Nghiên cứu này đề xuất một phương pháp đơn giản để chiết xuất và tinh chế resveratrol từ cây Polygonum cuspidatum, nhằm khắc phục các nhược điểm của các phương pháp truyền thống như tiêu tốn nhiều dung môi và chi phí cao. Phương pháp mới bao gồm thủy phân trans-polydatin để nâng cao hàm lượng resveratrol, áp dụng kỹ thuật sắc ký HPLC và phân tích khối phổ để xác định chất thu được. Kết quả cho thấy hàm lượng resveratrol chiết xuất đạt trên 73,8%, gấp 4 lần so với các phương pháp trước đó.

1. Trường đại học Dược Hà Nội
Bộ môn Dược liệu
Báo cáo khoa học
Nhóm 2 tổ 3 lớp A4 – K68
Người thực hiện:
1. Nguyễn Thị Thơi
2. Đỗ Thị Vinh
3. Bùi Tuấn Vũ
4. Bùi Quang Trong
5. Đông Thị Thảo
6. Trương Thị Thảo

2. Dong-Geng Wanga, Wen-Ying Liub, Guang-Tong Chena,b,✕
aMedical School, Nan Tong University, Nan Tong 226001, China
bDepartment of Pharmaceutical Analysis, China Pharmaceutical
University, Nanjing 210009, China
Received 31 May 2012; accepted 5 December 2012
Available online 10 December 2012
Phương pháp đơn giản để chiết xuất
và tinh chế Resveratrol từ Polygonum
cuspidatum.
Contents lists available at ScienceDirect
Journal of Pharmaceutical Analysis
www.elsevier.com/locate/jpa www.sciencedirect.com

3. 1.Mục tiêu nghiên cứu: Tìm một phương pháp đơn giản để
chiết xuất và tinh chế Resveratrol từ Polygonum cuspidatum.
2,Tính cấp thiết của nghiên cứu:
I,Đặt vấn đề
Hình 1: trans- resveratrol (A), Trans- polydatin( B)
• Resveratrol là hợp chất không flavonoid polyphenol
của công thức C14H12O3, hòa tan trong ether,
chloroform, methanol, ethanol, acetone, acid acetic,
ethyl ester và các dung môi hữu cơ khác.

4. • Nhiệt độ: nóng chảy 253-255 ℃, thăng hoa là
261 ℃
Trans – resveratrol có hoạt tính sinh học mạnh
hơn, nhưng hàm lượng lại thấp hơn so với dạng
muối glycoside của nó => Thủy phân Trans-
polydatin để tăng hàm lượng resveratrol.

5. Các phương pháp truyền thống đã dùng:
 Sử dụng nhiệt và một lượng lớn ethanol cho lọc, cô đặc
và tinh chế.
 Sử dụng phân tích polymer được đánh dấu có thời gian
tương tác đặc hiệu với resveratrol để tinh chế.
 Chiết xuất lỏng siêu tới hạn( SFE).
 Thủy phân bằng emzym.
 Chạy sắc kí ngược hiệu năng cao.
Nhược điểm:tốn dung môi, ô nhiễm môi trường, chi phí
cao.
=> Xây dựng một phương pháp đơn giản hơn để chiết xuất
và tinh chế resveratrol, cải thiện các nhược điểm trên cũng
như nâng cao năng suất chiết Resveratrol từ cây
P. cuspidatum

6. II, Phương pháp tiến hành,
1,Quy trình chiết xuất Resveratrol từ P. cuspidatum
Hình 2: Quy trình chiết xuất resveratrol

7. 2, Chạy sắc kí bằng HPLC kết hợp với máy phân tích khối
phổ
• Dịch resveratrol sau khi được chiết được tiến hành chấm và chạy
sắc kí thu được các vết.
• Sau đó được phân tích thông qua hệ thống phân tích khối phổ để
xác định chính xác chất thu được là resveratrol.
• Chạy sắc kí:
- Pha động: methanol: nước= 45:55(v:v).
- Pha tĩnh: cột C18(250mm x10mm x 5µm)
- Sau đó được phát hiện ở bước sóng 290nm.

8. Sau khi resveratrol được xác định bằng hệ thống HPLC
thì được nhúng trong dung môi base pH =8 -9 để loại
bỏ những tạp chất ảnh hưởng đến kết quả chiết xuất của
Resveratrol như các acid mạnh, những hợp chất tan
trong nước.

9. • Rửa kết thúc khi màu của pha nước thay đổi từ đỏ
sang không màu.
• Nồng độ của resveratrol xác định bằng HPLC và
được tính theo công thức 2.
% resveratrol = (VoCo/ViCi).100% (2)
Với Vo, Co là thể tích và nồng độ của resveratrol sau
khi chiết ở pha dung môi hữu cơ. Vi, Ci là thể tích và
nồng độ resvertrol trước khi chiết xuất bằng dung môi.

10. Chiết xuất
resveratrol từ
cây
P. cuspidatum
Đánh giá hiệu suất
chiết Resveratrol
trong từng bước
bằng HPLC
Lọc
• So sánh 2 phương pháp
lọc trực tiếp và gián tiếp
• Xét ảnh hưởng tỉ lệ thể
tích dịch chiết:nước
Thủy phân
• So sánh sự thủy phân
giữa H2SO4 và HCl
• Tìm ra điều kiện thủy
phân phù hợp
Chiết lỏng – lỏng
• So sánh khả năng
chiết của các dung
môi khác nhau
• Tìm dung môi chiết
phù hợp
Tẩy rửa
• So sánh hiệu suất chiết ở
các pH khác nhau
• Tìm môi trường pH thích
hợp
III, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

11. 1, Chiết xuất resveratrol từ cây P. cuspidatum.
• Pic1,2,5: là những thành phần chưa biết.
• Pic 3: resveratrol
• Pic 4: emodin
Dịch chiết
ethanol 95%
Cắn sau
khi lọc
Dung dịch
nước sau
khi lọc
Dịch chiết
sau thủy
phân

12. 2.Lọc
a, Vai trò của lọc
• Loại bỏ những hợp chất không phân cực hoặc ít phân
cực như physion, chysophanol, emodin… và những
mảnh vụn dược liệu khỏi dịch chiết ethanol 95% =>
tiến hành lọc và so sánh hai phương pháp lọc khác
nhau

13. - PP 1: lọc trực tiếp.
• Dịch chiết P.cuspidatum:
1.cô đặc ở áp suất thấp (loại bỏ
ethanol)
2.pha loãng/nước => lọc.
• Nhược điểm: Không loại bỏ
hoàn toàn những hợp chất
không/ít phân cực dạng đơn
phân tử trong dịch lọc.
- PP 2: Lọc gián tiếp
• Dịch chiết ethanol 95%:
1.Làm thành bột mịn kích thước
<0,9mm.Mẫu và nước cất chuyển
vào bình, để trong bình siêu âm.
2.Hỗn dịch thu được lọc ở áp suất
thấp.
• Ưu điểm: hầu hết tạp bị tủa lại
vì thế dễ bị loại bỏ khi lọc.
Khắc phục được nhược điểm
của phương pháp 1.

14. b, Hiệu quả của tỷ lệ dịch chiết : nước trong chiết xuất
Resveratrol.
• Tỉ lệ dịch chiết: nước (khối lượng/thể tích, g/ml) là
yếu tố quan trọng trong chiết xuất resveratrol.

15. Hình 4: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch
chiết và nước trong chiết xuất
resveratrol.

16. • Resveratrol là 1 polyphenol, thủy phân từ polydatin
cho hiệu quả chiết xuất tăng lên đáng kể.
=> Tiến hành thủy phân bằng dung dịch HCl 0,1 M để
thu được resveratrol.
• Tiến hành thủy phân bằng 2 điều kiện là:
• H2SO4 pH= 1,
• Nhược điểm: cả
resveratrol và polydatin
đều bị oxy hóa nên
không thu được
resveratrol.
• HCl, pH= 1.
• Cả resveratrol và
polydatin không bị
oxy hóa mà xảy ra
phản ứng thủy phân.

17. • Kết quả thực nghiệm: Sau 8h polydatin bị thủy phân
hoàn toàn.
• Kết quả chạy sắc kí:
Hình 3D sắc kí đồ của dịch chiết khi thủy phân

18. 4. Chiết xuất lỏng- lỏng.
a, Lựa chọn dung môi chiết.
• Sự có mặt của bất cứ thành phần nào một trong 2
pha đều chịu ảnh hưởng bởi Rf, To và tỉ lệ V giữa 2 pha.
=> lựa chọn đóng vai trò vô cùng quan trọng.
• Tiến hành thử các dung môi và kết quả thu hồi
resveratrol thu được như bảng sau:
.

19. • Mỗi dung môi được tiến hành làm 3 lần và lấy kết
quả trung bình.
• Dung môi methyl tert- butyl ether cho hiệu suất
chiết là cao nhất. Vì vậy chúng tôi lựa chọn methyl
tert- butyl ether làm dung môi chiết.

20. b, Sắc kí đồ sau khi chiết lỏng – lỏng:
Hình 5:Sắc kí đồ của mẫu sau khi chiết lỏng – lỏng.
Hình A: sắc kí đồ trong pha hữu cơ.
Hình B: Sắc kí đồ trong pha nước.

21. • 5. Tẩy rửa.
Hình 6 : Ảnh hưởng của pH đến hiệu
xuất chiết Resveratrol.

22. Resveratrol là acid yếu: trong vùng pH nhất
định nó sẽ tồn tại dạng phân tử không phân cực.
Khi rửa giải với dung dịch có:
 pH<9 resveratrol vẫn còn trong pha hữu cơ.
 pH >10 nó tồn tại dạng ion và được chuyển
hoàn toàn sang pha nước.
Như vậy điều kiện được khảo sát để chiết xuất
resveratrol là 8<pH<9.

23. b, Đánh giá kết quả tẩy rửa:
Hình 7: Sắc kí đồ của các chất sau khi tẩy rửa.
Hình A: sắc kí đồ trong pha nước.
Hình B: sắc kí đồ trong pha hữu cơ.

24. IV. Tổng kết
Theo các tài liệu được báo cáo, có nhiều phương pháp chiết xuất
resveratrol, 4 phương pháp nêu ở bảng 1 có nhược điểm:
-Sắc ký cột sử dụng silicagel nhưng tiêu tốn thời gian và yêu cầu
một lượng lớn dung môi hữu cơ.
- Sắc ký ngược dòng tốc độ cao và chiết xuất lỏng siêu tới hạn và
những phương pháp tiên tiến khác yêu cầu thiết bị đắt tiền.

25. • Vì thế, trong phương pháp này chúng tôi sử dụng acid
HCl và dung dịch base để tẩy rửa, không dùng thiết bị
phức tạp và dung môi hữu cơ.
• Không cần cột đóng gói như nhựa macroporous hay
gel silica.
• Tốn ít dung môi hữu cơ.
• Không cần các thiết bị đắt tiền.
• Hàm lượng resveratrol tăng lên 4 lần bằng cách thủy
phân dạng muối glycoside của nó
=> Hàm lượng Resveratrol chiết xuất được đạt trên
73,8%