Genų veiklos reguliavimas

1. BAKTERIJŲBAKTERIJŲ
IR EUKARIOTŲIR EUKARIOTŲ
GENŲ VEIKLOSGENŲ VEIKLOS
REGULIACIJAREGULIACIJA

2. 6.1. BAKTERIJŲ GENŲ VEIKLOS
REGULIACIJOS APŽVALGA
 Genų veiklos reguliacija reiškia, kad, esant
skirtingoms sąlygoms, genų ekspresijos
intensyvumas gali skirtis
 Nereguliuojami genai vadinami esminiais
(constitutive)
 Jų ekspresijos lygis iš esmės yra pastovus
 Dažniausiai esminiai genai koduoja baltymus, būtinus
organizmui išgyventi
 Genų reguliacijos pranašumas yra tas, kad
reguliuojamų genų koduojami baltymai gaminami tik
tada, kada to reikia
6-2

3. 6.1. BAKTERIJŲ GENŲ VEIKLOS
REGULIACIJOS APŽVALGA
 Genų reguliacija yra svarbi tokiems ląstelėje
vykstantiems procesams, kaip
 Metabolizmas
 Atsakas į aplinkos stresą
 Ląstelių dalijimasis
 Reguliacija gali vykti bet kuriame genų ekspresijos
etape. Todėl bakterijose ji gali būti:
 Transkripcinė
 Transliacinė
 Potransliacinė
6-3

4.  Dažniausiai genų ekspresija bakterijose reguliuojama
transkripcijos lygmenyje
 RNR sintezės laipsnis gali būti padidintas arba sumažintas
 Transkripcinėje reguliacijoje dalyvauja dviejų pagrindinių tipų
reguliaciniai baltymai
 Represoriai  Jungiasi prie DNR ir nuslopina transkripciją
 Aktyvatoriai  Jungiasi prie DNR ir skatina transkripciją
 Transkripcinė reguliacija, vykdoma represorių, vadinama
neigiama kontrole
 Transkripcinė reguliacija, vykdoma aktyvatorių, vadinama
teigiama kontrole
6.2. TRANSKRIPCINĖ
REGULIACIJA
6-4

5.  Mažos efektorių molekulės taip pat veikia transkripcinę
reguliaciją
 Tačiau jos jungiasi prie reguliuojančių baltymų, o ne tiesiogiai prie
DNR
 Kai kada mažos efektorių molekulės gali sustiprinti
transkripciją
 Tokios molekulės vadinamos induktoriais
 Induktoriai veikia dviem būdais

Prisijungia prie aktyvatorių ir paskatina juos jungtis prie DNR

Prisijungia prie represorių ir neleidžia jiems jungtis prie DNR
 Genai, reguliuojami tokiu būdu, yra vadinami indukuojamais
 Kitais atvejais mažos efektorių molekulės gali slopinti
transkripciją
 Korepresoriai jungiasi prie represorių ir skatina juos jungtis prie DNR
 Inhibitoriai jungiasi prie aktyvatorių ir neleidžia jiems prisijungti prie
DNR
 Genai, reguliuojami tokiu būdu, yra vadinami represuojamais
6-5

6. 6-6
 Reguliuojantys baltymai
turi dvi prisijungimo vietas
 Vieną mažai efektoriaus
molekulei
 Kitą - DNR
b) Baltymas represorius, korepresoriaus molekulė, represuojamas genas
a) Baltymas represorius, induktoriaus molekulė, indukuojamas genas

7. 6-7
c) Baltymas aktyvatorius, induktoriaus molekulė, indukuojamas genas
d) Baltymas aktyvatorius, inhibitoriaus molekulė, represuojamas genas

8.  Operonas yra reguliacinis genomo vienetas,
sudarytas iš kelių struktūrinių genų, kontroliuojamų
vieno promotoriaus
 Jis koduoja policistroninę mRNR, turinčią dviejų ar
daugiau struktūrinių genų koduojančias sekas
 Jis leidžia bakterijai koordinuotai reguliuoti grupę genų,
kurie koduoja baltymus, atliekančius panašias funkcijas
 Operoną sudaro keletas įvairių sričių
 Promotorius; operatorius; struktūriniai genai; terminatorius
lac operonas
6-8

9. 6-9
 lac operoną sudaro du atskiri transkripciniai vienetai
 1. Tikrasis lac operonas

a. DNR elementai
 Promotorius  Jungiasi RNR polimerazė
 Operatorius  Jungiasi lac baltymas represorius
 CAP vieta  Jungiasi katabolizmą aktyvinantis baltymas (CAP -
Catabolite Activator Protein)

b. Struktūriniai genai
 lacZ  Koduoja β-galaktozidazę

Fermentiškai skaido laktozę ir jos analogus

Verčia laktozę į alolaktozę (izomerą)
 lacY  Koduoja laktozės permeazę

Membraninis baltymas, reikalingas laktozės transportui į ląstelę
 lacA  Koduoja transacetilazę

Kovalentiškai modifikuoja laktozę ir jos analogus

Funkcinė paskirtis kol kas neaiški

10. 6-10
 2. lacI genas
 Nėra lac operono sudedamoji dalis
 Turi savo promotorių (i promotorių)
 Vyksta palyginti neintensyvi, tačiau pastovi ekspresija
 Koduoja lac represorių
 lac represoriaus baltymas funkcionuoja kaip tetrameras
 lac operono represijai reikia labai nedidelio represoriaus baltymo
kiekio

Vienoje ląstelėje paprastai randama dešimt tetramerinių
represoriaus baltymų
 lac operoną sudaro du atskiri transkripciniai vienetai

11. 6-11
Laktozės permeazės ir β-galaktozidazės funkcijos bakterijų ląstelėse

12.  lac operoną transkripciškai gali reguliuoti
 1. Represoriaus baltymas
 2. Aktyvatoriaus baltymas
 Pirmuoju atveju veikia indukuojamas neigiamos
kontrolės mechanizmas
 Jame dalyvauja lac represoriaus baltymas
 Induktorius yra alolaktozė

Ji prisijungia prie lac represoriaus ir jį inaktyvina
lac operoną reguliuoja baltymas
represorius
6-12

13. 6-13
Todėl nėra ir alolaktozės
RNR pol
negali pasiekti
promotoriaus
lac operonas
represuotas
a) Aplinkoje laktozės nėra
Pastovi
ekspresija
lac represorius jungiasi
prie operono ir
inhibuoja transkripciją

14. 6-14
Represoriaus konformacija
pakinta
Kažkiek jos pavirsta į alolaktozę
Jis daugiau nebegali
jungtis prie operatoriaus
lac operonas
indukuotas
b) Aplinkoje yra laktozės

15. 6-15
lac operono indukcijos ir represijos ciklas
Represorius nepilnai inhibuoja
transkripciją
Todėl sintetinami labai maži
fermentų kiekiai
Į ląstelę patenka nedidelis kiekis
laktozės, kurią β-galaktozidazė
verčia į alolaktozę.
Represorius atsikabina nuo
operatoriaus
Sintetinami lac operono
baltymai. Tai skatina
efektyvų laktozės
metabolizmą
Laktozės ištekliai išsenka.
Alolaktozės kiekis sumažėja.
Represoriaus baltymas
jungiasi prie operatoriaus
Dauguma baltymų,
dalyvaujančių laktozės
įsisavinime, degraduoja

16.  Detalūs genetiniai ir kristalografiniai tyrimai parodė,
kad lac represoriaus prisijungimas yra sudėtingesnis
procesas, nei manyta anksčiau
 Iš viso buvo nustatytos trys operatoriaus vietos
 O1  Tuoj pat už promotoriaus
 O2  Pasroviui lacZ koduojančioje srityje
 O3  Šiek tiek prieš srovę CAP vietos atžvilgiu
lac operonas turi tris operatoriaus
vietas lac represoriui prisijungti
6-16

17. 6-17
Trijų lac operatoriaus vietų nustatymas
Represijos laipsnis 1,300 kartų
Taigi, transkripcijos lygis yra
1/1,300 palyginus su lygiu, kai
terpėje yra laktozės
Represijos nėra
t.y.: pastovi ekspresija

18.  Šie rezultatai patvirtina hipotezę, kad efektyvi
represija vyksta tada, kai lac represorius jungiasi prie
dviejų iš trijų operatorių
 Jis gali jungtis prie O1 ir O2 , arba prie O1 ir O3,
 tačiau ne prie O2 ir O3
 Jei trūksta O2 arba O3, maksimali ekspresija nėra
pasiekiama
 lac represoriaus prisijungimas prie dviejų
operatoriaus vietų reikalauja DNR kilpos
susiformavimo
 DNR kilpa suartina operatorių vietas

Tai palengvina represoriaus baltymo prisijungimą
6-18

19. 6-19
Kiekvienas
represoriaus
dimeras jungiasi
prie vieno
operatoriaus
Kiekvienas
represoriaus
dimeras jungiasi
prie vieno
operatoriaus
DNR kilpų, kurias suformuoja prisijungdamas lac represorius, konfigūracija

20.  lac operonas gali būti transkripciškai reguliuojamas
ir kitu būdu, kuris vadinamas katabolitų represija
 Jei aplinkoje yra tiek laktozės, tiek ir gliukozės,
 E. coli pradžioje naudoja gliukozę, o katabolitų represija
neleidžia naudoti laktozę.
 Kai gliukozės atsargos išsenka, katabolitų represija
susilpnėja ir vyksta lac operono ekspresija
lac operoną taip pat reguliuoja ir
baltymas aktyvatorius
6-20

21.  Pati gliukozė nėra ta maža efektoriaus molekulė,
reguliuojanti lac operono veiklą katabolitų represijos
būdu.
 Šiame genetinės reguliacijos būde dalyvauja maža
molekulė, vadinama cikline AMP (cAMP)
 Ją iš ATP gamina fermentas adenililciklazė
 cAMP jungiasi prie baltymo aktyvatoriaus, vadinamo CAP
(Catabolite Activator Protein)
lac operoną taip pat reguliuoja ir
baltymas aktyvatorius
6-21

22.  cAMP-CAP kompleksas vykdo indukuojamą teigiamą
genetinę kontrolę
 cAMP-CAP kompleksas jungiasi prie CAP vietos, esančios
netoli lac promotoriaus, ir skatina transkripciją
 Esant gliukozės fermentas adenililciklazė
inhibuojamas
 Tai sumažina cAMP kiekį ląstelėje

Todėl cAMP nebeprisijungia prie CAP
 Transcripcijos intensyvumas krenta
lac operoną taip pat reguliuoja ir
baltymas aktyvatorius
6-22

23. 6-23
(b) Ląstelėje yra laktozės, bet ne cAMP
a) Ląstelėje yra cAMP ir laktozės

24. 6-24
c) Ląstelėje yra cAMP, bet ne laktozės
d) Ląstelėje nėra nei cAMP, nei laktozės

25.  trp operonas dalyvauja aminorūgšties triptofano
biosintezėje
 Genai trpE, trpD, trpC, trpB ir trpA koduoja fermentus,
dalyvaujančius triptofano biosintezėje
 Genai trpR ir trpL dalyvauja reguliacijoje

trpR  Koduoja trp represoriaus baltymą
 Dalyvauja represijoje

trpL  Koduoja trumpą peptidą, vadinamą “Lyderiu”
 Dalyvauja procese, vadinamame ateniuacija
trp operonas
6-25

26. 6-26
trp operono sandara ir veiklos reguliavimas, dalyvaujant trp
represoriaus baltymui
Negali prisijungti
prie operatoriaus
vietos
RNR pol gali
prisijungti prie
promotoriaus
a) Mažai triptofano, vyksta viso operono transkripcija

27. 6-27
trp operono sandara ir veiklos reguliavimas, dalyvaujant trp
represoriaus baltymui
b) Daug triptofano, vyksta operono represija

28. 6-28
trp operono sandara ir veiklos reguliavimas, dalyvaujant trp
represoriaus baltymui
Kitas reguliacijos
mechanizmmas
c) Daug triptofano, vyksta ateniuacija

29.  Ateniuacija vyksta bakterijose dėl to, kad jose transkripcija ir
transliacija gali vykti vienu metu
 Vykstant ateniuacijai transkripcija prasideda, tačiau ji
nutrūksta dar nepasigaminus pilnai mRNR
 Tokiai terminacijai vykti yra svarbus DNR segmentas, vadinamas
ateniuatoriumi (silpnintuvu)
 trp operone transkripcija sustoja netoli po trpL srities
 Toiu būdu ateniuacija sustabdo tolesnę triptofano biosintezę
 trp operono segmentas, esantis iš karto pasroviui nuo
operatoriaus vietos yra esminis ateniuacijai vykti
 Pirmasis trp operono genas yra trpL

Jis koduoja trumpą peptidą, vadinamą “Lyderiu”
6-29

30. 6-30
trpL mRNR seka, gaunama ateniuacijos metu
Dėka šių dviejų kodonų yra
nustatoma, ar yra pakankamai
triptofano transliacijai vykti
Paskui 3-4 kilpą seka U seka
 2-a sritis yra komplementari 1-ai ir 3-iai sritims
 3-ia sritis yra komplementari 2-ai ir 4-ai sritims
 Todėl gali susidaryti keletas “smeigtuko galvučių”
Ji veikia kaip vidinis
(nuo ρ nepriklausomas)
terminatorius

31.  “Smeigtuko galvutės” formavimasis tarp 3-4 sričių
priverčia RNR pol pabaigti transkripciją trpL geno
pabaigoje
 3-4 “smeigtuko galvutės” susidarymas priklauso
nuo trpL mRNR transliacijos
 Galimi trys variantai
 1. Transliacijos nėra
 2. Ląstelėje triptofano mažai
 3. Ląstelėje triptofano daug
6-31

32. 6-32
“Smeigtuko galvutės” struktūrų formavimasis priklausomai
nuo transliacijos sąlygų
Nevyksta vienalaikė transliacija ir
transkripcija
Gaunama stabiliausia
mRNR forma
Transkripcija sustoja iš
karto už trpL geno
a) Transliacijos nėra

33. 6-33
“Smeigtuko galvutės” struktūrų formavimasis priklausomai
nuo transliacijos sąlygų
Nepakankamas
tRNRtrp
kiekis
1-a sritis blokuojama
Struktūra tarp 3-4
sričių nesusidaro
RNR pol transkribuoja
likusią operono dalį
b) Ląstelėje triptofano mažai, susidaro struktūra tarp 2-3 sričių

34. 6-34
“Smeigtuko galvutės” struktūrų formavimasis priklausomai
nuo transliacijos sąlygų
Pakankamas tRNRtrp
kiekis
trpL mRNR transliacija vyksta
iki stop kodono
2-oji sritis negali sudaryti
bazių porų su jokia kita sritimi
Susiformuoja
“smeigtuko galvutė “
tarp 3-4 sričių
Transkripcija
sustoja
RNR polimerazė sustoja
c) Ląstelėje triptofano daug, susidaro struktūra tarp 3-4 sričių

35.  Daugelio operonų tyrimai išryškino bendrąsias
indukcinės ir represinės reguliacijos ypatybes
 Operonai, dalyvaujantys katabolizme (t.y., medžiagų
skaidyme), dažniausiai yra indukuojami

Medžiaga, kuri turi būti skaidoma (arba susiję junginiai), yra
induktoriai
 Operonai, dalyvaujantys anabolizme (t.y., medžiagų
biosintezėje) dažniausiai yra represuojami

Inhibitorius arba korepresorius yra maža molekulė, kuri yra
operono produktas
Indukcinė ir represinė reguliacija
6-35

36.  Bakterijų genų reguliacija dažniausiai vyksta
transkripcijos lygmenyje
 Tačiau taip pat yra nemažai pavyzdžių tokios reguliacijos,
kuri vyksta vėlesnėse genų ekspresijos stadijose
 Pavyzdžiui, genų ekspresijos reguliacija taip pat gali
būti:
 transliacinė
 potransliacinė
6.3. TRANSLIACINĖ IR
POTRANSLIACINĖ
REGULIACIJA
6-36

37.  Kai kurių bakterinių genų mRNR transliacija yra
reguliuojama prisijungiant baltymams
 Transliaciniai reguliaciniai baltymai atpažįsta
sekas, esančias mRNR
 Daugeliu atveju tokie baltymai inhibuoja transliaciją
 Jie vadinami transliaciniais represoriais
Transliacinė reguliacija
6-37

38.  Transliaciniai represoriai inhibuoja transliaciją vienu iš
dviejų būdų:
 1. Prisijungdami šalia Shine-Dalgarno sekos ir/ar starto
kodono

Tai steriškai trukdo ribosomoms inicijuoti transliaciją
 2. Prisitvirtindami už Shine-Dalgarno sekos/starto kodono ribų

Jie stabilizuoja antrinę mRNR struktūrą taip, kad nevyktų iniciacija
 Transliacinė represija taip pat aptinkama eukariotuose
Transliacinė reguliacija
6-38

39.  Antrasis transliacinės reguliacijos būdas yra
antiprasminės (antisense) RNR sintezė
 Tai yra RNR grandinė, kuri komplementari mRNR
 Tokiu būdu yra reguliuojamas E.coli genas,
atsakingas už osmoreguliaciją -
 sugebėjimą kontroliuoti vandens kiekį ląstelėje
 E. coli baltymas ompF yra svarbus osmoreguliacijai

Jį koduoja ompF genas (outer membrane protein F)

OmpF baltymas yra sintetinamas esant žemam osmoziniam slėgiui
 Esant aukštam osmoziniam slėgiui jo sintezė sumažėja
Transliacinė reguliacija
6-39

40. 6-40
 Už ompF geno inhibiciją esant aukštam osmoziniam slėgiui
yra atsakingas kitas genas, vadinamas micF
 micF RNR nekoduoja baltymo
 Tačiau ji yra komplementari geno ompF mRNR

Todėl ji vadinama antiprasmine RNR
Jos transliacija blokuojama

41.  Įprastas metabolizmo fermentų aktyvumo
reguliacijos būdas yra grįžtamojo ryšio (feedback)
inhibicija
 Galutinis metabolizmo kelio produktas gali inhibuoti
fermentą, veikiantį ankstyvosiose kelio stadijose
Potransliacinė reguliacija
6-41

42. 6-42
 Jei 3-io produkto koncentracija
pasidaro didelė,
 jis jungiasi prie 1-o fermento,
 taip inhibuodamas jo gebėjimą
paversti 1-ą substratą 1-u produktu
 Fermentas 1 yra alosterinis
fermentas, turintis dvi skirtingas
prisijungimo vietas
 Katalitinę vietą  jungiasi
substratas
 Reguliacinę vietą  jungiasi
galutinis produktas

43.  Kita baltymų funkcijos kontrolės strategija yra jų
struktūros kovalentinė modifikacija
 Kai kurios modifikacijos yra negrįžtamos
 Proteolitinis perdirbimas
 Prostetinių grupių, karbohidratų ar lipidų prijungimas
 Kitos modifikacijos yra grįžtamos ir baltymų funkciją
paveikia laikinai
 Fosforilinimas (–PO4)
 Acetilinimas (–COCH3)
 Metilinimas (–CH3)
Potransliacinė reguliacija
6-43

44. 6.4. EUKARIOTŲ GENŲ VEIKLOS
REGULIACIJOS APŽVALGA
 Eukariotų organizmai gauna daug naudos iš genų
veiklos reguliavimo
 Pavyzdžiui:
 Jie gali reaguoti į maisto prieinamumo pokyčius
 Jie gali reaguoti į aplinkos stresus
 Augalų ir gyvūnų daugialąstiškumas ir sudėtingesnė
ląstelės struktūra taip pat reikalauja ir žymiai
didesnės ir įvairesnės genų ekspresijos
6-44

45. 6.4. EUKARIOTŲ GENŲ VEIKLOS
REGULIACIJOS APŽVALGA
 Genų reguliacija būtina užtikrinant:
 1. Taisyklingą genų ekspresiją įvairių vystymosi
stadijų metu

Kai kurių genų ekspresija vyksta tik embrione, tuo tarpu
kitų – tik suaugusiame organizme
 2. Skirtumus tarp skirtingų ląstelių tipų

Nervų ir raumenų ląstelės atrodo tokios skirtingos tik
dėl to, kad skiriasi jų genų reguliacija (o ne DNR sekos)
6-45

46. 6.4. EUKARIOTŲ GENŲ VEIKLOS
REGULIACIJOS APŽVALGA
 Eukariotų genų ekspresija reguliuojama šiuose lygmenyse:
 Transkripcijos

Reguliaciniai transkripcijos veiksniai gali indukuoti arba inhibuoti
transkripciją

Chromatino kompaktizacijos laipsnis veikia transkripciją

DNR metilinimas (dažniausiai) inhibuoja transkripciją
 RNR brendimo

Alternatyvus splaisingas keičia egzonų pasirinkimą

RNR redagavimas pakeičia bazių sekas mRNR
 Transliacijos

Iniciacijos faktorių veikla gali būti modifikuojama fosforilinant

Transliaciją gali reguliuoti baltymai, prisijungiantys prie mRNR 5’ galo

mRNR stabilumas gali keistis dėl prisijungiančių baltymų
 Potransliaciniame

Baltymų funkcija gali būti modifikuojama grįžtamojo ryšio inhibicijos būdu
bei kovalentinės modifikacijos būdais
6-46

47.  Transkripcijos faktoriai yra baltymai, veikiantys RNR
polimerazės sugebėjimą transkribuoti tam tikrą geną
 Skiriami dviejų pagrindinių tipų transkripcijos faktoriai
 Bendrieji transkripcijos faktoriai

Reikalingi RNR pol prisijungti prie pagrindinio promotoriaus ir
perėjimui prie elongacijos

Būtini bazinei transkripcijai
 Reguliaciniai transkripcijos faktoriai

Reguliuoja šalia esančių genų transkripciją

Daro įtaką RNR pol sugebėjimui pradėti tam tikro geno transkripciją
6.5. REGULIACINIAI
TRANSKRIPCIJOS FAKTORIAI
6-47

48.  Reguliaciniai transkripcijos faktoriai atpažįsta
reguliacinius cis elementus, išsidėsčiusius šalia
pagrindinio promotoriaus
 Šios sekos vadinamos atsako, kontrolės arba
reguliaciniais elementais
 Susijusio geno transkripciją veikia baltymai
(reguliaciniai transkripcijos faktoriai), prisijungiantys
prie šių elementų
 Reguliaciniai baltymai, skatinantys transkripciją, vadinami
aktyvatoriais

Seka, prie kurios jie jungiasi, vadinama enhanseriu (stiprintuvu)
 Reguliaciniai baltymai, slopinantys transkripciją, vadinami
represoriais

Seka, prie kurios jie jungiasi, vadinama sailenseriu (duslintuvu)
6-48

49. 6-49
a) Genų aktyvacija
b) Genų represija

50.  Transkripcijos faktorių baltymai turi regionus,
vadinamus domenais, atliekančius specifines
funkcijas
 Vienas domenas gali būti jungimosi su DNR vieta
 Kitas domenas gali būti jungimosi su efektoriaus
molekulėmis vieta
 Motyvas yra domenas ar jo dalis, kurio(s) struktūra
yra labai panaši daugelyje skirtingų baltymų
Reguliacinių transkripcijos faktorių
struktūrinės ypatybės
6-50

51. 6-51
Atpažinimo spiralės atpažįsta ir sudaro kontaktus su
bazių sekomis palei DNR didįjį griovelį
Vienas iš transkripcijos faktorių prisijungimo prie DNR
būdų yra vandenilinių jungčių sudarymas tarp α
spiralės ir DNR bazių
Spiralės-posūkio-spiralės
elix-turn-helix) motyvas
b) Spiralės-kilpos-spiralės
(helix-loop-helix) motyvas Spiralės-kilpos-spiralės motyvai
gali dalyvauti baltymų
dimerizacijoje
Homodimerus suformuoja du
identiški transkripcijos faktoriai;
Heterodimerus suformuoja du
skirtingi transkripcijos faktoriai

52. 6-52
Sudarytas iš vienos α spiralės
ir dviejų β klosčių, palaikomų
kartu cinko metalo jonų (Zn++)
Dvi α spiralės,
susipynusios dėl leucino
motyvų
Besikaitaliojančios leucino liekanos
abiejuose baltymuose sąveikauja, dėl
ko vyksta baltymo dimerizacija
c) Cinko “pirštelių” (zinc fingers)
motyvas
d) Leucino “užtrauktuko” (leucine zipper)
motyvas

53.  Transkripcijos faktorių prisitvirtinimas prie enhanserio
padidina transkripcijos laipsnį (nuo 10 iki 1000 kartų)
 Transkripcijos faktorių prisitvirtinimas prie sailenserio
sumažina transkripcijos laipsnį
 Daugelis reguliacinių elementų yra nepriklausomi nuo
orientacijos arba dvikrypčiai
 Jie gali funkcionuoti tiek pirmyn, tiek ir atgal
 Dauguma reguliacinių elementų yra išsidėstę kelių šimtų
nukleotidų atstumu “prieš srovę” nuo promotoriaus
 Tačiau kai kurie randami ir kitur

Už keleto tūkstančių nukleotidų

Pasroviui nuo promotoriaus

Netgi intronuose!
Enhanseriai ir sailenseriai
6-53

54.  Dauguma reguliacinių transkripcijos faktorių tiesiogiai
nesijungia su RNR polimeraze
 Reguliacinių transkripcijos faktorių poveikį RNR
polimerazei perduoda du ląstelėje dažnai aptinkami
baltymų kompleksai
 1. TFIID
 2. Mediatorius
TFIID ir mediatorius
6-54

55. 6-55
Bendrasis transkripcijos
faktorius, kuris jungiasi prie
TATA dėžutės
Pritraukia RNR polimerazę prie
promotoriaus
 Transkripcijos aktyvatorius pritraukia
TFIID prie promotoriaus ir/ar aktyvina jo
funkciją
 Taigi, vyksta transkripcijos aktyvacija
 Transkripcijos represorius inhibuoja
TFIID prisijungimą prie promotoriaus
arba slopina jo funkciją
 Vyksta transkripcijos represija
a) Reguliaciniai transkripcijos faktoriai ir TFIID

56. 6-56
 Transkripcijos aktyvatorius stimuliuoja
mediatoriaus funkciją
 Šis leidžia RNR pol suformuoti
preiniciacijos kompleksą
 Po to prasideda transkripcijos elongacijos
fazė
 Transkripcijos represorius slopina
mediatoriaus funkciją
 Transkripcija stabdoma
STOP
b) Reguliaciniai transkripcijos faktoriai ir mediatorius

57.  Reguliacinių transkripcijos faktorių funkcijai gali turėti
įtakos:
 1. Efektoriaus molekulės prisijungimas
 2. Baltymų tarpusavio sąveika
 3. Kovalentinė modifikacija
Kaip reguliuojami reguliaciniai
transkripcijos faktoriai?
6-57

58. 6-58
Transkripcijos faktorius
dabar gali prisijungti prie
DNR
Homodimerų ir
heterodimerų
formavimasis
a) Efektoriaus molekulės (pvz., hormono) prisijungimas
b) Baltymų tarpusavio sąveika
c) Potransliacinė modifikacija, pvz., fosforilinimas

59.  Chromatino struktūros pokyčiai atsiranda dėl DNR
struktūros pokyčių ir/ar dėl chromatino
kompaktiškumo pokyčių
 Tokie pokyčiai gali būti
 1. Genų amplifikacija
 2. Genų pertvarkymai
 3. DNR metilinimas
 4. Chromatino glaudinimas
6.6. CHROMATINO
STRUKTŪROS POKYČIAI
6-59
Retai taikomi genų ekspresijos
reguliavimo būdai
Įprastiniai genų ekspresijos
reguliavimo būdai

60.  Genų amplifikacija yra retai
naudojamas genų veiklos
reguliavimo mechanizmas
 Dėl amplifikacijos labai padaugėja
tam tikrų genų kopijų

rRNR genų amplifikacija Xenopus laevis
ovocituose

Kai kurių genų amplifikacija vėžinėse
ląstelėse
 Susiformuoja žiedinės molekulės,
sudarančios smulkias acentromerines
chromosomas, vadinamas mažosiomis
taškinėmis chromosomomis (double
minutes; dmin)
6-60
Genų pertvarkymai stebimi tam tikrais specifiniais
atvejais

Pavyzdžiui, vyksta imunoglobulinų genų pertvarkymai,
užtikrinantys skirtingų antikūnų baltymų kodavimą.

61.  Erdvinė chromatino struktūra yra svarbus genų
ekspresijos reguliavimo mechanizmas
 Chromatinas yra labai dinamiška struktūra, kurios
konformacija keičiasi ir įgyja vieną iš dviejų galimų
būvių
 Uždara konformacija
 Chromatinas labai kompaktiškas
 Transkripcija labai apsunkinta arba iš viso neįmanoma
 Atvira konformacija
 Chromatinas stipriai dekondensuotas
 Gali vykti transkripcija
Chromatino struktūra
6-61

62.  Chromatino supakavimo laipsnio kitimai eukariotų
chromosomose vyksta interfazėje
 Vykstant genų aktyvacijai uždaras chromatinas turi virsti
atviru chromatinu

Tik tada gali vykti transkripcija
6-62
Pavyzdys gali būti varliagyvių ovocitų
chromosomos
Chromosoma nesuformuoja 30 nm siūlo
Vietoje to susidaro daug dekondensuotų
radialinių kilpų

Tai yra tos DNR sritys, kurių genai aktyviai
transkribuojami
Šios chromosomos pavadintos lempų
šepečiais (lampbrush chromosomes)

Jos primena šepetėlius, kadaise naudotus
žibalinėms lempoms valyti nuo suodžių

63.  Globino genų ekspresija vyksta retikuliocituose
 Tačiau individualių šios genų šeimos narių ekspresija
vyksta skirtingomis vystymosi stadijomis
 Pavyzdžiui:
 β-globinas  Suaugusiame organizme
 γ-globinas  Vaisiuje
 Kai kurie žmogaus globino genai yra išsidėstę 11-oje
chromosomoje šalia vienas kito
Globino genų ekspresija
6-63

64.  Talasemija yra vieno ar daugiau globino genų ekspresijos
defektas
 Įdomu, kad kai kurių talasemija sergančių pacientų organizmai
nesugeba sintetinti β globino, nors ir turi normalų jo geną
6-64
 Šio tipo talasemija atsiranda dėl DNR delecijos, įvykusios
prieš srovę nuo β globino geno
 β globino genas yra sveikas
 Tačiau jis yra išjungtas
DNR segmentų delecijos, randamos skirtingose žmonių
populiacijose

65. 6-65
 Prieš srovę nuo β
globino geno buvo
nustatyta DNR sritis,
būtina globino geno
ekspresijai
 Ši sritis pavadinta
lokuso kontrolės
regionu (locus control
region - LCR)
 Ji padeda reguliuoti
chromatino konformaciją
 Jos trūksta kai kurių
pacientų, sergančių
talasemija, DNR
Dabar genus gali pasiekti
RNR pol ir transkripcijos
faktoriai

66.  Šalia chromatino supakavimo laipsnio, kita
chromatino struktūrinė ypatybė, turinti įtakos genų
veiklai, yra nukleosomų padėtis
 Chromatine nukleosomos dažniausiai yra išsidėstę
ant DNR maždaug vienodais intervalais
 Tačiau nukleosomų padėtis chromatine gali keistis, kai
vyksta geno ekspresija
 Jų padėtis nesikeičia genuose, kurie neaktyvūs, pvz., esantys
kituose audiniuose
Globino genų ekspresija
6-66

67. 6-67
Nukleosomos padėties pokyčiai aktyvuojantis β globino genui
Išsidėstę reguliariais intervalais nuo -3000 iki + 1,500
Išsidėstymo reguliarumo sutrikimas
intervale nuo -500 iki + 200
a) Nukleosomų išsidėstymas fibroblastų β globino gene, kurio ekspresija nevyksta
b) Nukleosomų išsidėstymas retikuliocitų β globino gene, kurio ekspresija yra intensyvi

68.  Chromatino struktūra yra keičiama dviem įprastiniais
būdais
 1. Histonų kovalentinė modifikacija
 2. Nuo ATP priklausomas chromatino struktūros
pertvarkymas
Chromatino struktūros
pertvarkymas (remodeling)
6-68

69.  1. Kovalentinė histonų modifikacija
 Histonų polipeptidų galai yra modifikuojami įvairiais
būdais

Tai gali būti acetilinimas; fosforilinimas; metilinimas
6-69
Prikabina acetilo grupes; taip
susilpninamos histonų ir
DNR sąveikos
Pašalina acetilo grupes;
sąveikos atsistato
a) Histonų acetilinimas

70. 6-70
SWI/SNF šeimos baltymai
Akronimai nurodo, kokie pokyčiai
stebimi mielėse, jei fermentai
neveiklūs
SWI mutantai nesugeba atlikti
poravimosi tipo perjungimo
(switching)
SNF mutantai nefermentuoja
sacharozės (sucrose non-
fermenters)
Šie pokyčiai gali žymiai paveikti genų
ekspresijąb) Chromatino struktūros pertvarkymas
 2. Nuo ATP priklausomas chromatino struktūros
pertvarkymas
 ATP energija yra naudojama nukleosomų struktūrai pakeisti.
Tada DNR lengviau gali pasiekti transkripcijos baltymai

71.  Svarbi tranckripcijos aktyvatorių funkcija yra pritraukti
anksčiau paminėtus baltymus prie promotoriaus
 Gerai ištyrinėtas pavyzdys yra mielių genas,
dalyvaujantis poravimosi procese
 Mielės gali būti a ir α poravimosi tipo
 Persijungimą iš vieno tipo į kitą koduoja genas HO
Chromatino struktūros
pertvarkymas (remodeling)
6-71

72. 6-72
SWI pavadinimas kilęs
nuo “switching”
SAGA yra akronimas nuo
Spt/Ada/GCN5/Acetyltransferase
Histonų acetiltransferazė gali
transkripciškai reguliuoti genų veiklą

73. 6-73
SBP yra akronimas nuo
“mating type switching cell
cycle box protein”
RNR polimerazė
Atvira konformacija leidžia
prisijungti prie enhanserio
antram transkripcijos
aktyvatoriui (SBP)
Šis antrasis transkripcijos aktyvatorius
pritraukia RNR polimerazę ir bendruosius
transkripcijos faktorius prie promotoriaus.
Tai inicijuoja transkripciją

74.  DNR metilinimas yra chromatino struktūros pokytis,
nutildantis genų ekspresiją
 Jis būdingas daugeliui, tačiau ne visoms eukariotų
rūšims
 Mielių ir drozofilos DNR yra mažai metilinta
 Stuburinių ir augalų DNR yra ženkliai metilinta

Žinduolių DNR yra metilinta ~ 2 iki 7%
DNR metilinimas
6-74

75. 6-75
(arba DNR metilazė) CH3
CH3
CH3
Tik viena grandinė
metilinta
Abidvi grandinės
metilintos
a) Citozino metilinimas
b) Nemetilinta
c) Hemimetilinta
d) Pilnai metilinta

76.  DNR metilinimas paprastai inhibuoja eukariotų
genų transkripciją
 Ypač, jei metilinimas vyksta promotoriaus srityje
 Daugelis stuburinių ir augalų genų šalia savo
promotorių turi CpG sąleles
 Šių CpG sąlelių ilgis yra 1,000 - 2,000 nukleotidų
 Namų ruošos (housekeeping) genų

CpG sąlelės yra nemetilintos

Šių genų ekspresija vyksta daugelio audinių ląstelėse
 Specifinių audinių genų

ekspresija gali būti nutildyta metilinant CpG sąleles
6-76

77. 6-77
Transkripcinis nutildymas metilinant DNR
Transkripcijos
aktyvatoriai jungiasi
prie nemetilintos DNR
Tai inhibuoja transkripcijos
iniciaciją
a) Metilinimas inhibuoja transkripcijos aktyvatorių prisijungimą
Metilinimas
Metilo grupės blokuoja
transkripcijos aktyvatoriaus
prisijungimą prie
enhanserio

78. 6-78
Transkripcinis nutildymas metilinant DNR
b) metil-CpG surišantis baltymas pritraukia kitus baltymus, kurie
kompaktizuoja chromatiną
Metil-cpG surišantis baltymas
prisitvirtina prie metilintos
CpG sąlelės
Metil-CpG surišantis baltymas
pritraukia kitus baltymus, tokius
kaip histonų deacetilazė, kurie
pertvarko chromatiną į uždarą
konformaciją

79.  Metilintos DNR sekos yra paveldimos ląstelėms
dalijantis
 Po replikacijos tik viena DNR grandinė yra metilinta
(hemimetilinta DNR). Tai inicijuoja kitos DNR
grandinės metilinimą
DNR metilinimas yra paveldimas
6-79

80. CH3
CH3
CH3
CH3 Hemimetilinta DNR
DNR metilazė verčia
hemimetilintą DNR į
pilnai metilintą
Tai labai veiksmingas,
tačiau ir įprastas įvykis,
vykstantis žinduolių ir
augalų ląstelėse
CH3
CH3CH3
CH3
Einamasis metilinimas
6-80
DNR
replikacija
Metilinimas de novo
Retas labai
reguliuojamas įvykis

81. 6-81
 DNR metilinimas gali
veikti ne tik pavienių genų,
tačiau ir visų chromosomų
transkripciją
 Metilinant DNR yra
inaktyvinama žinduolių
viena X chromosoma

X chromosomos inaktyvinimas
vyksta atsitiktinai. Todėl jei X
chromosomoje esantis genas
yra heterozigotinėje būsenoje ir
koduoja morfologinį požymį,
tokios atsitiktinės inaktyvacijos
pasekmės yra matomos
fenotipiškai

Pavyzdys yra kačių kailio
spalva
 Calico
 Tortoiseshell

82.  Eukariotų organizmuose gana įprasta genų
ekspresiją reguliuoti ir RNR lygmenyje
 Galimi įvairūs tokios reguliacijos būdai
 Alternatyvus splaisingas
 RNR redagavimas
 RNR stabilumo keitimas
 RNR interferencija
6.7. RNR BRENDIMO IR
TRANSLIACIJOS REGULIACIJA
6-82

83.  Introninei eukariotų genų struktūrai labai svarbų
biologinį pranašumą suteikia reiškinys, vadinamas
alternatyviu splaisingu
 Alternatyvus splaisingas reiškia, kad pre-mRNR
splaisingas gali vykti daugiau negu vienu būdu
 Daugeliu atveju tai sukuria dvi alternatyvias versijas
baltymo, turinčio panašią funkciją

Taip yra dėl to, kad daugelis jų aminorūgščių sekų yra identiškoas
 Tačiau susidarančio sekų skirtumo pakanka, kad kiekvienas
baltymas pasižymmėtų tik jam būdingomis savybėmis
Alternatyvus splaisingas
6-83

84.  Splaisingo ir alternatyvaus splaisingo laipsnis labai
nevienodas skirtingų rūšių organizmuose
 Kepimo mielės turi maždaug 6,000 genų

~ 300 (t.y., 5%) koduoja mRNR, kurių splaisingas vyksta
 Tik keletui iš šių 300 genų būdingas alternatyvus splaisingas
 Žmogus turi ~ 35,000 genų

Daugumos šių genų mRNR būdingas splaisingas
 Manoma, kad ne mažiau kaip vienas trečdaliui būdingas alternatyvus
spaisingas
 Pastaba: Kai kurių mRNR alternatyvus splaisingas vyksta taip, kad
yra pagaminama dešimtys ar net šimtai skirtingų mRNR
Alternatyvus splaisingas
6-84

85.  Alternatyvus splaisingas nėra atsitiktinis reiškinys
 Specifiniai splaisingo būdai ląstelėje yra reguliuojami
 Šioje reguliacijoje dalyvauja baltymai, vadinami
splaisingo faktoriais
 Jie svarbūs pasirenkant splaisingo vietas
 Vienas iš splaisingo faktorių pavyzdžių yra SR baltymai
 Jų terminaliniame C gale yra domenas, turintis daug serino
(S) ir arginino (R)

Šie baltymai dalyvauja baltymų tarpusavio atpažinimo procesuose
 Jų terminaliniame N gale yra prisijungimo prie RNR domenas
Alternatyvus splaisingas
6-85

86.  Splaisosoma atpažįsta 5’ ir 3’ splaisingo vietas ir
pašalina įsiterpusį introną
 Splaisingo faktoriai moduliuoja splaisosomos
sugebėjima atpažinti ir pasirinkti splaisingo vietas
 Tai gali vykti dviem būdais
 1. Kai kurie splaisingo faktoriai inhibuoja splaisosomos
sugebėjimą atpažinti splaisingo vietą (splaisingo
represoriai)
 2. Kai kurie splaisingo faktoriai sustiprina splaisosomos
sugebėjimą atpažinti splaisingo vietą (splaisingo
enhanseriai)
6-86
Alternatyvus splaisingas

87. 6-87
Splaisingo faktorių reišmė vykstant alternatyviam splaisingui
a) Splaisingo represoriai

88. 6-88
Splaisingo faktorių reišmė vykstant alternatyviam splaisingui
b) Splaisingo enhanseriai

89.  RNR redagavimas reiškia nukleotidų sekos
pakeitimą RNR molekulėje
 Gali būti tam tikrų bazių pašalinimas arba įterpimas į
seką

Arba vienos bazės virtimas (konversija) kita
 RNR redagavimo pasekmės mRNR yra įvairios
 Starto arba stop kodonų sukūrimas
 Koduojančios sekos pasikeitimas
RNR redagavimas
6-89

90.  RNR redagavimas pirmiausia buvo aptiktas
tripanosomose
 Šiame procese dalyvauja RNA gidas (guide)
 RNR gidas gali nurodyti vieno ar daugiau uracilų
įterpimą ar pašalinimą iš RNR
RNR redagavimas
6-90

91. 6-91
3’ galai turi uracilų
seką
Pirmiausia, 5’ inkaras
jungiasi su
redaguojama RNR
Kerpa redaguojamą RNR
tam tikroje vietoje
5’ galas (inkaras) yra
komplementarus
redaguojamai mRNR
RNR gido 3’ galas
patraukiamas nuo
redaguojamos RNR
Įterpia uracilus Pašalina uracilus
Sujungia dvi RNR dalis

92.  Labiau paplitęs RNR redagavimo mechanizmas yra
vienos bazės vertimas kita
 Dažniausiai tai daroma deamininant bazę
6-92
Transliacijos metu
atpažįstamas kaip
guaninas

93. RNR redagavimo
pavyzdžiai
Organizmas Redagavimo tipas Aptinkamas
Tripanosomos Uracilo nukleotidų įterpimas,
retkarčiais - pašalinimas
Daugelyje mitochondrijų mRNR
Sausumos augalai C konversija į U Daugelyje mitochondrijų ir
chloroplastų mRNR, tRNR ir
rRNR
Gleivūnai C įterpimas Daugelyje mitochondrijų mRNR
Žinduoliai C konversija į U Apolipoproteino B mRNR
A konversija į I Glutamato receptoriaus mRNR,
daugelyje tRNR
Drozofila A konversija į I Kalcio ir natrio kanalų baltymų
mRNR
6-93

94.  Eukariotų mRNR stabilumas yra labai įvairus
 Gali būti nuo kelių minučių iki keleto dienų
 mRNR stabilumas gali būti reguliuojamas taip, kad
jos gyvenimo pusamžis sutrumpėtų arba pailgėtų
 Tai stipriai veikia mRNR koncentraciją ląstelėje

Kaip pasekmė, kinta gaminamo baltymo kiekis (geno ekspreijos
laipsnis)
 mRNR stabilumą veikia šie veiksniai
 1. poliA uodegos ilgis
 2. Destabilizuojantys elementai
mRNR stabilumas
6-94

95.  1. poliA uodegos ilgis
 Dauguma naujai sintetintų mRNR turi maždaug 200
nukleotidų ilgio poliA uodegą
 Ją atpažįsta su poliA susirišantis baltymas (polyA
binding protein),

Kuris susiriša su poliA uodega ir padidina stabilumą
 Senstant mRNR jos poliA uodega trumpėja dėl ląstelėje
esančių nukleazių veiklos
 Su poliA susirišantis baltymas daugiau negali susirišti, jei
poliA uodega trumpesnė nei 10-30 adenozinų

Tokia mRNR grandinė suskaidoma egzo- ir endonukleazių
6-95

96.  2. Destabilizuojantys elementai
 Randami trumpai gyvenančiose mRNR
 Šie elementai gali būti randami bet kurioje mRNR vietoje

Tačiau labiausiai įprasta jų buvimo vieta - 3’ gale tarp stop kodono
ir poliA uodegos
6-96
3’-untranslated region5’-untranslated region
AU-rich element
Atpažįsta ir psisijungia ląstelės baltymai
Šie baltymai veikia mRNR degradaciją

97.  Dvigrandininė RNR gali nutildyti tam tikrų genų
ekspresiją
 Šis atradimas buvo padarytas tiriant augalus ir nematodę
Caenorhabditis elegans
 Naudojant klonavimo metodus į augalų genomą
galima įterpti klonuotus genus
 Kai yra įterpiama daug klonuoto geno kopijų, geno
ekspresija gana dažnai yra nutildoma

Tai gali vykti dėl dvigrandininės RNR formavimosi
Dvigrandininė RNR ir genų
nutildymas (silencing)
6-97

98. 6-98
Genų insercijos, galinčios sukelti dvigrandininės RNR susidarymą
Transkripcija vyksta nuo abiejų
promotorių
Todėl transkribuojama tiek prasminė,
tiek koduojanti matricinė
grandinės
Dėl to susidaro komplementarios RNR,
formuojančios dvigrandininę
struktūrą
Šis įvykis nutildo klonuoto
geno ekspresiją

99.  Įrodymai, kad mRNR degraduoja dėl dvigrandininės
grandinės susidarymo, buvo gauti tiriant C. elegans
 Antiprasminės RNR injekcija į ovocitus nutildo geno
ekspresiją

Netikėtai pasirodė, kad dvigrandininės RNR injekcija tai daro 10
kartų efektyviau
 Šis reiškinys buvo pavadintas RNR interferencija (RNAi)
Dvigrandininė RNR ir genų
nutildymas (silencing)
6-99

100. 6-100
Ląstelėje esanti mRNR yra
sukarpoma endonukleazių,
esančių komplekse
Trumpa RNR iš
antiprasminės grandinės
Geno, koduojančio šią
mRNR, ekspresija
nutildoma

101.  RNR interferencija yra plačiai aptinkama
eukariotuose
 Manoma, kad RNRi
 1. Yra kovos su kai kuriais virusais būdas

Ypač su turinčiais dvigrandininės RNR genomą
 2. Svarbi nutildant kai kuriuos transpozabilius elementus

Kai kurie šių elementų gamina dvigrandininę RNR kaip tarpinį
transpozicijos proceso produktą
Dvigrandininė RNR ir genų
nutildymas (silencing)
6-101

102.  Ląstelės fundamentiniai procesai dažnai
reguliuojami moduliuojant transliacijos iniciacijos
faktorius
 Esant tam tikroms sąlygoms ląstelei yra naudinga
sustabdyti baltymų sintezę
 Virusinių infekcijų atveju

Tada virusas negali gaminti virusinių baltymų
 Badaujant

Ląstelė taupo resursus
Iniciacijos faktoriai ir transliacijos
laipsnis
6-103

103.  Nustatyta, kad eukariotų transliaciją veikia iniciacijos
faktorių fosforilinimas
 Pagrindiniai iniciacijos faktoriai, kontroliuojantys
transliacijos iniciaciją yra

eIF2 ir eIF4F
 Šių dviejų faktorių fosforilinimas duoda priešingus
rezultatus
 eIF2α fosforilinimas transliaciją slopina
 eIF4F fosforilinimas transliaciją skatina
6-104

104. 6-105
Reikalingas skatinti
iniciacijos tRNAmet
jungimąsi
prie 40S subvieneto

105.  eIF4F naudoja kitą transliacijos reguliavimo kelią
 Jis reguliuoja mRNR prisijungimą prie ribosominio
iniciacijos komplekso
 Fosforilinimas eIF4F aktyvina
 Fosforilinimą stimuliuoja signalinės molekulės,
skatinančios ląstelių proliferaciją

Pavyzdžiui, augimo faktoriai ir insulinas
 Fosforilinimą mažina šiluminis šokas ir virusinės infekcijos
6-106