Dokumen tersebut membahas tentang keseimbangan genomik dan diferensial ekspresi gen pada tingkat embrio dan molekuler. Termasuk di dalamnya adalah penjelasan mengenai transdeterminasi, metaplasia, kloning, teknik kloning gen, DNA blotting, dan transfer gen seperti konjugasi, transformasi, dan transduksi.

1. Oleh : Dian Ida Lestari F. Yudha Christianti KESEIMBANGAN GENOMIK

2. Rumusan Masalah Keseimbangan Genomik dan Differensial Ekspresi Gen Tingkat Embrio Keseimbangan Genomik dan Diferensial Ekspresi Gen Tingkat Molekuler

3. Keseimbangan Genomik Pengertian : adalah suatu keadaan di mana semua sel somatik dalam tubuh berisi gen yang sama dan karenanya menciptakan makhluk seutuhnya.

4. Differensial Ekspresi Gen Setiap sel tersusun dari set gen yang sama, namun tidak semua gen di dalam sel berekspresi, sesuai dengan kondisi lingkungan internal dan eksternal sel. Hanya 3-5% saja yang di ekspresikan Misal: 1. Di dalam pankreas, gen mengekspresikan hormon insulin 2. Pada sel darah merah, gen mengekspresikan hemoglobin

5. Keseimbangan Genomik dan Diferensial Ekspresi Gen Tingkat Embrional Transdeterminasi Metaplasia Kloning

6. Transdeterminasi Merupakan proses perubahan perkembangan sel-sel imaginal menjadi struktur organ yang lainnya dari determinasi normalnya. Contoh : Imaginal discs pada Drosophila melanogaster normalnya terdeterminasi berkembang menjadi antena, akan tetapi kemudian dapat menghasilkan struktur acak pada kaki lalat/

7. Gambar Perkembangan Normal Imaginal Discs pada Drosophila melanogaster

8. Gambar imaginal discs yang mengalami transdeterminasi

9. METAPLASIA Merupakan penggantian reversible sel-sel yang terdiferensiasi dengan sel-sel terdiferensiasi dewasa lainnya. Perubahan dari satu jenis sel yang lain umumnya mungkin menjadi bagian dari proses pematangan normal atau disebabkan oleh beberapa jenis stimulus yang abnormal.

10. Contoh Pembentukan lensa baru pada Salamander dibentuk dari sel-sel iris dorsal .

11. Metaplasia pada Salamander

12. A micrograph of Barrett's esophagus . Sebuah kondisi di mana lapisan esofagus diubah oleh kontak yang terlalu lama asam lambung.

13. Kloning Dari Bahasa Yunani - klon, ranting Kumpulan turunan suatu individu yang dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DNA atau antibodi) Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya

14. Contoh Kloning Kloning pada Amfibi Kloning pada domba Dolly Kloning pada Tikus Kloning pada tumbuhan

15. Kloning pada Amfibi

16. Kloning pada Domba Dolly

17. Kloning pada Tikus

18. Kloning Tumbuhan

19. Genomic Equivalence and Differensial gene Expresion; Molecular Investigation

20. Gene cloning Transferring gene DNA and RNA blotting DNA Library The polymerase chain reaction

21. 1. Gene Cloning Metod e untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan memperbanyak suatu potongan DNA tertentu ( klon ) yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan DNA yang kompleks.

22. Gene Cloning Ketika keseluruhan DNA dari suatu organisme diekstraksi, akan diperoleh seluruh gen yang dimiliki organisme tersebut Pada kloning gen, hanya gen (DNA) tertentu yang diisolasi, dimurnikan, dan diperbanyak (diklon)

23. Tujuan mengklon Gen Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali gen tersebut Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebut Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaan Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.

24. Sumber DNA untuk diklon DNA kromosom cDNA ( complementary DNA) yang disintesis menggunakan mRNA sebagai cetakan ( template ) DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan PCR

25. Bahan / Alat untuk Mengklon Enzim endonuklease restriksi Enzim ligase Vektors (biasanya plasmid atau bakteriofage) Inang ( Host ) Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang

26. Cara Mengklon DNA (1) Isolasi vektor kloning ( plasmid bacterial ) & DNA sumber gen Pemotongan DNA sumber gen & vektor kloning menggunakan enzim restriksi yang sama Penyisipan potongan DNA sumber gen ke dalam vektor kloning yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi yang sama; potongan disambung dengan bantuan enzim DNA ligase

27. Cara Mengklon DNA (2) Vektor kloning yang telah tersisipi potongan DNA dimasukkan ke dalam sel inang (transformasi sel inang) Menempatkan sel ke dalam medium dg ampisilin dan X-gal Identifikasi sel pengklon pembawa gen yang dikehendaki

28. DNA Library Genom DNA dipotong-potong dengan menggunakan endonuklease Semua fragmen yg dihasilkan diklon secara random ke dalam vektor plasmid Sebagian besar informasi genetik akan berada dalam campuran kultur bakteri. Kultur bakteri, yang masing-masing hanya berisi satu fraksi dari genom yang membawa semua gene tersebut dikenal dengan istilah library

29. Pembuatan DNA Library

30. DNA Blotting SOUTHERN BLOTTING Teknik ini dikembangkan oleh SOUTHERN (1975) Contoh penggunaan metode ini adalah : Untuk menentukan apakah gen tertentu yang diisolasi dari suatu organisme ( misal: gen Penisilin asilase dari B. subtilis) terdapat dalam bentuk yang sama dengan yang terdapat dalam organisme lain, misal B. Megaterium Teknik lain, seperti : - NORTHERN BLOTTING -> RNA - WESTERN BLOTTING -> Protein

31. Tahap-tahapan dalam SOUTHERN BLOTTING Isolasi DNA kromosom (mis, B. megaterium) DNA dipotong -> fragmen-fragmen Fragmen dipisahkan dengan elektroforesis (gel agarosa) Fragmen DNA -> denaturasi (alkali) -> DNA s.s. Gel agarosa dijiplak pada kertas nitroselulosa Fragmen pada kertas difiksasi (pemanasan 80oC) Kertas direndam dlm larutan yg berisi probe DNA ss*(diberi radioisotop) Jika komplemen -> DNA probe akan berhibridisasi dg DNA s.s pd kertas nitroselulosa

32. SOUTHERN BLOTTING Con’t 8. Kertas diletakkan pd plat autoradiografi -> untuk melihat posisi probe yang komplemen 9. Dengan membandingkan hasil audiografi terhadap gel agarosa asli -> maka fragmen mana yg merupakan gen pembawa kode untuk enzim penicillin asilase dapat diketahui dg tepat. 10. Selanjutnya fragmen dari gel tsb dapat diisolasi. *) misal digunakan DNA probe yang berasal dari gen murni pengkode enzim Penicillin asilase (B. subtillis)

34. PCR (Polymerase Chain Reaction) Adalah suatu teknik / metode dimana setiap fragmen DNA dapat diamplifikasi atau diperbanyak berkali-kali,dengan cepat tanpa menggunakan sel. PCR dapat melipat gandakan DNA milyaran kali dalam beberapa jam. Peristiwa ini harus ada primer karena DNA polimerase akan menambahkan nukleotida hanya pada rantai nukleotida yang sudah ada sebelumnya dengan bantuan primer.

35. Manfaat PCR Memperkuat gen spesifik sebelum diklon. Membuat fragmen Gen DNA secara berlimpah Kerjanya sangat spesifik dan ampuh. Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami kelainan sebelum dilahirkan. untuk melacak asal usul seseorang dengan membandingkan “ finger print”

36. PCR (Polimerase Chain Reaction) Syarat dalam tabung reaksi terdapat : 1. Template (DNA yang telah diketahui urutannya) 2. Primer (oligonukleotida, 15-20 pb) Merupakan molekul DNA untai tunggal sintetik yang pendek yang komplemen thd ujung2 DNA target 3. Enzim polimerase -> termostabil 4. Prekursor nukleotida

37. Proses PCR Denaturasi DNA ds menjadi DNA ss (94oC, 60”) Annealing (55 oC) Sintesis (72 oC) Satu siklus : D imulai dari denaturasi, annealing sp sintesis-> 5 menit P roses polimerisasi satu molekul DNA ds menghasilkan 2 copy

38. Perbanyakan DNA dengan PCR (Polymerase Chain Reaction)

39. Transfering Gene Konjugasi Trasformasi Transduksi

40. Konjugasi Perpindahan molekul genetik dari satu sel bakteri ke sel bakteri lainnya secara kontak antar sel. Sel donor akan memberikan informasi genetik kepada resipien. Plasmid akan mengontrol formasi filamen permukaan sel yang dibutuhkan untuk mengadakan kontak pada waktu terjadinya perkawinan.

41. Konjugasi Con’t Plasmid memiliki sistim khusus untuk replikasi dan transfer DNA plasmid dan sistem pengontrolan Plasmid memiliki faktor F yang merupakan faktor konjugatif ,

43. Transformasi Proses perpindahan genetik dimana sel resipien membutuhkan molekul DNA bebas ( DNA yang berada diluar sel atau yang telah dimurnikan ) Dalam laboratorium transformasi dapat dilakukan dengan mengisolasi DNA donor kemudian menambahkannya pada suspensi sel resipien. Transformasi dapat terjadi secara alami.

44. Transformasi Con’t Pada prinsipnya transformasi akan terjadi bila sel resipien mampu menerima DNA yang telah diisolasi dari sel donor. Transformasi dapat terjadi pada bakteri Gram positif ataupun Gram negatif Transformasi dapat dipindahkan dari sel bakteri kepada sel tanaman.

46. Transduksi Adalah transfer genetik dari sel ke sel oleh virus dari sel inang . Transduksi terbagi 2 Tranduksi Khusus : hanya terjadi pada beberapa virus tertentu , gen inang langsung diintegrasi kedalam genom virus , lalu ditransfer ke resipien selama proses lisogenisasi (pembentukan lisogen ) Lisogen adalah bakteri yang mengandung faga lengkap

47. Transduksi Con’t Transduksi umum : gen gen inang yang berasal dari suatu genom akan menjadi bagian dari partikel DNA virus yang sudah matang dari suatu tempat atau penambahan pada genom virus. Virus yang telah mengalami transduksi tidak mampu melisiskan inang. Hal ini disebabkan sel bakteri telah menggantikan tempat penting pada gen virus.