Il documento discute l'importanza della maturazione degli oociti e delle tecniche in vitro come l'IVM e l'IVF per migliorare la fertilizzazione negli ambiti veterinario e umano. Viene evidenziato il ruolo cruciale delle cellule della granulosa nella maturazione degli oociti e nello sviluppo embrionale. Inoltre, la co-coltura 3D dimostra un'efficacia superiore rispetto ai metodi tradizionali nel promuovere la competenza di maturazione degli oociti.

1. Anche le uova devono “MATURARE”

2. La maturazione degli oociti in vitro (IVM) e la
fertilizzazione (IVF) sono tecniche indispensabili
che trovano applicazione sia in campo veterinario
che umano.
Lo sviluppo di un oocita competente per la
fertilizzazione ed il successivo processo di
embriogenesi dipendono da appropriati segnali
provenienti dalle cellule della granulosa (CG)
che, a loro volta, devono essere adeguatamente
stimolate dall’oocita in crescita.

3. Colture cellulari
Per colture cellulari si intende cellule provenienti dalla dissociazione di tessuti animali che si
moltiplicano “in vitro” per una o più generazioni avendo perduto l’architettura del tessuto e
di solito avendo subito un certo grado di differenziazione.
•Possibilità di coltivare “in vitro” diversi tipi
cellulari, permettendo la sopravvivenza e la
funzionalità cellulare in un ambiente diverso
da quello naturale.
•Le colture cellulari vengono utilizzate nella
ricerca come modello sperimentale in
Ritorni in campo
innumerevoli tipi di esperimenti. Esse sono
zootecnico, veterinario, clinico,
utilizzate per analizzare l'effetto di farmaci e
medico, farmacologico.
verificare la mutagenicità e cancerogenicità
delle sostanze. Vengono utilizzate come
modello in cui studiare effetto
dell'espressione di particolari geni.

4. Colture cellulari
Nei sistemi in vivo lo sviluppo
le colture cellulari
differisce significativamente
tridimensionali (3D)
rispetto alle cellule coltivate
costituiscono un approccio
in 2D, soprattutto per quanto
alternativo e/o parallelo al
riguarda la morfologia, la
2D. Esse sono il punto di
cinetica di
legame tra la coltura cellulare
crescita, l’espressione genica
tradizionale e i modelli in
ed il grado di
vivo.
differenziazione.

5. Incapsulazione di cellule vive in
membrane semipermeabili e
biocompatibili

6. INCAPSULAZIONE DI CELLULE DELLA GRANULOSA (GC)
PER LO SVILUPPO IN VITRO DI PSEUDOFOLLICOLI
OVARICI
Follicoli Ovarici:
Follicoli primordiali ovarici sono strutture CELLULE DEL CUMULO
circondate da un singolo strato di cellule piatte
che durante la maturazione del follicolo
diventano cuboidali e si differenziano in cellule
della granulosa (GC), della teca interna e della
teca esterna.

8. La meiosi sussiste in due divisioni nucleari (indicate come meiosi I e
La MEIOSI meiosi II) che producono un totale di quattro nuclei figli, aventi ciascuno
la metà del numero dei cromosomi presenti nel nucleo di partenza.
Ia Divisione meiotica
Profase I
La cromatina inizia a condensarsi e i cromosomi
duplicati diventano pertanto visibili al
microscopio; subito dopo, in un processo
chiamato sinapsi, i cromosomi omologhi si
appaiano per tutta la loro lunghezza. Formatasi
questa struttura che prende in nome di tetrade
può avvenire il crossing over.
Metafase I
Formazione del fuso mitotico e allineamento
degli omologhi.
Anafase I
I cromosomi si separano completamente e
migrano verso il polo.
Telofase I
Riformazione dell’involucro nucleare con
distribuzione asimmetrica del materiale
citoplasmatico. Crossing over

9. Viene completata ad ogni ovulazione conferendo
IIa Divisione meiotica all’ovocita la possibilità di essere fecondato.
Profase II
Al picco pre-ovulatorio delle gonadotropine
l’attività nucleare riprende: l’ovocita completa la 1°
divisione meiotica ed elimina il primo globulo
polare: l’ovocita ora detto secondario inizia la
seconda divisione meiotica ma si arresta in MII.
Metafase II
Si forma il fuso e scompare l’involucro nucleare.
Comincia l’allineamento dei cromosomi: solo dopo
l’ovulazione e la successiva fertilizzazione, l’ovocita
completerà anche la seconda divisione meiotica con
l’estrusione del secondo globulo polare.
Anafase II
I centromeri dei cromosomi dei cromatidi fratelli si
rompono e i cromatidi si dividono, migrando ai poli
opposti della cellula.
Telofase II
si riforma l’involucro nucleare ed i cromosomi si
despiralizzano parzialmente.

11. PROFASE I: GV visibile, assenza globulo polare
METAFASE I: assenza GV e globulo polare
METAFASE II: assenza GV, I° globulo polare
POST-MATURO: I° globulo polare visibile, degenerazione citoplasma, disomogeneo
PB
Ovocita immaturo (profase I) Ovocita maturo (metafase II)
•Le cellule del cumulo possono presentare qualche •Globulo polare estruso
grado di espansione. • Cellule del cumulo espanse
•Le cellule della corona sono compatte e strettamente •Cellule della corona con tipica disposizione radiata
addossate alla zona pellucida •Cellule della granulosa, larghe e abbondanti.

12. Stereomicroscopio:
Struttura pseudofollicolare
dopo 48h di co-coltura 3D
(oo) oocita decumulato
(zp) zona pellucida
(GC) cellule granulosa
(m) membrana Ba alg
(c) core capsula
Adobe Photoshop X20

13. CELLULE della GRANULOSA
•Giunzioni comunicanti con l’ovocita
• Ruolo centrale nella maturazione del follicolo
• Regola lo sviluppo dell’oocita (controlla l’arresto meiotico e la successiva ripresa)
• Invia all’ovocita sostanze nutritive
• Segnali all’oocita per il processo di embriogenesi
la granulosa è controllata dall’ovocita
proliferazione, organizzazione
differenziamento, steroidogenesi
Attività ormonale CG FOLLICOLO produzione
PREOVULATORIO di 17-β-estradiolo e
Durante la maturazione follicolare le CG producono progesterone
estrogeni, dopo l’ovulazione si differenziano e FOLLICOLO POST
producono P4 OVULATORIO prevalente produzione
(CORPO LUTEO) di progesterone

14. COLTIVAZIONE IN MONOSTRATO
Monostrato
ASSENZA ADEGUATA ECM
ADESIONE DELLE CELLULE AD UN SUPPORTO
INADATTO
crescita bidimensionale e
MORFOLOGIA alterazioni morfologiche-
funzionali
MINOR ATTIVITÀ AROMATASICA COLTIVAZIONE STRUTTURE SIMILFOLLICOLARI
Prevalente produzione di Progesterone
3D
PRESENZA DI ECM NATURALE/ARTIFICIALE
BARRIERA SEMIPERMEABILE (LAMINA BASALE)
Produzione di 17-β-estradiolo
e progesterone

15. SCOPO: Realizzare una struttura pseudo-follicolare finalizzata ad ottenere elevati livelli
di maturazione di oociti di animali di interesse zootecnico,
mediante l’incapsulazione di GC immobilizzate
in una matrice extracellulare artificiale.

16. Aspirazione follicoli (Ø 2-8 mm)
Fluido follicolare contenente GC e oociti:
• centrifugare a 2000 giri/min.
• risospensione in terreno di coltura (HAM’S F-10)
• dosare 30 µl in piastra petri
• osservare allo stereomicroscopio
• isolare le uova in un’altra petri con 100 µl di terreno
Pellet GC Oociti
Co-coltura 3D

17. La sospensione viene estrusa in una
soluzione di alginato sodico; gli ioni bario
Sosp cellulare bivalenti diffondono verso la superficie
+ BaCl2
esterna inducendo la gelificazione
dell’alginato intorno alla sospensione
cellulare con formazione di una
membrana di alginato di bario
all’interfaccia delle singole gocce di
estruso.
Alginato di sodio

18. INCAPSULAZIONE
DI GC Cellule della
granulosa
Membrana di alginato Matrice extracellulare
di Ba atificiale

19. Pellet
CG
+ GC
BaCl2 Na alginato
Ba alginato
Sospensione cps in HAM’S F-10
Inserimento oocita o
complesso cumulo-oocita

20. IVM
37°C, 5% CO2 48 h
IVF
Coincubazione 37°C, 5% CO2 6 h
Incubazione 37°C 5% Co2 6 gg
Classificazione stereomicroscopica
(48 h e 144 h)
Non
Divisi
Divisi

21. SEM: oocita suino clivato dopo 48h dalla IVF; IVM in sistema 3D
hormone-free (800X)

22. Oociti suini in fase di divisione

23. Stereomicroscopio (90X): embrione suino a 144h dalla
IVF; IVM in sistema 3D hormone-free

24. Conclusioni
Oociti circondati da molte GC raggiungono una
competenza di maturazione più elevata (Sirad et al., 2006)
GC necessarie per il normale sviluppo dell’oocita
Fondamentali i contatti tra oocita e cellule del cumulo
Coltura 3D non è influenzata dalla presenza di un’intatta
corona radiata formazione
pseudo-cumulo

25. Conclusioni
Membrana di alginato di bario simula la membrana
basale in vivo
A 144 h presenza di GC sulla superficie
esterna degli oociti:
Importanza delle GC in fase di IVM sia per diretto contatto
che per la produzione di metaboliti e cataboliti
Co-coltura 3D buona efficienza nella IVM di oociti
per IVF e ET senza gonadotropine esogene

26. Conclusioni
Tecnica promettente per incrementare la qualità degli
embrioni nei protocolli di IVM
Produzione embrioni in ambito veterinario
terapia dell’infertilità umana