ở mức cường độ ánh
sáng 4000 lux cả hai chủng VKTQH lựa chọn đều có khả năng tổng hợp sinh
khối tốt nhất, giá trị ∆OD800 của 2 chủng Rhodopseudomonas sp. FO2 và
DQ4 đạt lần lượt là 2,02 và 1,96. Tuy nhiên khi xử lý thống kê, sự khác nhau

47. 37
về giá trị ∆OD800 của cả 2 chủng được nuôi ở mức cường độ ánh sáng 4000
lux và 5000 lux là không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95 %.
Ở điều kiện nuôi cấy trong bóng tối (mức cường độ chiếu sáng 0 lux)
thì cả hai chủng đều bị ức chế khả năng sinh trưởng. Mức độ tích lũy sinh
khối của 2 chủng Rhodopseudomonas sp. FO2 và DQ4 khá giống nhau tại các
mức cường độ ánh sáng thí nghiệm. Do đó, các chủng lựa chọn có nhu cầu
được chiếu sáng để sinh trưởng thích hợp nhất trong cường độ ánh sáng từ
4000 - 5000 lux.
3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của 2 chủng lựa chọn
Nguồn nitơ có vai trò quan trọng đối với quá trình phát triển của
VKTQH. Để khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tăng trường của 2
chủng vi sinh vật lựa chọn, chúng tôi tiến hành nuôi cấy 2 chủng trong các
môi trường DSMZ-27 có thay thế hàm lượng nitơ bằng các nguồn NH4Cl,
pepton, (NH4)2SO4, Co(NH2)2, NH4NO3, NaNO2, KNO3, Ca(NO3)2.4H2O. Kết
quả nghiên cứu được thể hiện trên Hình 3.8.
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của 2 chủng vi
khuẩn tía quang hợp lựa chọn
Từ Hình 3.8 cho thấy, cả 2 chủng đều có khả năng sử dụng nguồn nitơ
giống nhau. Trong số 8 nguồn nitơ được khảo sát thì 2 chủng lựa chọn có khả

48. 38
năng sử dụng nguồn pepton để sinh trưởng tốt nhất (∆OD800 của cả 2 chủng
đều > 2,2), tiếp đến là NH4Cl (thành phần chính của môi trường DSMZ 27),
(NH4)2SO4, ure. Khi xử lý thống kê, sự khác nhau về khả năng sử dụng nitơ
pepton và NH4Cl của hai chủng VKTQH là có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%.
4 nguồn nitơ còn lại từ NH4NO3, NaNO2, KNO3 và Ca(NO3)2 được 2
chủng này sử dụng cho sự sinh trưởng khá thấp (giá trị ΔOD800 <1,5). Tương
tự theo nghiên cứu của Lê Thị Thanh Thảo, chủng Rhodopseudomonas
Palustris PN16, PN21 và PN31 đều có khả năng thu nhận sinh khối khác
nhau khi sử dụng các nguồn nitơ khác nhau, nguồn nitơ từ (NH4)2SO4 là thích
hợp cho sự sinh trưởng của các chủng này. Ở nghiên cứu này, sinh khối thu
được của hai chủng VKTQH lựa chọn thu được tốt nhất là nguồn pepton, do
đó chúng tôi lựa chọn pepton làm nguồn nitơ thay thế NH4Cl trong môi
trường DSMZ 27 để nuôi cấy 2 chủng Rhodopseudomonas sp. FO2 và DQ4 ở
các nghiên cứu tiếp theo. Môi trường DSMZ 27 có thay thế hàm lượng nitơ từ
muối NH4Cl bằng pepton được chúng tôi đặt là môi trường DSMZ 27 cải tiến.
3.2.5. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sinh trưởng của 2
chủng lựa chọn
Các chủng lựa chọn đều được phân lập từ các thủy vực ô nhiễm dầu, vì
vậy, để xác định khả năng sinh trưởng thích hợp nhất của 02 chủng lựa chọn ở
các độ mặn khác nhau, chúng tôi đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của nồng
độ muối đến khả năng sinh trưởng. Thí nghiệm được mô tả như mục 2.3.4
chương 2. Sau 5 ngày nuôi cấy, khả năng tích lũy sinh khối của hai chủng
nghiên cứu được xác định và trình bày ở Hình 3.9.
Từ Hình 3.9 cho thấy, nồng độ muối có ảnh hưởng đến khả năng tích
lũy sinh khối của 2 chủng VKTQH lựa chọn, nồng độ muối càng tăng thì khả
năng sinh trưởng của 2 chủng càng giảm. Cả hai chủng đều có khả năng sinh
trưởng và phát triển tốt nhất khi trong môi trường không chứa muối, giá trị
∆OD800 của cả hai chủng đều >1,8. Khoảng nồng độ muối trong môi trường

49. 39
nuôi cấy các chủng lựa chọn có khả năng sinh trưởng được là 0 % - 1,5 %, khi
đó ∆OD800 của cả hai chủng đều >1,5.
Hình 3.9. Ảnh hưởng của NaCl đến sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn tía
quang hợp lựa chọn
Khi môi trường nuôi cấy của hai chủng có nồng độ muối từ 2 - 5 % thì
khả năng sinh trưởng của 2 chủng nghiên cứu bắt đầu bị ức chế (∆OD800 của
cả hai chủng đều <1,5). Tương tự nghiên cứu của Wong và cộng sự, 3 chủng
Rhodopseudomonas palustris PS3, YSC3 và YSC4 đều có đặc điểm không bắt
buộc sử dụng NaCl cho sự tăng trưởng sinh khối và tích lũy các chất. Chủng PS3
có thể dung nạp tới 1,5 % NaCl, trong khi 2 chủng còn lại có thể dung nạp tới
0,7 % NaCl [74].
Do đó, chúng tôi lựa chọn sử dụng môi trường không có chứa muối (NaCl
0 %) tối ưu nhất để nuôi cấy thu nhận 2 chủng Rhodopseudomonas sp. FO2 và
DQ4 cho các đánh giá tiếp theo.
3.3. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT COENZYME Q10 TỪ 2
CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP LỰA CHỌN
Với mục tiêu sản xuất sinh khối lớn cũng như tách chiết và tinh sạch
được một lượng lớn CoQ10 từ 2 chủng lựa chọn nhằm định hướng cho việc
ứng dụng thực phẩm chức năng, dựa vào các kết quả nghiên cứu tối ưu môi

50. 40
trường và điều kiện nuôi cấy, kết hợp với phương pháp tách chiết CoQ10 dựa
theo phương pháp của Paterson và Buddie (1991), chúng tôi đã xây dựng đã
phương pháp thu nhận CoQ10 từ 2 chủng Rhodopseudomonas sp. FO2 và
DQ4 như Hình 3.10.
Hình 3.10. Phương pháp thu nhận CoQ10 từ 2 chủng FO2 và DQ4
Chủng FO2, DQ4
Nuôi cấy
cấp giống để đạt 0D 800 = 0,1, môi trường DSMZ 27
cải tiến, nuôi ở điều kiện kị khí, 27-30 o
C, pH 6,5-7,
cường độ sáng 4000-5000 lux, thời gian LM 5 ngày
Thu sinh khối
Ly tâm 8000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4 o
C
Phá vỡ tế bào
Trộn sinh khối: hh methanol và n-hexan (3:2) =1:10
Tách chiết
Thu dịch trên n-hexan
Lắc vontex 20-30 phút, ly tâm 8000
vòng/phút, trong 10 phút ở 4o
C
Cô đặc chân không 40o
C, hòa tan
vào 2,5 ml dung môi n –hexan
Dịch thô chứa
CoQ10

51. 41
Thuyết minh phương pháp:
Bước 1. Nuôi cấy: 2 chủng lần lượt được nuôi trong bình thủy tinh 100
ml có chứa môi trường DSMZ27 không có muối, với điều kiện nuôi cấy ở 27-
30 o
C, pH đầu 6,5-7, cấp giống 5-10 % để mật độ nuôi cấy ban đầu OD800
đạt khoảng 0,1. Thời gian nuôi cấy 2 chủng giống trong 5 ngày.
Bước 2. Ly tâm: Sinh khối được thu từ dịch nuôi cấy bằng cách ly tâm
tốc độ 8000 vòng/phút, trong 10 phút ở nhiệt độ 5 o
C
Bước 3. Phá vỡ tế bào: Cân lấy 2,5 g sinh khối sau đó cho thêm 25 ml
hỗn hợp methanol: n-hexan với tỉ lệ 3:2 vào ống falcol 50 ml. Lắc vontex
trong vòng 20-30 phút. Tiến hành ly tâm thu dịch tốc độ 8000 vòng/phút,
trong 10 phút ở 4 o
C
Bước 4. Tách chiết CoQ10: Sau khi tâm thu dịch tốc độ 8000
vòng/phút, trong 10 phút ở 4 o
C. Tiến hành chiết thu lấy dịch ở pha trên.
Bước 5. Cô đặc: Sau khi thu được dịch ở pha trên trên tiến hành cô đặc
chân không với áp suất 260 mbar nhiệt độ 40 o
C. Thu được cặn khô có chứa
CoQ10.
Bước 6. Phân tích hàm lượng CoQ10: Cặn thô được hòa tan vào 2,5
ml dung môi n –hexan được gọi là dịch thô chứa CoQ10. Dịch thô thu được từ
sinh khối các chủng VKTQH được xác định hàm lượng CoQ10 bằng phương
pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) với các điều kiện: sử dụng cột Hypersil C18
(200 x 4 mm); tỷ lệ pha động Me-OH: H2O = 70: 30 (v/v); tốc độ dòng chảy
0,5 ml/phút và áp suất là 220 bar. CoQ10 chuẩn (hãng Sigma) được sử dụng
xây dựng đường chuẩn. Dựa vào đường chuẩn, thời gian lưu và chiều cao pick
của từng mẫu suy ra hàm lượng CoQ10 do các chủng tương ứng tạo thành.
Sau khi tìm được điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp cho
Rhodopseudomonas sp. FO2 và DQ4 là môi trường DSMZ 27 cải tiến (bổ sung
thêm pepton hàm lượng 1 g/l môi trường), các chủng này được nhân nuôi, tiến
hành tách chiết CoQ10 theo quy trình ở Hình 3.10 và được so sánh với hàm
lượng CoQ10 của hai chủng thu được khi nuôi ở môi trường DSMZ 27 sau 5

52. 42
ngày nuôi cấy. Kết quả đánh giá hàm lượng CoQ10 của các chủng được thể
hiện ở Bảng 3.3 sau.
Bảng 3.3.Hàm lượng CoQ10 của các chủng VKTQH tích lũy trên môi
trường nuôi cấy khác nhau
STT Kí hiệu
chủng
Hàm lượng CoQ10
(mg/g sinh khối tươi)
Hàm lượng
CoQ10
thay đổi
(%)
Môi trường
DSMZ 27
Môi trường
DSMZ 27 cải tiến
1 FO2 5,67 7,24 27,69
2 DQ4 6,06 7,79 28,55
Từ số liệu ở Bảng 3.3 cho thấy, sau khi nuôi cấy 5 ngày trên môi
trường phù hợp (DSMZ 27 cải tiến) kết hợp với các điều kiện nuôi cấy tối ưu,
cả 2 chủng VKTQH lựa chọn đều có khả năng tích lũy CoQ10 cao hơn so với
môi trường cũ. Hàm lượng CoQ10 của chủng FO2 và DQ4 được nuôi trong
môi trường tối ưu tăng lần lượt 27,69 và 28,55 % so với môi trường nuôi
DSMZ 27. Ở môi trường cải tiến, hàm lượng CoQ10 được tích lũy từ 2 chủng
chủng Rhodopseudomonas sp. FO2, Rhodopseudomonas sp. DQ4 lần lượt là
7,24 và 7,79 mg/g sinh khối tươi.
Bằng các phương pháp tách chiết CoQ10 từ dịch lên men, Jeya và
cộng sự, 2010 đã công bố chủng Agrobacterium tumefaciens ATCC4452 và
chủng Pseudomonas sp. N84 có khả năng tổng hợp CoQ10 lần lượt là 87,6
mg/l và 2,02 mg/l; chủng Paracoccus denitrificans ATCC 19367 tổng hợp
được 27,6 mg/l và chủng Rhodobacter sphaeroides FERM-P4675 tổng hợp
được 97,2 mg/l CoQ10 [27]. Như vậy, trong các nhóm vi khuẩn có khả năng
tổng hợp CoQ10 đã được công bố thì nhóm VKTQH có ưu thế trong việc sản
xuất CoQ10 vì tế bào của chúng chứa hàm lượng chất này cao hơn so với các
vi sinh vật khác. Bên cạnh đó, nhóm vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng
linh hoạt trong các điều kiện khác nhau (kể cả điều kiện khắc nghiệt) do vậy

53. 43
tiềm năng cho việc sản xuất CoQ10 từ nhóm vi khuẩn này là khá cao. Phương
pháp tách chiết CoQ10 từ vi sinh vật của các nghiên cứu trên đều sử dụng
phương pháp tách chiết: phá vỡ tế bào sau đó chiết bằng n-hexan. Đây là
phương pháp đơn giản, phù hợp ở quy mô công nghiệp
Tại Việt Nam, tính tới nay chưa thấy có sản phẩm CoQ10 được sản
xuất từ các chủng vi sinh vật nội địa ở dạng tự nhiên, tuy nhiên cũng đã có
một nghiên cứu trên một số đối tượng cụ thể. Ha và cộng sự (2007) sản xuất
CoQ10 trên chủng đột biến Agrobacterium tumefaciens KCCM 10413 đã đạt
9,05 mg/g sinh khối khô [38], Kiên và cộng sự (2010) đã thu được CoQ10 với
hàm lượng 6,34 mg/g sinh khối khô trên chủng đột biến Rhodobacter
sphaeroides KACC 91339P khi nuôi cấy ở điều kiện lên men hiếu khí, không
chiếu sáng [77]. Năm 2010, Trần Thị Lệ Quyên và Đào Thị Lương đã phân
lập được chủng nấm men Rhodosporidium paludigenum PL5-2 có khả năng
tổng hợp hàm lượng CoQ10 là 3,1 mg/g sinh khối khô [78]. Năm 2014, Lê
Thị Thanh Thảo và cộng sự đã chiết thành công CoQ10 từ 3 chủng VKTQH
ký hiệu là PN16, PN21 và PN31 thuộc loài Rhodopseudomonas palustris với
hàm lượng lần lượt là: 348,8 µg/g, 385,3 µg/g và 399,8 µg/g sinh khối tươi
[71].
Như vậy có thể thấy rằng, ngoài các ứng dụng để xử lý nước thải với
hàm lượng chất hữu cơ cao [71]; phân hủy các hydrocarbon mạch vòng [71,
79] thì nhóm VKTQH còn mở ra hướng ứng dụng tách chiết các hợp chất có
hoạt chất sinh học từ các chủng VKTQH ở dạng tự nhiên góp phần nâng cao
vai trò của nhóm vi khuẩn này không chỉ trong lĩnh vực xử lý môi trường mà
còn ứng dụng được trong lĩnh vực y dược học.

54. 44
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
- Từ 06 chủng VKTQH đã sàng lọc được chủng FO2 và DQ4 có khả
năng sinh trưởng trên môi trường DSMZ 27 và khả năng tích lũy CoQ10 cao
đạt lần lượt là 5,67 mg/g và 6,06 mg/g sinh khối tươi. Bằng các phương pháp
đánh giá về hình thái tế bào, các đặc tính về sinh lý sinh hóa và phân tích trình
tự đoạn gen 16S rRNA của 2 hai chủng FO2 và DQ4 được đặt tên lần lượt là
Rhodopseudomonas sp. FO2 và Rhodopseudomonas sp. DQ4. Trình tự đoạn
gen đã được đăng ký trên ngân hàng gen của Nhật Bản (DDBJ) với mã số là
LC318129 và LC318128.
- Điều kiện thích hợp nuôi cấy 2 chủng Rhodopseudomonas sp. FO2 và
Rhodopseudomonas sp. DQ4: môi trường DSMZ 27 cải tiến có nguồn nito
thay thế là pepton với hàm lượng 1 g/l môi trường, không có bổ sung muối
(NaCl 0 %), pH đầu từ 6,5 đến 7; các chủng được nuôi ở nhiệt độ từ 27 đến
30 o
C và cường độ ánh sáng từ 4000-5000 lux.
- Phương pháp tách chiết CoQ10 từ Rhodopseudomonas sp. FO2 và
Rhodopseudomonas sp. DQ4 được nuôi cấy trong môi trưởng DSMZ cải tiến
thu được hàm lượng CoQ10 của chủng Rhodopseudomonas sp. FO2 và
Rhodopseudomonas sp. DQ4 cao hơn so với môi trường DSMZ 27 lần lượt là
27,69 và 28,55 %; hàm lượng CoQ10 của 2 chủng Rhodopseudomonas sp.
FO2 và DQ4 lần lượt là 7,24 và 7,79 mg/g sinh khối tươi.
4.2. KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục nghiên cứu và đánh giá khả năng tích lũy CoQ10 của các
chủng vi khuẩn tía quang hợp khác và xây dựng quy trình tách chiết theo quy
mô công nghiệp.
- Nghiên cứu sử dụng sinh khối CoQ10 từ Rhodopseudomonas sp. FO2
và Rhodopseudomonas sp. DQ4 để tạo ra một số thực phẩm chức năng giàu
CoQ10 và đánh giá tác dụng hoạt tính sinh học của chúng.