Tạo Thể Lai Mang Gen Kháng Bệnh Mốc Sương Bằng Dung Hợp Tế Bào Trần Giữa Khoai Tây Dại Và Khoai Tây Trồng, các bạn tham khảo thêm tại tài liệu, bài mẫu điểm cao tại luanvantot.com

1. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
HOÀNG THỊ GIANG
TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG
BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA KHOAI TÂY DẠI
VÀ KHOAI TÂY TRỒNG
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

2. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
HOÀNG THỊ GIANG
TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC
SƢƠNG BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN
GIỮA KHOAI TÂY DẠI VÀ KHOAI TÂY TRỒNG
Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số: 62 62 01 11
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Nguyễn Quang Thạch
2. TS. Ramona Thieme
HÀ NỘI – 2016

3. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng để bảo
vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám
ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày… tháng… năm…
Tác giả luận án
Hoàng Thị Giang
i

4. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận đƣợc
sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,
đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết
ơn sâu sắc tới GS.TS. Nguyễn Quang Thạch – Viện Sinh học Nông nghiệp – Học Viện
Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian, tâm
huyết và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Ramona Thieme, TS. Thilo
Hammann – Viện Nghiên cứu Chọn tạo Giống Cây trồng (Viện JKI)- CHLB Đức, là
những ngƣời thầy đã tận tình luôn tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian và công sức
và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn Di truyền và Chọn giống cây trồng, Khoa Nông học- Học viện Nông nghiệp Việt Nam
đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Viện Sinh học Nông
nghiệp, đặc biệt là các cán bộ Phòng Sinh học phân tử & Công nghệ vi sinh đã giúp đỡ
và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./.
Hà Nội, ngày... tháng... năm 20...
Nghiên cứu sinh
Hoàng Thị Giang
ii

5. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
MỤC LỤC
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục chữ viết tắt vi
Danh mục bảng vii
Danh mục hình ix
Trích yếu luận án xi
Thesis abstract xiii
PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1
1.2 Mục tiêu của đề tài 3
1.3 Phạm vi nghiên cứu 3
1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3
1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam 5
2.2 Nguồn gen khoai tây dại và tình hình khai khác nguồn gen khoai tây dại 7
2.2.1 Vai trò của nguồn gen kháng bệnh trên cây khoai tây 7
2.2.2 Tình hình khai thác nguồn gen kháng bệnh trong chọn tạo giống khoai tây 8
2.3 Cơ sở khoa học của phƣơng pháp dung hợp tế bào trần 10
2.3.1 Tách tế bào trần 10
2.3.2 Nuôi cấy tế bào trần 11
2.3.3 Tái sinh tế bào trần 12
2.3.4 Dung hợp tế bào trần 13
2.3.5 Chọn lọc các con lai soma 14
2.4 Bệnh mốc sƣơng trên cây khoai tây 15
2.4.1 Giới thiệu về bệnh mốc sƣơng 15
2.4.2 Đặc điểm xâm nhiễm của nấm P. infestans 17
2.4.3 Cơ sở phân tử của tính kháng bệnh mốc sƣơng do nấm P. infestans gây ra 18
iii

6. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
2.4.4 Các nghiên cứu về gen kháng bệnh mốc sƣơng trên cây khoai tây 20
2.5 Các phƣơng pháp chọn tạo giống khoai tây 23
2.5.1 Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp truyền thống 23
2.5.2 Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp chuyển gen 23
2.5.3 Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp dung hợp tế bào trần 24
PHẦN 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 30
3.1.1 Địa điểm nghiên cứu 30
3.1.2 Thời gian nghiên cứu 30
3.2 Vật liệu nghiên cứu 30
3.2.1 Vật liệu thực vật 30
3.2.2 Hóa chất 31
3.2.3 Thiết bị 32
3.3 Nội dung nghiên cứu 32
3.3.1 Nội dung 1: Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại
với các giống khoai tây trồng 32
3.3.2 Nội dung 2: Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp xác định
độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR 33
3.3.3 Nội dung 3: Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai
soma và các đặc tính nông sinh học 33
3.3.4 Nội dung 4: Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng
để tạo quần thể chọn lọc 34
3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 34
3.4.1 Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống
khoai tây trồng 34
3.4.2 Xác định con lai soma bằng đo độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị
phân tử SSR 38
3.4.3 Đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây
nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử 39
3.4.4 Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần
thể chọn lọc 43
3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 44
iv

7. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45
4.1 Kết quả 45
4.1.1 Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống
khoai tây trồng 45
4.1.2 Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây
trồng thu thập đƣợc 48
4.1.3 Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp 51
4.1.4 Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp đo độ bội (Flow
cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR 55
4.1.5 Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây
nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử 58
4.1.6 Nghiên cứu tạo con lai trở lại giữa các con lai soma với các giống khoai
tây trồng 73
4.2 Thảo luận 84
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91
5.1 Kết luận 91
5.2 Kiến nghị 92
Danh mục các công trình công bố 93
Tài liệu tham khảo 94
Phụ lục 104
v

8. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BA : 6-benzyl amino purine
BC : Backcross
CNSH : Công nghệ sinh học
CT : Công thức
CV : Coefficient of variation
DAS – ELISA : Double Antibody Sandwich –
Enzyme linked imunosorbent assay
DNA : Deoxyribonucleic acid
ELISA : Enzyme – linked imunosorbent assay
FAO : Food and Agriculture Organization
GA3 : Gibberellic Acid
IAA : Indole-3-acetic acid
JKI : Julius Kuehn Institute
KLCTB : Khối lƣợng củ trung bình
LSD : Least significant difference
MS : Murashige and Skoog
NAA : Naphthaleneacetic acid
NSLT : Năng suất lý thuyết
NSTT : Năng suất thực thu
OD : Optical density
PCR : Polymerase chain reaction
PEG : Polyethylene glycol
PVX : Potato virus X
PVY : Potato virus Y
RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA
SAS : Statistical Analysis Systems
SH : Somatic hybrid
SSR : Simple sequence repeat
Tm : Nhiệt độ gắn mồi
UV : Ultra violet
vi

9. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
DANH MỤC BẢNG
TT Tên bảng Trang
2.1 Năng suất và năng lƣợng của một số cây lƣơng thực ở các nƣớc đang
phát triển 5
2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới năm 2013 6
2.3 Tốp 10 quốc gia có sản lƣợng khoai tây lớn nhất thế giới 6
2.4 Diện tích, năng suất và sản lƣợng khoai tây của Việt Nam giai đoạn 2006
- 2013 7
2.5 Tổng kết về kết quả đánh giá tính kháng của các loài khoai tây dại chính
đối với một số loại sâu, bệnh hại trên cây khoai tây và chống chịu với các
điều kiện bất thuận của môi trƣờng 8
3.1 Các vật liệu đã thu thập, nguồn gốc, độ bội và các tính trạng mong muốn
phục vụ cho lai soma 31
3.2 Các mồi sử dụng để chọn lọc con lai 32
3.3 Các cặp mồi phát hiện gen kháng mốc sƣơng 32
4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ macerozym và cellulase trong dung dịch enzym
đến hiệu suất tách tế bào trần của các dòng/giống khoai tây thí nghiệm 45
4.2 Ảnh hƣởng của thời gian ủ của mô lá trong dung dịch enzym đến hiệu
suất tế bào trần thu đƣợc 47
4.3 Ảnh hƣởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lƣợng tế bào sau dung
hợp (Nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa Solanum bulbocastanum và Delikat) 48
4.4 Kết quả tái sinh và độ bội của các con lai tái sinh sau dung hợp ở các mật
độ tế bào dung hợp khác nhau (Nghiên cứu trên tổ hợp lai giữa Solanum
bulbocastanum và Delikat) 50
4.5 Kết quả dung hợp giữa các dòng khoai tây dại nhị bội với các giống
khoai tây trồng tứ bội bằng phƣơng pháp xung điện 51
4.6 Sự phân chia của các tổ hợp lai sau khi dung hợp trên các điều kiện môi
trƣờng khác nhau 52
4.7 Sự phân chia của các tổ hợp lai trên các môi trƣờng nuôi cấy khác nhau 53
vii

10. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
4.8 Ảnh hƣởng của môi trƣờng tái sinh khác nhau đến khả năng tạo chồi của
các tổ hợp lai 54
4.9 Kết quả nuôi cấy tái sinh chồi của các tổ hợp lai sau dung hợp 55
4.10 Kết quả tái sinh và phân tích độ bội thể của các tổ hợp lai sau dung hợp 56
4.11 Kết quả chọn lọc con lai soma bằng phân tích độ bội và chỉ thị phân tử SSR 58
4.12 Đặc điểm hình thái của nấm P. infestans trong quá trình nuôi cấy 59
4.13 Phản ứng của một số giống khoai tây với 2 mẫu mốc sƣơng thu thập từ
Hà Nội và Lạng Sơn 59
4.14 Kết quả đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma và
dòng bố mẹ bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời 61
4.15 Kết quả đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma và
dòng bố mẹ bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ (tuber slice test) 63
4.16 Kết quả đánh giá các con lai soma và các dòng bố mẹ về khả năng kháng
bệnh mốc sƣơng trên đồng ruộng và đánh giá sự thành thục của cây 64
4.17 Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học của các dòng/giống khoai
tây bố mẹ và con lai soma 68
4.18 Đánh giá các tính trạng trên củ của các con lai soma và các dòng bố mẹ 70
4.19 Kết quả lai lai trở lại giữa các con lai soma với giống khoai tây trồng làm bố 74
4.20 Đánh giá khả năng kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai BC1 ở giai
đoạn cây con 75
4.21-A Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học của các con lai BC. 78
4.21-B Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học của các con lai BC 79
4.22 Kết quả đánh giá năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của cá con
lai BC1 80
viii

11. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
DANH MỤC HÌNH
TT Tên hình Trang
3.1 Các loài khoai tây dại nhị bội đƣợc trồng trong nhà kính để phục vụ thí nghiệm 30
4.1 Hình ảnh tế bào trần của các dòng/giống khoai tây khác nhau với các
enzym phù hợp. 46
4.2 Chất lƣợng tế bào sau dung hợp ở các tần số và số lần xung khác nhau. 48
4.3 Các macrocallus tái sinh sau khi dung hợp 51
4.4 Sự phân chia của tổ hợp lai trn3G + Delikat trên các điều kiện môi
trƣờng khác nhau sau 4 ngày nuôi cấy 52
4.5 Khả năng tái sinh chồi của tổ hợp lai trn + Rasant sau 12 tuần trên môi
trƣờng khác nhau 55
4.6 Hình ảnh độ bội của dòng khoai tây bố mẹ và con lai 56
4.7 Kết quả phân tích SSR với chỉ thị phân tử STIIKA của tổ hợp lai trn 3G
+ cv.Rasant. 57
4.8 Kết quả phân tích SSR với chỉ thị phân tử STM2022 của tổ hợp lai trn
3G + cv.Rasant 57
4.9 Bọc động bào tử và cành bọc động bào tử của nấm mốc sƣơng 59
4.10 So sánh tính độc của 2 nguồn nấm bệnh phân lập từ Hà Nội và Lạng Sơn 60
4.11 Sự biểu hiện vết bệnh trên lá sau 6 ngày lây nhiễm 62
4.12 Sự biểu hiện tính kháng trên đồng ruộng của con lai soma blb2G +
Delikat (SH2283/5) 65
4.13- A Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 1/1’ 66
4.13-B Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu blb1 66
4.13-C Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu blb3 67
4.14 Các đặc tính hình thái, sinh trƣởng và đặc điểm ra hoa của các con lai
soma (2283/5/1; 2281/10, 2292/4, 2295/1) của tổ hợp lai blb2G (+)
Delikat so với các dòng/giống bố mẹ (Delikat, S.bulbocastanum) 71
4.15-A Các biến dị về hình thái, kiểu sinh trƣởng của các con lai soma trong
cùng một tổ hợp lai 72
4.15- B Các biến dị về dạng lá của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai 72
ix

12. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
4.15- C Các biến dị về dạng hoa của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai
Delikat (+) trn3G 73
4.15- D Các biến dị về dạng củ của các con lai soma trong cùng một tổ hợp lai
Rasant (+) trn3G 73
4.16 Một số tổ hợp lai backcross thành công 74
4.17 Cây con sau gieo hạt 10 ngày 75
4.18 Kết quả phân tích độ bội của các con lai BC1 76
4.19 Sự đa dạng kiểu hình của các con lai BC1 của tổ hợp lai Delikat + blb)
SH2283/5 x Delikat 83
4.20 Dạng củ của: A- Atlantic; B- pnt2G; C- con lai soma pnt2G (+) Atlantic;
D- BC1 của tổ hợp lai khoai tây của một số tổ hợp lai pnt2G (+) Atlantic
với giống khoai tây trồng Atlantic 83
x

13. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN
Tên tác giả: Hoàng Thị Giang
Tên Luận án: Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sƣơng bằng dung hợp tế bào
trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng
Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 62 62 01 11
Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt
Nam Mục đích nghiên cứu
Tạo đƣợc các con lai soma bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai tây dại
nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh mốc sƣơng
từ loài dại vào khoai tây trồng, sau đó lai trở lại (backcross) với khoai tây trồng nhằm
tạo đƣợc nguồn vật liệu di truyền khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng.
Phƣơng pháp nghiên cứu
- Vật liệu nghiên cứu: Các dòng khoai tây dại kháng bệnh mốc sƣơng (Solanum
bulbocastanum, S. tarnii, S. pinnatisectum thu thập từ Ngân hàng Gen khoai tây quốc tế
tại Đức (The Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, IPK,
Genebank); các giống khoai tây trồng mang các tính trạng nông sinh học quý thích nghi
với điều kiện khí hậu ở Việt Nam
- Nội dung và phương pháp nghiên cứu: (1) Tách và dung hợp tế bào trần giữa
các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng theo Morller et al. (1992) và đƣợc
cải tiến bởi Thieme et al. (1997, 2008); (2) xác định các con lai soma bằng các phƣơng
pháp đo độ bội (Flow cytometry) theo (Thieme et al., 2008) và bằng chỉ thị phân tử SSR
(theo Dinu and Thieme, 2001; Song et al., 2005); (3) đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc
sƣơng của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo (theo Darsow et al., 2004;
Hammann et al., 2009) và bằng chỉ thị phân tử (theo Wang et al., 2008 và Lokossou et
al., 2010); (4) lai trở lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần
thể chọn lọc
Kết quả chính
- Đã xác định đƣợc các thông số để dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại
mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch
enzym thích hợp cho từng dòng/giống; thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung
dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ; dung hợp ở thông
xi

14. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
số 800 kHz với 2 lần xung; mật độ tế bào thích hợp nhất để xung điện là từ 4x 105
tế
bào/ml đến 5x 105
tế bào/ml; môi trƣờng nuôi cấy các sản phẩm sau dung hợp là môi
trƣờng VKMII lỏng; môi trƣờng Cul-medium để tạo callus và môi trƣờng RJM để tái
sinh chồi.
- Đã lai thành công soma bằng dung hợp tế bào giữa khoai tây dại nhị bội (2x)
mang gen kháng bệnh mốc sƣơng (S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. tarnii) với
giống khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.). Các con lai soma của tổ hợp lai giữa
dòng khoai tây dại S. bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (2295/2, 2292/4,
2181/10 và 2283/5) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng Rpi-blb1 và Rpi-blb3 là nguồn
vật liệu kháng bệnh khoai tây có giá trị cho chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây
kháng bệnh của Việt Nam.
- Đã lai trở lại thành công giữa các con lai soma với khoai tây trồng tạo đƣợc 11
tổ hợp lai và chọn đƣợc 4 con lai từ tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat
(13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng
đồng thời có các đặc điểm nông sinh học phù hợp, đây là nguồn vật liệu có giá trị cho
chọn giống khoai tây kháng bệnh ở nƣớc ta.
xii

15. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
THESIS ABSTRACT
PhD candidate: Hoang Thi Giang
Thesis title: Study of interspecific somatic hybrids between wild potato species and
potato cultivars via protoplast fusion for selection of late blight resistant potato
Major: Genetics and Plant Breeding Code: 62 62 01 11
Educational organization: Vietnam National University of Agriculture
(VNUA) Research Objectives
The aims of this study was to produce interspecific somatic hybrids and then to
investigate the possibilities to incorporate late blight resistance from diploid wild potato
species into tetraploid potato cultivars. These hybrids and progenies could be promising
materials for breeding program of late blight resistant potato in Vietnam.
Materials and Methods
- Material: Late blight resistant wild-type potatoes (Solanum bulbocastanum, S.
tarnii, S. Pinnatisectum) that come from the Leibniz Institute of Plant Genetics and
Crop Plant Research, IPK, Genebank, Germany); cultivated potatoes with promising
agronomical traits in Vietnamese condition.
- Methods: Protoplast fusion was conducted between late blight resistant wild-
type potates (S. bulbocastanum, S. tarnii, S. pinnatisectum) and potato cultivars
(Solanum tuberosum L.). In the present study, protocols for protoplast isolation, fusion,
and culture according to Morller and Wenzel (1992) and modified by Thieme et al.
(1997, 2008) were used to obtain interspecific somatic hybrids. Flow cytometry (Dinu
and Thieme, 2001) and single sequence repeat methods (Song Ye-Su et al., 2005) were
ultilized to identify all the regenerated plants and selected interspecific somatic hybrids
which were hexaploid (2n=6x=72). These interspecific somatic hybrids were assessed
continuously resistance to late blight via detached leaflet assay, tuber slice test and field
test (Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009) and molecular markers to find the
presence of resistant genes Rpi-blb (Wang et al., 2008, Lokossou et al., 2010). In
addition, backcrossing (backcross-BC) between the somatic hybrids and the cultivated
potato varieties as the pollen donor to generate the BC1 progeny were conducted in the
present study.
xiii

16. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
Main findings and conclusions
In the present study 1612 calluses from seven different fusion combinations
were generated, of which 188 progeny plants were regenerated. Flow cytometry (Dinu
and Thieme, 2001) and single sequence repeat methods (Song Ye-Su et al., 2005) were
ultilized to identify all the regenerated plants and selected 69 interspecific somatic
hybrids which were hexaploid (2n=6x=72). These interspecific somatic hybrids were
assessed continuously resistance to late blight via detached leaflet assay, tuber slice test
and molecular markers to find the presence of resistant genes Rpi-blb. Only somatic
hybrid plants between S. bulbocastanum with Delikat exhibited resistance against late
blight disease. Futhermore, Rpi-blb1 and Rpi-blb3 genes, which belong to resistant-
related genes, Rpi-blb, were found in somatic hybrids of these combination. Moreover,
these BC1 also exposed many precious agronomical characteristics of cultivated
potatoes. These hybrids and progenies could be promising materials for breeding
program of late blight resistant potato in Vietnam.
xiv

17. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Khoai tây là một trong bốn cây lƣơng thực quan trọng của loài ngƣời.
Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển, khoai tây bị nhiều tác nhân gây bệnh
tấn công, ảnh hƣởng đáng kể tới năng suất. Trong các bệnh gây hại khoai tây,
bệnh mốc sƣơng do Phytophthora infestans (Mont.) de Bary gây ra đƣợc coi là
bệnh phổ biến và nguy hại nhất. Trong điều kiện thuận lợi bệnh có thể phát triển
nhanh thành dịch, phá hủy toàn bộ mùa màng trong vòng một đến hai tuần lễ.
Nhiều biện pháp đã đƣợc xây dựng và đề xuất để hạn chế tác hại của bệnh mốc
sƣơng nhƣ sử dụng giống kháng bệnh và đặc biệt sử dụng các loại thuốc hoá học
phòng chống bệnh mốc sƣơng. Trung tâm Khoai tây quốc tế (CIP) ƣớc lƣợng
hàng năm Mỹ, châu Âu và các nƣớc đang pháp triển phải chi khoảng 1 tỉ đôla
cho thuốc hóa học để kiểm soát bệnh mốc sƣơng (Anonymous, 1997). Việc sử
dụng biện pháp phòng chống bệnh hại bằng thuốc hóa học vừa gây ô nhiễm môi
trƣờng vừa tăng chi phí sản xuất (Darsow et al., 2008) nhƣng vẫn không giảm
thiệt hại hoàn toàn. Hơn nữa, nấm mốc sƣơng có tính di truyền khá linh động và
thích ứng cao nên dễ kháng các loại thuốc hóa học. Chọn giống kháng bệnh mốc
sƣơng đƣợc coi là một biện pháp hiệu quả, đặc biệt sau dịch bệnh mốc sƣơng
gây ra nạn đói ở Ái-nhĩ-lan giữa thế kỷ 19 (1845-1846) và các dịch bệnh xảy ra
vào nửa đầu thế kỷ 20 ở châu Âu.
Chọn giống khoai tây kháng bệnh vào đầu thế kỷ 20 (những năm 1950 và
1960) tập trung vào việc sử dụng các gen trội (R còn gọi là gen Rpi) chính kháng
mốc sƣơng từ loài hoang dại Solanum demissum và 11 gen R đƣợc chuyển vào
khoai tây. Mặc dù gen kháng chính có hiệu quả cao, nhƣng tính kháng ở các
giống mang gen kháng chính R nhanh chóng bị vƣợt qua vì nấm mốc sƣơng có
khả năng thích nghi với cây kháng rất nhanh (Fry, 2008; McDonald and Linde,
2002). Tuy nhiên, nhiều chiến lƣợc khác nhau đƣợc xem xét để sử dụng các gen
kháng nhằm tạo khả năng kháng đồng ruộng bền vững (Jones, 2001; Park et al.,
2009) và sử dụng các gen kháng từ nhiều loài hoang dại khác nhau. Các gen
kháng từ các nguồn khác nhau đƣợc tích tụ nhờ phƣơng pháp lai chuyển gen
truyền thống và sử dụng chị thị phân tử (Tan et al., 2008, 2010).
Các nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều loài khoai tây dại nhƣ Solanum
pinnatisectum (pnt2G), Solanum tarnii (trn3G), Solanum bulbocastanum (blb2G)
1

18. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
(Thieme et al., 2008; Szczerbakowa et al., 2005), Solanum cardiophyllum
(Thieme et al., 2010) mang nguồn gen kháng bệnh mốc sƣơng cao. Tuy nhiên,
rất khó để chuyển đặc tính kháng này qua con đƣờng lai hữu tính giữa các loài
hoang dại (2n = 2x = 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do cơ chế cách ly về
sinh sản (Jackson and Hanneman, 1999), cụ thể là sự khác biệt về số lƣợng
nhiễm sắc thể và số cân bằng nội nhũ (Borgato et al., 2007; Tiwari et al,, 2010).
Để khắc phục rào cản lai này nhà chọn giống có thể sử dụng kỹ thuật nhiễm sắc
thể, lai bắc cầu, thụ phấn mento, xử lý auxin và cứu phôi. Dung hợp tế bào trần
để tạo con lai, gọi là con lai soma, là một giải pháp để khắc phục rào cản lai xa
(Oberwalder et al., 2000; Wielgat and Wasilewska, 2001) và chuyển nhiều gen
kháng vào khoai tây trồng. Dung hợp tế bào trần hay lai soma có thể chuyển các
tính trạng đơn gen và đa gen từ các loài hoang dại vào khoai tây nhƣng vẫn bảo
toàn đƣợc hệ gen nhân và tế bào chất (Gavrilenko et al., 2003) và tạo ra nguồn
vật liệu đa dạng mang mức kháng bệnh cao (Mattheij et al., 1992; Thach et al.,
1993; Davey et al., 2005; Thieme et al., 2010).
Các nhà nghiên cứu đã thu nhận đƣợc nhiều con lai soma kháng mốc
sƣơng giữa khoai tây trồng với S. circaeifolium (Mattheij et al., 1992), S.
pinnatisectum (Thieme et al., 1997), S. bulbocastunum (Helgeson et al., 1998), S.
nigrum (Horsma et al., 2001), S. berthaultii (Bidani et al., 2007), S. tarnii
(Thieme et al., 2008) và S. cardiophyllum (Thieme et al., 2010). Một số con lai
soma giữa khoai tây với S. bulbocastunum (Helgeson et al., 1998), S. nigrum
(Horsman et al., 2001), S. tarnii (Thieme et al., 2004, 2008) đã đƣợc lai lại với
khoai tây trồng tạo vật liệu tiền chọn giống để khai thác trong các chƣơng trình
chọn giống.
Mặc dù quy trình lai soma ở thực vật, kể cả khoai tây đã đƣợc thiết lập,
phƣơng pháp phân lập tế bào trần và tái sinh cây đối với các loài hoang dại từ
Mexico chƣa đạt hiệu quả cao (Chen et al., 2006). Chen et al. (2006) cho rằng để
ứng dụng phƣơng pháp dung hợp tế bào trần hai tiêu chí phải thỏa mãn, đó là phải
phân lập đƣợc số lƣợng tế bào trần đủ lớn và chúng có khả năng nhân và tái sinh
thành cây mới. Nhìn chung, tế bào trần có thể phân lập dễ dàng từ mô lá thông qua
xử lý emzym. Song các điều kiện phân lập phụ thuộc vào kiểu gen, thay đổi mạnh
giữa các loài do sự khác nhau về thành phần của thành tế bào. Davis (1985) chỉ ra
rằng các điều kiện khác nhau ảnh hƣởng tới năng suất và khả năng tái sinh của tế
bào trần, do đó cần phải xác định pháp và điều kiện cụ thể cho từng loài.
2

19. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân lập tế bào trần từ ba loài
khoai tây hoang dại S. pinnatisectum, S. tarnii và S. bulbocastanum (pnt2G,
trn3G và blb2G) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và dung hợp với tế bào trần
từ các giống khoai tây trồng tứ bội Delikat, Atlantic, Agave và Rasant, mẫn cảm
với bệnh mốc sƣơng.
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Xác định đƣợc các thông số để tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào
trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội kháng bệnh mốc sƣơng và các giống
khoai tây trồng mẫn cảm với bệnh mốc sƣơng.
Tạo đƣợc các con lai soma bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai
tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh
mốc sƣơng từ loài dại vào khoai tây trồng.
Tạo đƣợc các con lai lại (backcross) giữa các con lai soma với các giống
khoai tây trồng tứ bội nhằm tạo đƣợc dòng vật liệu di truyền khoai tây mang gen
kháng và có đặc điểm nông sinh học phù hợp phục vụ phát triển giống khoai tây
kháng bệnh mốc sƣơng ở Việt Nam.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Trên cơ sở thu thập đƣợc nguồn vật liệu quý là các dòng khoai tây dại
mang nguồn gen kháng bệnh mốc sƣơng, đề tài tập trung nghiên cứu quy trình
tách, dung hợp tạo các thể lai soma cải thiện đƣợc khả năng kháng bệnh mốc
sƣơng đồng thời tổ hợp đƣợc những tính trạng quý từ khoai tây trồng. Trên nền
đa dạng di truyền đã tạo ra, đánh giá, chọn lọc các thể lai soma có khả năng
kháng bệnh mốc sƣơng và mang các đặc tính nông sinh học phù hợp.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Đã xác định đƣợc các thông số để dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại
mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung
dịch enzym thích hợp cho từng dòng/giống; thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá
trong dung dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ;
dung hợp ở thông số 800 kHz với 2 lần xung; mật độ tế bào thích hợp nhất để
xung điện là từ 4x 105
tế bào/ml đến 5x 105
tế bào/ml; môi trƣờng nuôi cấy các
sản phẩm sau dung hợp là môi trƣờng VKMII lỏng; môi trƣờng Cul-medium để
tạo callus và môi trƣờng RJM để tái sinh chồi.
Đã lai thành công soma bằng dung hợp tế bào giữa khoai tây dại nhị bội
3

20. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
(2x) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng (S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S.
tarnii) với giống khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) tứ bội (4x) mẫn cảm
với bệnh mốc sƣơng (Agave, Atlantic, Delikat, Quarta và Rasant) nhƣng có
năng suất và chất lƣợng tốt. Các con lai soma của tổ hợp lai giữa dòng khoai tây
dại S. bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (2295/2, 2292/4, 2181/10
và 2283/5) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng Rpi-blb1 và Rpi-blb3 là nguồn vật
liệu kháng bệnh khoai tây có giá trị cho chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây
kháng bệnh của Việt Nam.
Đã lai trở lại thành công giữa các con lai soma với khoai tây trồng tạo
đƣợc 11 tổ hợp lai và chọn đƣợc 4 con lai từ tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5
x Delikat (13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11) mang gen kháng bệnh
mốc sƣơng đồng thời có các đặc điểm nông sinh học phù hợp, đây là nguồn vật
liệu có giá trị cho chọn giống khoai tây kháng bệnh ở nƣớc ta.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
Đây là một nghiên cứu có tính khoa học chuyên sâu về di truyền chọn
giống cây trồng. Đề tài cũng là một bƣớc phát triển kỹ thuật cao của công nghệ tế
bào thực vật (kỹ thuật dung hợp tế bào trần) trong tạo giống khoai tây. Các kết
quả của đề tài có giá trị khoa học cả trong nƣớc và quốc tế. Đề tài đã góp phần
chứng minh khả năng chuyển đƣợc tính kháng bệnh mốc sƣơng từ các loài khoai
tây dại sang các giống khoai tây trồng thông qua dung hợp tế bào trần và ứng
dụng thành công kết quả này trong chọn tạo các giống khoai tây trồng kháng các
loại bệnh quan trọng.
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu đã chọn tạo đƣợc thành công 4 dòng con lai soma và khoai tây
trồng giống Delikat (blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat là các dòng 13.1303.2,
13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11 có khả năng kháng bệnh mốc sƣơng đồng thời
có đặc điểm nông sinh học phù hợp. Đây là nguồn vật liệu có giá trị cho chƣơng
trình chọn giống khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng ở Việt Nam.
4

21. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT KHOAI TÂY TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
Khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ sau đó mở rộng sang các nƣớc phát
triển. Theo các chuyên gia nhận định: Khoai tây chính là cây lƣơng thực của
tƣơng lai dành cho những nƣớc nghèo và nƣớc đang phát triển Khi giá lúa gạo
và lúa mỳ tăng lên, khoai tây trở thành lƣơng thực giàu dinh dƣỡng cho những
nƣớc đó với giá rất rẻ (FAO, 2006). Mặt khác Khoai tây là cây trồng tạo ra khối
lƣợng sinh học và năng lƣợng nhiều hơn bất kỳ một loại cây trồng lƣơng thực
nào (sau lúa gạo, ngô, lúa mỳ) trong thời gian ngắn trên cùng một đơn vị diện
tích (FAO, 2005). Theo Struik and Wiersema (1999), khoai tây là loại cây lƣơng
thực có hàm lƣợng chất khô, năng lƣợng cũng nhƣ hàm lƣợng dinh dƣỡng cao
gần gấp đôi so với lúa mỳ và gạo (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Năng suất và năng lƣợng của một số cây lƣơng thực
ở các nƣớc đang phát triển
Năng suất Hàm lƣợng chất Năng lƣợng Năng suất protein
tấn ha kh tấn ha (MJ/ha/ngày) (kg/ha/ngày)
Khoai tây 11,0 2,2 216 1,4
Lúa mỳ 1,5 1,3 135 1,3
Gạo 2,2 1,9 151 0,9
Nguồn: FAO (2005)
Do vậy, khoai tây chính là cây trồng giàu tiềm năng phát triển trong tƣơng
lai, với diện tích trồng ngày càng đƣợc mở rộng với năng suất, chất lƣợng ngày
càng tăng nhanh, nhất là ở các nƣớc đang phát triển và nƣớc chậm phát triển.
Theo số liệu tổng kết của FAOSTAT (2014), tổng diện tích trồng khoai
tây trên thế giới năm 2013 là 19.463.041 ha, trong đó khu vực Châu Á chiếm
51,68% tổng diện tích trồng khoai tây trên thế giới. Châu Âu là châu lục đứng
thứ 2 trên thế giới về diện tích trồng khoai tây (chiếm 29,42%). Châu Mỹ La tinh
có diện tích trồng khoai tây thấp nhất (chiếm 8,4%) (bảng 2.2).
Năng suất bình quân của thế giới là 18,9 tấn/ha trong đó châu Mỹ la Tinh
lại là châu lục có năng suất cao nhất (21,7 tấn/ha). Châu Âu cũng là châu lục có
năng suất bình quân cao hơn của thế giới (19,8 tấn/ha).
5

22. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
Bảng 2.2. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới năm 2013
Vùng lãnh thổ
Diện tích thu Sản lƣợng Năng suất trung
hoạch ha tấn ình tấn ha
Châu Á 10.058.568 180.460.442 17,9
Châu Âu 5.725.707 112.980.347 19,8
Mỹ Latinh 1.627.959 42.619.996 21,7
Châu Phi 2.005.331 30.198.747 15,1
Thế Giới 19.463.041 368.096.362 18,9
Việt Nam 23.007 313.383 13,6
Nguồn: FAOSTAT (2014)
Bảng 2.3. Tốp 10 quốc gia có sản lƣợng khoai tây lớn nhất thế giới 1000 tấn
STT Nƣớc Năm 2005 Năm 2009 Năm 2013
1 Trung Quốc 70.906,73 69.059,65 88.987,0
2 Ấn Độ 28.787,70 34.391,00 45.343,6
3 Liên bang Nga 37.279,82 31.133,96 30.199,13
4 Mỹ 19.222,70 19.569,11 -
5 Ukraine 19.462,40 19.666,10 22.258,6
6 Đức 11.624,20 11.617,50 9.669,7
7 Ba Lan 10.369,25 9.702,80 6.334,2
8 Belarus 8.184,95 7.124,98 5.913,7
9 Pháp 6.604,60 7.164,20 6.975,0
10 Hà Lan 6.777,00 7.181,00 6.334,2
Thế giới 325.099,74 329.556,91 368.096,36
Việt Nam 434,00 239,08 23,08
Chú thích: (-): Số liệu chƣa đƣợc cập nhật
Nguồn: FAOSTAT (2014)
Khuynh hƣớng chung của sản xuất khoai tây trên thế giới là: giảm dần ở
các nƣớc phát triển; tăng dần ở các nƣớc đang phát triển; tăng cƣờng tỷ lệ khoai
tây chế biến; tăng cƣờng chất lƣợng giống và cơ giới hóa sản xuất khoai tây và
khoai tây là cây đƣợc quan tâm trong thời đại khí hậu thay đổi.
Ở Việt Nam cùng với việc mở rộng diện tích trồng, năng suất cây khoai tây
tăng chậm qua các năm, tuy nhiên tới năm 2013 tuy diện tích có giảm nhƣng năng
suất có chiều hƣớng tăng lên (theo FAOSTAT, 2014). Theo thời gian, cây khoai tây
đã và đang khẳng định vị trí của mình, dần trở thành cây trồng quan trọng trong cơ
6

23. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
cấu nông nghiệp của nƣớc ta. Thực tế cho thấy là tiềm năng năng suất của khoai tây
ở đồng bằng sông Hồng có thể đạt 40 tấn/ha, trong đó năng suất đƣợc nông dân
chấp nhận và mong muốn phát triển 15 - 30 tấn/ha. Thế nhƣng năng suất bình
quân thực tế của chúng ta mới chỉ đạt 13,6 tấn/ha.
Bảng 2.4. Diện tích, năng suất và sản lƣợng khoai tây của Việt Nam
giai đoạn 2006 - 2013
Chỉ tiêu Diện tích Sản lƣợng Năng suất
Năm (ha) tấn tấn ha
2006 35000 370000 10,57
2007 36000 372000 10,33
2008 36000 380000 10,56
2009 37000 388000 10,49
2010 37100 446200 12,03
2013 23077 313383 13,60
Nguồn: FAOSTAT (2014)
Vấn đề khó khăn nhất hiện nay đối với ngành sản xuất khoai tây đó là
giống, đặc biệt là các giống khoai tây sạch bệnh. Hiện giống khoai tây ở trong
nƣớc mới chỉ đáp ứng từ 20-25% nhu cầu, số còn lại phải nhập khẩu từ Trung
Quốc, Hà Lan…
2.2. NGUỒN GEN KHOAI TÂY DẠI VÀ TÌNH HÌNH KHAI KHÁC
NGUỒN GEN KHOAI TÂY DẠI
2.2.1. Vai trò của nguồn gen kháng ệnh trên cây khoai tây
Giống nhƣ tất cả các cây trồng, khoai tây rất nhạy cảm với các loài sâu
bệnh. Một thực tế là đối với nền nông nghiệp hiện đại thƣờng sử dụng một vài
giống tƣơng đối đồng nhất trên một diện tích rộng lớn. Do vậy, nếu nhƣ một loại
sâu bệnh tấn công trên một cây thì sẽ dễ dàng lây lan nhanh chóng sang những
cây khác trên cả một cánh đồng, một vùng hay thậm chí bùng nổ thành dịch bệnh
nguy hiểm cho cả một quốc gia. Trong khi đó, đối với việc canh tác truyền thống,
nơi có rất nhiều các dòng/giống khác nhau đƣợc trồng chung trên một diện tích
đất thì sâu bệnh khó mà tấn công và bùng nổ thành dịch do đặc tính đa dạng di
truyền. Thậm chí một nhóm giống cây trồng trồng nào đó hay một nhóm chủng
vi sinh vật trong đất lại mang các gen hữu ích có thể bảo vệ đƣợc cây trồng khỏi
bị tấn công bởi các loài sâu bệnh hại. Nhiều cây trồng có thể bị biến mất do
không có hệ thống gen kháng lại sâu bệnh hại (Hawkes, 1990).
7

24. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
Trong suốt cả một thời gian dài, chúng ta đã phải dùng thuốc hóa học để
kiểm soát đƣợc sâu bệnh hại. Tuy nhiên chi phí cho việc dùng thuốc hóa học thì rất
đắt đỏ và rất khó khăn đối với những ngƣời nông dân nghèo trong một thế giới phát
triển. Các nhà chọn tạo giống cây trồng đã hết sức cố gắng trong việc đƣa nguồn gen
kháng vào nhiều cây trồng. Điều này góp phần đáng kể vào việc giảm thiểu ô nhiễm
môi trƣờng do sử dụng thuốc hóa học. Ngay từ những năm 30, 40 của thế kỷ trƣớc,
các nhà chọn tạo giống đã nhận ra rằng rất cần thiết phải đƣa các nguồn đa dạng di
truyền từ các loài khoai tây dại vào khoai tây trồng để chuyển đƣợc tính kháng với
các loại sâu, bệnh hại cũng nhƣ chống chịu đƣợc với các điều kiện bất thuận của
môi trƣờng nhƣ chịu lạnh, chịu hạn, chịu nóng... (Hawkes, 1990).
2.2.2. Tình hình khai thác nguồn gen kháng ệnh trong chọn tạo giống khoai tây
Có rất nhiều các loài dại đã đƣợc phát hiện mang các đặc tính kháng sâu
bệnh và chống chịu với các điều kiện bất thuận đã đƣợc phát hiện và khai thác
vào nguồn gen khoai tây trồng.
Bảng 2.5. Tổng kết về kết quả đánh giá tính kháng của các loài khoai tây dại
chính đối với một số loại sâu, ệnh hại trên cây khoai tây và chống chịu
với các điều kiện ất thuận của m i trƣờng
STT Đối tƣợng kháng Tên loài dại
I. KHÁNG NẤM
1 Phytophthora infestans Solanum demisssum, S. bulbocastanum, S. polyadenim,
(Bệnh mốc sƣơng) S. pinnatisecstum, S. stoloniferum, S. verrucosum,
S. tuberosum subsp. andigena, S. phureja,
S. microdontum, S. berthaultii, S. tarrijense,
S. circaeifolium, S. vernei.
2 Synchytrium endobioticum S. sparsipilum, S. acaule, S. Spegazzinii
(bệnh ung thƣ)
3 Stretomyces scabies (Bệnh S. chacoense, S. commersonii,
ghẻ) S. yungasense và một số loài khoai tây trồng khác
II. KHÁNG KHUẨN
4 Raltonia solanacearum Smith S. chacoense, S. phureja, S. stenotonum, S.
(Bệnh héo xanh vi khuẩn) microdontum
5 Erwinia carotovara (Bệnh S. bulbocastanum, S. chacoense,
thối nhũn) S. demissum, S. hjertingii, S. leptophyes, S.
microdotum, S. megistacrolobum, S. phureja, S.
pinatisectum, S. tuberosum subsp. andigena,...
8

25. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
STT Đối tƣợng kháng Tên loài dại
III. KHÁNG VIRUS
6 Potato virus X S. acaule, S. chacoense, S. curtilobum, S. phureja, S.
(Bệnh virus PVX) sucrense, S. tarijense,
S. sparsipilum, S. tuberosum subsp. andigena,...
7 Potato virus Y S. chacoense, S. stoloniferum, S. phureja, S. demissum,
(Bệnh virus PVY) S. tuberosum subsp. Andigena
8 Potato leaf roll virus (Bệnh S. brevidens, S. etuberosum, S. acaule, S.
virus PLRV) raphanifonium
9 Spindle tuber viroid S. acaule, S. berthaultii,
S. guerreroense
IV. KHÁNG SÂU
10 Leptinotarsa decemlineata S. chacoense, S. demissum, S. commersonii, S.
(Bọ cánh cứng) berthaultii, S. tarijense, S. Polyadenium
11 Myzus persicae, S. berthaultii, S. stoloniferum, S. multidissectum,
Macrosiphum euphorbiae S. medians, S. marinasense, S. lignicaule,
(rệp) S. infunundibuliforme, S. chomatophilum,
V. KHÁNG TUYẾN TRÙNG
12 Globodera rostochiensis, G. S. acaule, S. spegazzinii, S. vernei, S. gourlayi, S.
Pallida capsicibaccatum, S. boliviense, S. bulbocastanum, S.
(Bệnh tuyến trùng nốt sần) cardiophylum, S. oplocense, S. sparsipilum, S. sucrense
13 Meloidogyne incognita S. chacoense, S. microdontum, S. phureja, S.
(bệnh tuyến trùng trên rễ) sparsipilum, S. tuberosum subsp. andigena, S.
Curtilobum
VI. CÁC ĐẶC TÍNH SINH LÝ
14 Chịu sƣơng giá S. cacaule, S. ajanhuiri, S. brachistotrichum, S.
(Frost) brevicaule, S. brevidens, S. canasense, S.
chomatophilum, S. commersonii, S. curtilobum, S.
demissum, S. juzepczukii,
15 Chịu nhiệt và hạn (Heat, S. acaule, S. bulbocastanum, S. chacoense,
drought) S. megistacrolobum, S. microdontum, S. papita,
S. pinnatisectum, S. Tarijiense
16 Sự hóa đen ở củ S. hjertingii
(Lack of tuber blackening
Nguồn: Hawkes (1990)
Ross (1986) đã chỉ ra rằng có 6 loài khoai tây dại đƣợc khai thác cho các
giống khoai tây trồng của Châu Âu bao gồm: S. demissum (kháng mốc sƣơng,
9

26. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
PLRV), S. acaule (Kháng PVX, PLRV, PSTV, wart, Globoder và chịu sƣơng
giá), S. stoloniferum (Kháng PVA, PVY), S. chacoense (Kháng PVA, PVY, mốc
sƣơng, Colorado beetle, bọ nhậy), S. spegazzinii (kháng Fusarium, wart,
Globodera), S. vernei (kháng GloboderaI, có hàm lƣợng tinh bột cao). Theo thời
gian, nguồn gen kháng từ các loài khoai tây dại đã đƣợc khai thác và chuyển vào
nguồn gen khoai tây trồng. Bảng 2.5 cho biết một số tính kháng đã đƣợc phát
hiện ở các loài khoai tây dại.
2.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƢƠNG PHÁP DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN
Một trong những lĩnh vực quan trọng nhất cho sự phát triển công nghệ
nuôi cấy mô tế bào thực vật đã đƣợc chứng minh là công nghệ tách, nuôi cấy và
dung hợp tế bào trần. Cocking et al. (1960) đã chứng minh đƣợc rằng có thể sử
dụng enzym để phân giải thành tế bào thực vật một cách dễ dàng, điều này có ý
nghĩa vô vùng to lớn đối với di truyền học tế bào thực vật bậc cao. Nuôi cấy tế
bào trần đƣợc áp dụng không chỉ cho dung hợp tế bào trần mà còn cho kỹ thuật
ADN ngoại lai, cơ quan tử, vi khuản và virus. Do đó, kỹ thuật tách, nuôi cấy tế
bào trần đã trở thành một lĩnh vực nghiên cứu rất quan trọng trong công nghệ
sinh học thực vật. Những khâu quan trọng của kỹ thuật này bao gồm: tách, nuôi
cấy và tái sinh tế bào trần; dung hợp tế bào trần; chọn lọc các thể lai soma.
2.3.1. Tách tế ào trần
Tế bào trần (protoplast) là phần của tế bào nằm trong thành tế bào, có khả
năng co nguyên sinh và có thể đƣợc tách rời khỏi thành tế bào bằng phƣơng
pháp cơ học hoặc emzym. Tế bào trần đƣợc bao bọc bởi màng nguyên sinh, nó
có thể tái tạo lại thành tế bào mới và phân chia. Tế bào trần có thể tách từ mô
hoặc từ các cơ quan thực vật nhƣ lá, rế, hạt phấn hoặc mô sẹo (callus).
Vào những năm 60 của thế kỷ XX, Cooking đã sử dụng một enzyme để
phân giải thành tế bào và kết quả là tạo ra các tế bào trần chóp rễ của cây cà chua.
Quy trình này cũng đƣợc áp dụng thành công trên nhiều đối tƣợng thực vật khác,
rất dễ sử dụng và đạt hiệu quả cao.
Để tách đƣợc tế bào trần ngƣời ta có thể sử dụng hai phƣơng pháp tách
cơ học và tách bằng enzyme. Tách cơ học là làm cho tế bào trần ở trạng thái co
nguyên sinh sau đó tác động cơ học để giải phóng tế bào trần. Tuy nhiên phƣơng
pháp này có nhiều mặt hạn chế: chỉ áp dụng trên một vài đối tƣợng thực vật; mật
độ tế bào trần thu đƣợc không cao; khả năng tái sinh yếu. Phƣơng pháp tách tế
10

27. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
bào trần bằng enzyme đã khắc phục đƣợc những nhƣợc điểm trên. Hiện nay,
phƣơng pháp enzyme đƣợc sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao.
2.3.2. Nu i cấy tế ào trần
Các phƣơng pháp nuôi cấy nói chung đã đƣợc nhiều tác giả công bố trong đó
có phƣơng pháp nuôi cấy dịch huyền phù và giọt. Tế bào trần đƣợc hòa lơ lửng
trong môi trƣờng lỏng ở mật độ khoảng 105
tế bào trần/ml trong hộp chứa một lớp
mỏng môi trƣờng và nuôi cấy trong điều kiện tĩnh. Quá trình nuôi cấy giọt đã đƣợc
phát triển bởi Kao et al. (1974). Theo phƣơng pháp này các tác giả đã đặt một giọt
(khoảng 50µl) dịch huyền phù tế bào trần (với mật độ 104
- 105
tế bào trần /ml trong
đĩa petri nhựa, quấn paraphin và nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu.
Một phƣơng pháp khác cũng đƣợc sử dụng là nuôi cấy trong thạch. Một
thể tích dịch huyền phù có tế bào trần đƣợc trộn với một thể tích tƣơng đƣơng
của thạch (1-2%) và giữa ở trong 450
C trong bể ấm trong một thời gian nhất
định, sau đó lấy 5ml hỗn hợp này đổ vào hộp lồng, quấn paraphin xung quanh và
tiến hành nuôi cấy (Nagata et al., 1971)
Bên cạnh các phƣơng pháp đã nêu trên ngƣời ta còn sử dụng một số các
phƣơng pháp nuôi cấy tế bào trần khác nhƣ nuôi cấy trong buồng vi nuôi cấy
hay nuôi cấy hỗ trợ.
Kao et al. (1975) đã cải tiến môi trƣờng cơ bản để nuôi cấy tế bào trần
đơn dòng của loài Vicia hajastana cho nhiều loài khác để tái sinh tế bào trần.
Thông thƣờng môi trƣờng nuôi tế bào trần chứa 3-5% sucrose nhƣng với một
vài loài (nhu thuốc lá) trong môi trƣờng lƣợng đƣờng thấp hơn 1%. Vitamin
cũng đƣợc sử dụng cho môi trƣờng nuôi tế bào trần tƣơng tự nhƣ trong môi
trƣờng cơ bản. Cả hai chất điều tiết sinh trƣởng (auxin và cytokinin) cũng đƣợc
sử dụng trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào trần ở những tỷ lệ khác nhau, ảnh
hƣởng đến sự tái tạo thành tế bào và sự phân chia của tế bào trần. Nguồn auxin
ảnh hƣởng đến khả năng hình thành callus từ tế bào trần (2,4D, α-NAA hay
IAA). Cytokinin thƣờng đƣợc sử dụng là BA, Kinetin, 2-Pi hay zeatin. Tỷ lệ
auxin/cytokinin trong môi trƣờng của mỗi loài khác nhau để kích thích sự phân
chia hình thành callus của các tế bào trần.
Duy trì áp suất thẩm thấu cho môi trƣờng nuôi cấy là yếu tố cần thiết cho
sự ổn định, khả năng sống và sự phát triển tiếp theo của tế bào trần. Trong quá
trình tách, nuôi cấy tế bào trần đều phụ thuộc vào sự ổn định của áp suất thẩm
11

28. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
thấu, nó sẽ hạn chế sự vỡ tế bào cho đến khi tái tạo thành tế bào. Áp suất thẩm
thấu trong môi trƣờng nuôi cũng quan trọng nhƣ trong dung dịch enzym bao
gồm sorbitol, manitol, glucose hay sucrose. Với tế bào trần của các cây họ ngũ
cốc, đậu thì cả sorbitol và manitol đƣợc chứng minh là thích hợp tạo áp suất
thẩm thấu ổn định, còn với tế bào trần của các cây khoai tây, đậu hoa, dứa và sắn
thì sucrose là tốt hơn glucose hay manitol, còn với tế bào trần của thuốc lá thì cả
galactose và fructose đều đƣợc sử dụng để tạo áp suất thẩm thấu. Áp suất thẩm
thấu của môi trƣờng nuôi dần đƣợc giảm bởi việc thêm định kỳ vài giọt môi
trƣờng mới để các tế bào trần tái tạo thành và phân chia tạo callus.
2.3.3. Tái sinh tế ào trần
Các tế bào trần sau khi nuôi cấy thƣờng có biểu hiện tăng thể tích tế bào
chất, tăng kích thƣớc và phát sinh hầu hết các cơ quan tử (chủ yếu là lục lạp) tụ
thành đám quanh nhân (có thể quan sát rõ trên kính hiển vi). Tỷ lệ tái tạo và độ
thành thục của thành tế bào trong quá trình nuôi cấy phụ thuộc vào các yếu tố:
giai đoạn phân hóa của tế bào trần, điều kiện tách tế bào trần và tính đặc thù của
loài thực vật. Quá trình tái tạo thành tế bào diễn ra ngay vài giờ sau khi tách và
có thể hoàn thiện sau 2-7 ngày. Sau khi thành tế bào đƣợc tái tạo hoàn chỉnh, tế
bào trần không còn giữ nguyên hình dạng nhƣ ban đầu.
Sự phân chia diễn ra liên tục và tạo thành các cụm đa bào gọi là
microcallus (những cụm đa bào này là kết quả của sự tái tạo thành và sự phân
chia tế bào). Sự phân chia tiếp tục xảy ra sau 1-3 tuần nuôi cấy và bắt đầu hình
thành microcallus. Sau đó các microcallus đƣợc chuyển sang môi trƣờng không
có áp suất thẩm thấu cao (môi trƣờng cứng) đê tạo thành macrocallus. Các
macrocallus khi đƣợc chuyển sang môi trƣờng định hƣớng phân hóa có thể tiếp
tục phát sinh thành cơ quan phân hóa nhƣ chồi, rễ, lá.. hay tái sinh thành cây
hoàn chỉnh. Quá trình phân chia của tế bào trần để hình thành callus phụ thuộc
vào loại, nồng độ và tỷ lệ auxin/cytokinin bổ sung vào môit rƣờng nuôi cấy
(Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009).
Các tế bào trần đƣợc nuôi cấy trong đĩa petri nhỏ ( 3,5cm hoặc 5cm)
với môi trƣờng lỏng phù hợp trong điều kiện tối 250
C. Sau 3-4 tuần có thể thấy
các microcallus xuất hiện. Các microcallus này sẽ đƣợc cấy chuyển sang đĩa petri
lớn ( 9cm) chứa môi trƣờng cứng Cul-medium (Haberlach et al., 1985). Các đĩa
petri này đƣợc đặt trong phòng nuôi với quang chu kỳ là 16h chiếu sáng/ngày,
nhiệt độ là 220
C.
12

29. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
Sau 3-8 tuần có thể thu đƣợc các marcocallus với kích thƣớc 0,5-1,5mm
nằm trên bề mặt thạch. Các marcocallus đƣợc cấy chuyển tiếp sang môi trƣờng
tái sinh RJM (Möllers and Wenzel, 1992), đặt trong điều kiện nuôi cấy
macrocallus. Khoảng 8-12 tuần sau khi cấy chuyển, marcocallus sẽ tái sinh thể
chồi. Các thể chồi đƣợc chuyển sang môi trƣờng MS (Murashige and Skoog,
1962) để tạo cây hoàn chỉnh.
2.3.4. Dung hợp tế ào trần
Dung hợp tế bào trần hay tạo thể lai soma là một trong những ứng dụng
quan trọng nhất của nuôi cấy tế bào trần Quá trình dung hợp protoplast đƣợc
kích thích để hòa trộn 2 bộ genome của 2 loài vào mới nhau trong đó có thể là lai
cùng loài, lai khác loài, khác genome hay thậm chí khác giới (điều mà không thể
thực hiện đƣợc bằng phƣơng pháp lai thông thƣờng). Thực tế là các tế bào trần
sau khi đƣợc tách ra, thành tế bào bị phân giải, chúng rất dễ dàng hòa trộn vào
với nhau trong điều kiện in vitro (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009). Quá trình
dung hợp tế bào trần có thể xảy ra một cách tự phát hay do kích thích bằng một
số nhân tố nhƣ cơ học, hóa học hay vật lý (gọi chung là dung hợp do kích thích).
2.3.4.1. Dung hợp tự phát
Sau khi các tế bào trần đƣợc tách ra (từ mô callus nuôi cấy hay các tế bào
sinh dƣỡng) dƣới dạng huyền phù nhờ các enzym phân giải thành tế bào, các sợi
liên bào (yếu tố kết nối giữa các tế bào tiếp giáp nhau) sẽ bị đứt gãy, từ đó kích
thích cá tế bào tiến sát lại gần nhau và xảy ra quá trình dung hợp tự phát hình
thành lên các tế bào đa nhân (2-40 nhân).
Kiểu dung hợp này thƣờng hay gặp ở các tế bào callus, với những tế bào có
kích thƣớc trung bình, hiếm gặp ở những tế bào sinh dƣỡng (mô lá). Chính vì vậy
quá trình dung hợp tự phát sẽ không thể tái sinh đƣợc cây hoàn chỉnh mà khả năng
phân chia rất ít. Hơn nữa trong quá trình tách tế bào trần hay cấy huyền phù tế bào
thƣờng làm cho các tế bào co nguyên sinh mạnh, hoặc làm đứt gãy cả nhóm sợi liên
bào nên sẽ làm giảm hiệu suất dung hợp. Do đó kiểu dung hợp này ít đƣợc sử dụng.
2.3.4.2. Dung hợp do kích thích
Sử dụng các nhân tố cơ học, hóa học hay điện năng để kích thích sự dung
hợp tế bào trần. Phƣơng pháp dung hợp bằng cơ học: Dùng micropipet trộn đều
hỗn hợp hai loại tế bào trần của cùng một loài hay khác loài. Đầu tip của pipet
đƣợc giới hạn một cách không hoàn toàn, các tế bào trần đƣợc hút lên hút xuống
nhiều lần để tạo thành áp lực dòng chảy nén chúng lại để kích thích sự dung hợp.
13

30. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
Quá trình này dễ làm tổn thƣơng tế bào.
Hai đối tƣợng tế bào đem lai có thể dung hợp thành một tế bào mới một
cách tự phát hoặc đƣợc cảm ứng bởi tác nhân nhƣ hóa chất (dung hợp hóa chất
polyethylen glycol, ký hiệu là PEG) hay xung điện (dung hợp xung điện-
electrofusion). Đối với cây khoai tây ngƣời ta đã sử dụng cả hai phƣơng pháp
trên. Tuy nhiên so với phƣơng pháp dung hợp bằng hóa chất, dung hợp xung
điện đƣợc áp dụng phổ biến và đạt hiệu quả cao hơn hơn do thao tác đơn giản,
tốc độ nhanh, hiệu suất dung hợp cao trong cùng một thời điểm và ít gây độc đối
với tế bào. Phƣơng pháp dung hợp bằng hóa chất PEG thƣờng gây độc cho tế
bào trần do không rửa sạch hết PEG, do vậy sẽ ảnh hƣởng đến khả năng tái sinh
sau này (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009).
2.3.5. Chọn lọc các con lai soma
Nhìn chung khoảng 20%-25% tế bào trần có thể bị kích thích dung hợp
bởi các yếu tố kích thích mặc dù sự hình thành thể nhân có thể là 50-70%
(Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009). Tuy nhiên, sự nhận biết các thể dị nhân là
không đơn giản, cần phải có các phƣơng pháp chọn lọc đặc trung. Việc tách
đƣợc các cá thể lai heterocariot (dị nhân) ra khỏi các cá thể đồng dung hợp hay
chƣa dung hợp khi tái sinh là hết sức quan trọng. Trong mục tiêu nghiên cứu lý
thuyết, ngƣời ta có thể sử dụng các bố , mẹ có đặc trƣng rất khác nhau để dễ
dàng thanh lọc ra các thể lai trên môi trƣờng chọn lọc.
Bằng các phƣơng pháp chỉ thị phân tử (AFLP, RAPD, RELP, PCR) hoặc
Isozyme có thể xác định chính xác các con lai soma mang các gen của cả bố và
mẹ dung hợp.
Theo Thach et al. (1993) đã tạo thành công con lai soma giữa các nhóm
khoai tây thuộc Solanum tuberosum L., việc xác định con lai dựa trên phân tích
isozyme esterase, peroxidase và kỹ thuật RFLP (Enzyme cắt là EcoRI) đã xác
định đƣợc các con lai đều có sự biểu hiện của 2 allele trội đơn gen Rx và Ry từ
bố mẹ dung hợp (partners).
Theo Thieme et al. (2008), con lai giữa Solanum tuberosum cv. Delikat và
S. tarnii đƣợc xác nhận bằng chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeat) và
AFLP (Amplified Fragment length polymorphism), đồng thời cũng dựa vào đặc
điểm hình thái và phân tích Flow cytometry. Kết quả cho thấy chỉ thị SSR không
cho kết quả với tổ hợp lai trên và các con lai BC1 còn AFLP cho kết quả
14

31. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
tốt để khẳng định đúng con lai soma.
Ngoài ra, để xác định con lai soma một số tác giả đã nghiên cứu thành
phần, hàm lƣợng alkaloid trong các cây lai. Theo Laurila et al. (1996) để xác
định con lai soma tiến hành phân tích thành phần SGAA (Steroidal Glycoalkaloid
Aglycone) của cây lai. Kết quả cho thấy các thành phần alkaloid của bố mẹ bao
gồm solanidine và slanthrene của S. tuberosum, tomatidine của S. brevidens đều
có mặt trong cây lai. So sánh với bố mẹ, cho biết thành phần SGAA trong cây lai
cao hơn so với S. tuberosum nhƣng hàm lƣợng thấp vào khoảng 20 mg/ 100g
trọng lƣợng tƣơi.
Hơn nữa ngƣời ta có thể xác định con lai dựa vào đặc điểm hình thái khi
bố mẹ có đặc điểm khác nhau rõ rệt. Tuy nhiên phƣơng pháp này chỉ đƣợc áp
dụng đồng thời với phƣơng pháp xác định ở mức phân tử thì mới cho kết quả
chính xác nhất.
2.4. BỆNH MỐC SƢƠNG TRÊN CÂY KHOAI TÂY
2.4.1. Giới thiệu về ệnh mốc sƣơng
Bệnh mốc sƣơng do nấm Phytophthora infestans gây ra là bệnh gây hại
nghiêm trọng bậc nhất, đặc biệt bệnh nếu bùng phát thành dịch sẽ rất nguy hiểm
ở các vùng chuyên canh. Nguồn mốc sƣơng lan truyền chủ yếu là từ Mỹ vì tại
Mexico vào thế kỉ 19 khoai tây không phải loại lƣơng thực đƣợc trồng rộng rãi.
Cùng với sự phát tán của khoai tây tới các vùng trồng trọt ở châu Âu và châu Mỹ
một thời gian ngắn sau bệnh mốc sƣơng cũng nhanh chóng lan truyền và gây hại
nặng ở các vùng trồng trọt này. Bệnh mốc sƣơng đã gây ra mất mùa khoai tây ở
vụ đông năm 1845 và năm 1846 tại Ireland làm hơn 1.5 triệu ngƣời chết đói và
gần 1 triệu ngƣời chết trong khi di cƣ sang Mỹ để tránh nạn đói này. Bệnh mốc
sƣơng cũng gây nạn đói thứ 2 xảy ra ở nƣớc Đức năm 1919.
Triệu chứng bệnh trên lá bệnh lúc đầu chỉ là những điểm nhỏ màu xanh
tái, hình dạng không đều, sau đó chuyển thành màu nâu và xanh nhạt, vết bệnh
không có giới hạn rõ rệt. Lúc đầu bệnh thƣờng xuất hiện ở mép lá, cuống lá sau
đó lan rộng vào phiến lá tạo thành những đám mô bị thối nâu, khi trời ẩm ƣớt
mặt dƣới lá chỗ có vết bệnh xuất hiện lớp nấm trắng xốp nhƣ sƣơng muối.
Về đặc điểm phát sinh và gây bệnh, nấm có thể phát triển trong khoảng
nhiệt độ từ 4-260
C nhƣng tối thích ở khoảng 16-200
C, ẩm độ thích hợp là từ 91-
100%. Bào tử nấm có kích thƣớc trung bình khoảng 36 x 22 µm - 29 x 19 µm
15

32. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
(Erwin and Ribeiro, 1996), đƣờng kính sợi nấm từ 3,5 - 4,0 µm, khi nuôi cấy trên
môi trƣờng nhân tạo có thể đạt kích thƣớc từ 7,0 - 16 µm. Trên mô bệnh nấm hình
thành các bào tử phân sinh hình ôvan, elíp hoặc hình quả chanh yên, bào tử ngắn,
đỉnh bào tử có núm nhỏ, kích thƣớc bào tử khoảng 29 - 36 µm x 19 - 22 µm.
Nấm mốc sƣơng có chu kì phát triển hoàn toàn với hai giai đoạn sinh sản
vô tính và sinh sản hữu tính. Sinh sản vô tính bằng bọc bào tử, dƣới hai hình thức
nảy mầm trực tiếp và nảy mầm gián tiếp thông qua bào tử động (hình thành trong
điều kiện lạnh, có giọt nƣớc). Nấm mốc sƣơng có 2 kiểu ghép cặp A1, A2 và
một dạng hữu tính. Sinh sản hữu tính phần lớn xảy ra ở các vùng lạnh ẩm và phải
có đủ cả kiểu ghép cặp A1, A2. Bào tử trứng đƣợc hình thành khi có sự kết hợp
giữa A1 và A2 ở cạnh nhau, cơ quan sinh sản trên sợi nấm là bao trứng
(Oogonium), và bao đực (Antheridium). Sau khi phối giao, nhân của bao đực dồn
sang bao trứng thụ tinh hình thành bào tử trứng lƣỡng bội (Oospore) với kích
thƣớc khoảng 31 x 50m (Erwin and Ribeiro, 1996). Khi ở vùng khí hậu không
thuận lợi cho sự hình thành bào tử trứng hoặc chỉ có 1 trong 2 chủng nấm thì nấm
mốc sƣơng chỉ sinh sản theo kiểu vô tính.
Trong những nghiên cứu sau này chủng quần bao gồm cả A1 và A2 còn
đuợc phát hiện thêm ở Thái Lan, Nepal và Trung Quốc (Koh, 1999; Nishimura,
1999). Ở một số nƣớc tây Âu, Mỹ, Canada đã phát hiện giai đoạn sinh sản hữu
tính (Drenth, 1996).
Tại Việt Nam bệnh mốc sƣơng cà chua, khoai tây (còn đƣợc gọi là bệnh
sƣơng mai, bệnh rám sƣơng, bệnh dịch muộn v.v… là một trong những bệnh
nguy hiểm nhất trên cà chua, khoai tây, bệnh đặc biệt nghiêm trọng tại các vùng
trồng có khí hậu mát và ẩm nhƣ Đà Lạt, Sơn La...
Các nghiên cứu trên đối tƣợng nấm mốc sƣơng P. infestans tại Việt Nam
cho thấy bệnh phát triển mạnh trong điều kiện độ ẩm cao, nhiệt độ ban đêm
tƣơng đối thấp, độ nhiệt ban ngày tƣơng đối cao. Nhiệt độ thích hợp cho bệnh
phát sinh ban đầu vào khoảng 18 - 22°C, nếu trong điều kiện ẩm độ cao nhƣng
nhiệt độ lại thấp hơn 10°C hoặc lớn hơn 28°C thì khó có khả năng xuất hiện bệnh
trên đồng ruộng, ẩm độ thích hợp nhất cho bào tử P. infestans nảy mầm và xâm
nhập vào cây phải đạt từ 90% cho đến độ ẩm bão hoà, ẩm độ thích hợp nhất cho
sự phát triển bệnh là 76%, đặc biệt nếu thời tiết có thêm mƣa phùn và sƣơng mù
thì bệnh sẽ phát triển rất nhanh, cây có thể bị tàn lụi trong vòng 7 - 10 ngày.
16

33. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
Nghiên cứu về đặc tính sinh học của quần thể nấm vào năm 2003 trong
toàn bộ 130 isolate nấm thu thập đƣợc trên cà chua và khoai tây kết quả cho thấy
tất cả các chủng đƣợc thu thập đều thuộc kiểu ghép cặp A1 (Ngô Thị Xuyên và
Lê Hồng Vĩnh, 2003). 254 chủng thu thập đƣợc trong năm 2005 cũng thuộc kiểu
A1 (Ngô Thị Xuyên và Lê Hồng Vĩnh, 2005). Nghiên cứu về cấu trúc gen của
quần thể nấm P. infestans tại Việt Nam bằng mt-DNA haplotype và nhận dạng
vùng GR57 cũng khẳng định rằng chủng quần nấm tại Việt Nam vẫn là chủng
quần cũ (Le et al., 2008).
2.4.2. Đặc điểm xâm nhiễm của nấm P. infestans
Theo Andrivon et al. (2007), nấm mốc sƣơng P.infestans có thể xâm
nhiễm trực tiếp từ các bọc động bào tử hoặc xâm nhiễm gián tiếp nhờ động bào
tử. Các bọc động bào tử đƣợc phát tán nhờ gió, khi tiếp xúc với bề mặt lá khoai
tây mỗi bọc động bào tử có thể giải phóng 6 đến 12 động bào tử, điều này chỉ xảy
ra khi gặp điều kiện nhiệt độ thích hợp và bề mặt lá phải đủ ẩm. Sau khi tiếp xúc
các bọc động bào tử nhanh chóng nảy mầm để hình thành nên cấu trúc ống mầm
là bộ phận sẽ đâm xuyên vào mô lá trong quá trình xâm nhiễm. Dƣới điều kiện
tối ƣu quá trình xâm nhiễm thƣờng diễn ra trong vòng 2 giờ và sự xâm nhiễm có
thể xảy ra ở cả 2 mặt lá. Trong quá trình xâm nhiễm, sợi nấm mốc sƣơng tạo ra
cấu trúc vòi hút ăn lan giữa các khoảng gian bào và phát triển vào vùng tế bào
chất. Từ vòi hút của nấm P.infestans sẽ sản sinh ra các protein hiệu ứng (effector)
mà cây trồng có thể hoặc không thể nhận biết khi chúng đi qua màng tế bào.
Năm 2009 các nhà khoa học đã hoàn thành việc giải trình tự genome của nấm
P. infestans, genome của chúng có kích thƣớc khoảng 240 Mbp, lớn hơn nhiều so
với genome của các loài Phytopthora khác: genome của Phytophthora sojae có kích
thƣớc 95 Mbp và genome của Phytophthora ramorum có kích thƣớc khoảng 65
Mbp. Genome của nấm P. infestans mang hàng loạt yếu tố di động và rất nhiều gen
mang thông tin di truyền mã hóa cho các protein hiệu ứng có liên quan tới quá trình
gây bệnh. Những protein này đƣợc phân thành 2 nhóm dựa vào vị trí mà chúng
đƣợc sản sinh. Nhóm thứ nhất là nhóm protein đƣợc sinh ra bên trong tế bào chất
của tế bào ký chủ, gồm các protein RXLR có chứa trình tự Arginine-X-Leucine-
Arginine (trong đó X là amino acid bất kỳ) ở đầu N của phân tử. RXLR, là những
protein không độc nghĩa là chúng sẽ đƣợc cây nhận biết và khởi động phản ứng siêu
nhạy (HR) để tiêu diệt nấm P. infestans. Khi nghiên cứu tổ hợp nấm P. infesstans
trên cây khoai tây và sử dụng kính hiển vi video, ngƣời ta đã quan sát thấy
17

34. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
tế bào ký chủ sụp đổ và chết sau 26 giây và nấm chết sau đó khoảng 20 giây. Nấm P.
infestans đƣợc cho là chứa một lƣợng lớn các protein hiệu ứng, nhiều hơn khoảng
60% so với các loài Phytopthora khác, điều này cho phép chúng có thể nhanh chóng
phá vỡ các chiến lƣợc tự vệ của cây ký chủ (Haverkort et al., 2009).
Theo nghiên cứu của Jiang et al. (2008) thì các protein hiệu ứng RXLR đƣợc
mã hóa bởi khoảng 700 gen thuộc họ gen Avh (avirulence homologs genes). Các nhà
khoa học thuộc trƣờng đại học Wageningen (Hà Lan) và Viện Nghiên cứu cây
lƣơng thực Xcốt-len đã tiến hành nghiên cứu trên 700 gen mã hóa protein hiệu ứng
và nhận thấy rằng có khoảng 400 gen không tạo ra RNA trong cây và vì vậy chúng
không tạo ra chất hiệu ứng trong quá trình xâm nhiễm của nấm P. infestans. Nhóm
chất hiệu ứng thứ hai là các protein đƣợc sinh ra trong gian bào của tế bào ký chủ
(apoplast), bao gồm các enzyme thủy phân nhƣ protease, lipase và glycosylase đóng
vai trò phá hủy mô thực vật; các enzyme ức chế đóng vai trò bảo vệ nấm khỏi các cơ
chế phòng thủ của cây ký chủ trong quá trình xâm nhiễm.
2.4.3. Cơ sở phân tử của tính kháng ệnh mốc sƣơng do nấm P.infestans gây ra
Theo Adillah et al. (2008) trong quá trình phát triển cây khoai tây cũng nhƣ
các cây trồng khác luôn là đối tƣợng gây hại của rất nhiều các tác nhân gây cả
trên và dƣới mặt đất, đặc biệt là các vi sinh vật gây hại nhƣ virus, vi khuẩn,
nấm... với từng đối tƣợng gây bệnh, cây trồng sẽ có các chiến lƣợc kháng để
chống lại sự xâm nhiễm và gây bệnh của chúng. Các chiến lƣợc này là một phần
của hệ thống miễn dịch thực vật, có thể đƣợc chia làm 2 nhóm lớn. Thứ nhất là
chiến lƣợc kháng dựa trên cơ sở các thụ thể trên màng tế bào (receptor) nhận biết
các mô hình liên quan đến tính gây bệnh (pathogen/microbe associated molecular
patterns – MAMP/PAMPs). Chiến lƣợc nhận biết MAMP/PAMPs đƣợc coi nhƣ
tín hiệu cảnh báo sớm cho tế bào khi xảy ra sự xâm nhiễm, một số mô hình
MAMP/PAMPs bao gồm các phân tử tín hiệu nhƣ flagellin, lipopolysaccharide
và các nhân tố Tu kéo dài có nguồn gốc từ các vi khuẩn Gram âm; chitin, b-
glucan và ergosterol có nguồn gốc từ nấm; họ protein CBEL có khả năng liên kết
chặt với cellulose và PEP13 – một cấu trúc peptide nằm trong enzyme chuyển
hóa Glutamine có nguồn gốc từ nấm trứng.
Các phân tử tín hiệu (chất kích hoạt) đƣợc nhận biết trong mô hình tƣơng
tác MAMP/PAMPs có đặc điểm là khá bảo thủ ở nhiều đối tƣợng sinh vật, sự
nhận biết các chất kích hoạt đƣợc đảm nhiệm bởi các thụ thể nằm trên màng tế
bào để tạo ra tính kháng cơ bản. Tuy nhiên, tác nhân gây bệnh có thể khắc phục
18

35. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
tính kháng cơ bản bằng cách tiết vào tế bào cây các chất hiệu ứng (effector) vƣợt
qua rào cản kiểm soát của các thụ thể trên màng tế bào. Các loại nấm sinh
dƣỡng/bán sinh dƣỡng tiết vào tế bào cây nhiều effector thông qua vòi hút
(haustorium) hình thành bên trong tế bào ký chủ. Nhiều effector của tác nhân gây
bệnh có hoạt tính enzym, có vai trò biến đổi các protein của ký chủ nhằm tạo điều
kiện cho sự gây bệnh và vô hiệu hóa khả năng nhận biết của cây. Một trong các
vai trò của các effector này là ức chế phản ứng phòng thủ của cây thông qua mô
hình nhận biết MAMP/PAMPs. Nếu hoạt động của các effector này có hiệu quả,
cây sẽ bị nhiễm bệnh (Adillah et al., 2008).
Nhƣng ngoài chiến lƣợc kháng bệnh dựa trên các mô hình
MAMP/PAMPs, cây trồng còn có chiến lƣợc kháng thứ 2 cho hiệu quả kháng
cao hơn và kháng trên phổ rộng đó là tính kháng dựa trên các protein kháng
(resistance proteins) đƣợc mã hóa bởi các gen kháng R (resistance genes). Các
protein kháng R có vai trò nhận biết, tƣơng tác với các chất hiệu ứng có nguồn
gốc từ tác nhân gây bệnh và khởi động phản ứng siêu nhạy, tƣơng tác giữa
protein kháng R - chất hiệu ứng đƣợc nghiên cứu đầu tiên bởi Flor (1971) và ông
đƣa ra thuật ngữ “gen đối gen” để chỉ mối tƣơng tác này. Các chất hiệu ứng
đƣợc nhận biết bởi các protein R đƣợc gọi là các protein không độc Avr
(Avirulence protein) mã hóa bởi các gen Avr – gen quy định tính không độc.
Các nghiên cứu gần đây trên đối tƣợng nấm mốc sƣơng P. infestans chỉ mới
phát hiện đƣợc một số gen Avr mã hóa các protein nội bào, các protein này đƣợc
cho là sẽ hoạt động bên trong tế bào ký chủ. Tất cả các gen Avr của nấm P. infestans
đã đƣợc phát hiện cho đến nay đều mã hóa cho các protein mang đoạn peptide tín
hiệu có trình tự Arginine – X – Leucine – Arginine (trong đó X là axit amin bất kỳ)
và chứa trình tự EER ở đầu axit của phân tử protein. Cấu trúc kép RXLR – EER này
cần thiết cho quá trình xâm nhập và di chuyển của các protein hiệu ứng bên trong tế
bào ký chủ. Nhờ có cấu trúc kép RXLR-EER, protein Avr3a đƣợc sinh ra tại vòi hút
của nấm P. infestans đi vào tế bào chất của tế bào ký chủ. Sau khi vào tế bào chất,
protein Avr3a có thể tƣơng tác với các protein kháng R của cây ký chủ và phản ứng
kháng của cây đƣợc khởi động (Whisson et al., 2007).
Dựa trên cơ sở tƣơng tác phân tử giữa nấm bệnh P. infestans – cây trồng,
các nhà khoa học hiện đang tập trung nghiên cứu theo hƣớng sử dụng các gen
kháng R trong công tác chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng và
bƣớc đầu đã đạt đƣợc kết quả khá khả quan.
19

36. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
2.4.4. Các nghiên cứu về gen kháng ệnh mốc sƣơng trên cây khoai tây
Sau khi bệnh mốc sƣơng khoai tây trở thành một vấn nạn vào khoảng giữa
thế kỉ 20, đã có nhiều giải pháp khác nhau đƣợc đề xuất. Đầu tiên là biện pháp hóa
học: sử dụng hỗn hợp Boocđo, một hỗn hợp giữa vôi cùng với dung dịch đồng
sunphat…. Một giải pháp khác đƣợc đề xuất vào khoảng những năm 1900s, sau khi
Salaman thu đƣợc một ít củ của loài khoai tây dại từ vƣờn bách thảo Kew nƣớc
Anh, có khả năng kháng bệnh mốc sƣơng. Loài dại này sau đó đƣợc chứng minh là
loài S. demissum, có khả năng kháng bệnh mốc sƣơng nhƣng không hoàn toàn
(Salaman, 1910). Từ đây 11 gen kháng R (R1-R11) từ loài S. demissum đã đƣợc phát
hiện (Black et al., 1953; Eide et al., 1959; Malcolmson et al., 1969), sau đó đã đƣợc
đƣa vào khoai tây trồng cung cấp cho thị trƣờng trong những năm 1950s, 1960s.
Sau khi đƣợc phát hiện, đã có nhiều nghiên cứu thực hiện trên các đối
tƣợng gen kháng này, trong số 11 gen kháng có đƣợc từ loài khoai tây S.
demissum, gen R1 nằm trên nhiễm sắc thể số V (Leonards and Schippers, 1992),
gen R2 định vị trên nhiễm sắc thể số IV, các gen R3, R6, R7 đƣợc định vị trên
nhiễm sắc thể số XI, gen kháng R5, R8, R9, R10 và R11 đều nằm trên nhiễm sắc
thể XI và là các alen khác nhau của locus gen R3 (Li et al., 2011).
Bradshaw et al. (2005) chỉ ra rằng gen R10 và R11 nằm trên nhiễm sắc thể
số 11 và là các dạng alen khác nhau của các gen thuộc locus R3 trên nhiễm sắc
thể XI. Các nhà khoa học đã tiến hành định vị các gen kháng, theo đó gen R11
liên kết với marker PAG/MAAG-172.3 với khoảng cách 8,5cM và gen R10 liên
kết với chỉ thị phân tử PAC/MATC-264.1.
Nghiên cứu theo hƣớng tối ƣu hóa phƣơng pháp PCR nhằm phát hiện các
gen kháng bệnh bằng marker phân tử trên cây khoai tây của Mori et al. (2011) đã
kết luận rằng gen R1 có nguồn gốc từ loài S. demissum đƣợc định vị trên nhiễm
sắc thể số V (Leonards and Schippers, 1992) liên kết chặt với chỉ thị phân tử R1
và đƣợc phát hiện nhờ cặp mồi liên kết đặc hiệu 76-2sf2 – 76-2SR, khi tiến hành
phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu sẽ cho sản phẩm có kích thƣớc khoảng
1400bp. Gen kháng R2 định vị trên nhiễm sắc thể số IV liên kết chặt với chỉ thị
phân tử R2-800, đƣợc phát hiện nhờ cặp mồi đặc hiệu R2SP-S7 – R2SP-A9 và
cho kích thƣớc đoạn nhân khoảng 800bp.
Với 11 gen kháng (R1-R11) đã đƣợc phát hiện đều là các gen kháng đặc
hiệu chủng có tính kháng cao nhƣng chỉ kháng đƣợc một số kiểu gen (chủng,
20

37. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
nòi) của tác nhân gây bệnh, tính kháng dựa trên các gen kháng này đƣợc gọi là
tính kháng đặc hiệu chủng hay tính kháng dọc.
Tuy nhiên, tính kháng có đƣợc từ những gen này chƣa thực sự hiệu quả,
ngay sau khi các giống kháng bệnh đƣợc đƣa vào sản xuất thì tác nhân gây bệnh
đã cho thấy khả năng biến đổi mô hình gây bệnh của chúng, kết quả là tạo ra các
chủng mới có thể gây bệnh trên cây khoai tây mang các gen kháng R. Vì vậy
hƣớng đi này nhanh chóng cho thấy sự kém hiệu quả trong biểu hiện tính kháng
đối với tác nhân gây bệnh cũng nhƣ hạn chế về tính bền vững.
Yêu cầu đặt ra cho các nhà chọn tạo giống khoai tây là cần phải tìm đƣợc
những nguồn vật liệu mới cho tính kháng trên diện rộng, kháng đƣợc nhiều chủng
nấm P. infestans (tính kháng không đặc hiệu chủng) và cho hiệu quả kháng bền
vững. Cho đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện đƣợc nguồn vật liệu thay thế các
gen kháng đặc hiệu chủng có nguồn gốc từ S. demissum, đó là các locus gen và gen
kháng không đặc hiệu chủng hay các gen kháng ngang có nguồn gốc từ các loài
khoai tây dại nhƣ S. berthaultii, S. pinnatisectrum và S. microdontum….
Bằng các phƣơng pháp phân tích di truyền định tính và định lƣợng thực
hiện trên loài S. microdontum, Adillah et al. (2008, 2010) đã phát hiện đƣợc một
locus gen kháng bệnh mốc sƣơng trên loài dại này. Locus gen này nằm trên vai
ngắn của nhiễm sắc thể số IV, giữa chỉ thị phân tử AFLP pCTmAGG_310 và
CAPS (sự đa hình các đoạn cắt đƣợc khuếch đại - Cleaved Amplified
Polymorphic Sequence) chỉ thị TG339, T0703. Vị trí của gen Rpi-mcd1 đƣợc phát
hiện là trùng khớp với một cụm gen kháng P. infestans khá bảo thủ, mang các
gen kháng gồm R2, R2-like, Rpi-blb3 và Rpi-abpt trên nhiễm sắc thể sốIV4. Điều
này cho thấy gen Rpi-mcd1 đƣợc phát hiện từ loài dại S. microdontum là gen
kháng thứ 5 đƣợc tìm thấy trong cụm gen này.
Trên loài khoai tây dại S. berthaultii các nhà khoa học đã phát hiện gen
kháng bệnh mốc sƣơng Rpi-ber nằm trên nhiễm sắc thể số 10. Các chỉ thị đặc
hiệu trên nhiễm sắc thể số 10 gồm Q133, CT214 và TG63 liên kết khá chặt với
gen Rpi-ber với khoảng cách lần lƣợt là 6.4, 5.1 và 1.3cM.
Một số gen kháng có nguồn gốc từ các loài khoai tây dại khác đã đƣợc
định vị, chẳng hạn nhƣ gen kháng trội Rpi1 từ loài dại S. pinnatisectum đƣợc
định vị nằm trên nhiễm sắc thể số VII (Kuhl et al., 2001), các gen kháng từ
những loài dại nhƣ S. Mochiquense: gen R (Smilde et al., 2005); loài dại
21
pi-moc1

38. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
S. Phureja: gen Rpi-phu1 (Sliwka et al., 2011); loài dại S. venturiiI: gen Rpi-vnt1
(Foster et al., 2009); loài dại S. Dulcamara: gen Rpi-dlc1 (Golas et al., 2010) đều
đƣợc định vị trên nhiễm sắc thể số X.
Một nguồn gen kháng mốc sƣơng mới đƣợc phát hiện gần đây và hiện
đang đƣợc tập trung nghiên cứu là các gen kháng có nguồn gốc từ loài khoai tây
dại Solanum bulbocastanum. Đây là loài dại nhị bội, có nguồn gốc từ vùng trung
Mỹ, phát triển tại vùng đồi núi có độ cao từ 1200 đến 2300 mét so với mực nƣớc
biển, thuộc đông bắc Mexico (Spooner et al., 2005). Cho đến nay các nhà khoa
học đã phát hiện và nhân dòng đƣợc 4 gen kháng bệnh mốc sƣơng có nguồn gốc
từ loài dại Solanum bulbocastanum thuộc vùng lặp giàu Leucine (NBS-LRR),
bao gồm: Gen Rpi-blb1 (van der Vossen et al., 2003) hay còn đƣợc biết đến với
tên RB (Song et al., 2003); gen Rpi-blb2 (van der Vossen et al., 2005); gen Rpi-
blb3 (Lokosou et al., 2009); gen Rpi-bt1 (Oosumi et al., 2009) đƣợc phát hiện từ
phép lai giữa S. bulbocastanum và S. tuberosum.
Trong đó, gen Rpi-blb1/RB, định vị trên nhiễm sắc thể số VIII, gần chỉ thị
CT64 và thuộc một cụm gồm 4 gen kháng tƣơng đồng (resistance gene analogues
– RGAs) (van der Vossen et al., 2003); gen Rpi-blb2 nằm trên nhiễm sắc thể số VI
gần chỉ thị phân tử CT119; gen Rpi-blb3 định vị trên nhiễm sắc thể số IV gần chỉ
thị phân tử TG339 và nằm trong cụm gen kháng mốc sƣơng đặc hiệu chủng (R2,
Rpi-abpt, R2-like). Nhóm gen kháng này là các gen kháng không đặc hiệu chủng,
cho hiệu quả kháng cao và khá bền vững.
Các nghiên cứu về sự đa dạng, phạm vi phân bố cũng nhƣ quá trình tiến
hóa của các gen kháng mốc sƣơng có ở loài dại S. bulbocastanum đã đƣa ra các
cặp mồi liên kết đặc hiệu với những gen kháng này. Gen Rpi-blb1/RB đƣợc phát
hiện bởi 2 cặp mồi là Blb1 (Wang et al., 2008) và 1/1’, các cặp mồi này liên kết
đặc hiệu với gen Rpi-blb1/RB và sẽ khuếch đại một đoạn DNA có kích thƣớc lần
lƣợt là 820 và 213bp (Wang et al., 2008); gen Rpi-blb2 đƣợc phát hiện nhờ cặp
mồi Blb2F/R, cặp mồi này liên kết đặc hiệu với gen Rpi-blb2 và cho đoạn DNA
đƣợc khuếch đại có kích thƣớc khoảng 715bp (Lokossou et al., 2010), trong khi
Wang et al. (2008) cho rằng cặp mồi Blb2F/R sẽ khuếch đại đoạn DNA có kích
thƣớc khoảng 773bp.
Cặp mồi Blb3F/R đƣợc cho là liên kết đặc hiệu với gen kháng mốc sƣơng Rpi-
blb3 và sẽ khuếch đại một đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 618bp (Wang et al., 2008).
22

39. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
2.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY
2.5.1. Chọn tạo giống khoai tây ằng phƣơng pháp truyền thống
Các phƣơng pháp chọn tạo khoai tây truyền thống thƣờng đƣợc áp dụng
nhƣ kỹ thuật lai tạo, lai lại (backcross), đột biến và chọn lọc (Kuckuck et al., 1985).
Nhƣợc điểm của phƣơng pháp truyền thống là vấp phải những khó khăn về mặt đặc
tính di truyền của kỹ thuật trồng trọt (Solanum tubersosum). Đó là bộ genom của
khoai tây trồng trọt ở thể tứ bội tetraploid (2n=4x = 48 nhiễm sắc thể), gây ra sự
phân ly sau lai tạo với một quần thể rất lớn, rất phức tạp, đòi hỏi quá trình chọn lọc
tốn rất nhiều công sức. Quá trình này đòi hỏi tối thiểu 10 năm để có đƣợc một giống
lai ra đời (Fitsden, 1984). Ngoài ra, nhiều đặc tính chống chịu do nhiều gen quy định
sẽ có thể mất dần trong quá trình chọn lọc ở các thế hệ tiếp sau. Các tính trạng không
mong muốn ở các dòng khoai dại (hình thái củ xấu, mắt sâu,…) lại xuất hiện ở con
lai lại đòi hỏi quá trình lai lại tốn rất nhiều thời gian.
2.5.2. Chọn tạo giống khoai tây ằng phƣơng pháp chuyển gen
Ngay từ năm 1986, để giảm thiệt hại do bệnh hại và virus, con ngƣời đã
chuyển nạp các gen mang trình tự mã hóa protein có tác dụng làm tăng tính
kháng virus hoặc kháng bệnh vào thực vật. Trồng khoai tây kháng virus đã đem
lại lợi nhuận tăng tới 22% ở Mexico (trong khi chỉ có 1/4 diện tích trồng khoai
tây của nƣớc này sử dụng giống khoai tây xác nhận). Các phƣơng pháp tạo
giống khoai tây kháng bệnh virus bằng con đƣờng chuyển gen bao gồm: chuyển
gen tổng hợp protein vỏ tạo cây khoai tây kháng virus; tạo cây khoai tây kháng
virus nhờ chuyển gen tổng hợp protein vận chuyển của virus; tạo cây khoai tây
kháng virus nhờ chuyển gen tổng hợp enzym sao chép và tạo cây khoai tây kháng
virus nhờ làm câm các gen sau phiên mã của virus.
Ngoài chuyển gen kháng bệnh virus, cũng có các nghiên cứu về chuyển gen
kháng bệnh mốc sƣơng đƣợc phát hiện từ loài khoai tây dại S. bulbocastanum có
nguồn gốc từ Mê-xi-cô. Ngoài kháng bệnh mốc sƣơng, loài dại này cũng kháng
bệnh tuyến trùng (root-knot), héo xanh (Verticillium wilt) và rệp.
Nhược điểm của phương pháp chuyển gen
+ Nhiều tính trạng nông sinh học quan trọng không thể chuyển vào cây
trồng bằng công nghệ gen do chúng đƣợc kiểm soát bởi đa gen; hoặc các gen
kiểm soát các tính trạng mong muốn vẫn chƣa đƣợc biết đến.
+ Nhiều gen rất khó để tách ra đƣợc và nhân dòng thành công.
23

40. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
+ Do khoai tây là cây lƣơng thực, thực phẩm nên vẫn còn nhiều tranh cãi
về sử dụng sản phẩm chuyển gen (GMO).
2.5.3. Chọn tạo giống khoai tây ằng phƣơng pháp dung hợp tế ào trần
2.5.3.1. Các nghiên cứu về chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương
bằng phương pháp dung hợp tế bào trần ở nước ngoài
Có rất nhiều biện pháp đã đƣợc đƣa ra để hạn chế tác hại của bệnh mốc
sƣơng gây ra nhƣ sử dụng tập đoàn giống mới cho các vùng nhiễm bệnh, sử
dụng các thuốc hoá học nhƣng chƣa đem lại kết quả nhƣ mong đợi. Các nghiên
cứu gần đây cho thấy các loài khoai tây dại nhƣ S. pinatisectum, S. tarnii, S.
bulbocastanum mang nguồn gen kháng bệnh mốc sƣơng cao. Tuy nhiên rất khó
để chuyển đặc tính kháng này qua lai tạo hữu tính giữa các loài dại (2n = 2x
= 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do sự không tƣơng hợp về genom, sự bất
thụ trong lai xa. Để khắc phục hiện tƣợng này, lai soma (dung hợp tế bào) đƣợc áp
dụng để chuyển tính kháng mốc sƣơng từ khoai tây dại vào khoai tây trồng. Đây là
hƣớng đi đúng đắn và đã đƣợc nhiều nghiên cứu chứng minh về khả năng chuyển
các đặc tính quý của các loài khoai tây khác nhau thông qua dung hợp tế bào
(Mattheij et al., 1992; Thach et al., 1993; Thieme et al., 2000, 2008, 2010).
Hƣớng nghiên cứu mới là sử dụng nguồn gen khoai tây dại có đặc tính
kháng bệnh mốc sƣơng rất điển hình làm nguyên liệu dung hợp trực tiếp với các
dòng khoai tây trồng để tạo các con lai soma mang đặc tính chống chịu virus mốc
sƣơng và rệp truyền bệnh Các dòng lai này sẽ đƣợc sử dụng làm vật liệu lai lại
với chính bố mẹ của chúng. Kết quả tạo ra các dòng khoai tây trồng trọt mang
đặc tính kháng bệnh virus rõ rệt cùng với các đặc tính nông sinh học tốt của bố
mẹ. Đã có nhiều công trình công bố về việc sử dụng nguồn gen khoai tây dại để
chuyển vào các giống khoai tây trồng bằng dung hợp tế bào trần và lai hữu tính
(Thieme et al., 2010): S. Chacoense (Butenko et al., 1982); S.niggrum (Binding
et al., 1982, 1988); S.brevidens (Austin et al., 1985; Helgeson, 1993);
S.circaeifolium (Mattheij et al., 1992); S.berthaultii (Serraf et al.,1991);
S.commersonii (Cardi et al., 1993); S.khasianum, S.aculeatissimum (Stattmann et
al., 1994); S.torvum (Jadari et al., 1992); S.phureja (Puite et al., 1986);
S.pinnatisectum (Sidorov et al., 1987, 1994; Schilde-Rentschler et al., 1993;
Thieme et al., 1995); S.bulbocastanum (Austin et al., 1993; Brown et al., 1995;
Schilde-Rentschler et al., 1993; Thieme et al., 1995).
Mê-xi-cô là một trung tâm phát sinh của cả P. infestans và các loài khoai
24

41. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
tây dại. Nơi đây đã tồn tại các chủng P. infestans có hoạt tính mạnh nhất và độc
hại nhất. Sở dĩ các loài khoai tây dại có thể sống đƣợc ở đây là do chúng có khả
năng kháng cao với hầu hết các chủng gây bệnh. Do đó, các loài khoai tây dại
này nhƣ một nguồn cung cấp gen giàu có cho quá trình cải tiến giống khoai tây
của các nhà chọn tạo giống và các nhà di truyền học. Chi Petota thuộc họ
Solanum gồm khoai tây trồng và các loài dại thân thuộc của chúng, gồm khoảng
200 loài dại. Trong chúng có các loài có khả năng kháng với các loại bệnh và
dịch hại cũng nhƣ các stress phi sinh học. Nhiều loài đã đƣợc bảo tồn trong ngân
hàng gen khoai tây quốc tế ở Đức (The Leibniz Institute of Plant Genetics and
Crop Plant Research, IPK, Genebank) và các nƣớc khác, chúng đã đƣợc đánh giá
và khai thác cho chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây. Chúng đƣợc đánh giá
một cách có hệ thống về các tính kháng và sự hình thành năng suất, chúng đƣợc
ghi vào danh sách và lƣu trữ nhằm để cung cấp các tính trạng vốn không có ở
nguồn gen cây trồng. Để khai thác các dòng khoai tây dại, có hàng loạt các công
bố theo hƣớng này.
Thieme et al. (1997) đã lai tạo thành công giữa khoai tây trồng S.
tuberosum (2n = 2x và 2n = 3x) với 2 loài khoai tây dại nhị bội Mê-xi-cô
(S.pinnasisexta và S.bulbocastana) qua dung hợp tế bào trần bằng xung điện. Sắc
xuất thành công của dung hợp đạt 63-89%. Tỷ lệ thành công cao này có thể đƣợc
giải thích là do các protoplast của bố mẹ đã bị chết hoặc các con lai có khả năng
tái sinh cao hơn so với các dạng bố mẹ. Qua phân tích isozym và chỉ thị phân tử
(RAPD) đã chọn lọc đƣợc các con lai soma tổ hợp đƣợc các đặc tính nông sinh
học quý của khoai tây trồng S. tuberosum và khả năng kháng bệnh mốc sƣơng
cao của các loài khoai tây dại.
Dinu and Thieme (2000) đã tạo thành công tổ hợp lai giữa các loài khoai
tây dại với các giống khoai tây trồng S. tuberosum L., các dòng khoai tây chọn
tạo giống và các dòng nhị bội nhằm để chuyển các gen kháng bệnh mốc sƣơng
và các gen kháng bệnh virus vào khoai tây trồng. Sử dụng phân tích Flow
cytometry, microsatellite và isozym để xác định các con lai khác loài. Các
nguyên liệu này là nguồn tiềm năng cho việc cải biến tính di truyền và nông sinh
học cho cây khoai tây. Ngoài tổ hợp các đặc tính kháng bệnh, phƣơng pháp dung
hợp tế bào trần còn để tổ hợp các đặc tính kháng các stress sinh học và phi sinh
học vào cây trồng (Chen et al., 1999; Naess et al., 2000; McGrath et al., 2002).
Thieme et al. (2004) đã tạo đƣợc 500 con lai soma khác loài qua dung hợp
25

42. Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
tế bào trần giữa các loài khoai tây dại thuộc chi Pinnatisecta và chi Etuberoa với
các dòng/giống khoai tây trồng. Các loài dại S. cardiophyllum và S. tarnii có khả
năng kháng với P. infestans. Các con lai soma đƣợc chọn lọc và lai lại
(backcross) với khoai tây trồng. Sử dụng phƣơng pháp test trên lá, củ; phƣơng
pháp lây nhiễm nhân tạo, cho thấy các con lai soma và các dòng con lai BC đều
có khả năng kháng với bệnh mốc sƣơng trên lá và củ.
Thieme et al. (2007) đã dung hợp thành công tổ hợp S. tarnii (2n=2x=24)
và S. Etuberosum với cv. Delikat. Con lai soma tạo thành đƣợc xác định độ bội
bằng máy Flowcytometry, xác nhận con lai soma heterozygote bằng kỹ thuật
SSR, chỉ thị AFLP và phân tích đa hình isozym. Những cây lai soma đều biểu
hiện tính kháng rất cao với dòng virus PVY và kháng nấm P. infestans rất tốt qua
phản ứng siêu nhạy (HR-hypersensitive reaction). Thế hệ BC1 và BC2 cũng biểu
hiện tính kháng virus và kháng nấm cao, không những vậy tính kháng này rất bền
vững ở cả con lai và thế hệ BC.
Các con lai soma khác loài giữa giống khoai tây trồng Delikat với loài khoai
tây dại S. tarnii lần đầu tiên đƣợc tạo ra bằng công nghệ dung hợp tế bào trần bằng
xung điện (Thieme et al., 2008). Các con lai ngẫu nhiên tái sinh đƣợc chọn lọc bằng
các chỉ thị phân tử (SSR, AFLP); phân tích hình thái và xác định độ bội bằng Flow
cytometry. Các con lai soma chọn lọc đƣợc đã đƣợc lai lại thành công với
cv.Delikat. Các dòng bố mẹ, các con lai soma, các con lai BC1 đều đƣợc kiểm tra
tính kháng virus PVY bằng lây nhiễm nhân tạo, ghép với cây chỉ thị và tiếp xúc với
môi giới truyền bệnh trên đồng ruộng; đồng thời chúng cũng đƣợc kiểm tra tính
kháng bệnh mốc sƣơng trên lá và trên củ. Kết quả cho thấy, các con lai soma đều
không có biểu hiện bị nhiễm virus PVY và hầu hết chúng đều có khả năng kháng cao
với bệnh mốc sƣơng trên lá. Các con lai BC1 có khả năng kháng cao với virus PVY
và một số ít kháng đƣợc mốc sƣơng trên lá. Các con lai soma và con lai BC1 chọn
lọc đƣợc cũng đƣợc đánh giá trên đồng ruộng về khả năng hình thành năng suất và
chất lƣợng củ. Một số dòng BC1 đã hình thành củ với năng suất và chất lƣợng tốt.
Các kết quả này đã khẳng định, ở con lai soma có biểu hiện đồng thời cả tính kháng
virus và mốc sƣơng; tính kháng virus đƣợc chuyển vào thế hệ BC1, nhƣng tính
kháng mốc sƣơng thì rất khó chuyển. Điều này chứng tỏ rằng công nghệ lai tế bào là
một công cụ đắc lực trong việc tạo các nguyên liệu đầu vào cho chọn tạo giống với
độ đa dạng di truyền cao.
26