ELISA- шинжилгээний аргийн талаар

1. E.L.I.S.A яаж
ажилладаг вэ?

2. ELISA гэж юу вэ?
•ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay
• Enzyme-Linked: антиген болон эсрэгбиетэй
фермент холбон үйлчлэх
• Immunosorbent: уусмалд буй эсрэгбие болон
антигенийг абсорбцилож авах арга.
• Assay: Илтгэгч бодисыг задрал дээр дүгнэлт
хийх арга

3.  Түүх
 EIA/ELISA-гаас өмнө радио-идэвхт бодис зүүсэн антиген эсвэл
эсрэгбиеийг ашигладаг Иммуно-ассей аргын нэг төрөл Радиоизотоп иммуно-
ассей үүсжээ.
 Avramais (1966, 1969) ба Pierce (1967) нар нь химийн аргыг ашиглан
биологийн ферментийг эсрэгбиетэй холбож, тэр нь уусмал буй субстратын
шинжээс хамаараад дохиог идэвхжүүлэх аргыг боловсруулсан.
 Энэхүү дохио нь уусмалд буй эсрэгбие болон антигенээс хамаардаг..
 ELISA-ын бүрдэл хэсэг:
 Эсрэгбие: ийлдэсийн IgG
 Фермент : Horse Radish Peroxidase (HRP) буюу тунхууны пероксидаза
нь 44000 МЖ-тэй, 4 лизиний үлдэгдлээ тогтсон.
 Субстрат: TMB (3,3',5,5', тетраметилбензидин). Энэ нь ферменттэй
харилцан үйлчлэлцэж, исэлдүүлэх Н2О2 үүсгэснээр уусмалыг цэнхэр өнгөтэй
болгоноУрвалыг зогсоохын тулд шингэрүүлсэн хүчил нэмэхэд уусмал эргэн
улбар шар өнгөндөө орно.

4.  ELISA-ын тухай ерөнхийд нь
ELISA хийхэд 96 нүхтэй
бичил хэмжээт таваг хэрэг
болно.
 Эсрэгбиеийг ашиглан тодорхой
нэгэн субстанцийг өнгөний
өөрчлөлтөөр тодорхойлох арга.
 ELISA-гийн ихэнх хэлбэрийн
биохимийн задрал үйл ажиллагаа
шингэн орчинд “wet lab” болно.
 ELISA нь тодорхой нэгэн
антигений эсрэг үүссэн нэг
төрлийн эсрэгбиеийг олох
боломжтой.
 ELISA нь бусад “assay”
аргуудаас зөвхөн дархан
бүрдлийг үүсгэдгээрээ онцлог.

5.  ЗАРЧИМ
 “Wet lab" analytic biochemistry assay, ELISA involves detection of an
"analyte" in a liquid sample by a method that continues to use liquid
reagents during the "analysis“.
 ELISA –гийн суурь зарчим нь фермент ашиглан эсрэгбие-
антигены холбоог илрүүлэхэд орших ба ферментийг эсрэгбиетэй
холбосон байх ба энэ нь өнгөгүй хромоген бодисыг өнгөт бодис
болгож, эсрэгбие, антигены холбоо илэрнэ.

6. Субстрат
Өнгөт
бүтээгдэхүүн
Хоёрдогч эсрэгбие
Анхдагч эсрэгбие
Сорьцонд олон төрлийн антиген

7.  ELISA-ын төрөл
Өрсөлдөөгүй
Шууд
Шууд бус
Сэндвич
Өрсөлдөх

8.  Шууд бус ELISA
 Тавган дээр антиген бэхлэсэн
байна.
 Блоклогч буффер уусмал нэмнэ.
 Тохирсон эсрэбие ирж
холбогдоно.
 Хоёрдогч эсрэгбие-HRPO –ийг
нэмэхэд эсрэгбиеийг
өвөрмөцөөр сонгож холбогдоно.
 TMB субсратыг нэмэхэд, HRPO
TMB-ийн үйлчлэлээс уусмалын
өнгө өөрчлөгдөнө.
 Зөв явагдсан тохиолдолд, ферментийн идэвхжил
буюу өнгө нь ийлдсэнд буй эсрэгбиеийн хэмжээтэй
шууд хамааралтай.

9. Шууд бус ELISA-гийн давуу тал
 Хоёрдогч эсрэгбие нь өргөн тархсан, хямд үнэтэй
байдаг.
 Хувисамхай, мөн олон төрлийн эсрэгбиеийг нэг
зүйлийн хоёрдогч эсрэгбиеээр илрүүлж болно.
 Дархлааны хариу урвал оролцоогүй анхдагч
эсрэгбиетэй холбогддог.
 Мэдрэг чанар нь их, учир нь тухайн эсрэгбиеийн
хэд хэдэн эпитоптой хоёрдогч эсрэгбие холбогдох
чадвартай тул энэ нь дохиог ихэсгэж өгдөг.
 Шууд бус ELISA-гийн сул тал
 Хоёрдогч эсрэгбие нь анхдагч эсрэгбиетэй
хөндлөн-хариу урвалд орох боломжтой.
 Нууц үеийг дараагаар шинжлэх шаардлагатай
болдог.

10.  Шууд ELISA
1. Сорьцоос авсан антиген
гадаргуу дээр бэхлэнэ.
2. Фермент холбоот анхдагч
эсрэгбиеийг нэмж өгнө.
3. Угаана, угаасны дараа
зөвхөн дархан бүрдэл
үлдэнэ.
4. Субстратыг нэмж өгөхөд
фермент хромоген бодис
ялгаруулан уусмалын
өнгийг өөрчилнө.
 Зөв хийсэн тохиолдолд,
ийлдсэнд буй антигены
хэмжээ уусмалын өнгөний
нягттай шууд хамааралтай.

11.  Шууд ELISA-гийн давуу тал
 Нэг л эсрэгбие ашиглах учир аргачлалын
хувьд түргэн.
 Хөндлөн хариу үйлдэлд оролцсон
эсрэгбие ялгарна.
 Шууд ELISA-гийн сул тал
 Immunoreactivity of the primary antibody
may be reduced as a result of labeling.
 Нэг бүр анхдагч эсрэгбие холбогдохдоо
удаан учир хугацаа их шаардах ба үнэтэй.
 Анхдагч эсрэгбиеийн сонголт нь туршилт
болгонд өвөрмөц буюу уян хатан биш.
 Бага зэргийн дохио өгнө.

12.  Сэндвич ELISA
1. a. Тавган дээр эсрэгбиеүдийг эгнүүлэн бэхлэсэн байна.
b. Блоклогч буффер нэмнэ.
2. Тавган дээр сорьцын антиген нэмэхэд тохирох нь эсрэгбиетэй
холбогдоно.
3. Тавган дээр биотинтой зүүсэн илрүүлэгч эсрэгбиеийг нэмнэ.
4. HRPO –ферментийг нэмэхэд, биотинтой зүүсэн илрүүлэгч эсрэгбиетэй
холбогдоно.
5. TMB субстрат нэмэхэд HRPO ферментийн өөрчлөлтөөр өнгө
өөрчлөгдөнө.
Зөв хийсэн тохиолдолд, ийлдэсийн антигений хэмжээ уусмалын өнгөний
нягтралтай шууд хамааралтай.

13.  ELISA-г хийхэд ямар багаж хэрэгтэй вэ?
 ELISA таваг
 Эерэг контрол
 Сөрөг контрол
 Шингэрүүлсэн
буффер
 Конъюгат
 TMB субстрат
 Зогсоох уусмал

14.  ELISA-гийн үйл явц
A B C D E
Wash
3X
Wash
4X
Wash
4X
Wash
4X
Алкалин
фосфотаза
субстрат нэмэхэд
уусмалд 405нм
ДУ өнгө
сийвэнгийн
конц –аас
хамаарч өгнө.
Бэхлэсэн
0,2мкг
анхдагч
эсрэгбие
Бэхлэгдсэн
эсрэгбие дээр
шингэрүүлсэн
сийвэнгээ
хийнэ
0,1мкг
биотинжуулсан
хоёрдогч
эсрэгбие хийнэ.
Хөргүүрт 4
цельст урьд
орой нь
1:2000 шингэрүүлсэн
streptavidin
холбогддог алкалин
фосфатаза нэмэх(
E)
2цаг 2цаг 1цаг
Инкубацийн өрөөнд 24 цельст байлгана.

15.  ELISA-гийн тавганы үр дүн

16.  Өрсөлдөх ELISA
Хатуу фазад буй бэхлэсэн
эсрэгбие
Тодорхой хэмжээгээр
сорьцын эсрэгтөрөгч болон
фермент зүүсэн эсрэгтөрөгч
хийнэ.
Сорьцын эсрэгтөрөгч болон
фермент зүүсэн антиген
өрсөлдөж холбогдоно.
Исэлдүүлэгч субстрат нэмэхэд
фермент зүүсэн антигентэй
үйлчлэлцэж өнгө үүсгэнэ.
Зөв хийсэн тохиолдолд, ийлдсэнд буй антигений хэмжээтэй
уусмалын өнгөний нягт урвуу пропорциональ хамааралтай байна.

17.  Давуу тал
 Suitable for complex (crude or
impure) samples, since the antigen
does not require purification prior to
measurement.
 Сул тал
 Each antigen may require a different
method to couple it to the enzyme.

18. ELISA-гийн хэлбэрүүдийг хооронд нь
харьцуулбал:
Шууд Шууд бус Sandwich Өрсөлдөх

19.  ELISA—гийн хариуг уусмалын оптик нягт болон
концентрацийн log утгаар харьцуулан муруй
гарган дүгнэнэ.
 Тэгээд үүнийгээ хэвийн антигений концентрацийг
хэмжиж гаргасан жишиг муруйтай харьцуулах
маягаар хариу гаргана.

20.  ELISA дүгнэлт
ELISA-гийн хариу нь 3 төрлөөр гарч
болно. Үүнд:
 Тоон:
 Чанарын
 Хагас тоон:

21. Хэрэглээ
Оношлогооны Токсикологи
Үйлдвэрийн Судалгааны

22.  Оношлогооны Хэрэглээ
 Шинжлүүлэгчийн цусанд вирусын бүтээгдэхүүнийг
илрүүлэх
 HIV-1 ба HIV-2 (анти-НIV эсрэгбие )
 Hepatitis C (эсрэгбиеийн
 Hepatitis B (Вирусын антиген ба эсрэгбиеийг
илрүүлэх)
 Дааврын түвшинг үзэх
 HCG (жирэмсний тест)
 LH (овуляцийг илрүүлэх)
 TSH, T3 and T4 (бамбай булчирхайн үйл ажиллагааг)
 Халдварыг тодорхойлох
 Бэлгийн замаар тархсан HIV, тэмбүү, хламидыг
 Hepatitis B ба C
 Токсоплазма гонди, H.Pylori, TB
 Эмийн хорыг илрүүлэх
 Хоол болон гэрийн тоосонд буй аллергеныг илрүүлэх

23.  Оношлогооны Хэрэглээ
 Аутоиммун өдөөгч ба харшил төрүүлэгчийг үзэх
 Чонон яр
 Хэрлэг төст артрит
 Хоол болон гэрийн тоосонд буй аллергеныг
илрүүлэх
 Дархлаа тогтох
 Гахайн хавдар
 Улаанууд
 Нярайн эрт илрүүлэлт
 Гипотиреоидизм
 Фенилкетонури
 Адренал гиперплази
 Хавдарын маркеруудыг илрүүлэх

24. Гэрийн оношийн хэрэглээнд
Жирэмсний тест
• hCG даавар: жирэмсэн эмэгтэйн
шээсэд үзэх
• 1-10 мин: (+) хоёр зураас, (-) нэг зураас
HIV тест
• Шүлсэнд: OraSure, OraQuick,
Calypte AWARE
• Цус: гэрийн аргаар

25. Үйлдвэрлэлийн хэрэглээ
Аллерген илрүүлэх
• 8 том ангиллыг хүнсний аллерген
• Маш бага түвшинтэй (ppm)
Вакцины чанарын хяналт
• Лиценц
• Бүтээгдэхүүний орцийг батлах

26. Токсикологи хэрэглээнд
Эмийн жор
• Зүрх судасны эмнүүд,
антидепрессантууд, цитостатикууд
• Эмийн тун
Эмийн зүй бус хэрэглээ
• Morphine, amphetamines, barbiturates
• Нярайд: тун ихсэх

27. Мэдрэг ба өвөрмөц чанар
•Мэдрэг чанар
• Боломж: эерэг гарах нь өвчинтэй гэсэн
үг
• Бүртгэлд сөрөг нь алдаа заана.
•Өвөрмөц чанар
• Боломж: сөрөг гарах нь өвчингүй гэсэн
үг
• Бүртгэл эерэг нь алдаа заана.

28.  Мэдрэг чанар
ELISA хамгийн мэдрэг чанар өндөртэй аргын нэг
юм. ELISA-ийн ердийн илрүүлэх чадвар нь 0,1-1 Fmole
(10^-15) буюу 0,01-0,1 ng байдаг ба мэдрэг чанар нь
эсрэгбие болон эсрэгтөрөгчийн харилцан үйлчлэлцэх
үндсэн шинж чанараас хамаарна.
Түүнээс гадна chemiluminescent эсвэл fluorescent
сорт гэх мэт зарим нэг субстратыг үр дүнг нь
нэмэгдүүлэхийн тул ашигладаг.
Өмнө дурдсанчлан, шууд бус арга нь мэдрэг
чанар өндөртэй байх ёстой.
ELISA нь маш мэдрэг (>99%) ба
маш өвөрмөц (>99%) шинж чанартай
Гэсэн хэдий ч төгс бус: алдаа гарч болно.

29. Хариуны хязгаарлалт
Хоолны тест
• Буруу сөрөг: шоколад, болгосон мах,
самар
• PCR-аар дахиж үзэх
HIV тест
• Буруу эерэг: тэмбүү, лупус, лаймын
өвчин
• Western Blot –аар нэмж хийх

30. Хийсэн: АУС-324
Б.Саруулжавхлан
Д.Намуун
Ц.Дэлгэржаргал

31. Ашигласан:
1. Voller, A., Bartlett, A., & Bidwell, D. E. (1978). Enzyme immunoassays with special reference to ELISA
techniques. Journal of Clinical Pathology, 31(6), 507-520.
2. Lequin, R. M. (2005). Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA). Clinical Chemistry, 51(12), 2415-2418
3. Berg, J.M., Tymoczko, J.L. & Stryer, L. (2012). Biochemistry Seventh Edition. New York: W.H. Freeman
and Company.
4. Dipiro, J.T., Talbert, R.L., Yee, G.C., Matzke, G.R., Wells, B.G., & Posey, L.M. (2008): Pharmacotherapy
A Pathophysiologic Approach Seventh Edition. New York: McGraw-Hill Companies Inc.
5. Doan, T., Melvold, R., Viselli, S., & Waltenbaugh C. (2012). Lippincott’s Illlustrated Reviews:
Immunology. Lippincott Williams & Wilkins.
6. Singh, R., John, T. J., Cherian, T., & Raghupathy, P. (1994). Immune response to measles, mumps &
rubella vaccine at 9, 12 & 15 months of age. The Indian Journal of Medical Research, 100, 155-159.
7. Miyai, K., Miyagi, T., Ashida, N., Narizuka, Y., Taniguchi, K., Tatsumi, H., … Oura, T. (1998). Evaluation
of highly sensitive thyrotropin assay for detecting thyroid diseases in neonatal screening: preliminary
studies. Journal of Endocrinology, 46(6), 671-766.
8. Scholler, N., Crawford, M., Sato, A., Drescher, C. W., O’Braint, K. C., Kiviat, N., Anderson, G. L., &
Urban, N. (2006). Bead-Based ELISA for validation of ovarian cancer early detection markers. Clinical
Cancer Research, 12, 2117-2124.
9. Dewar R, Goldstein D, Maldarelli F. Diagnosis of human immunodeficiency virus infection. In: Mandell
GL, Bennett GE, Dolin R, eds. Principles and Practice of Infectious Diseases. 7th ed. Philadelphia, Pa:
Elsevier Churchill Livingstone; 2009: 119.
10. Sino Biological Inc. ELISA for Food Industry. Retrieved from
http://www.elisa-antibody.com/ELISA-applications/food-industry
11. A.D.A.M. Medical Encyclopedia. (2013, March 22). ELISA/Western blot tests for HIV. Retrieved from
www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003538.htm

32. Таалан соёрхсонд
баярлалаа